Η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) είναι μια πρωτεϊνική κινάση τυροσίνης (nRPTK) με κυτταροπλασματική κατανομή στην περιφέρεια του κυττάρου. Εντοπίζεται κυρίως σε περιοχές του κυττάρου γνωστές ως εστίες προσκόλλησης, με τις οποίες το κύτταρο προσκολλάται στην εξωκυτταρική ύλη. Συμμετέχει σε σημαντικές κυτταρικές διεργασίες όπως στην κυτταρική κίνηση και μετανάστευση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στην κυτταρική επιβίωση και απόπτωση. Η FAK ενεργοποιείται από πολλά ερεθίσματα που μπορούν να επάγουν φωσφορυλίωση της σε αμινοξέα τυροσίνης (Υ397, Υ576, Υ577, Υ861, Υ925) όπως για παράδειγμα αυξητικοί παράγοντες, νευροπεπτίδια, παράγοντες που ενεργοποιούν υποδοχείς συνδεδεμένους με G-πρωτεΐνες και μηχανικά ερεθίσματα αλλά κυρίως μετά από τη διέγερση των ιντεγκρινικών υποδοχέων των κυττάρων. Ο ρόλος της FAK στην μεταγωγή μηνυμάτων, στο πλαίσιο της κυτταρικής επικοινωνίας είναι διττός: δρα ως κινάση φωσφορυλιώνοντας τα υποστρώματα της αλλά και ως πρωτεΐνη συνδετήρας (adaptor protein) δημιουργώντας πολυπρωτεϊνικά σηματοδοτικά σύμπλοκα. Δεδομένης, λοιπόν, της ιδιαίτερης φύσης του μορίου, η FAK θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως ενεργοποιούμενη πρωτεΐνη ικρίωμα (activable scaffold protein). Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία του βακτηρίου E. coli. Έτσι, χρησιμοποιήθηκαν φαρμακολογικοί αναστολείς για να ανιχνευθεί η συμμετοχή τελεστών της μεταγωγής σημάτων στην ενεργοποίηση της FAK. Επιπλέον, διερευνήθηκε με ανοσοκατακρημνίσεις η συμπλοκοποίηση της FAK με πρωτεΐνες-κλειδιά σημαντικών κυτταρικών μονοπατιών σε κύτταρα που βρίσκονταν σε εναιώρημα. / Cells respond to extracellular stimuli with the recruitment of multiple cytoskeletal and regulatory proteins, which form specialized complexes. These complexes are usually involved in the promotion of integrin-mediated signals to the nucleus. In this study, we investigated whether any signal transduction complexes are constitutively present, in Medfly hemocyte suspension, in the absence of external stimuli. Hemocytes from the 3rd instar larvae were isolated and protein crude extracts were prepared. In hemocyte lysates, the presence of FAK (focal adhesion kinase), Integrin β1 and the adaptor protein Paxillin was identified with immunoprecipitation and immunoblot analysis. The presence of these proteins was also confirmed with immunofluorescence microscopy, in attached hemocytes on glass slides. Co-immunoprecipitation with FAK and immunoblot analysis with anti-Paxillin, anti-tubulin, anti-actin and anti-ERK revealed the complex formation of FAK with Paxillin, Tubulin, Actin and ERK in hemocyte suspensions. The profiles of this complex and of each one of these proteins, separately, varies, during development and phagocytosis of E.coli. Consequently, it was demonstrated that FAK forms complex with cytoskeletal proteins like paxillin, tubulin, actin and signalling proteins such as ERK, in Medfly hemocytes, without the influence of any extracellular stimuli.

H κινάση εστιών προσκόλλησης (FAK) συμμετέχει στη μεταγωγή μηνυμάτων κατά την κυτταροφαγία. Στα αιμοκύτταρα των εντόμων υπάρχει σε διαφορετικές ποσότητες κατά την ανάπτυξη. Ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση στην Tyr-397. Kατά την κυτταροφαγία του βακτηρίου Ε. coli ενεργοποιείται άμεσα. Ανάμεσα στα μόρια που σχηματίζουν σύμπλοκο με την FAK είναι και οι πρωτείνες pinch, Src και οι ΜΑΡΚ. Κάποια από τα παραπάνω σχηματίζουν σύμπλοκο κατά την κυτταροφαγία ενώ για άλλα το σύμπλοκο προυπάρχει. Ο κυτταροσκελετός ακτίνης και τουμπουλίνης χρειάζονται για την κυτταροφαγία, όπως χρειάζεται και η έκκριση. Τέλος διαπιστώθηκε πως κατά την κυτταροφαγία του βακτηρίου Ε. coli και του πεπτιδίου RGD, συμμετέχουν οι πρωτείνες Src, Ras, Rho και JNK. / Focal adhesion kinase (FAK) participates in signal transduction at phagocytosis. Insect hemocytes have FAK in different mounts during development. FAK becomes activated after phosphorylation at Tyr-397. During phagocytosis of E. coli, FAK becomes immediately activated. Pinch, Src and MAPK are some of the molecules which are in complex with FAK. Some of these molecules are in complex with FAK during phagocytosis, but some others there are in complex at any time. Phagocytosis, in order to happen, needs actin and tubulin cytoskeleton. Secretion is also needed for this purpose. Finally, we found that the proteins Src, Rho, Ras and JKN participate in phagocytosis of the RGD peptide and in phagocytosis of the microbe Escherichia coli.

Ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) έχει μοριακή μάζα 18 kDa και ανήκει σε μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη και σχετίζονται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε τη συμμετοχή των ενδοκυτταρικών κινασών FAK και ILK στην επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα ομφάλιου λώρου (HUVEC). Εξωγενής χορήγηση ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στις τυροσίνες 397 και 925, ενώ μειώνει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στη τυροσίνη 576. Η κινάση ILK φαίνεται να εμπλέκεται στη διεγερτική δράση της PTN στη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC, αφού μείωση της έκφρασης της κινάσης ILK με παρεμβαλλόμενο RNA στα κύτταρα HUVEC, οδήγησε σε αναστολή της επαγόμενης από ΡΤΝ κυτταρικής μετανάστευσης. Επιπλέον, διέγερση των κυττάρων HUVEC με PTN είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της ενεργοποίησης της κινάσης ILK. Με σκοπό να διερευνηθεί η θέση της κινάσης ILK στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται από τη PTN στα κύτταρα HUVEC, μελετήσαμε την πιθανή αλληλεπίδραση της ILK με μόρια που είναι γνωστό ότι συμμετέχουν σε αυτό το μονοπάτι. Παρατηρήθηκε ότι η κινάση ILK αλληλεπιδρά σε μεγάλο βαθμό με την κινάση FAK, ενώ μικρού βαθμού αλληλεπίδραση φαίνεται και με τις ιντεγκρίνη β3 και κινάση c-Src. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η διέγερση με PTN των κυττάρων HUVEC αυξάνει την αλληλεπίδραση μεταξύ των κινασών FAK και ILK. Τέλος, με δεδομένο ότι η β-κατενίνης εμπλέκεται στη κυτταρική μετανάστευση, ερευνήσαμε κατά πόσο η PTN και η κινάση ILK εμπλέκονται στο σηματοδοτικό μονοπάτι της β-κατενίνης στα κύτταρα HUVEC. Η ΡΤΝ αυξάνει με δοσο-εξαρτώμενο και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε κύτταρα HUVEC, φαινόμενο που αναστέλλεται μετά τη μείωση της έκφρασης της κινάσης ILK με siRNA. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ότι η ΡΤΝ έχει διαφορική δράση στη φωσφορυλίωση τυροσινών της κινάσης FAK διαφορετικών θέσεων και ότι η κινάση ILK συμμετέχει στη διεγερτική δράση της PTN στη μετανάστευση των κυττάρων. / Pleiotrophin (PTN) is an 18 kDa secreted growth factor that displays high affinity for heparin. A growing body of evidence indicates that PTN is involved in cell proliferation, migration and differentiation. In the present work, we studied the possible role of two intracellular kinases, focal adhesion kinase (FAK) and integrin-linked kinase (ILK), in the PTN-induced migration of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Exogenous administration of PTN significantly increased the phosphorylation of FAK kinase in tyrosines 397 and 925 and decreased phosphorylation in tyrosine 576. ILK seems to be involved in PTN-induced migration of HUVEC, since suppression of the ILK kinase using small interfering RNA (siRNA) abolished the stimulatory effect of PTN in migration of HUVEC. In addition, stimulation of HUVEC with PTN increased the ILK kinase activity. In order to determine which other signaling mediators are involved in the PTN signaling pathway, we studied the interaction of ILK with other proteins that have been implicated in the PTN-induced signal transduction. ILK strongly interacted with FAK kinase and to a lesser extent with c-src kinase and integrin ανβ3. Interestingly, PTN increased the degree of interaction between ILK and FAK kinases. Finally, it has been well described that β-catenin is involved in cell migration and that PTN increases β-catenin phosphorylation. We therefore investigated whether PTN affects β-catenin phosphorylation in HUVEC through activation of ILK kinase. PTN significantly increased phosphorylation of β-catenin in a concentration and time dependent manner, which seemed to be abolished after suppression of the ILK kinase using siRNA. Collectively, these results suggest a role of FAK and ILK kinases in the PTN-related signaling cascade which leads to cell migration both human endothelial cells.

Η παρούσα μελέτη διερευνά τη συμμετοχή της κινάσης της τριφωσφορικής ινοσιτόλης (PI3-kinase) στο σηματοδοτικό μονοπάτι που επάγεται παρουσία μικρομοριακών συγκεντρώσεων καδμίου (Cd 50 μΜ) σε αιμοκύτταρα του μυδιού Μ. galloprovincialis. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με χρήση της ουσίας wortmannin (wort), που αποτελεί αναστολέα της δραστικότητας της PI3-kinase. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, αιμοκύτταρα που επωάστηκαν για 1 ώρα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις wortmannin παρουσίασαν σημαντική μείωση της βιωσιμότητάς τους σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 50 nM. Επιπρόσθετα, κύτταρα που προ-επωάστηκαν με μη- τοξικές συγκεντρώσεις wortmannin, πριν την έκθεσή τους σε Cd 50 μΜ, παρουσίασαν σημαντική μείωση της ικανότητας του μετάλλου να προκαλεί αύξηση της θνησιμότητας των κυττάρων, παραγωγή σουπεροξειδικών ανιόντων (.O2 -) και νιτρικών οξειδίων (ΝΟ), καθώς και να επάγει την λιπιδική υπεροξείδωση. Παράλληλα, κύτταρα που επωάστηκαν με τον φωρβολεστέρα PMA (10 μg/ml), που αποτελεί σημαντικό αγωνιστή της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) η οποία ευθύνεται για την επαγωγή της διαδικασίας της αναπνευστικής έκρηξης (παραγωγή .O2 - και ΝΟ, μέσω της ενεργοποίησης της NADPH οξειδάσης και ΝΟ συνθετάσης αντίστοιχα) έδειξαν σημαντική αύξηση των επιπέδων (.O2 -) και ΝΟ, συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου. Η παρουσία της wortmannin (1 και 50 nM) σε κύτταρα που εκτέθηκαν στον φωρβολεστέρα PMA ανέστειλε σημαντικά της ικανότητα του τελευταίου να προκαλεί αύξηση των επιπέδων ΝΟ, ενώ τα επίπεδα (.O2 -) παρέμειναν υψηλά. Από τα αποτελέσματά μας μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η PI3- kinase μπορεί να σχετίζεται με μια PKC-ανεξάρτητη επαγωγή της δραστικότητας της NO συνθετάσης, ενώ η αλληλεπίδρασή της με την PKC φαίνεται να οδηγεί στην επαγωγή της δραστικότητας της NAPDH οξειδάσης. / The involvement of PI3-kinase in cadmium (Cd) mediated oxidative effects on hemocytes of mussel M. galloprovincialis was investigated. According to the results, hemocytes pre-treated for 15 min with non-toxic concentrations of wortmannin (1 and 50 nM, as revealed by neutral red retention assay), a specific PI3-kinase inhibitor, showed a significant attenuation of Cd ability (at concentration of 50 μΜ) to promote cell death, superoxide anions (.O2 -) production, nitric oxide (NO) generation and lipid peroxidation (MDA content) in any case. Furthermore, wort-treated cells showed a significant attenuation of PMA (10 μg/ml) ability to induce NO generation but not .O2 - production. It seems that PI3-kinase in cells faced with pro-oxidants, such as Cd, could lead to a PKC-independent induction of NO synthase activity, while the existence of a cross-linking among PI3-kinase and protein kinase C is seemed fundamental for the regulation of NAPDH oxidase activity, probably through a PKC-dependent signaling pathway.

Ο αγγειακός ενδοθηλιακός παράγοντας (VEGF) επάγει την παραγωγή του μονοξειδίου του αζώτου(ΝΟ), το οποίο διαμεσολαβεί πολλές από τις αγγειογενετικές δράσεις του. Μολονότι, γνωρίζουμε ότι ο «υποδοχέας του ΝΟ» διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC) συμμετέχει στην αγγειογένεση που επάγεται από τον VEGF, ελάχιστα είναι χαρακτηρισμένα τα καθοδικά μόρια- εκτελεστές μέσω των οποίων το cGMP που προέρχεται από την sGC κατευθύνει την αγγειογενετική απάντηση. Για να προσδιορίσουμε την συμμετοχή της PKG (cGMP-dependent protein kinase) στην αγγειογένεση που επάγεται από τον VEGF, χρησιμοποιήσαμε τα πεπτίδια DT2 και DT3, δύο επιλεκτικούς αναστολείς της PKGIα. Έχοντας την απάντηση αυτού του ερωτήματος ως στόχο, πραγματοποιήσαμε in vivo (CAM, μοντέλο του κερατοειδή του ματιού κουνελιού, τροποποιημένη δοκιμασία Miles assay) και in vitro (πολλαπλασιασμός και μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, εκβλάστηση σε δακτυλίους αορτής) μελέτες. Επιπλέον εκτιμήθηκε η ικανότητα του DT2 να παρεμβάλλεται στην μεταγωγή σήματος του VEGF. Επώαση CAM μεμβρανών με τους πεπτιδικούς αναστολείς της PKGIα είχε σαν αποτέλεσμα την μείωση του μήκους των αγγείων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με το DT3 να είναι πιο αποδοτικό από το DT2. Επιπρόσθετα παρατηρήσαμε, ότι το DT3 καταργεί την αγγεογενετική απάντηση που προέρχεται από τον VEGF στον κερατοειδή χιτώνα του ματιού κουνελιού. Η αναστολή της PKGI εμποδίζει επίσης την αγγειακή διαρροή που επάγεται από τον VEGF. In vitro, χορήγηση VEGF σε ενδοθηλιακά κύτταρα επάγει την φωσφορυλίωση της VASP στην Ser239 (επιλεκτικό υπόστρωμα για την PKGΙ) μέσω της ενεργοποίησης του VEGFR2 ενώ η συνχορήγηση του DT2 έχει σαν αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα φωσφορυλιωμένης VASP πρωτεΐνης αποδεικνύοντας ότι σε άθικτα κύτταρα διέγερση του VEGFR2 οδήγησε σε ενεργοποίηση της PKGI. Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με DT2 ή DT3 αναστέλλει την διαμεσολαβούμενη από τις ΜΑΡΚ κινάσες ERK1/2 και p38 μετανάστευση, πολλαπλασιασμό και εκβλάστηση τους που επάγονται από τον VEGF. Εν κατακλείδι, παρέχουμε αποδείξεις ότι η PKGI είναι μέρος του μεταγωγικού μονοπατιού που διαμεσολαβεί τις αγγειογενετικές δράσεις του VEGF και ότι οι πεπτιδικοί αναστολείς της PKGI θα μπορούσαν να δοκιμαστούν σε ασθένειες που σχετίζονται με ενισχυμένη αγγειογένεση. / Vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulates nitric oxide (NO) production, which mediates many of its angiogenic actions. However, the angiogenic pathways that operate downstream of NO following VEGF treatment are not well characterized. Herein, we used DT2 and DT3, two highly selective cGMP-dependent protein kinase I peptide inhibitors to determine the contribution of PKGI in VEGF-stimulated angiogenesis. Incubation of chicken chorioallantoic membranes (CAM) with PKG-I peptide inhibitors decreased vascular length in a dose-dependent manner, with DT-3 being more effective than DT2. Moreover, inhibition of PKG-I with DT3 abolished the angiogenic response elicited by VEGF in the rabbit eye cornea. PKG-I inhibition, also blocked VEGF-stimulated vascular leakage. In vitro, treatment of cells with VEGF stimulated phosphorylation of the PKG substrate VASP through VEGFR2 activation; the VEGF-stimulated VASP phosphorylation was reduced by DT2. Pre-treatment of cells with DT2 or DT3 inhibited VEGF-stimulated mitogen activated protein kinase cascades (ERK1/2 and p38), growth, migration and sprouting of endothelial cells. The above observations taken together identify PKGI as a downstream effector of VEGFR2 in EC and provide a rational basis for the use of PKG-I inhibitors in disease states characterized by excessive neovascularization

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας που δεσμεύεται στην ηπαρίνη και εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθώς και της αγγειογένεσης. Υψηλές συγκεντρώσεις του αυξητικού παράγοντα HARP έχουν βρεθεί σε ανθρώπινους καρκινικούς όγκους, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως επίσης και σε ορό ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η HARP αποτελεί υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις από το ολικό μόριο. Η HARP ασκεί τις βιολογικές τις δράσεις ύστερα από πρόσδεση στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς SDC3, RPTPβ/ζ και ALK. Παρά την ταυτοποίηση του υποδοχέα ALK ως λειτουργικού υποδοχέα της HARP, μέχρι σήμερα υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις αναφορικά με την αλληλεπίδρασή του με τη HARP. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του αυξητικού παράγοντα HARP και του υποδοχέα ALK σε καρκινικά κύτταρα PC3 ανθρώπινου προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HARP επάγει τη φωσφορυλίωση του ALK σε κύτταρα PC3, ωστόσο δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση του συγκεκριμένου υποδοχέα σε κύτταρα PC3 στα οποία είχε μειωθεί η συσσώρευση του RPTPβ/ζ. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν ανασυνδυασμένα πεπτίδια που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με τη θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) και αντιστοιχούσαν σε περιοχές του αυξητικού παράγοντα HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] που προκύπτουν ύστερα από πέψη με πλασμίνη. Ύστερα από πειράματα συγκατακρήμνισης βρέθηκε ότι ο ALK αλληλεπιδρά ισχυρά με το πεπτίδιο P(60-110) αποτέλεσμα το οποίο προέκυψε και ύστερα από μεωρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται η έμμεση αλληλεπίδραση του υποδοχέα ALK και του αυξητικού παράγοντα HARP, η οποία βρέθηκε ότι διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Αποδεικνύεται επίσης ότι παρόλο που η αλληλεπίδραση των δύο αυτών μορίων δεν είναι ικανή να οδηγήσει στη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK, τα δύο αυτά μόρια αλληλεπιδρούν βιοχημικά καθώς η αλληλουχία 60-110 των αμινοξέων της HARP αλληλεπιδρά ισχυρά και με τις δύο μορφές του υποδοχέα, με μοριακό βάρος 220 και 140 kDa αντίστοιχα. / HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) is a heparin-binding growth factor, involved in the regulation of cell differentiation, cell proliferation as well as in angiogenesis. Elevated concentrations of HARP have been detected in malignancies, in cancer cell lines, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. It is also known that HARP is substrate for different proteases of the cell microenvironment, leading to the production of biological active peptides which can exert similar or even opposite biological activities to HARP. HARP exerts its biological actions after binding to the transmembrane receptors SDC3, RPTPβ/ζ and ALK. Even though ALK has been defined as a functional HARP receptor, contradictory results have been published concerning HARP-ALK interaction. In the present work, we studied the interaction of HARP growth factor with ALK transmembrane receptor using PC3 prostate cancer cells. It was shown that HARP induces the phosphorylation of ALK in PC3 cells, however no effect on ALK activation was observed in PC3 cells after RPTPβ/ζ knockdown. We also used recombinant gst-fused peptides corresponding to various fragments of HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] which result after cleavage with plasmin. After GST pull-down assays it was shown that ALK strongly binds to the P(60-110), result that was also taken after RPTPβ/ζ knockdown. Cumulatively, our results indicate that HARP-induced ALK phosphorylation is mediated by RPTPβ/ζ. It is also demonstrated that HARP interacts biochemically with ALK, since P(60-110) strongly binded both species of ALK (220 and 140 kDa).

Οι κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες (CDKs) αποτελούν μία οικογένεια κινασών σερίνης/θρεονίνης, η δραστικότητά των οποίων εξαρτάται από την πρόσδεσή τους σε ρυθμιστικές υπομονάδες (κυκλίνες). Οι CDKs διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στην ομαλή αλληλοδιαδοχή των σταδίων του κυτταρικού κύκλου οδηγώντας σε φυσιολογικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ωστόσο, απορρύθμιση της δράσης τους παρατηρείται σε πολλούς καρκινικούς όγκους με συνέπεια να αποτελούν ελκυστικό στόχο για την καταπολέμηση του καρκίνου. Πληθώρα παραγόντων με ανασταλτική δράση έναντι των CDKs έχουν συντεθεί και μερικοί από αυτούς βρίσκονται σε προχωρημένες φάσεις κλινικών δοκιμών. Επιπλέον πρόσφατα πειράματα γενετικής κατέδειξαν την CDK1 ως επαρκή (σε έλειψη των άλλων CDKs) και πιθανά αναγκαία για την ολοκλήρωση του κυτταρικού κύκλου. Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης σχεδιάσθηκε και συντέθηκε μια σειρά υποκατεστημένων πυρρολο[2,3-a]καρβαζολίων, σε μία προσπάθεια βελτίωσης των ιδιοτήτων και μελέτης των σχέσων χημικής δομής– βιολογικής δραστικότητας του 2-(αιθοξυκαρβονυλο)-9-χλωρο- πυρρολο[2,3-a]καρβαζολίου , το οποίο πρόσφατα αποδείχθηκε αναστολέας της CDK1. Συγκεκριμένα συντέθηκαν 3-ακυλαμιδο-, 3- αλκυλσουλφοναμιδο- και 3-αμινο-υποκατεστημένα πυρρολο[2,3- a]καρβαζόλια, καθώς και Ν-αλκυλ-υποκατεστημένα πυρρολο[2,3- a]καρβαζολο-2-καρβοξαμίδια. Η σύνθεση των τελικών αυτών προϊόντων στηρίχτηκε στη σύνθεση ενδιαμέσων κατάλληλα υποκατεστημένων 7-κετο- 4,5,6,7-τετραϋδροϊνδολίων, και στην ινδολοποίηση αυτών κατά Fischer με την ο-χλωρο-φαινυλυδραζίνη. Μελετήθηκε η επίδραση των 3-ακυλαμιδο-υποκατεστημένων παραγώγων στη δραστικότητα του συμπλόκου CDK1/κυκλίνη Β. Όλα τα παράγωγα προκάλεσαν σε συγκέντρωση 100 μΜ αναστολή της δραστικότητας της CDK1 σε ποσοστό από 35 έως 75%. Δραστικότερη εμφανίστηκε η ένωση 1a3. / Cyclin dependent kinases (CDKs) are a subgroup of serine/threonine kinases, whose activity depends upon binding to regulatory subunits (cyclins). CDKs have a crucial role in cell cycle progression and proliferation. Deregulation of their activity is a common feature in human tumors; hence, CDKs represent attractive targets for cancer therapy. A plethora of CDK inhibitors have been synthesized and some of them are already in late phases of clinical trials. Furthermore, recent genetic studies have indicated that CDK1 is sufficient (when in absence of other CDKs) and probably essential to drive the cell cycle. Attempting to improve the structural characteristics and study the structure–activity relationships of 9-chloro-2-(ethoxycarbonyl)- pyrrolo[2,3-a]carbazole, which has been proved as a CDK1 inhibitor, this study focused on the design and synthesis of several substituted pyrrolo[2,3-a]carbazole derivatives. Particularly, 3-acylamido-, 3- alkylsulfonamido- and 3-amino-substituted pyrrolo[2,3-a]carbazoles and N-alkyl-substituted pyrrolo[2,3-a]carbazolo-2-carboxamides comprised synthetic targets of the study. The synthesis of the final products was based on the synthesis of appropriately substituted 7-keto-4,5,6,7- tetrahydroindole intermediates which served as building blocks in Fischer indolization reactions with the o-chloro-phenylhydrazine. The effect of the 3-akylamido- substituted derivatives on the CDK1/cyclin B activity was studied. All derivatives proved to inhibit CDK1 activity, in a range of 35 to 75%. Derivative 1a3 proved the most potent inhibitor of CDK1.

Η ντοπαμινεργική νεύρωση είναι πολύ σημαντική για τις μακροχρόνιες αλλαγές της συναπτικής πλαστικότητας στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό, καθώς και για την έκφραση των πρώιμων γονιδίων που σχετίζονται με τη μνήμη και τη μάθηση. Πολλές εργασίες έχουν δείξει ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ντοπαμινεργικών και γλουταμινεργικών υποδοχέων είναι ιδιαίτερα σημαντικές για τις γνωστικές λειτουργίες του ιππόκαμπου και του προμετωπιαίου φλοιού. Προκειμένου να μελετήσουμε το μοριακό υπόβαθρο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ντοπαμινεργικών και γλουταμινεργικών υποδοχέων στο ιππόκαμπο και τον προμετωπιαίο φλοιό του επίμυος, εξετάσαμε «in vitro» την επίδραση της ενεργοποίησης των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης στο επίπεδο φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων γλουταμινικού οξέος., καθώς στην φωσφορυλίωση/ ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης (Extracellular Regulated Kinase1/2) και της DARPP-32 (Dopamine-and cyclicAMP-Regulated PhosphoProtein-32). Επιπλέον, συγκρίναμε τις αλληλεπιδράσεις των D1/NMDA/AMPA υποδοχέων που παρατηρούνται στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό με αυτές που εμφανίζονται στο ραβδωτό σώμα, στο οποίο η πυκνότητα των D1 υποδοχέων είναι η μέγιστη στον εγκέφαλο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων από τον ειδικό αγωνιστή τους SKF38393 (10 μΜ) στις τομές του ιππόκαμπου και του προμετωπιαίου φλοιού έχει ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης: α) της σερίνης-897 της NR1 υπομονάδας και της σερίνης-1303 της NR2B υπομονάδας του NMDA υποδοχέα, οι οποίες επάγουν τη διακίνηση των υποδοχέων στην μεμβρανική επιφάνεια (trafficking) και την ενίσχυση των ρευμάτων του ιοντικού διαύλου, αντίστοιχα, β) των σερινών-831 και -845 της GLUR1 υπομονάδας του AMPA υποδοχέα, οι οποίες ενισχύουν τα ρεύματα του ιοντικού διαύλου και αυξάνουν την πιθανότητα ανοίγματος του καναλιού, αντίστοιχα και γ) της ERK1/2 κινάσης, αλλά όχι της DARPP-32. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η συνενεργοποίηση των D1 και NMDA υποδοχέων με ανενεργές δόσεις των ειδικών αγωνιστών τους SKF38393 (2 μΜ) και NMDA (5 μΜ), αντίστοιχα έχει ως αποτέλεσμα μια περαιτέρω αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων, καθώς και της ERK1/2 κινάσης, αλλά όχι της DARPP-32. Οι παραπάνω επαγόμενες από την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων και την συνενεργοποίηση των D1/ NMDA υποδοχέων φωσφορυλιώσεις αναστέλλονται πλήρως από τον ειδικό αναστολέα της ενεργοποίησης της ERK1/2 κινάσης, SL327. Αντίθετα, στο ραβδωτό σώμα τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η επαγόμενη από τους D1 υποδοχείς φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων βασίζεται στο καλά περιγραμμένο σηματοδοτικό μονοπάτι D1/PKA/DARPP-32. Συμπερασματικά, τα «in vitro» πειράματα δείχνουν στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό να υφίσταται ισχυρή συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ των D1 και των NMDA υποδοχέων, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΕΡΚ1/2 κινάσης. Επιπλέον, η επαγόμενη από την διέγερση των D1 υποδοχέων και από τη συνδιέγερση των D1/ NMDA υποδοχέων φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMΡΑ υποδοχέων φαίνεται να οφείλεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι της ERK1/2 κινάσης και πιθανώς αποτελεί το μοριακό υπόβαθρο της ενίσχυσης των ρευμάτων των NMDA και AMPA υποδοχέων από την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων. Προκειμένου να διερευνήσουμε εάν αυτή η συνεργιστική αλληλεπίδραση των D1/ NMDA υποδοχέων υφίσταται και «in vivo» και να εξετάσουμε περαιτέρω τη λειτουργική της σημασία, επιλέξαμε ένα φυσικό συμπεριφορικό τεστ, την εισαγωγή των πειραματόζωων σε «πρωτόγνωρο» περιβάλλον (ελεύθερη εξερεύνηση του χώρου). Η δοκιμασία αυτή είναι γνωστό ότι επάγει την αύξηση των επιπέδων ντοπαμίνης στον ιππόκαμπο και τον προμετωπιαίο φλοιό και κατ’επέκταση επάγει την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η εισαγωγή των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον επάγει στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό: α) μια σημαντική αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και ΑΜPA υποδοχέων, καθώς και ισχυρή φωσφορυλίωση/ ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης. Τα φαινόμενα αυτά όπως δείξαμε μετά τη χορήγηση ειδικών ανταγωνιστών εξαρτώνται από τη σύγχρονη ενεργοποίηση των D1/ NMDA υποδοχέων και οφείλονται στο «νέο» ερέθισματα, δεδομένου ότι δεν εμφανίζονται μετά από δοκιμασία «εξοικείωσης» των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον, β) επιγεννετικές τροποποιήσεις (φωσφορυλίωση/ ακετυλίωση της ιστόνης Η3) και γ) αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων έκφρασης των πρώιμων γονιδίων cFos και zif268 επιλεκτικά στη CA1 περιοχή του ιπποκάμπου, φαινόμενα τα οποία εξαρτώνται από την συνενεργοποίηση των D1/ NMDA υποδοχέων, καθώς και των μουσκαρινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Συμπερασματικά τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι: α) η φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων πιθανώς δρα ως «δείκτης του πρωτόγνωρου ερεθίσματος», δεδομένου ότι δεν εμφανίζονται μετά την «εξοικείωση» των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον, β) η ισχυρή ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης που επάγεται από το «νέο» ερέθισμα απαιτεί τη συνεργιστική αλληλεπίδραση των D1/ NMDA υποδοχέων και γ) η ενεργοποίηση του μονοπατιού μεταγωγής σήματος της ERK1/2 κινάσης οδηγεί σε επιγεννετικές αλλαγές και αύξηση της έκφρασης των πρώιμων γονιδίων cFos και zif268, φαινόμενα τα οποία απαιτούνται στη ρύθμιση της συναπτικής πλαστικότητας, καθώς και στις διαδικασίες της μνήμης και της μάθησης. / Dopaminergic innervation is critical for long term changes in synaptic efficacy in hippocampus and prefrontal cortex (PFC), as well as for learning-associated immediate-early gene expression. Many studies have demonstrated that the interactions between dopamine and glutamate receptors are essential for the prefrontal cortical (PFC) and hippocampal cognitive functions. In order to understand the molecular basis of dopamine/glutamate interactions in rat PFC and hippocampus, we investigated the effect of “in vitro” dopamine D1 receptor stimulation on glutamate NMDA and AMPA receptor subunits’ phosphorylation, as well as on ERK1/2 (Extracellular Regulated Kinase1/2) and DARPP-32 (Dopamine-and cyclicAMP-Regulated PhosphoProtein-32) phosphorylation/activation. Furthermore, we compared the D1/NMDA/AMPA receptor interactions seen in PFC and hippocampus with those appearing in striatum, in which the D1 receptors’ density is the highest within the mammalian brain. Our results showed that stimulation of D1 receptor by the specific agonist SKF38393 (10μM) in PFC and hippocampal slices significantly increased the phosphorylation state of: a) NR1ser897 and NR2Bser1303 subunits of NMDA receptor, which promotes the trafficking and enhances the ionic currents, respectively, b) of GLUR1(ser831 and ser845) subunit of AMPA receptor, which enhances the receptor currents and the open probability of the receptor channel and c) of ERK1/2, but not of DARPP-32. Interestingly, co-stimulation of D1 and NMDA receptors with an ineffective dose of SKF38393(2μM) and NMDA(5μM) respectively, elevated further the phosphorylation level of NMDA and AMPA receptor subunits, as well as of ERK1/2, but not of DARPP-32. The D1- and D1/NMDA-induced phosphorylations were totally inhibited by SL327 (specific ERK1/2 inhibitor). Conversely, in striatal slices our data confirm that the D1-mediated phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits relies on D1/PKA/DARPP-32 signalling. In conclusion, in PFC and hippocampus: a) a strong synergistic interaction of D1 and NMDA receptors exists, which results in a significant ERK1/2 pathway activation, b) The D1 and the D1/NMDA receptor induced phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits seems to rely on ERK1/2 signalling and could to some extend underlie the enhancement of NMDA and AMPA receptor currents mediated by D1 receptor activation. In order to investigate whether this synergistic interaction occurs also “in vivo” and to further examine its functional significance, we exposed the rats to a novel environment (open field exploration), which is known to evoke dopamine release in hippocampus and PFC. Our results showed that the “spatial” novelty stimulus induced in rat hippocampus and PFC: a) a significant increase in phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits, as well as a robust phosphorylation/activation of ERK1/2 signalling, which are both dependent on the concomitant stimulation of D1/NMDA receptors and are both abolished by habituation, b) chromatin remodeling events (phosphorylation-acetylation of histone H3) and c) an increase in the immediate early genes cFos and zif268 expression in the CA1 region of hippocampus, which is dependent on the coactivation of D1/NMDA and muscarinic acetylcholine receptors. Our results indicate that: a) the phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits could act as a ‘novelty detector’, since it is absent after habituation, b) the robust activation of ERK1/2 signalling elicited by “spatial” novelty, demands the synergistic interaction of D1/NMDA receptors and c) the activation of ERK1/2 pathway leads to chromatin remodeling events and expression of the immediate early genes cFos and zif268, which are required for the regulation of synaptic plasticity and memory consolidation.

Τα πυρρολοκαρβαζολικά ανάλογα του ινδολοκαρβαζολικού αρωματικού σκελετού φυσικών προϊόντων είναι μία νέα τάξη ενώσεων που εξετάζονται ως πιθανά αντικαρκινικά φάρμακα. Διακρίνονται σε αναστολείς πρωτεϊνικών κινασών και σε παράγοντες που δρουν στη DNA τοποϊσομεράση Ι ή ΙΙ και βλάπτουν το DNA, ανάλογα με το μηχανισμό δράσης τους και τη δομή τους. Μελετώντας την επίδραση επτά πυρρολο[2,3-α]καρβαζολικών αναλόγων στην ενεργότητα της κυκλινο-εξαρτώμενης κινάσης 1 (cyclin dependent kinase 1, CDK1) βρήκαμε ότι μόνο ένα από τα ανάλογα (1e) ανέστειλε πλήρως και με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο το ένζυμο, ενώ όλα αναστέλλουν μερικώς ή πλήρως την ενεργότητα της τοποϊσομεράσης Ι in vitro. Στηn παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των ίδιων αναλόγων στον πολλαπλασιασμό και μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και στην αγγειογένεση in vivo, στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας. Διαπιστώθηκε ότι όλα τα ανάλογα αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro, καθώς και την αγγειογένεση in vivo, αλλά διαφέρουν ως προς την αποτελεσματικότητα ή την ισχύ. Από προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας είναι γνωστό ότι ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (PTN) επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων in vitrο, δρώντας μέσω του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης RPTPβ/ζ και της ιντεγκρίνης ανβ3. Με δεδομένο ότι στη βιβλιογραφία η CDK1 έχει αναφερθεί να συμμετέχει στην επαγόμενη από ενεργοποίηση της ανβ3 μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μελετήσαμε την επίδραση των πυρρολο[2,3-α]καρβαζολικών αναλόγων στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Μόνο το ανάλογο 1e ανέστειλε τη δράση της ΡΤΝ, τόσο στα ενδοθηλιακά, όσο και στα ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG, τα οποία εκφράζουν RPTPβ/ζ και ιντεγκρίνη ανβ3 και μεταναστεύουν ως ανταπόκριση στη διέγερση με ΡΤΝ. Ίδια δράση είχε και η ροσκοβιτίνη, γνωστός αναστολέας των CDK1/2 και CDK5 και στα δύο είδη κυττάρων, ενώ ο εκλεκτικός μόνο για CDK1/2 αναστολέας NU2058 δεν είχε καμία δράση στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων δεν εξαρτάται από τις κινάσες CDK1 και CDK2, αλλά από την κινάση CDK5, δεδομένο που επιβεβαιώθηκε με μείωση της έκφρασης της CDK5 με την τεχνική του siRNA. Η ΡΤΝ δρα επαγωγικά στην ενεργότητα της CDK5, με μέγιστη δράση 5 λεπτά μετά την επίδραση της ΡΤΝ. Σε αυτήν την ενεργοποίηση συμμετέχει και ο υποδοχέας της ΡΤΝ RPTPβ/ζ, αλλά όχι η ιντεγκρίνη ανβ3. Από παλιότερες μελέτες μας είναι δεδομένο πως η πρόσδεση της ΡΤΝ στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης c-SRC, η οποία απαιτείται για την επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Για πρώτη φορά αναφέρουμε την αλληλεπίδραση της c-SRC με την CDK5 σε εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και το ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης της κινάσης c-SRC. Τέλος, η κινάση CDK5 δεν εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης ανβ3 και των ERK1/2 από την ΡΤΝ. Συμπερασματικά, η κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 5 (CDK5) φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με αγγειογένεση και τα αποτελέσματά μας προσφέρουν σημαντικά δεδομένα προς αυτήν την κατεύθυνση. Eίναι η πρώτη φορά που περιγράφεται η έκφραση του βασικού ρυθμιστή της CDK5 p35 σε άλλο είδος κυττάρων, εκτός των νευρικών, και ιδιαίτερα στα ενδοθηλιακά. Ο εξέχων ρόλος της κινάσης CDK5 σε διάφορες λειτουργίες και σε παθολογικές καταστάσεις, αρχικά στο νευρικό και στη συνέχεια στα περισσότερα συστήματα, καθιστά ιδιαίτερα σημαντικό το σχεδιασμό και την ανάπτυξη αναλόγων που επιδρούν στην ενεργότητά της άμεσα ή έμμεσα, με βάση τη δομή του αναλόγου 1e. / Indolocarbazole alkaloids constitute a group of natural products that have attracted great attention because of their potential therapeutic applications. Ιndolopyrrolocarbazoles are a new class of antitumor drugs, which can be divided into two major groups, depending on their mechanisms of action and structural features: protein kinase inhibitors and DNA-damaging agents. We have previously evaluated the effect of 7 pyrrolo[2,3-a]carbazole analogues on CDK1/cyclinB (Cyclin Dependent Kinase 1, CDK1) activity and found that only compound1e totally inhibited the enzyme in a dose-dependent manner, while all analogues partially or totally inhibited the activity of topoisomerase I in vitro, with compound 1e being the least effective. In this thesis, the effect of all the pyrrolo[2,3-a]carbazole analogues on angiogenesis was investigated, using the in vivo model of the chick embryo chorioallantoic membrane, as well as proliferation and migration of human endothelial cells in vitro. All the analogues had an effect on the proliferation and migration of endothelial cells in vitro and angiogenesis in vivo, but with differences in their effectiveness or potency. We have previously shown that PTN induces migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and ανβ3 integrin. The recent report that ανβ3 expression up-regulates CDK1, which then modulates cell migration, led us to test the effect of the CDK1 inhibitor compound 1e and the other pyrrolo[2,3a]carbazole analogues on the PTN induced migration of human endothelial cells. Only compound 1e inhibited PTN induced migration of human endothelial cells, a result also confirmed in human glioblastoma U87MG cells, which are known to express both RPTPβ/ζ and ανβ3 and migrate in response to PTN. Roscovitine, a synthetic inhibitor of CDKs with selectivity towards CDK1/2 and CDK5, completely attenuated PTN-induced migration of endothelial cells, while the CDK1/2 selective inhibitor NU2058 had no effect, suggesting that inhibition of CDK5 is responsible for inhibition of PTN-induced cell migration. The complete attenuation of PTN-induced migration of endothelial cells following the down-regulation of CDK5 by siRNA further confirmed that CDK5 plays an important role in PTN-induced migration of endothelial cells. PTN increased CDK5 kinase activity with the maximum increase observed within 5 min after stimulation of cells with PTN. This was confirmed by both direct kinase assays, as well as by measuring interaction of CDK5 with its activator protein p35. PTN-induced activation of CDK5 is independent of ανβ3, but depends on RPTPβ/ζ and its downstream activated c-SRC kinase. This is the first time that an interaction between CDK5 and c-SRC is reported in extracts of endothelial cells, as well as the fact that PTN induced CDK5 activation requires c-SRC activation in these cells. Finally, we report no immediate effect of kinase CDK5 on PTN induced activation of ανβ3 integrin and ERK1/2 phosphorylation. Accumulating data favour the notion that CDK5 plays an important role in angiogenesis-related functions of endothelial cells and our data reinforce this observation. The expression of p35 in endothelial cells, the prime regulator of CDK5, is reported here for the first time in other type of cells apart from neuronal. The basic role of CDK5 in several pathologies point out the importance of research and development of compounds that can be effective in inhibiting this kinase, based on the structure of analogue 1e.

Πολλές παθήσεις του καρδιαγγειακού συστήματος σχετίζονται με την λειτουργία του ενζύμου της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης (soluble guanylate cyclase, sGC). Η sGC εμπλέκεται στο μονοπάτι ΝΟ-sGC-cGMP το οποίο ενεργοποιείται από το βιολογικά διαθέσιμο μονοξείδιο του αζώτου (nitric oxide, ΝΟ). Πολλές παθολογικές καταστάσεις αντιμετωπίστηκαν για πάνω από 140 χρόνια με τη χρήση φαρμάκων που παρέχουν NO (ΝΟ-φάρμακα), χωρίς ωστόσο να είναι γνωστός ο μηχανισμός δράσης τους. Αν και τα φάρμακα αυτά συνεισέφεραν στη βελτίωση των παθολογικών καταστάσεων, ωστόσο παρουσίαζαν σημαντικά μειονεκτήματα. Για την αντιμετώπιση αυτών, το ενδιαφέρον στράφηκε στον σχεδιασμό και την σύνθεση ενώσεων των οποίων η δράση θα ήταν ανεξάρτητη από το ΝΟ. Μεταξύ αυτών, τα παράγωγα BAY 58-2667 και η HMR 1766 αποδείχθηκαν ενεργοποιητές της sGC. Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, σχεδιάσθηκαν και συντέθηκαν έξι νέα βενζοφουρανικά ανάλογα του HMR-1766, σε μία προσπάθεια ανακάλυψης νέων ενώσεων, ενεργοποιητών της sGC με ενισχυμένη δραστικότητα και εκλεκτικότητα δράσης. Η προσέγγιση που ακολουθήθηκε για την σύνθεση των τελικών προϊόντων περιελάμβανε την ανοικοδόμηση του βενζοφουρανικού δακτυλίου από υποκατεστημένα παράγωγα σαλικυλικού οξέος και την μετέπειτα σύζευξη αυτού με κατάλληλους δομικούς λίθους για τον σχηματισμό μίας σουλφοναμιδικής και μίας αμιδικής πλευρικής αλυσίδας. Στα πλαίσια της μελέτης, διερευνήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν όλα τα συνθετικά στάδια για την παραλαβή των ενδιάμεσων και των τελικών προϊόντων. Η μελλοντική αποτίμηση της βιολογικής δράσης των νέων ενώσεων αναμένεται να διευκρινίσει αν οι ενώσεις αυτές είναι ικανές να δράσουν ως ενεργοποιητές της sGC, αλλά και αν μπορούν να αποτελέσουν χρήσιμα χημικά εργαλεία για την διευκρίνιση δομικών πληροφοριών του ενζύμου. Το δεύτερο τμήμα της παρούσας εργασίας, αφορά στον σχεδιασμό και την σύνθεση νέων αναλόγων του φυσικού προιόντος Hymenialdesine (HMD). Η HMD είναι ένα φυσικό προϊόν το οποίο έχει αποδειχθεί αναστολέας πολλών πρωτεϊνικών κινασών, όπως των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (CDKs), η υπερλειτουργία των CDKs ενέχεται στην εμφάνιση παθολογικών καταστάσεων (καρκίνος, νευροεκφυλιστικές παθήσεις, διαβήτης). Στόχος της μελέτης ήταν ο σχεδιασμός και η διερεύνηση της σύνθεσης νέων σπειρανικών ινδολοαζεπινικών αναλόγων της HMD, με ενισχυμένη ανασταλτική και εκλεκτική δράση έναντι των CDKs. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκε η μετατροπή της 5-κετονομάδας της αζεπινο[3,4-b]ινδολο-1,5-διόνης σε ένα αμινο-υποκατεστημένο στερεογονικό κέντρο μέσω νουκλεόφιλης προσβολής της πρόδρομης χειρόμορφης t-βουτυλοσουλφινυλ-ιμίνης. Διερευνήθηκαν ποικίλες πειραματικές συνθήκες για τη βελτιστοποίηση σχηματισμού τόσο της ενδιάμεσης σουλφινυλ-ιμίνης, όσο και της υποκατάστασης αυτής. Τα συνθετικά αυτά στάδια θεωρούνται κρίσιμα και η βελτιστοποίηση τους απαραίτητη για την ομαλή εξέλιξη του συνθετικού σχήματος. Τα αποτελέσματα που καταγράφηκαν στα πλαίσια της μελέτης αναμένεται να συμβάλλουν ουσιαστικά στην επιτυχή ολοκλήρωση της σύνθεσης των νέων σπειρανικών αναλόγων της HMD. / Many cardiovascular diseases are connected with the activity of soluble guanylate cyclase (sGC). sGC is part of the NO-sGC-cGMP pathway, which is activated by the biologically available nitric oxide (NO). Many drugs that release NO (NO-drugs) have been used for more than 140 years. Although these drugs have contributed to the treatment of these diseases, they have presented some disadvantages. Thus, new compounds have been discovered whose activity is independent of NO. Compounds BAY 58-2667 and HMR-1766 belong to this new class of compounds and are characterized as sGC activators. In the first part of this study, six new benzofuran derivatives of HMR-1766 were designed and synthesized, aiming at the discovery of new compounds, activators of sGC with enhanced activity and selectivity against sGC. The synthetic approach involves the initial formation of benzofuran ring from substituted derivatives of salicylic acid and its coupling with selected building blocks. The optimazation of all synthetic steps for the synthesis of the intermediate and final products was also part of this study. The biological evaluation of the new compounds is expected to reveal their biological activity as sGC activators and/or their role as chemical tools for the structural elucidation of the enzyme. The second part of this study, concerns the design and synthesis of new derivatives of Hymenialdesine (HMD). HMD is a natural product with inhibitory activity against many protein kinases, such as cyclin-dependent kinases (CDKs). Hypeactivation of CDKs is implicated in pathological disorders such as cancer, neurodegenerative diseases and diabetes. The aim of the study was the synthesis of new spiro-indolazepino derivatives of HMD with potential enhanced inhibitory activity and selectivity against CDKs. The transformation of the 5-ketogroup of the azepino[3,4-b]indol-1,5-dione to a new amino-substituted stereogenic center by nucleophilic attack of the intermediate chiral tert-sulfinylimine was the key-step of the synthetic approach. The results of this study are expected to contribute substantially to the synthesis of new spiro HMD derivatives.