Το γλοιοβλάστωμα αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους τύπους καρκίνου για τον άνθρωπο δεδομένου ότι ο μέσος όρος επιβίωσης είναι 12-15 μήνες. Η συμβατική θεραπεία με τα κλασσικά χημειοθεραπευτικά σχήματα δεν έχει αποδώσει ιδιαιτέρως θετικά αποτελέσματα. Η εξέλιξη της μοριακής βιολογίας έχει «ρίξει φως» στην διερεύνηση και κατανόηση αρκετών μηχανισμών της κυτταρικής λειτουργίας που αφορούν τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων. Στο γλοιοβλάστωμα έχει παρατηρηθεί αυξημένη δραστηριότητα πολλών υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην επιφάνεια των κυττάρων όπως ο EGFR, ο PDGFR και ο VEGFR. Ταυτόχρονα, υπάρχουν και άλλα μόρια επιφανείας με ιδιαίτερο ενδιαφέρον όπως οι ιντεγκρίνες λόγω της ιδιότητας τους να καθορίζουν τη μετανάστευση. Στη νέα εποχή των αναστολέων κινάσης τυροσίνης οι οποίοι δρουν έναντι των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων και θεωρούνται πολλά υποσχόμενα μικρά μόρια, πρέπει να διερευνηθεί αν μπορούν να έχουν θέση στην αντιμετώπιση του γλοιοβλαστώματος. Αρχικά έγινε εκτίμηση της επίδρασης των αναστολέων sunitinib και lapatinib ξεχωριστά αλλά και σε συνδυασμό, στο πολλαπλασιασμό και στο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων γλοιβλαστώματος U87 και M059K σε συγκεντρώσεις 0,01, 0,1, 1 και 10μΜ. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 διμεθυλθειαζόλο βρωμιδίου και το ολοκληρωμένο σύστημα ανίχνευσης αννεξίνης V/προπιδίου (annexin V/propidium iodide), αντίστοιχα. Για τη διαδικασία της μετανάστευσης εφαρμόστηκε η μέθοδος μελέτης του χημειοτακτισμού. Η έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών MM-2 και MMP-9 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο του ζυμογραφήματος. Περαιτέρω έγινε διερεύνηση της πιθανής εμπλοκής των φαρμάκων στο σχηματισμό συμπλόκων EGFR-υπομονάδα β1 ιντεγκρινών, PDGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών και VEGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών. Η μελέτη της δημιουργίας των συμπλόκων των β υπομονάδων των ιντεγκρινών με τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης και της ανάλυσης κατά Western. Τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν και με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Με την ίδια μέθοδο μελετήθηκε και η επίδραση των φαρμάκων στη φωσφορυλιωμένη μορφή της FAK. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι και οι δύο αναστολείς sunitinib και lapatinib, μείωσαν τον πολλαπλασιασμό με δοσοεξαρτώμενο τρόπο 48 ώρες μετά την προσθήκη τους στα κύτταρα είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Τα αποτελέσματα της αναστολής του πολλαπλασιασμού συμβάδιζαν με τα αποτελέσματα της απόπτωσης όπου το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε. Περαιτέρω η μετανάστευση των κυττάρων εμφανίστηκε μειωμένη μετά την προσθήκη των φαρμάκων είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Η έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών MMP-2 και MMP-9 δεν επηρεάστηκε στα κύτταρα U87 μετά την προσθήκη και των 2 φαρμάκων. Αντίθετα, στα κύτταρα M059K το sunitinib αλλά και ο συνδυασμός του με το lapatinib ελαττώσαν την έκφραση των MMPs 48 ώρες μετά τη προσθήκη τους στο θρεπτικό μέσο. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι το lapatinib μπορεί να αναστείλει την δημιουργία συμπλόκου του EGFR με την υπομονάδα β1 των ιντεγκρινών, έως και 30 λεπτά μετά την προσθήκη του φαρμάκου στα κύτταρα. Αντίστοιχα το sunitinib μπορεί να αναστέλλει το σχηματισμό συμπλόκου της υπομονάδας β3 των ιντεγκρινών με τον VEGFR εντός δύο ωρών από την προσθήκη των φαρμάκων, χωρίς επίδραση όμως στον σχηματισμό των συμπλόκων PDGFR – υπομονάδα β3 ιντεγκρίνης. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με την χρήση ανοσοφθορισμού. Συνοψίζοντας, οι δύο αναστολείς κινάσης τυροσίνης, sunitinib και lapatinib κατάφεραν να επιδείξουν αξιόλογα αποτελέσματα στις παραμέτρους του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Τα αποτελέσματα της έρευνας είναι πρωτοποριακά διότι, αναφορικά με την μετανάστευση στο γλοίωμα, αυτή φαίνεται να αναστέλλεται αποτελεσματικότερα με τον συνδυασμό των δύο φαρμάκων πιθανά μέσω του μηχανισμού διαταραχής της δημιουργίας του συμπλόκου ιντεγκρίνης- υποδοχέας αυξητικού παράγοντα. / Glioblastoma is considered to be one of the most fatal among the malignancies in human with median survival between 12-15 months. The conventional chemotherapy cannot change the fate of these patients. Recent advances in molecular biology have shed light in the various mechanisms recruited by malignant cells in order to proliferate, metastasize and escape apoptosis. Studies in glioblastoma have already shown up-regulation in the function of tyrosine kinase receptors such as EGFR, PDGFR and VEGFR. Besides this, in the more recent years, research supports the significant role of integrins in the migration process of glioblastoma cells. In the new era of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), where their main mechanism of action is by blocking various growth factor receptors, it has to be determined a possible contribution in the fight against glioblastoma. Initially, it was estimated a possible effect of sunitinib and lapatinib applied either alone or in combination, on U87 and M059K glioma cells’ proliferation and apoptosis using doses of 0,01 μM, 0,1 μM, 1μM and 10 μM. The proliferation was estimated using the 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 dimethyltetrazolium bromide assay and apoptosis using annexin V/propidium iodide detection assay. Migration assay was performed using Boyden chamber assay. The release of MMP-2 and MMP-9 into the culture medium of U87 and M059K cells was measured by zymography. Furthermore, a possible implication of the tested agents in the formation of EGFR-integrin β1 complex, VEGFR-integrin β3 and PDGFR-integrin β3 complexes formation was studied. Immunoprecipitation and western blot analysis were used for studying the complex formation of EGFR, PDGFR and VEGFR with integrins. Validation of the results was made using immunofluorescence assay. Also, similar experiments were performed for the effect of sunitinib and lapatinib in FAK phosphorylation. The results showed that both tested agents decreased cell proliferation in a dose-dependent manner 48 h after their application in both cell lines either alone or in combination. The results in cell proliferation were in line with the increase in apoptotic cells after their treatment with the tested agents. Furthermore, the ability of U87 and M059K cells to migrate was inhibited either by each agent alone or in combination. Both agents did not affect MMP-2 and MMP-9 levels in U87 cells, however, MMPs levels were decreased in M059K cells, 48h after their treatment with sunitinib either alone or in combination with lapatinib. Additionally, a time course study for the effect of lapatinib on EGFR-integrin β1 complex revealed an inhibition in complex formation up to 30 min after agent application. Likewise, sunitinib inhibited complex formation of VEGFR-integrin β3 complex within 2h after its application without affecting PDGFR-integrin β3 complex. The previously-described interruption of complexes formation was confirmed with an immunofluorescence assay. Summarizing the results, sunitinib and lapatinib exerted significant effects on glioblastoma cell proliferation, apoptosis and migration. The preliminary results of the current study are the first to support the implication of a dual anti-EGFR/HER-2 agent, lapatinib and a multi-targeted agent, sunitinib in glioma cells migration, through a mechanism implying interruption of growth factor receptor - integrin complexes formation.

Η εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια της νεφρικής λειτουργίας και εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης που οδηγεί σε γενικευμένη ίνωση του νεφρικού ιστού. Στους μηχανισμούς που ενοχοποιούνται για την εξέλιξη της βλάβης αυτής προς ίνωση συμμετέχουν κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες που προέρχονται από ενδοθηλιακά, επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα και κύτταρα του διάμεσου νεφρικού ιστού. Η ίνωση του διάμεσου νεφρικού χώρου είναι μία κοινή διαδικασία που χαρακτηρίζεται από την de novo ενεργοποίηση μυοϊνοβλαστών με αποτέλεσμα την αυξημένη εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης. Τα επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα είναι πηγή προέλευσης των ενεργοποιημένων μυοϊνοβλαστών μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάπτωση. Διάφοροι μεσολαβητές της νεφρικής βλάβης όπως είναι και η κυκλοσπορίνη ερχόμενοι σε επαφή με κύτταρα του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου οδηγούν σε ενεργοποίηση προϊνωτικών παραγόντων εκκρίνοντας εξωκυττάρια ύλη. Μεταξύ αυτών των μεσολαβητών της νεφρικής βλάβης, ιδιαίτερο ρόλο φαίνεται ότι διαδραματίζουν το νιτρικό οξείδιο και η ενδοθηλίνη, δύο παράγοντες που μετέχουν σε φυσιολογικές, αλλά και παθοφυσιολογικές κυτταρικές διαδικασίες. Τα συστήματα νιτρικού οξειδίου και ενδοθηλίνης αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σε επίπεδο υποδοχέων στο κυτταρικό επίπεδο προκαλώντας αλλαγές του αγγειακού τόνου και ενεργοποίηση ή αναστολή προϊνωτικών σημάτων. Ο σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης των συστημάτων νιτρικού οξειδίου και ενδοθηλίνης σε σωληναριακά νεφρικά κύτταρα κάτω από την επίδραση της κυκλοσπορίνης. Χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινες κυτταροκαλλιέργειες νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου (ΗΚ-2) τα οποία επωάσθηκαν σε θεραπευτικές και τοξικές συγκεντρώσεις κυκλοσπορίνης (CsA) και ακολούθησε η ανίχνευση του νιτρικού οξειδίου (NO), της ενδοθηλιακής και επαγώγιμης συνθετάσης του ΝΟ (e-NOS, i-NOS) και της ενδοθηλίνης-1 (ET-1) με τους Α και Β υποδοχείς της (ΕΤ-Α, ΕΤ-Β). Το ΝΟ μετρήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Griess, ενώ η συσσώρευση της ενδοθηλίνης και των Α και Β υποδοχέων της καθώς και οι συνθετάσες του ΝΟ ανιχνεύθηκαν τόσο σε επίπεδο μεταγράφου (m-RNA) χρησιμοποιώντας RT-PCR, όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης με Western Blot ανάλυση. Πειράματα πραγματοποιήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα στο επωαστικό μέσο εκτός από κυκλοσπορίνη και ειδικούς αναστολείς του ΝΟ (L-NAME) και των υποδοχέων της ενδοθηλίνης (BQ123, BQ 788), ενώ ακολούθησε η ανίχνευση των συνθετασών του ΝΟ και των υποδοχέων της ενδοθηλίνης αντίστοιχα. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν προκύπτει ότι η κυκλοσπορίνη ασκεί τοξική δράση σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και επάγει τη συσσώρευση της ΕΤ-1,του ΝΟ, των συνθετασών του ΝΟ και των Α και Β υποδοχέων της ΕΤ-1. Η επαγωγή του ΕΤ-Α υποδοχέα είναι ανεξάρτητη από την παρουσία ή μη ΝΟ, σε αντίθεση με τον ΕΤ-Β υποδοχέα η επαγωγή του οποίου καταστέλλεται πλήρως όταν αναστέλλεται το σύστημα του νιτρικού οξειδίου (L-NAME). Η επαγωγή της e-NOS από την κυκλοσπορίνη είναι απόλυτα εξαρτώμενη από το σύστημα της ΕΤ-1, σε αντίθεση με την i-NOS η οποία επάγεται σε σημαντικό βαθμό ακόμη και όταν το σύστημα ενδοθηλίνης αδρανοποιείται πλήρως με ειδικούς αναστολείς (BQ123 και BQ788). / The progression of renal fibrosis is characterized by loss of kidney function and deposition of extracellular matrix components. The mechanism implicated in the development of renal fibrosis involves cytokines and growth factors originating from endothelial, tubular epithelial and interstitial cells. Activated myofibloblasts derive from differentiated tubular epithelial cells trough a process called epithelial to mesenchymal transition. Various kidney injury mediators like cyclosporine-A (CsA) are entering the luminal space of the tubules causing activation of profibrotic factors such as nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1). A cross talk exists between endothelin and NO systems in the regulation of vascular tone and inflammatory process. Aim of this study was to investigate the effect of cyclosporine-A on the expression of Nitric Oxide and endothelin-1 on cultured renal tubular cells. Human tubular epithelial cells (HK-2) were cultured in the presence of CsA at various concentrations (0 -1,000 ng/ml). RT-PCR was used to determine NO synthases (eNOS, iNOS) and endothelin receptors (ETR-A, ETR-B) and Western Blot analysis for the subsequent proteins. Similar experiments were also carried out using specific NO (L-NAME) and endothelin receptor (BQ123, BQ 788) inhibitors. At therapeutic concentrations, CsA exerts a significant cytotoxic effect on tubular epithelial cells. A dose dependent activation of NO synthases eNOS and iNOS and endothelin receptors ET-A and ETR-B was observed, even at therapeutic concentrations of CsA. An interaction between NO and ET-1 systems under the influence of CsA was also observed, since blockage of NO production was followed by down-regulation of ET-B while blocking of endothelin pathway with ET receptor antagonists, was followed by down-regulation of eNOS expression.

Οι μεταγραφικοί παράγοντες COUP-TF (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor) ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων στεροειδών/ θυρεοειδών ορμονών και θεωρούνται “ορφανοί”, αφού μέχρι στιγμής δεν έχει βρεθεί το υπεύθυνο πρόσδεμα για την ενεργοποίηση τους. Πειραματικές διαδικασίες στο εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι στο πρωτογενές μετάγραφο των COUP-TFs συμβαίνει εναλλακτικό μάτισμα που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δύο mRNAs που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες οι οποίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επίπρόσθετων αμινοξέων στην καρβοξυτελική περιοχή (Carboxy Terminal Extension) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Πειράματα EMSA με τη χρήση in vitro μεταφρασμένων πρωτεϊνών, αποκάλυψαν ότι η μεγάλη πρωτεΐνη δεν μπορεί να προσδεθεί σε κανένα COUP-TF στοιχείο απόκρισης. Επίσης παρατηρήθηκε ότι παρουσία της μεγάλης πρωτεΐνης, η ικανότητα της μικρής πρωτεΐνης να προσδένεται στο DNA μειώνεται με ανταγωνιστικό τρόπο, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι το ετεροδιμερές πρωτεϊνικό σύμπλοκο δεν μπορεί να προσδεθεί στο DNA. Σκοπός μας είναι να ερευνήσουμε το ρόλο της ένθεσης των 21 αμινοξέων στην μεγάλη πρωτεΐνη, ως προς την ικανότητα πρόσδεσης της στο DNA. Στον αχινό Paracentrotus lividus, η αμινοξική ένθεση στην καρβοξυτελική περιοχή (CTE) της μεγάλης πρωτεΐνης περιέχει δύο προλίνες. Η υπόθεση μας είναι ότι αυτές οι δύο προλίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην στερεοδιαμόρφωση της πρωτεΐνης, επηρεάζοντας την ικανότητα πρόσδεσης στο DNA. Για να ελέγξουμε την υπόθεση αυτή, προκαλέσαμε σημειακές μεταλλάξεις, μεταλλάσσοντας συγχρόνως τις δύο προλίνες σε αλανίνες αλλά κάθε μία προλίνη σε αλανίνη μεμονωμένα, καθώς επίσης μελετήσαμε και μια σειρά εσωτερικών αμινοξικών ελλειμάτων μέσα στην ένθεση των 21 αμινοξέων στην καρβοξυτελική περιοχή. Το σύνολο των μεταλλάξεων έδειξε ότι οι μεταλλαγμένες μεγάλες πρωτεΐνες δεν προσδένονται στο DNA καθώς επίσης ότι οι μεταλλαγμένες μεγάλες πρωτεΐνες ετεροδιμερίζονται πιο αποτελεσματικά με την μικρή ισομορφή πιθανότατα λόγω επαγόμενης αλλαγής της στερεοδιαμόρφωσης της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Επίσης μελετήσαμε την εξάπλωση του εναλλακτικού ματίσματός στα Δευτεροστόμια, χρησιμοποιώντας ειδικούς εκφυλισμένους εκκινητές σε πειράματα PCR. Εναλλακτικό μάτισμα των μεταγράφων COUP-TF παρατηρήθηκε επίσης στους οργανισμούς Sphaerechinus granularis (Εχινόδερμο) και Saccoglossus kowalevskii (Ημιχορδωτό). / COUP-TFs (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter- Transcription Factors) belong to the superfamily of steroid/thyroid hormone receptors and they are consider orphans since the proper ligand that activates them is not yet found. Experimental procedures in our laboratory have shown that in Echinoderms the alternative splicing of the COUP-TF primary transcript results in two mRNAs which encode two protein variants that differ by a 21 amino acid insertion in the Carboxy Terminal Extension (CTE) of the DNA Binding Domain (DBD). EMSA experiments with the use of in vitro translated proteins revealed that the large protein variant is incapable of binding any COUP-TF response elements. Furthermore, in the presence of the large variant, the small COUP-TF protein ability to bind DNA is diminished in an antagonistic way, suggesting that the heterodimeric protein is also incapable of DNA binding. Our aim is to investigate the role of the 21aa insertion in the large variant regarding the DNA binding affinity. In sea urchins the CTE insertion in the large variant contains two prolines. Our hypothesis is that these two prolines play an important role in the protein‟s conformation which in turn is responsible for the loss of DNA binding. To check this, we created point mutations by mutating both prolines to alanines simultaneously and then each proline to alanine separately. We also analyzed a series of internal amino acid deletions within the 21aa insertion of the CTE. All the mutations proved that the large mutated proteins are incapable of binding DNA and that they heterodimerize more effectively with the small protein variant possibly because of the changed conformation of the large protein variant. We also studied the alternative splicing among Deuterostomes, by using degenerate primers in PCR experiments. We observed that alternative splicing of COUP-TF transcripts occurs in the sea urchin Sphaerechinus granularis and in the hemichordate Saccoglossus kowalevskii.