Οι φυλετικές ορμόνες επηρεάζουν τη βιολογική συμπεριφορά του μελανώματος. Μετά την ανακάλυψη των οιστρογονικών υποδοχέων (ER) και ιδίως του υποδοχέα βήτα, η άποψη πως τα μελανώματα εκφράζουν χαμηλές συγκεντρώσεις ER αναθεωρήθηκε. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το βαθμό έκφρασης των ER στο πρωτοπαθές μελάνωμα αλλά και στο λεμφαδένα φρουρό αυτού που παριστά ένα σημαντικό σταθμό στη μεταστατική διαδικασία και να εκτιμήσει πιθανή συσχέτιση με την πρόγνωση και τη συνολική επιβίωση. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση δεδομένων 60 ασθενών, μέσης ηλικίας 54,4 ± 14,5 ετών, με διάγνωση μελανώματος κατά την περίοδο 2001-2012. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε βιοψία λεμφαδένα φρουρού, μετά την αναγνώρισή του με ραδιοϊσοτοπική λεμφαγγειογραφία. Εάν η ιστοπαθολογική εξέταση αναδείκνυε διήθηση του λεμφαδένα από το νεόπλασμα, διενεργείτο συμπληρωματικός λεμφαδενικός καθαρισμός, σε δεύτερο χρόνο. Με ανοσοϊστοχημική μέθοδο εκτιμήθηκε η έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων (ERα και ERβ) σε όλες τις δυνατές περιπτώσεις. Η έκφραση του ERα ήταν εξαιρετικά ασθενής, αναδεικνύοντας τον ERβ σαν τον επικρατούντα οιστρογονικό υποδοχέα, τόσο στον πρωτοπαθή όγκο, όσο και στο λεμφαδένα φρουρό. H εντονότερη ανοσοέκφραση του ERβ καταδείχθηκε σε λεπτά, λιγότερο διηθητικά μελανώματα με αρνητικούς λεμφαδένες φρουρούς. Επιπρόσθετα, η έκφραση του ERβ στον πρωτοπαθή όγκο σχετιζόταν σαφώς με το κυτταρικό μικροπεριβάλλον του, πιθανά επηρεάζοντας τη λεμφογενή διασπορά. Τα επίπεδα έκφρασης του ERβ είναι ελαττωμένα σταθερά σε επιθετικά μελανώματα, μεγάλου πάχους με μεταστατική νόσο στο λεμφαδένα φρουρό. Η αξιολόγησή τους υποδεικνύει έναν πιθανό δείκτη του μεταστατικού δυναμικού των μελανωμάτων και κατ’ επέκταση της πρόγνωσης της νόσου. / Steroid hormones seem to affect the biological behavior of melanoma. Prior to the discovery of estrogen receptor beta (ERb), melanomas were considered to contain low estrogen receptor concentrations. Furthermore, no studies have examined the role of estrogen receptor expression in sentinel lymph nodes (SLNs) of melanomas. The purpose of this study was to investigate the immunoexpression of estrogen receptors in malignant melanomas and SLNs and to examine any possible association with prognosis and overall survival. A retrospective analysis of prospectively collected data was conducted during a 12-year period (2001-2012). Sixty patients with mean age of 54.4 ± 14.5 years old diagnosed with melanomas after excision biopsy of pre-existing melanocytic lesions, were included in the study. All patients underwent wide excision of the primary tumor and SLN identification. Therapeutic lymph node dissection was conducted in cases where the final pathological report was indicative of SLN tumor invasion. Determination of estrogen receptor alpha (ERa) and beta (ERb) status by immunohistochemistry on tumor and nodal paraffin blocks was performed in all feasible cases. ERb but not ERa was the predominant estrogen receptor found in all primary tumors and SLNs examined. The most intense ERb immunostaining was seen in negative SLNs associated with thinner, less invading melanomas. ERb expression in the primary tumor seems to correlate with the cellular microenvironment, possibly altering the process of SLN invasion. ERb expression is down-regulated in aggressive melanomas with sentinel nodal disease, suggesting its possible usefulness as a surrogate marker for metastatic potential and prognosis in malignant melanoma.

Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης αποτελεί την 4η κατά συχνότητα μορφή καρκίνου στους άνδρες στο Δυτικό κόσμο, ακολουθώντας τον καρκίνο του προστάτη, του πνεύμονα και του κόλου. Η επιφανειακή μορφή του καρκίνου της κύστεως έχει το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των πολύ συχνών υποτροπών, οι οποίες ευθύνονται για τη μεγάλη νοσηρότητα της νόσου. Οι πολύ συχνές υποτροπές έχουν, όπως εύκολα γίνεται αντιληπτό, τεράστιο κοινωνικοοικονομικό κόστος, εφ’ όσον ένα σημαντικό τμήμα των πασχόντων αποτελεί μέρος του οικονομικά ενεργού πληθυσμού. Η καρκινογένεση δεν είναι μια απλή διαδικασία, αλλά μια αλληλουχία αλλαγών οι οποίες αφορούν τους κυτταρικούς μηχανισμούς αύξησης, διαφοροποίησης και απόπτωσης και οδηγούν στη μετατροπή ενός φυσιολογικού κυττάρου σε νεοπλασματικό. Ως «Χημειοπρόληψη» ορίζεται η χρήση ειδικών φυσικών ή συνθετικών χημικών ουσιών που μπορούν να παρέμβουν σε κάποια από τα μοριακά αυτά γεγονότα και να προλάβουν, καταστείλουν ή αναστρέψουν, την εξέλιξη προκαρκινικών βλαβών σε διηθητικό καρκίνο. Η διαφορά στην επίπτωση του νεοπλάσματος και τα διαφορετικά κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως ανάμεσα στα δύο φύλα, υποδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο των ορμονών του φύλου στην παθογένεια του νεοπλάσματος. Υποθέσεις μόνο γίνονται για τη σημασία των οιστρογόνων στην ανάπτυξη καρκίνου της ουροδόχου κύστεως, αφού ακόμα ο ρόλος τους δεν έχει αποσαφηνιστεί. Τα οιστρογόνα ασκούν τη δράση τους μέσω των υποδοχέων τους (ERα, ERβ) οι οποίοι αποτελούν μέλη μιας υπεροικογένειας μεταγραφικών παραγόντων, των πυρηνικών υποδοχέων. Οι πυρηνικοί υποδοχείς ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μέσω θετικής ή αρνητικής παρεμβάσεως στη δράση άλλων μεταγραφικών παραγόντων, όπως του NFκB, με τη βοήθεια ενός μηχανισμού που ονομάζεται cross-talk. Αν και η φλεγμονή με την καρκινογένεση έχουν αναγνωρισμένη σχέση από παλιά, συνδέθηκαν άμεσα με την παρατήρηση ότι υπερέκφραση του γονιδίου για το ένζυμο κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2), αποτελεί πρώιμο γεγονός της καρκινογένεσης (Greten et al, 2004). Η COX-2, όπως επίσης και ο μεταγραφικός παράγοντας NFκB, που σχετίζεται με τη φλεγμονή, έχει διαπιστωθεί ότι συμμετέχουν στις διαδικασίες της καρκινογένεσης.. Η σύνδεση των οιστρογόνων στους οιστρογόνικους υποδοχείς επάγει τη δέσμευση συν-ρυθμιστικών παραγόντων, οι οποίοι διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες τους συν-ενεργοποιητές (coactivators), όπως p300 και τους συν-καταστολείς (corepressors), όπως NCoR. Κατά την παρούσα εργασία μελετήθηκε η μεμονωμένη όσο και η συνδυαστική έκφραση των πέντε παραπάνω μορίων στο φυσιολογικό επιθήλιο και στα καρκινώματα διαφόρων Grade, σε ιστικά δείγματα από 140 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε διαγνωστική βιοψία διουρηθρική εκτομή νεοπλάσματος κύστεως ή ριζική κυστεκομή. Η μέθοδος που εφαρμόστηκε ήταν η ανοϊστοχημεία σε τομές παραφίνης, η οποία λόγω του μορφολογικού της χαρακτήρα επέτρεψε τη λήψη δεδομένων για τη σχετική εντόπιση των μορίων στους ενδοκυττάριους χώρους, τις ενδοεπιθηλιακές στιβάδες, τις φυσιολογικές ή παθολογικές ιστολογικές βαθμίδες και το επιθηλιακό ή μεσεγχυματικό διαμέρισμα. Ο παράγοντας NFκB (υπομονάδα p65) εμφάνισε μεικτή υποκυττάρια εντόπιση. Στην παρούσα ανοσοϊστοχημική μελέτη το επίπεδο της έκφρασης του NFκB στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων παρουσίαζε μια στατιστικά σημαντική συνολική αύξηση στα τρία επίπεδα διαφοροποίησης των καρκινωμάτων. Τα καρκινώματα χαμηλής διαφοροποίησης παρουσίαζαν ισχυρότερη ανοσοθετικότητα του NFκB από τα μετρίας και καλής διαφοροποίησης. Η αύξηση της πυρηνικής εντόπισης του NFκB συνδυάζεται με ταυτόχρονη ελάττωση της κυτταροπλασματικής, γεγονός που επιβεβαιώνει τη βιολογική δράση του. Ο πυρηνικός υποδοχέας ERβ, που εντοπίζεται στο πυρήνα των καλώς διαφοροποιημένων καρκινικών κυττάρων, είναι στατιστικά σημαντικά αυξημένος σε σχέση με λιγότερο διαφοροποιημένα νεοπλασματικά κύτταρα. Στην παρούσα ανοσοϊστοχημική μελέτη τα κύτταρα του φυσιολογικού επιθηλίου της ουροδόχου κύστης, εκφράζουν έντονα τον πυρηνικό υποδοχέα και κατά την πρόοδο της καρκινογένεσης η έκφραση του ελαττώνεται, παράλληλα με την απώλεια της διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων. Στην εξέλιξη της καρκινογένεσης, η COX-2 επάγεται σταθερά, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, με διαδοχικές αυξήσεις που συνοδεύουν όλα τα στάδια της προοδευτικής αποδιαφοροποίησης των κυττάρων. Η πυρηνική έκφραση του p300 αυξάνεται σταδιακά καθώς τα καρκινώματα αποκτούν χαρακτήρες αποδιαφοροποίησης, συσχέτιση στατιστικώς σημαντική. Η πυρηνική έκφραση του NCoR ελαττώνεται σταδιακά καθώς τα καρκινώματα αποκτούν χαρακτήρες αποδιαφοροποίησης, συσχέτιση στατιστικώς σημαντική, σύμφωνα με τα ευρήματα της παρούσας μελέτης. Στις υπόλοιπες συσχετίσεις μελετήθηκε η συν-έκφραση πλέον των παραγόντων σε κάθε ασθενή, με σκοπό την εξαγωγή συμπερασμάτων για ενδεχόμενη αλληλεπίδραση τους. Αναλυτικότερα, παρατηρήθηκε στα καρκινώματα της ουροδόχου κύστεως ισχυρή θετική συσχέτιση του NFκB με την έκφραση της COX-2, υποδηλώνοντας τον υποστηρικτικό ρόλο των δύο αυτών παραγόντων στην πρόοδο της καρκινογένεσης. Από τη συσχέτιση NFκB και ERβ προέκυψε κατασταλτική επίδραση του πρώτου στην ογκοανασταλτική δράση του δεύτερου, υποδηλώνοντας σχέση ανταγωνισμού στη δέσμευση συνπαραγόντων και κατάληψης ίδιων περιοχών στους υποκινητές γονιδίων, ενώ δεν αναδείχθηκε συνομιλία ανάμεσα στον ERβ και COX-2. Τέλος αποκαλύφθηκε συνεργική δράση του NFκB με τον p300 στην καρκινογένεση, με τον ERβ και NCoR να χάνουν την ικανότητα πρόκλησης κυτταρικής διαφοροποίησης και άρα την προστατευτική επίδρασή τους. Η έκφραση του ERβ συσχετίστηκε με την ιστοπαθολογική βαρύτητα, ανά βαθμό έκφρασης των συνρυθμιστών p300 και NCoR, ώστε να διευκρινιστεί εάν η συγκέντρωση τους στα κύτταρα είναι καθοριστικός παράγοντας για την επίδραση του πυρηνικού υποδοχέα στον ιστολογικό φαινότυπο. Η επεξεργασία των δεδομένων φανερώνει αρνητική συσχέτιση της προόδου της καρκινογένεσης με την πυρηνική έκφραση του ERβ, αλλά μόνο όταν τα κύτταρα υπερεκφράζουν παράλληλα τον p300. Η απώλεια της έκφρασης του NCoR αναστέλλει την ενεργοποίηση του πυρηνικού υποδοχέα ERβ, γεγονός που διαπιστώθηκε και στην παρούσα μελέτη κατά τη διάρκεια της απώλεια διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης. Επομένως, το τελικό αποτέλεσμα της δράσης του ERβ εξαρτάται από τον ανταγωνισμό των ενεργοποιητών και καταστολέων για τις ίδιες θέσεις σύνδεσης στο μόριο του ERβ. Συνολικά, η χρήση αγωνιστών των ERβ και NCoR με παράλληλη αναστολή των NFκB, COX2 και NCoR, θα είχε πιθανότατα ευνοϊκό αποτέλεσμα στην αναστροφή της καρκινογένεσης στην ουροδόχο κύστη. Ειδικές παράμετροι του χημειοπροληπτικού σχήματος, θα ήταν ωφέλιμο να τροποποιούνται ύστερα από εξατομικευμένη αξιολόγηση του δικτύου των πέντε παραγόντων. / Backround Bladder cancer is the forth most common malignancy among men in the Western World, following prostate, lung, and colon cancer. However, due to the highly recurrent nature of the disease, bladder cancer is the most prevalent and the most expensive per patient treated. Carcinogenesis is a complicated multistage process that gradually deprives normal cells of their natural phenotype, resulting in tissue disturbance, from which tumors finally emerge. During its lengthy course it is accompanied by an evenly prolonged inflammatory response. Chemoprevention pursues the arrest of both processes, by means of pharmacological targetting key molecules, involved in cell growth, differentiation and apoptosis, as well as in chronic inflammation. Nuclear Hormone Receptors are appropriate targets, as they are induced by ligand binding to mediate gene transcription. Epidemiological and molecular data support the possible role of ERβ and NFκB between the two collateral processes, providing evidence for target-specific chemopreventive strategies. ERβ promotes cellular differentiation and restriction of inflammation. Nuclear receptor coregulators provide a great level of sophistication in the dynamic process of transcriptional regulation. The transcriptional coactivator p300 is a ubiquitous nuclear protein and transcriptional cofactor with intrinsic acetyltransferase activity. NCoR is a protein that contain distinct functional domains responsible for interaction with NRs, and activation of HDAC proteins, ultimately resulting in targeted repression of transcription The inducible transcription factor NF-κB, immediately after being released from a cytoplasmic inhibitor, translocates into nucleus, where it enhances transcription of anti-apoptotic and pro-inflammatory genes. COX-2, an enzyme often induced in neoplastic conditions, perpetuates the chronic inflammatory state in the epithelium and its microenvironment, by means of prostaglandin synthesis. Elucidation of the molecular networks implicated in estrogen signaling is very important in view of the potential use of selective estrogen receptor modulators in chemoprevention and targeted anticancer therapy. Materials and Methods. In our retrospective study we included 111 consecutive patients (74 males and 37 females), aged 23-90 years (mean 70±10) diagnosed with TCC of the bladder by either biopsies, transurethral resection of bladder tumor, or radical cystectomies, between 2000 and 2002 from the Urological Department of Urology of University Hospital of Patras, Greece. None of the patients had received any preoperative intravesical therapy. Bladder tumors were graded and staged according to the World Health Organization (WHO) grading. Paraffin section immunohistochemistry was utilized and relative expression was estimated in intracellular compartments, intraepithelial layers, and histologic categories. NF-κB(p65 subunit) demonstrated mixed subcellular presence, COX2 cytoplasmic whereas ERβ, p300 and NCoR staining patterns were nuclear. NF-κB and COX-2, were constantly upregulated as tumorigenesis progressed. Results NF-κB, COX-2 and p300 expression correlated positively with progression of carcinogenesis, suggesting a potential involvement in bladder tumorigenesis. On the contrary, ERβ and NCoR were severely diminished in cancer, compared to normal epithelium, and they were affected by tumor Grade. The remaining correlations are based on coexpression analysis of the aforementioned factors, individually for each patient, to permit judgement of molecular interactions. In detail, an inverse staining between ERβ and nuclear p65 immunoreactivity was observed and we could suggest that there is a reciprocal transactivation between ERβ and activated NFκB. COX-2 was positively associated in bladder carcinomas with NFκB, a finding which may denote the nuclear factor contribution to the enzyme induction. A correlation has been established, when correlating the expression of ERβ with the coregulators, positive with NCoR and negative with p300, indicating a potential role of these key molecules in bladder carcinogenesis. Furthermore, p300 and NCoR, may not be strictly segregated and in bladder cancer cells interact directly, since, according to biochemical purification studies, p300 is capable of directed negative interaction with NCoR. Conclusions The inhibition of ERβ in combination with the antiapoptotic properties of NFκB may contribute to the pathogenesis of TCC. Selective ERβ and NCoR agonist and agents-inhibitors of NFκB, COX2 and p300 may represent a possible new treatment strategy, by virtue of their role in bladder carcinogenesis. Subtle variations in the chemopreventive regimen, based on personalized molecular profiling, would hopefully achieve a patient-tailored therapeutic approach.

Ο νεογνικός χειρισμός, ένα πειραματικό μοντέλο πρώιμων εμπειριών, είναι γνωστό οτι επηρεάζει τη λειτουργία του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων, βελτιώνοντας έτσι την προσαρμοστικότητα, την αντιμετώπιση του στρες, τις διανοητικές ικανότητες και γενικά τις διεργασίες του εγκεφάλου που σχετίζονται με την πλαστικότητα. Προηγούμενη μελέτη έχει δείξει οτι ο νεογνικός χειρισμός παρουσιάζει εκλεκτικές επιδράσεις στους υποδοχείς του N-μεθυλο-D-ασπαρτικού οξέος (NMDA) του διεγερτικού νευροδιαβιβαστή γλουταμινικό στον εγκέφαλο των επίμυων. Οι υποδοχείς του γλουταμινικού που διαμεσολαβούν την ταχεία συναπτική νευροδιαβίβαση στις διεγερτικές συνάψεις του κεντρικού νευρικού συστήματος είναι οι υποδοχείς του α-αμινο-3-υδροξυ-5-μεθυλο-ισοξαζολο-προπιονικού οξέος (AMPA) και είναι κρίσιμοι κατά τη νευρωνική ανάπτυξη, τη συναπτική πλαστικότητα και τη δομική αναδιαμόρφωση του εγκεφάλου. Συντίθενται από τέσσερις υπομονάδες, τις GluRA, GluRB, GluRC και GluRD, οι οποίες συνδυάζονται για να σχηματίσουν τετραμερή. Οι περισσότεροι υποδοχείς AMPA είναι ετεροτετραμερή, αποτελούμενα από τουλάχιστον δύο από τις αναφερθείσες υπομονάδες. Οι υποδοχείς AMPA που είναι διαβατοί στο ασβέστιο δεν περιέχουν την υπομονάδα GluRB, ενώ τόσο η υπομονάδα GluRA, όσο και η GluRB, παίζουν σημαντικό ρόλο στη συναπτική διακίνηση των υποδοχέων AMPA. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να ερευνηθεί κατά πόσο ο νεογνικός χειρισμός μπορεί να επιδρά στους υποδοχείς AMPA, εφόσον έχει δειχθεί οτι η σύνθεση των υπομονάδων και κατά συνέπεια και οι ιδιότητες των υποδοχέων AMPA στη σύναψη μεταβάλλονται από την αισθητική εμπειρία και κατά πόσο αυτή η επίδραση είναι εξαρτώμενη από το φύλο. Σύμφωνα με το παρόν πρωτόκολλο νεογνικού χειρισμού, κάθε νεογνό απομακρυνόταν από τη φωλιά για 15 λεπτά καθημερινά από την πρώτη μεταγεννητική ημέρα μέχρι τον απογαλακτισμό του τρεις εβδομάδες μετά. Η τεχνική του in situ υβριδισμού χρησιμοποιήθηκε για την εντόπιση και ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mRNA της κάθε υπομονάδας. Η έκφραση των υπομονάδων του υποδοχέα AMPA μελετήθηκε σε συγκεκριμένες εγκεφαλικές περιοχές που εμπλέκονται στο συναίσθημα, στη μάθηση, στη μνήμη και στην αισθητική αντίληψη, όπως ο ιππόκαμπος, η αμυγδαλή και ο εγκεφαλικός φλοιός ενήλικων αρσενικών και θηλυκών επίμυων. Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν οτι ο νεογνικός χειρισμός προκάλεσε διαφορετικές και σε κάποιες περιπτώσεις φυλετικά διμορφικές μεταβολές στην έκφραση των υπομονάδων του υποδοχέα AMPA, με τρόπο ειδικό ανά υπομονάδα και περιοχή. Πιο συγκεκριμένα, τα ζώα που είχαν υποστεί νεογνικό χειρισμό, αρσενικά και θηλυκά, είχαν μειωμένα επίπεδα mRNA της GluRB και της GluRC στο ραχιαίο ιππόκαμπο και στο σωματαισθητικό φλοιό, συγκριτικά με τα ζώα χωρίς χειρισμό. Επιπλέον, τα επίπεδα mRNA της GluRC ήταν μειωμένα στην αμυγδαλή και στον προμετωπιαίο φλοιό και τα επίπεδα mRNA της GluRD ήταν μειωμένα στον κοιλιακό ιππόκαμπο αρσενικών και θηλυκών ζώων που είχαν υποστεί χειρισμό. Επιπροσθέτως, ο νεογνικός χειρισμός είχε φυλετικά διμορφικές επιδράσεις, αυξάνοντας τα επίπεδα mRNA της GluRA στο ραχιαίο ιππόκαμπο των αρσενικών ζώων και μειώνοντάς τα στα θηλυκά, καθώς και μειώνοντας τα επίπεδα mRNA της GluRΒ στον κοιλιακό ιππόκαμπο και στην αμυγδαλή μόνο των θηλυκών επίμυων. Οι μεταβολές στο mRNA των υποδοχέων AMPA θεωρούμε οτι συντελούνται μέσω επιγενετικής ρύθμισης λόγω του νεογνικού χειρισμού. Τα αποτελέσματα μας στο ραχιαίο ιππόκαμπο υποδεικνύουν ότι ο νεογνικός χειρισμός είναι πιθανό να προκαλεί επαγόμενη από την εμπειρία συναπτική ενδυνάμωση και αποδυνάμωση αρσενικών και θηλυκών ζώων αντίστοιχα, δεδομένων των αντίθετων μεταβολών που παρατηρούνται στα επίπεδα του mRNA της υπομονάδας GluRA στα δύο φύλα. Επιπλέον, η παρατηρούμενη μείωση της έκφρασης του mRNA της GluRB πιθανόν να οδηγεί σε μειωμένο αριθμό αδιάβατων στο ασβέστιο υποδοχέων AMPA που περιέχουν την υπομονάδα GluRB, οπότε ο νεογνικός χειρισμός μπορεί να προκαλεί μεταβολή στο φαινότυπο του υποδοχέα AMPA από αδιάβατο σε διαβατό στο ασβέστιο και τελικά αύξηση της πλαστικότητας της σύναψης στις περιοχές όπου παρατηρούνται οι μεταβολές. Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη δείξαμε οτι οι υπομονάδες του υποδοχέα AMPA μεταβάλλονται από το νεογνικό χειρισμό, ένα μοντέλο πρώιμης εμπειρίας, στον εγκέφαλο ενήλικων επίμυων, με τρόπο ειδικό ανά υπομονάδα και ανά περιοχή και σε κάποιες περιπτώσεις φυλετικά διμορφικό. Αυτό σημαίνει οτι η γλουταμινεργική νευροδιαβίβαση μεταβάλλεται από μια πρώιμη εμπειρία. Αυτή η επίδραση του νεογνικού χειρισμού μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που υπόκεινται της αυξημένης πλαστικότητας του εγκεφάλου των ζώων που έχουν υποστεί νεογνικό χειρισμό, η οποία εκδηλώνεται τόσο σε κυτταρικό επίπεδο όσο και στο συμπεριφορικό επίπεδο. / Neonatal handling, an experimental model of early life experiences, is known to affect the hypo¬thalamic-pituitary-adrenal axis function, thus increasing adaptability, coping with stress, cognitive abilities and in general brain plasticity-related pro¬cesses. Previous study has shown selective effects of neonatal handling on rat brain NMDA receptors. AMPA receptors (AMPARs) mediate fast synaptic trans¬mission at excitatory synapses in the CNS and are crucial during neuro¬nal development, synaptic plasticity and structural remodeling. AMPARs are composed of four types of subunits, designated as GluRA, GluRB, GluRC and GluRD, which combine to form tetramers. Most AMPARs are heterotetramerics, made of at least two of the four pro¬per subunits GluRA-D. AMPA receptors that are permeable to Ca2+ lack the GluRB subunit, while both GluRA and GluRB subunits have an important role in AMPAR trafficking towards the synapse. The present study addressed the question of whether neonatal handling might have an effect on AMRARs, since it has been shown that the subunit composition and thus the synaptic properties of AMPARs, changes in response to sensory experience, and whether this effect is gender-specific. According to the current neonatal handling pro¬tocol, each pup of a litter was removed from the nest for 15 min daily from the first postnatal day 1 (PND1) until weaning (PND22). In situ hybridization was used in order to localize and quantify subunit mRNA expression, with specific cDNA oligo¬nucleotides. AMPAR subunit expression was studied in specific brain regions that are involved in emotions, learning, memory and sensory perception, such as the hippo¬campus, cerebral cortex and amydgala of adult male and female rats. We found that neonatal handling caused differential and in cases sexually dimorphic changes in AMPA receptor subunit expression, depending on the brain region and the subunit. More specifically, neonatally handled animals, both males and females, had lower GluRB and GluRC mRNA levels in the dorsal hippocampus and the somatosensory cortex, compared to the non-handled. Moreover, GluRC mRNA levels were decreased in the amygdala and the prefrontal cortex and GluRD mRNA levels were decreased in the ventral hippocampus of handled animals of both sexes. Furthermore, neonatal handling had sexually dimorphic effects, increasing GluRA mRNA levels in the dorsal hippocampus of males while decreasing them in females, as well as decreasing GluRB mRNA levels in the ventral hippocampus and the amygdala only of the females. The observed changes in AMPA receptor mRNA levels are thought to occur via epigenetic regulation in response to neonatal handling. Our results in dorsal hippocampus suggest that neonatal handling may induce experience-dependent synaptic strengthening in males and weakening in females, due to the opposite changes observed in GluRA mRNA levels of the two sexes. Moreover, the observed decrease in GluRB mRNA expression most likely leads to reduced GluRB-containing calcium-impermeable AMPA receptors, therefore neonatal handling may cause a switch in AMPA receptor phenotype from calcium-impermeable to calcium-permeable AMPA receptors, and thus induce a higher synaptic plasticity in the regions where the changes are observed. In the present study we show that neonatal handling, an experimental model of early life experiences, induces changes in the AMPA receptor subunits expression in the adult rat brain that are region- and subunit-specific and in cases sexually dimorphic. These results demonstrate that glutamatergic transmission changes in response to an early experience. This effect of handling could be one of the factors underlying the increased plasticity of the brain of neonatally handled animals, which is manifested both at the cellular and at the behavioural/systemic level.

Φυσιολογικά επίπεδα της αγρίου τύπου απολιποπρωτεϊνης Ε (apoE) στο πλάσμα διαμεσολαβούν στην κάθαρση των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών ενώ υψηλότερα επίπεδα από τα φυσιολογικά προκαλούν υπερτριγλυκεριδαιμία. Αυτή η ιδιότητα της αγρίου τύπου apoE μειώνει σημαντικά την θεραπευτική της αξία ως ένα πιθανό βιολογικό φάρμακο για την αντιμετώπιση της δυσλιπιδαιμίας. Πρόσφατα, έχει δημιουργηθεί και μελετηθεί μια μεταλλαγμένη μορφή της apoE, apoE4 [ L261A, W264A, F265A, L268A, V269A ] (apoE4mut1) με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες. Συγκεκριμένα, αυτή η μεταλλαγμένη μορφή μπορεί να φέρει τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης σε φυσιολογικές τιμές χωρίς να προκαλέσει υπερτριγλυκεριδαιμία ακόμα και όταν υπερεκφράζεται. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε φαρμακοδυναμική και φαρμακοκινητική ανάλυση της apoE4mut1 σε πειραματόζωα. Με γονιδιακή μεταφορά μέσω ιού σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στον LDL υποδοχέα (LDLr-/-) και σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στην apoE (apoE-/-), δείχθηκε οτι η δράση της apoE4mut1 ( μείωση της χοληστερόλης ) εξαρτάται από την έκφραση ενός λειτουργικού κλασσικού LDL υποδοχέα. Εφάπαξ έγχυση της apoE4mut1 συνδεδεμένης με λιποσώματα σε apoE-/- ποντίκια που ήταν σε δίαιτα δυτικού τύπου για 6 εβδομάδες αποκάλυψε οτι η εξωγενώς συντιθέμενη apoE4mut1 διατηρεί άθικτη την ικανότητά της να κανονικοποιεί τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης αυτών των ποντικιών με μια μέγιστη φαρμακολογική απόκριση που παρατηρείται σε μόλις 10 ώρες μετά την έγχυση. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός οτι τα επίπεδα χοληστερόλης του πλάσματος παρέμειναν σημαντικώς μειωμένα για τις επόμενες 24 ώρες μετά την έγχυση της apoE4mut1- λιποσώματα. Μετρήσεις συγκεντρώσεων της apoE έδειξαν οτι η apoE4mut1 στην μορφή των πρωτεολιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχει χρόνο ημίσειας ζωής 15.8 h. Τα δεδομένα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα οτι η καθαρή apoE4mut1 μπορεί να αποτελέσει ένα νέο υποψήφιο φάρμακο για την άμεση αντιμετώπιση της υπερχοληστερολαιμίας σε άτομα που εκφράζουν έναν λειτουργικό LDL υποδοχέα. / Physiological levels of wild-type (wt) apolipoprotein E (apoE) in plasma mediate the clearance of cholesterol-rich atherogenic lipoprotein remnants while higher than normal plasma apoE concentrations fail to do so and trigger hypertriglyceridemia. This property of wt apoE reduces significantly its therapeutic value as a potential biological drug for dyslipidemia. Recently, we reported the generation of a recombinant apoE variant, apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A] (apoE4mut1) with improved biological functions. Specifically, this variant can normalize high plasma cholesterol levels without triggering hypertriglyceridemia, even at supraphysiological levels of expression. In the present study we performed pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4mut1 in experimental mice. Using adenovirus-mediated gene transfer in LDL receptor deficient (LDLr-/-) and apoE deficient (apoE-/-) mice, we show that the cholesterol lowering potential of apoE4mut1 is dependent on the expression of a functional classical LDLr. Bolus infusion of apoE4mut1-containing proteoliposomes in apoE-/- mice fed western-type diet for 6 weeks indicated that exogenously synthesized apoE4mut1 maintains intact its ability to normalize the high cholesterol levels of these mice with a maximum pharmacological effect obtained at only 10 hours post-treatment. Interestingly, plasma cholesterol levels remained significantly reduced even 24 hours following intravenous infusion of apoE4mut1 proteoliposomes. Measurements of plasma apoE levels indicated that apoE4mut1 in the form of proteoliposomes used in the study has a half-life of 15.8 h. Our data suggest that purified apoE4mut1 may be an attractive new candidate for the acute correction of hypercholesterolemia in subjects expressing functional LDL receptor.

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας που δεσμεύεται στην ηπαρίνη και εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθώς και της αγγειογένεσης. Υψηλές συγκεντρώσεις του αυξητικού παράγοντα HARP έχουν βρεθεί σε ανθρώπινους καρκινικούς όγκους, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως επίσης και σε ορό ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η HARP αποτελεί υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις από το ολικό μόριο. Η HARP ασκεί τις βιολογικές τις δράσεις ύστερα από πρόσδεση στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς SDC3, RPTPβ/ζ και ALK. Παρά την ταυτοποίηση του υποδοχέα ALK ως λειτουργικού υποδοχέα της HARP, μέχρι σήμερα υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις αναφορικά με την αλληλεπίδρασή του με τη HARP. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του αυξητικού παράγοντα HARP και του υποδοχέα ALK σε καρκινικά κύτταρα PC3 ανθρώπινου προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HARP επάγει τη φωσφορυλίωση του ALK σε κύτταρα PC3, ωστόσο δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση του συγκεκριμένου υποδοχέα σε κύτταρα PC3 στα οποία είχε μειωθεί η συσσώρευση του RPTPβ/ζ. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν ανασυνδυασμένα πεπτίδια που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με τη θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) και αντιστοιχούσαν σε περιοχές του αυξητικού παράγοντα HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] που προκύπτουν ύστερα από πέψη με πλασμίνη. Ύστερα από πειράματα συγκατακρήμνισης βρέθηκε ότι ο ALK αλληλεπιδρά ισχυρά με το πεπτίδιο P(60-110) αποτέλεσμα το οποίο προέκυψε και ύστερα από μεωρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται η έμμεση αλληλεπίδραση του υποδοχέα ALK και του αυξητικού παράγοντα HARP, η οποία βρέθηκε ότι διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Αποδεικνύεται επίσης ότι παρόλο που η αλληλεπίδραση των δύο αυτών μορίων δεν είναι ικανή να οδηγήσει στη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK, τα δύο αυτά μόρια αλληλεπιδρούν βιοχημικά καθώς η αλληλουχία 60-110 των αμινοξέων της HARP αλληλεπιδρά ισχυρά και με τις δύο μορφές του υποδοχέα, με μοριακό βάρος 220 και 140 kDa αντίστοιχα. / HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) is a heparin-binding growth factor, involved in the regulation of cell differentiation, cell proliferation as well as in angiogenesis. Elevated concentrations of HARP have been detected in malignancies, in cancer cell lines, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. It is also known that HARP is substrate for different proteases of the cell microenvironment, leading to the production of biological active peptides which can exert similar or even opposite biological activities to HARP. HARP exerts its biological actions after binding to the transmembrane receptors SDC3, RPTPβ/ζ and ALK. Even though ALK has been defined as a functional HARP receptor, contradictory results have been published concerning HARP-ALK interaction. In the present work, we studied the interaction of HARP growth factor with ALK transmembrane receptor using PC3 prostate cancer cells. It was shown that HARP induces the phosphorylation of ALK in PC3 cells, however no effect on ALK activation was observed in PC3 cells after RPTPβ/ζ knockdown. We also used recombinant gst-fused peptides corresponding to various fragments of HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] which result after cleavage with plasmin. After GST pull-down assays it was shown that ALK strongly binds to the P(60-110), result that was also taken after RPTPβ/ζ knockdown. Cumulatively, our results indicate that HARP-induced ALK phosphorylation is mediated by RPTPβ/ζ. It is also demonstrated that HARP interacts biochemically with ALK, since P(60-110) strongly binded both species of ALK (220 and 140 kDa).

Οι οπιοειδείς υποδοχείς (OR), μ, δ, κ και NOP, είναι μέλη των επταελικοειδών υποδοχέων που συζεύγνυνται με G πρωτεΐνες (7ΤΜ ή GPCR), οι οποίοι αποτελούν τη μεγαλύτερη υπεροικογένεια υποδοχέων και έναν από τους κύριους φαρμακολογικούς στόχους λόγω της υψηλής φυσιολογικής τους σημασίας. Οι OR ρυθμίζουν μια ποικιλία φυσιολογικών αποκρίσεων στο νευρικό σύστημα, με κυριότερη την αναλγησία. Τα οπιοειδή φάρμακα είναι τα πιο ισχυρά και αποτελεσματικά αναλγητικά έναντι στον οξύ πόνο, όμως η παρατεταμένη χρήση τους οδηγεί σε φαινόμενα ανοχής και εξάρτησης. Γι’ αυτό υπάρχει έντονο ενδιαφέρον στην αποσαφήνιση των μηχανισμών που εμπλέκονται στα φαινόμενα αυτά προκειμένου να σχεδιαστούν πιο αποτελεσματικά φάρμακα χωρίς τέτοιες παρενέργειες. Η σηματοδότηση των οπιοειδών υποδοχέων γίνεται κυρίως μέσω της ενεργοποίησης των Gi/o πρωτεϊνών που με τη σειρά τους ρυθμίζουν κατάλληλους τελεστές. Πέρα όμως από αυτούς τους κλασσικούς αλληλεπιδρώντες εταίρους οι OR έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν και με πολλές άλλες πρωτεΐνες κυρίως μέσω των περιοχών της τρίτης ενδοκυτταρικής τους θηλιάς (i3L) και του καρβοξυτελικού τους άκρου (CT) (Georgoussi et al., 2006- Georgoussi, 2008- Georgoussi et al., 2012). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές επηρεάζουν όχι μόνο την σηματοδότηση των OR αλλά και την εν γένει εύρυθμη λειτουργία τους. Μια σημαντική πρωτεϊνική οικογένεια που ελέγχει τη μεταγωγή σήματος από τις G πρωτεΐνες βρέθηκε να είναι οι πρωτεΐνες Ρυθμιστές της κυτταρικής Σηματοδότησης μέσω G πρωτεϊνών ή RGS πρωτεΐνες (Regulators of G protein signaling, RGS). Ο πρωταρχικός τους ρόλος είναι η αλληλεπίδραση τους με τις Gα υπομονάδες των G πρωτεϊνών και η επιτάχυνση της υδρόλυσης του GTP από τις τελευταίες οδηγώντας στη μείωση της σηματοδότησης των GPCR. Μέλη της οικογένειας των RGS πρωτεϊνών είχε δειχθεί ότι πέρα από τις Gα πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν επίσης με υποδοχείς GPCR, τελεστές αλλά και με άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες, προσδίδοντας τους έναν ιδιαίτερο οργανωτικό ρόλο στη λειτουργία του κυττάρου και καθιστώντας τις RGS πρωτεΐνες μόρια υψηλού φαρμακολογικού ενδιαφέροντος. Παρελθόντα πειράματα in vitro συγκατακρήμνισης, του εργαστηρίου Κυτταρικής Σηματοδότησης και Μοριακής Φαρμακολογίας, με τη χρήση GST-χιμαιρικών πεπτιδίων των καρβοξυτελικών άκρων των μ-OR και δ-OR (μ-CT και δ-CT αντίστοιχα) και της τρίτης ενδοκυτταρικής θηλιάς του δ-OR (δ-i3L), έδειξαν ότι η RGS4, ένα μέλος της B/R4 υποοικογένειας, αλληλεπιδρά και με τους δυο υποδοχείς στις περιοχές αυτές (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009). Η αλληλεπίδραση της RGS4 στα καρβοξυτελικά άκρα των υποδοχέων αυτών γίνεται στην περιοχή που σχηματίζει μια 8η αμφιπαθική α-έλικα (έλικα VIII), σημείο επαφής των OR και για άλλες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις όπως αυτή των STAT5A/B ((Mazarakou and Georgoussi, 2005- Georganta et al., 2010), της σπινοφιλίνης (Fourla et al., 2012) και άλλων πρωτεϊνών (Georgoussi et al., 2012). Βρέθηκε επίσης ότι η RGS4 είναι αρνητικός ρυθμιστής της κυτταρικής σηματοδότησης των μ-OR και δ-OR (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009). Τέλος, αποδείχθηκε για πρώτη φορά ότι η RGS4 παίξει το ρόλο «μοριακού φίλτρου» καθοδηγώντας τους μ-OR και δ-OR να αλληλεπιδράσουν με συγκεκριμένο διαφορετικό υποπληθυσμό Gα υπομονάδων των G πρωτεϊνών (Leontiadis et al., 2009). Καμία πληροφορία για τον ρόλο των RGS πρωτεϊνών δεν υπάρχει για τον κ-OR. Για τον λόγο αυτό σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να ελέγξουμε αν οι RGS πρωτεΐνες της Β/R4 υποοικογένειας αλληλεπιδρούν με τον κ-OR και αν ναι, ποιος είναι ο ρόλος τους στη σηματοδότηση του κ-OR και των G πρωτεϊνών με τις οποίες ο τελευταίος συζεύγνυται. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο κ-OR μπορεί να αλληλεπιδράσει και με την RGS4 και με την RGS2 τόσο in vitro όσο και in vivo. Η δημιουργία GST-χιμαιρικών πεπτιδίων του καρβοξυτελικού άκρου του κ-OR (κ-CT) έδειξε ότι η RGS4 αλληλεπιδρά επίσης εντός της έλικας VIII ενώ η RGS2 αλληλεπιδρά με το τελικό μη συντηρημένο άκρο του κ-CT όσο και του δ-CT. Επιπλέον η συνέκφραση της RGS4 ή της RGS2 σε κύτταρα 293F που εκφράζουν τον κ-OR έδειξε ότι και οι δυο RGS πρωτεΐνες προάγουν την επιλεκτική και διαφορική σύζευξη του κ-OR με συγκεκριμένο υποπληθυσμό των Gαi/o υπομονάδων. Σε ότι αφορά τον φυσιολογικό ρόλο των RGS4 και RGS2 στις ελεγχόμενες από τον κ-OR κυτταρικές αποκρίσεις βρήκαμε ότι τόσο η RGS4 όσο και η RGS2 ανέστειλαν την καταστολή της αδενυλικής κυκλάσης που ελέγχει ο κ-OR, αλλά όχι ο δ-OR, με την RGS2 να έχει ισχυρότερη επίδραση στο μονοπάτι αυτό. Επίσης οι RGS4 και RGS2 μείωσαν την ενεργοποίηση των ERK1,2 κινασών που σηματοδοτούσε ο κ-OR. Τέλος, βρήκαμε ότι παρόλο που καμία από τις δυο RGS δεν επηρεάζει την εσωτερίκευση του κ-OR, η RGS4 επιταχύνει την εσωτερίκευση του δ-OR. Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι οι RGS4 και RGS2 πρωτεΐνες είναι δυο νέοι αρνητικοί ρυθμιστές στην σηματοδότηση των κ-OR και δ-OR. Εμφανίζουν διαφορικό ρυθμιστικό ρόλο στα σηματοδοτικά μονοπάτια καθενός OR, με ρόλο κλειδί στην καθοδήγηση της σύζευξής τους με τις Gα υπομονάδες και μπορούν να αποτελέσουν ενδιαφέροντες φαρμακολογικούς στόχους για τον έλεγχο της δράσης των οπιοειδών. / Οpioid receptors (OR) (subtypes μ, δ, κ and NOP) belong to the superfamily of the Heptahelical G protein-coupled receptors (7TM or GPCRs), the largest class of receptors in the human genome and common targets for therapeutics. ORs mediate their responses in the nervous system via coupling to members of the Gi/Go proteins to regulate the activity of various effector systems. Opioids are the most potent analgesics but prolonged administration leads to phenomena of tolerance and dependence thus there is a great interest towards understanding of OR signalling in an effort to develop new drugs devoid of adverse effects. Extended observations have demonstrated that the cytoplasmic face of the ORs is critical in mediating their signal through interactions not only with G proteins but also with multiple other proteins. These regulatory proteins play distinct roles in the regulation of the OR signalling, and in the fine tuning of these receptors. Regulators of G protein signalling (RGS) proteins is a class of proteins that modulate G protein signalling events by directly interacting with Gα subunits and accelerating the GTP hydrolysis, thus reducing GPCR signalling towards their effectors. RGS can also interact with many GPCRs, effectors and auxiliary proteins thus playing a key role in the cell functions, making them highly attractive as pharmacological targets (Abramow-Newerly et al., 2006). Our previous in vitro studies have shown that a member of the B/R4 subfamily of RGS proteins such as RGS4 interacts directly with μ-OR and δ-OR within a conserved region in their C-termini (μ-CT and δ-CT), forming a helix VIII, as well as within the δ-third intracellular loop (δ-i3L). RGS4 associates with μ-OR and δ-OR in living cells and forms selective complexes with Gαi/o proteins in a receptor dependent manner. Expression of RGS4 in HEK293 cells attenuated adenylyl cyclase inhibition mediated by μ-OR and agonist-mediated ERK1,2 phosphorylation for both receptors (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009), suggesting for the first time that RGS4 is a negative modulator of μ-OR and δ-OR signalling. To deduce whether similar effects also occur for the κ-opioid receptor (κ-ΟR) and define the ability of other members of the B/R4 subfamily of RGS proteins, such as RGS2, to interact with OR we generated fusion peptides encompassing the C-terminus of κ-OR (κ-CT). Results from pull down experiments indicated that RGS2 interacts with the κ-CT, the δ-CT and the δ-i3L but fails to interact with the μ-CT. RGS4-N-terminal domain is responsible for OR interaction. Mapping the sites of RGS2 interaction indicated that RGS2 interacts with the non conserved portion of the C-termini of ORs exhibiting a different docking site as compared to that of RGS4. Co-precipitation studies in living cells indicated that RGS2 and RGS4 associate with κ-ΟR constitutively and upon receptor activation and confer selectivity for coupling with a specific subset of G proteins in an RGS protein dependent manner. Expression of both RGS2 and/or RGS4, in 293F cells attenuated agonist mediated-adenylyl cyclase inhibition for κ-ΟR, but not δ-OR, with RGS2 exhibiting a more robust effect. RGS4 and RGS2 reduced κ-ΟR-mediated ERK1,2 phosphorylation whereas, RGS4 accelerated agonist-induced internalization of the δ-OR but not of the κ-OR. Collectively, our observations demonstrate that RGS2 and RGS4 are novel interacting partners and negative modulators of κ-ΟR and δ-OR signalling. These two RGS proteins display a differential modulatory effect in each signalling pathway tested and play a key functional role by conferring selectivity for both κ-OR and δ-OR coupling with a specific subset of G proteins. Therefore they can be considered as attractive new pharmacological targets to manipulate opioid receptors signalling.

Ο λιπώδης ιστός θεωρείται πλέον ενδοκρινές όργανο που παράγει πληθώρα βιολογικά δραστικών πεπτιδίων, που καλούνται λιποκίνες. Ανάλογα με την ανατομική τους εντόπιση, οι διαφορετικές αποθήκες λίπους έχουν και διαφορετική ικανότητα παραγωγής λιποκινών και επίδρασης σε φυσιολογικές λειτουργίες. Οι λιποκίνες που παράγονται από τον περιαγγειακό λιπώδη ιστό εμπλέκονται στην παθογένεια αγγειακών νόσων, συμπεριλαμβανόμενης της αθηροσκλήρωσης. Είναι γνωστό πως η αντιπονεκτίνη ασκεί αντιαθηρογόνες δράσεις, ενώ ο ρόλος της Τ-καντχερίνης ως υποδοχέα της αντιπονεκτίνης δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Το απελινεργικό σύστημα, αποτελούμενο από την απελίνη και τον υποδοχέα της APJ, αποτελεί μεσολαβητή ποικίλων καρδιαγγειακών λειτουργιών και ενδέχεται να συμμετέχει και στην αθηροσκληρωτική διαδικασία. Η χεμερίνη είναι λιποκίνη με γνωστό ρόλο στην ανοσία, στη λειτουργία του λιπώδους ιστού και στο μεταβολισμό, δρώντας κυρίως μέσω του υποδοχέα της CMKLR1. Μελετήσαμε την πρωτεϊνική έκφραση της αντιπονεκτίνης και της Τ-καντχερίνης, της απελίνης και του APJ, της χεμερίνης και του CMKLR1 σε ανθρώπινες αορτές, στεφανιαίες αρτηρίες και στον αντίστοιχο περιαγγειακό λιπώδη ιστό και συσχετίσαμε την έκφρασή τους με την παρουσία αθηροσκλήρωσης και με κλινικές παραμέτρους. Εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για την αντιπονεκτίνη, την Τ-καντχερίνη, την απελίνη, τον APJ, τη χεμερίνη και τον CMKLR1 σε δείγματα ανθρώπινων αορτών και στεφανιαίων αρτηριών, περιλαμβανόμενου και του περιαγγειακού λίπους. Οι αορτικές και στεφανιαίες αθηρωματικές βλάβες αξιολογήθηκαν με βάση την κατάταξη του AHA. Ανοσοϊστοχημική χρώση, ποικίλης έντασης, για την αντιπονεκτίνη ανιχνεύθηκε μόνο στα λιποκύτταρα, ενώ η Τ-καντχερίνη εντοπίστηκε στα αγγειακά λεία μυικά κύτταρα (ΑΛΜΚ) και στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ανοσοϊστοχημική χρώση για την απελίνη ανιχνεύθηκε σε λιποκύτταρα, ΑΛΜΚ, ενδοθηλιακά κύτταρα και μακροφάγα-αφρώδη κύτταρα των αθηρωματικών βλαβών, ενώ ο APJ εντοπίστηκε στα ΑΛΜΚ και στο ενδοθήλιο των αγγείων. Ανοσοθετικότητα για τη χεμερίνη παρατηρήθηκε και στις δύο αποθήκες λίπους ,στα ΑΛΜΚ και σε αφρώδη κύτταρα των αθηρωματικών βλαβών. Ο CMKLR1 εκφράστηκε σε ΑΛΜΚ και σε αφρώδη κύτταρα αορτών και στεφανιαίων αγγείων με αθηρωματικές βλάβες. Η έκφραση αντιπονεκτίνης στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό και η έκφραση Τ-καντχερίνης στα ΑΛΜΚ συσχετίστηκαν αρνητικά με την αθηροσκλήρωση και στις δύο εντοπίσεις, όπως και η έκφραση απελίνης στα ΑΛΜΚ. Η έκφραση χεμερίνης στις περιαγγειακές αποθήκες λίπους και στα αφρώδη κύτταρα συσχετίστηκε στατιστικά σημαντικά με τη βαρύτητα της αθηροσκλήρωσης και στις δύο εντοπίσεις. Πολλές ακόμα – ειδικές για την εντόπιση – συσχετίσεις παρατηρήθηκαν. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν πιθανό ρόλο της Τ-καντχερίνης ως μεσολαβητή των αντιαθηρογόνων δράσεων της αντιπονεκτίνης, ενώ υποστηρίζουν το ενδεχόμενο αντιαθηρογόνο προφίλ της απελίνης και του υποδοχέα της APJ στις ανθρώπινες αρτηρίες. Ενισχύουν, ακόμα, τον υποτιθέμενο ρόλο της χεμερίνης στην εξέλιξη των αθηρωματικών βλαβών, πιθανότατα δρώντας μέσω του CMKLR1 υποδοχέα της. Περαιτέρω έρευνα είναι αναγκαία για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της τοπικά παραγόμενης αντιπονεκτίνης, απελίνης και χεμερίνης και της σηματοδότησης μέσω των αντίστοιχων υποδοχέων τους – T-cadherin, APJ και CMKLR1 – στην παθογένεια της αθηροσκλήρωσης στον άνθρωπο. / Adipose tissue is considered an endocrine organ, producing numerous bioactive peptides, called adipokines. Depending on their anatomical location, different fat depots have a different capacity to produce adipokines and influence physiological functions. Adipokines produced by periadventitial fat have been implicated in the pathogenesis of vascular disease, including atherosclerosis. Adiponectin has established anti-atherogenic actions, while the role of T-cadherin as an adiponectin receptor is not fully elucidated. The apelinergic system, consisting of apelin and its APJ receptor, is a mediator of various cardiovascular functions and may also be involved in the atherosclerotic process. Chemerin is an adipokine with an established role in immunity, adipose tissue function and metabolism, acting, mainly through its CMKLR1 receptor. We investigated the protein expression of adiponectin and T-cadherin, apelin and APJ, chemerin and CMKLR1 in human aortas, coronary vessels and the respective periadventitial adipose tissue and correlated their expression with the presence of atherosclerosis and clinical parameters. Immunohistochemistry for adiponectin, T-cadherin, apelin, APJ, chemerin and CMKLR1 was performed on human aortic and coronary artery samples including the periadventitial adipose tissue. Aortic and coronary atherosclerotic lesions were assessed using the AHA classification. Adiponectin immunostaining, of varied intensity, was detected only in adipocytes, while T-cadherin was localized to vascular smooth muscle cells (VSMCs) and endothelial cells. Apelin immunostaining was detected in adipocytes, VSMCs, endothelial cells and foam cells in atherosclerotic lesions, while APJ was found in VSMCs and endothelia. Chemerin immunopositivity was noticed in both periadventitial fat depots, in VSMCs and foam cells in atherosclerotic lesions. CMKLR1 was expressed in VSMCs and foam cells in aortic and coronary vessels with atherosclerotic lesions. Periadventitial adiponectin and VSMC T-cadherin expression were negatively correlated with atherosclerosis in both sites, as was VSMC apelin expression. Chemerin expression in periadventitial fat depots and foam cells was statistically significantly correlated with the severity of atherosclerosis in both locations. Several other – depot specific – associations were observed. Our results suggest a possible role for T-cadherin as a mediator of anti-atherogenic adiponectin actions, while they support the putative anti-atherogenic profile for apelin and its APJ receptor in human arteries. They also lend some support to a presumable role of chemerin in the progression of atherosclerotic lesions, possibly acting through its CMKLR1 receptor. Further research is necessary to elucidate the role of locally produced adiponectin, apelin and chemerin and signaling through their respective receptors – T-cadherin, APJ and CMKLR1 – in the pathogenesis of human atherosclerosis.

Οι μέχρι τώρα ενδείξεις από τη βιβλιογραφία εισηγούνται ένα πιθανό προστατευτικό ρόλο των οιστρογόνων στην καρκινογένεση στο παχύ έντερο. Η έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων στο φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, στα αδενώματα και τα καρκινώματα και οι αλληλεπιδράσεις τους με διάφορους συμπαράγοντες θα πρέπει να μελετηθούν υπό το πρίσμα των πολύπλοκων μοριακών δικτύων μεταξύ επιθηλιακών κυττάρων και μυοϊνοβλαστών του στρώματος, αλλά και της θεωρίας των βλαστικών κυττάρων που φαίνεται να ενέχονται στην καρκινογένεση. Η έκφραση των ERα, ERβ1, ΑΙΒ-1, TIF-2, PELP1, NCoR και ALDH1 μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά σε 107 καρκινώματα παχέος εντέρου, σε 77 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου και σε 29 αδενώματα του ίδιου οργάνου. Εκτιμήθηκαν τόσο τα επιθηλιακά κύτταρα όσο και οι μυοϊνοβλάστες. Για την ακριβέστερη εκτίμηση των μυοϊνοβλαστών, συνεχόμενες ιστολογικές τομές υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημικό έλεγχο με χρήση των anti-αSMA και CD34 αντισωμάτων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση των ERβ1, ΑΙΒ-1, ΤΙF-2 και PELP1 ήταν πιο συχνή σε μυοϊνοβλάστες του στρώματος των καρκινωμάτων σε σχέση με τα αδενώματα και το φυσιολογικό βλεννογόνο. Επίσης, στους μυοϊνοβλάστες των καρκινωμάτων, ο NCoR εντοπιζόταν αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Αντίθετα, δεν υπήρχε διαφορά στο ποσοστό έκφρασης των δεικτών αυτών στα επιθηλιακά κύτταρα μεταξύ του φυσιολογικού βλεννογόνου, των αδενωμάτων και των καρκινωμάτων. Ωστόσο, η κυτταροπλασματική εντόπιση του ERβ1 ήταν συχνότερη στα επιθηλιακά κύτταρα των καρκινωμάτων σε σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο και τα αδενώματα. Επίσης, ο NCoR εκφραζόταν πιο συχνά στο κυτταρόπλασμα και σπανιότερα στον πυρήνα των κακοήθων επιθηλιακών κυττάρων σε σχέση με τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα. Η κυτταροπλασματική έκφραση του NCoR στα επιθηλιακά κύτταρα σχετιζόταν με μεγαλύτερη ελεύθερη νόσου και συνολική επιβίωση και αποτελούσε ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη της ελεύθερης νόσου επιβίωσης. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ένα πιθανό ρόλο της ενεργοποίησης του μονοπατιού των οιστρογονικών υποδοχέων στους μυοϊνοβλάστες του στρώματος, στην ανάπτυξη των καρκινωμάτων του παχέος εντέρου. Επίσης, η κυτταροπλασματική μετατόπιση, από τον πυρήνα, του NCoR στα επιθηλιακά κύτταρα, πιθανότατα επηρεάζει διάφορα μοριακά δίκτυα στον πυρήνα των κυττάρων, επιφέροντας ταυτόχρονα ογκοπροαγωγές δράσεις στα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου και ογκοκατασταλτικές επιδράσεις στα αναπτυσσόμενα νεοπλάσματα. Δεδομένου ότι, η πυρηνική έκφραση του NCoR έχει προταθεί ως δείκτης των stem κυττάρων, τα ελάχιστα κύτταρα, στα οποία παρατηρήθηκε πυρηνική έκφραση στον καρκίνο παχέος εντέρου, πιθανότατα, αντιστοιχούν σε καρκινικά stem κύτταρα. Η ALDH1 αποτελεί, επίσης, δείκτη φυσιολογικών και καρκινικών stem κυττάρων σε διάφορα όργανα. Στη μελέτη μας η ALDH1 εκφράστηκε έντονα σε κύτταρα του φυσιολογικού βλεννογόνου, τα οποία βρίσκονταν στη βάση των κρυπτών και πιθανότατα αντιπροσωπεύουν τα stem/προγονικά κύτταρα του εντερικού επιθηλίου. Κατά αντιστοιχία, η έκφραση της ALDH1 στα καρκινικά κύτταρα σχετιζόταν με παρουσία μεταστάσεων και χειρότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση. Το εύρημα αυτό, πιθανόν, να αποτελεί ένα δείκτη των καρκινικών stem/προγονικών κυττάρων. Αντίθετα, η έκφραση ALDH1 στους μυοϊνοβλάστες των καρκινωμάτων σχετιζόταν με ευνοϊκούς προγνωστικούς παράγοντες και μεγαλύτερο ελεύθερο νόσου διάστημα. Επίσης, περιστατικά με χαμηλή έκφραση ALDH1 στους μυοϊνοβλάστες και υψηλή έκφραση στα επιθηλιακά κύτταρα σχετιζόταν με μικρότερο διάστημα ελεύθερη νόσου επιβίωσης, αλλά και συνολικής επιβίωσης. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν το σημαντικό ρόλο των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων επιθηλίου-στρώματος κατά την καρκινογένεση στο παχύ έντερο και επισημαίνουν τα πολύπλοκα μοριακά δίκτυα που ρυθμίζουν τη λειτουργία των κυττάρων. Η συστημική προσέγγιση των επιθηλιακών κυττάρων και της παθολογίας τους προϋποθέτει τη μελέτη των μορίων τους μέσα σε πολύπλοκα δίκτυα που επηρεάζουν τη δράση τους με μη γραμμικό τρόπο και περιλαμβάνει αμφίδρομες αλληλεπιδράσεις από τα περιβάλλοντα κύτταρα. / Background. The stochastic model of carcinogenesis is recently challenged by the stem cell model. The later suggests that cancer develops from uncontrolled proliferation and aberrant differentiation of adult stem cells or progenitor cells that acquire stem cell-like properties. Microenvironment regulates function and differentiation of normal epithelial cells creating a protective niche for stem cells. Additionally, microenvironment plays a critical role in induction and progression of carcinomas. Both mutations in adult stem cells and changes in signals emanating from the stem cell niche contribute to the initiation of carcinomas. Recent findings suggest a protective role of estrogens in colorectal carcinogenesis. However, estrogens exert various actions on cells depending on the molecular microenvironment and their cross-talk with intracellular cascades and coregulators of transcription. Additionally, estrogens modulate the function of stromal cells and might influence carcinogenesis by indirect actions. Elucidation of the molecular networks implicated in estrogen signaling is very important in view of the potential use of selective estrogen receptor modulators in chemoprevention and targeted anticancer therapy. Materials and methods. An immunohistochemical study was designed to analyze the estrogen receptors α and β and the various co-regulators of transcription expression of along with that of a proposed functional stem cell marker, ALDH1, in normal colonic mucosa, adenomas and colorectal carcinomas. One hundred seven cases of colorectal carcinoma were retrieved from the Pathology files of the University Hospital of Patras, Greece. None of the patients had received preoperative chemotherapy or radiotherapy. All female patients were at the postmenopausal age. Follow-up was available for all patients. Paired normal mucosa and adenoma specimens were evaluated in 77 and 29 cases, respectively, in an effort to examine the whole spectrum of the multistage progression of colorectal carcinogenesis. Primary antibodies against ERα, ERβ1, AIB-1, TIF-2, PELP1, NCoR and ALDH1 and the Envision polymer-based detection system were employed. Epithelial cells and stromal myofibroblasts were separately assessed. α-SMA and CD34 staining of serial histologic sections was valuable for the recognition of the myofibroblastic nature of the cells. Results. ERα expression was extremely rare and was noted in <1% of the epithelial cells in two cases of colorectal carcinoma. ERβ1, TIF-2, and NCoR were expressed in the nuclei and cytoplasm of epithelial cells and myofibroblasts. AIB-1 and PELP-1 were expressed in the nuclei of epithelial cells and myofibroblasts. PELP-1 displayed a dot-like pattern of staining in the nuclei of cells that is possibly attributed to the presence of focally increased concentration of PELP1 in multiprotein co-regulator complexes within the nuclei of cells. Statistical analysis revealed that nuclear and cytoplasmic expression of ERβ1 and TIF-2 and nuclear expression of AIB-1 and PELP1 in myofibroblasts increased from normal mucosa through adenoma to carcinomas. NCoR was expressed in the cytoplasm of carcinoma-associated fibroblasts but not in myofibroblasts of normal mucosa. Thus, various components of estrogen signaling namely ERβ1 (both genomic and non-genomic actions-associated localization) and co-regulators of transcription, are enhanced in cancer associated myofibroblasts, whereas co-repressor NCoR is expressed in the cytoplasm of the cells implying that ER signaling is enhanced in myofibroblasts of carcinomas. In contrast, nuclear expression of ERβ1, AIB-1, TIF-2, and PELP-1 in epithelial cells was not different among normal mucosa, adenomas and carcinomas. Cytoplasmic expression of ERβ1 was higher in colorectal carcinomas, implying activation of non-genomic actions of ERβ in colorectal carcinogenesis. A translocation of NCoR from the nucleus to the cytoplasm was noted in colorectal carcinomas, since nuclear expression was more common in normal mucosa and cytoplasmic expression was noted in the majority of carcinomas. Cytoplasmic expression of NCoR in epithelial cells was associated with favorable prognosis. These findings might suggest that derepression of NCoR repressed transcription is an important feature of colorectal carcinogenesis and correlates with patients’ prognosis. ALDH1 expression was noted in the nuclei and the cytoplasm of myofibroblasts and epithelial cells. Expression in myofibroblasts was more often noted in carcinomas compared to normal mucosa and was associated with absence of metastasis and favorable prognosis. Epithelial cells of normal mucosa expressed high levels of ALDH1 expression. A distinct pattern of ALDH1 expression along the crypt axis was noted. Nuclear expression was more common and cytoplasmic expression was intensified at the base of the crypts (compartment where epithelial stem cells reside) compared to superficial epithelium. Carcinomas displayed heterogenous expression of ALDH1 in epithelial cells. Increased cytoplasmic expression was associated with the presence of metastasis and poor prognosis. Thus, ALDH1 expression had distinct impacts on metastatic potential of carcinomas and patients’ prognosis, accordingly to the cell where it is expressed. Additionally, patients with increased expression in epithelial cells and decreased expression in myofibroblasts had worse prognosis compared to patients displaying all other combinations of ALDH1 expression in epithelial cells and myofibroblasts. Our findings imply a possible role of ALDH1 as a stem/progenitor cell marker in normal mucosa. The association of ALDH1 expression in malignant cells with metastatic potential and worse prognosis implies that it might represent a marker of carcinomas with increased stem/progenitor cell content. The favorable prognostic role of ALDH1 expression in myofibroblasts might be associated with its role in local retinoic acid production. Retinoic acid has various tumor suppressive roles in colorectal carcinomas and can potentially be used in chemopreventive or chemotherapeutic strategies especially in patients with low local production levels. Thus, a comprehensive analysis of molecular networks both in any single cell and among the different cells of colorectal carcinomas and non neoplastic mucosa are mandatory in order to elucidate the role of estrogen signaling in colorectal carcinogenesis in view of development of targeted clinical applications. Conclusions 1.ERβ is the predominant estrogen receptor in colonic tissue. 2.ERβ1 dependent signaling is enhanced in cancer-associated myofibroblasts. 3.PELP1 is associated with genomic actions in both epithelial cells and myofibroblats. 4.In epithelial cells, loss of NCoR nuclear expression correlates with colorectal carcinogenesis possibly through derepression of transcription mediated by various transcription factors. 5.ALDH1 emerges as a marker of normal and cancer stem cells of colorectal carcinomas.

Ο έλεγχος της έκφρασης των πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν τον Λείο Μυικό Φαινότυπο (ΛΜΦ) είναι εξαιρετικής σημασίας για την κατανόηση, σε μοριακό επίπεδο, διεργασιών που σχετίζονται με πολλές φυσιο-παθολογικές καταστάσεις στον άνθρωπο. Μεταξύ των ασθενειών όπου ο ΛΜΦ είναι καθοριστικής σημασίας για την ανάπτυξη και εξέλιξή τους, είναι η αθηροσκλήρωση, η υπέρταση, η επαναστένωση των αρτηριών μετά από αγγειοπλαστική, η ίνωση οργάνων όπως οι πνεύμονες, το ήπαρ και οι νεφροί, και η ανάπτυξη μεταστάσεων από συμπαγείς όγκους. Επομένως, κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που οδηγούν σε τροποποίηση του ΛΜΦ είναι βασικής σημασίας για την αναγνώριση στρατηγικών περιορισμού της εξέλιξης των νόσων αυτών και της εκδήλωσης των κλινικών συνεπειών τους. Αρχικό στόχο αποτέλεσε η ανάπτυξη και καθιέρωση ενός in vitro προτύπου συστήματος για την διαφοροποίηση μη διαφοροποιημένων κυττάρων προς φαινότυπο που προσομοιάζει με αυτό των Λείων Μυικών Κυττάρων (ΛΜΚ), ώστε να χρησιμεύσει στη μελέτη του μοριακού καθορισμού και ελέγχου του φαινότυπου των κυττάρων αυτών. Πρώτα-πρώτα, χαρακτηρίσαμε βασικά, σημαντικά «μοριακά εργαλεία» για την διαπίστωση και μοριακή διερεύνηση του ΛΜ-φαινοτύπου. Χρησιμοποιώντας τα, αναπτύξαμε και χαρακτηρίσαμε πρωτογενώς ένα πρότυπο σύστημα διαφοροποίησης σε ΛΜΚ, βασιζόμενο σε Μεσεγχυματικά Βλαστικά Κύτταρα (ΜΒΚ) προερχόμενα από γέλη Wharton ομφάλιου λώρου. Στα κύτταρα αυτά, η έκφραση γονιδίων και πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν τον ΛΜΦ εξαρτάται από την επαρκή έκφραση της πρωτεΐνης Serum Response Factor (SRF), από την ύπαρξη αλληλουχιών Serum Response Element (SRE) στον υποκινητή των εξεταζόμενων ΛΜΚ-ειδικών γονιδίων, και επάγεται από εξωγενή έκφραση της Μυοκαρδίνης. Επομένως, όπως έχει περιγραφεί και για άλλα πρότυπα συστήματα, η διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών σε κύτταρα που προσομοιάζουν ΛΜΚ στηρίζεται στην συνέργεια δύο μεταγραφικών παραγόντων, του SRF και της Μυοκαρδίνης. Το πρότυπο αυτό θα είναι χρήσιμο για να διερευνήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης φυσιολογικών και φαρμακολογικών παραγόντων στον έλεγχο του ΛΜΦ. Επί πλέον, το πρότυπο σύστημα αυτό δύναται να αποβεί χρήσιμο για την κατανόηση εν γένει διεργασιών που οδηγούν στην βασική κυτταρική αλλαγή γνωστή ως Επιθηλιακή-Μεσεγχυματική Μετάβαση (ΕΜΤ) και κατ’ επέκταση για την κατανόηση μηχανισμών παθογένειας πλείστων νόσων που χαρακτηρίζονται από ΕΜΤ. Παράλληλα, έγινε προσπάθεια διερεύνησης αν η κυτταρική σειρά A7r5 αγγειακών ΛΜΚ αποτελεί βιώσιμο φαρμακολογικό σύστημα για την διερεύνηση των μηχανισμών μέσω των οποίων η έκφραση του ΛΜΦ ελέγχεται σε μοριακό επίπεδο από τους αδρενεργικούς υποδοχείς, μία οικογένεια υποδοχέων που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση του αγγειακού τοιχώματος και στην αρτηριακή παθοφυσιολογία. Δείξαμε ότι ο κυτταρικός πληθυσμός A7r5 δεν απαντά σε α1-αδρενεργική διέγερση διότι στερείται α1-αδρενεργικών υποδοχέων. Διέγερση αποκτάται με εισαγωγή μέσω πλασμιδίου α1-αδρενεργικών υποδοχέων, άρα το ενδογενές σηματοδοτικό σύστημα είναι παρόν και λειτουργικό. Επιπρόσθετα, ανακαλύψαμε ότι τα κύτταρα A7r5 εκφράζουν ενδογενώς λειτουργικούς β-αδρενεργικούς υποδοχείς. Θέτουμε έτσι τα θεμέλια για μία σε βάθος διερεύνηση του τυχόν ρόλου των β-αδρενεργικών υποδοχέων στον έλεγχο του φαινοτύπου των αγγειακών ΛΜΚ, ο οποίος είναι καθοριστικός για την γένεση και πορεία των καρδιαγγειακών νοσημάτων εν γένει. Συμπερασματικά λοιπόν α) τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα προερχόμενα από τη γέλη Wharton ανθρώπινου ομφάλιου λώρου αποτελούν κατάλληλο πρότυπο σύστημα διερεύνησης της ρύθμισης των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση προς ΛΜΚ από μόρια φαρμακολογικής σημασίας, και β) τα κύτταρα A7r5 αποτελούν καλό πρότυπο σύστημα για την διερεύνηση του τυχόν ρόλου των β-αδρενεργικών υποδοχέων στον έλεγχο του φαινοτύπου των ΛΜΚ των αγγείων. / The control of the genes that specify the Smooth Muscle Cell Phenotype is of great importance for our understanding, at a molecular level, of the processes central in a number of human pathologies. Among the diseases whose onset and progress is influenced by alterations in Smooth Muscle-Like (SM-L) phenotype are atherosclerosis, organ fibrosis (lung, liver and kidney), and metastasis associated with solid tumors. For these reasons, the understanding of the cell and molecular mechanisms that lead to changes in the SM phenotype expression are of central importance in our efforts to identify new approaches in limiting the progress of these diseases and the manifestation of the associated clinical symptoms. The first Aim of this work was the development and initial characterization of an in vitro model of differentiation towards a Smooth-Muscle-Like phenotype, to serve for the study of its molecular control. Initially, we characterized basic important molecular tools useful in determining the SM-L phenotype. With their aid, we developed and characterized a model system based on Wharton’s Jelly-derived Mesenchymal stem Cells (MSCs). In these cells, the expression of genes and proteins characteristic of the SM Phenotype depends on the protein levels of Serum Response Factor (SRF) and on the existence of SRF-binding elements on the promoters of the SM-specific genes; it is also potently induced by the exogenous expression of the transcription factor Myocardin. Therefore, this population of MSCs behaves as other characterized model systems, in that their differentiation to a SM-L phenotype is supported by the synergistic action of SRF and Myocardin. This novel model system based on Wharton’s Jelly MSCs will be useful to study the role of specific physiological and pharmacological agents in the control of the SM phenotype. In addition, such a system can offer insights in the basic cellular process of Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) and by extent, in the pathological mechanisms of diseases characterized by EMT. In parallel, we investigated whether the differentiated SMC line A7r5 is a viable pharmacological model system to investigate the control of the SMC phenotype by adrenergic receptors, a family of receptors that plays a crucial role in the homeostasis of the vessel wall. We showed that A7r5 cells do not express functional α1-adrenergic receptors; however, the intracellular signaling system linked to α-adrenergic receptors is present and functional. In contrast, A7r5 cells endogenously express functional β-adrenergic receptors, and A7r5 cells are therefore an attractive model to study the role of these receptors in the control of the SMC-phenotype. In conclusion, a) Mesenchymal Stem Cells from Wharton’s Jelly surrounding the human umbilical cord are a suitable in vitro model for the study of the molecular mechanisms that modulating Smooth Muscle Cell differentiation, and b) A7r5 cells are a good in vitro model system to investigate the role of the β-adrenergic receptor in controlling the phenotype of Vascular Smooth Muscle cells.

Η παρούσα εργασία αφορά στη μελέτη της ανταγωνιστικής αλληλεπίδρασης των Α1/D1 υποδοχέων στο επίπεδο έκφρασης του πρώιμου γονιδίου zif/268 (δείκτης νευρωνικής δραστηριότητας) και της in vivo μεταγωγής σήματος των Α1 και Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση στο μυ weaver. Ο μυς weaver αποτελεί ένα γενετικό μοντέλο ντοπαμινεργικής απονεύρωσης, η οποία συμβαίνει σταδιακά, έτσι ώστε το μοντέλο αυτό να προσομοιάζει τη Νόσο Πάρκινσον (ΝΠ) στον άνθρωπο. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης προέκυψε το ενδιαφέρον αποτέλεσμα ότι με την ταυτόχρονη ενεργοποίηση των Α1 και D1 υποδοχέων παρατηρήθηκε η αναμενόμενη ανταγωνιστική αλληλεπίδραση (ενδεχομένως μέσω σχηματισμού του ετεροδιμερούς), ενώ με την ενεργοποίηση μόνο των Α1 υποδοχέων στους weaver μύες παρατηρήθηκε αυξημένη ενεργοποίηση των νευρώνων του ραβδωτού σώματος και συγκεκριμένων περιοχών του εγκεφαλικού φλοιού. Η ενεργοποίηση αυτή ήταν μη αναμενόμενη, δεδομένου ότι οι Α1 υποδοχείς (A1Rs) είναι συζευγμένοι με Gi πρωτεΐνες και καταστέλλουν τη μεταγωγή σήματος που οδηγεί στην επαγωγή του zif/268 μέσω του D1R/Gs/cAMP/PKA/pDARPP-32/pCREB μονοπατιού. Η ακόλουθη διερεύνηση του μηχανισμού έδειξε ότι η Α1R-επαγόμενη ενεργοποίηση του zif/268 καταστέλλεται από τον ειδικό ανταγωνιστή των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης (A2ARs) ZM241385 και από τον ειδικό αγωνιστή των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης Quinpirole, υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση των Α2ΑRs και άρα ενεργοποίηση της έμμεσης οδού. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε, δεδομένου ότι η διέγερση των Α1Rs προκάλεσε αύξηση της έκφρασης του mRNA της εγκεφαλίνης, αλλά όχι της δυνορφίνης, που αποτελούν δείκτες ενεργοποίησης της έμμεσης και της άμεσης οδού, αντίστοιχα. Το γεγονός ότι ο αγωνιστής των Α1Rs δεν προκαλεί στα φυσιολογικά ζώα ενεργοποίηση του zif/268 mRNA υποδεικνύει την υπερευαίσθητη απόκριση των Α2ARs. Η μελέτη της υπερευαίσθητης αυτής απόκρισης στο μυ weaver έγινε με τη διερεύνηση της μεταγωγής σήματος μετά από in vivo ενεργοποίηση των Α2ΑRs: α) του καθιερωμένου μονοπατιού Α2ΑRs/Gs/AC/cAMP/PKA/pDARPP-32/pCREB, το οποίο οδηγεί στη επαγωγή του zif/268 και β) του μονοπατιού των ΜΑΡΚ. Τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης της DARPP-32 στη θέση Thr-34. Τα αυξημένα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης DARPP-32 πολλαπλασιάζουν τη δράση της ΡΚΑ και άρα διευκολύνουν τη μεταγωγή σήματος μέσω Α2ΑRs/Gs/AC/cAMP/PKA/pDARPP-32/pCREB μονοπατιού. Επομένως, η υπερευαίσθητη απόκριση των Α2ΑRs κάτω από την έλλειψη ντοπαμίνης στο μυ weaver φαίνεται να οφείλεται στα αυξημένα ενδογενή επίπεδα της φωσφορυλιωμένης DARPP-32. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών ERK1/2(MAPK44/42) είναι αυξημένα στον μυ weaver, αλλά μειώνονται σημαντικά μετά από την ενεργοποίηση των Α2ΑRs. Δεν γνωρίζουμε το μηχανισμό μέσω του οποίου αυξάνονται τα ενδογενή επίπεδα των ERK1/2 και πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Το συμπέρασμα όμως που εξάγεται είναι ότι κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση η μεταβίβαση σήματος μέσω των Α2ΑRs δεν ενεργοποιεί την οδό των MAP κινασών. Στην παρούσα in vivo μελέτη αναδεικνύεται ο ρόλος των Α1 και Α2Α υποδοχέων στην λειτουργία των βασικών γαγγλίων κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν ιδιαίτερη σημασία δεδομένου ότι εμφανίζονται σε ένα γενετικό μοντέλο παρκινσονισμού, στο οποίο η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων είναι σταδιακή και προσομοιάζει τη ΝΠ, και όχι οξεία, όπως σε άλλα τοξικά μοντέλα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζουν ενδεχομένως κλινικό ενδιαφέρον, δεδομένου ότι η ενεργοποίηση της έμμεσης οδού μέσω Α1Rs από την ενδογενή αδενοσίνη θα επιδείνωνε περαιτέρω τις κινητικές δυσλειτουργίες της ΝΠ. Η πληροφορία αυτή, καθώς και η γνώση για την ενισχυμένη μεταγωγή σήματος μέσω των Α2Α υποδοχέων ενισχύουν την πρόταση για χρήση των Α2Α ανταγωνιστών ως αντιπαρκινσονικά φάρμακα. Δεδομένου ότι σήμερα το ενδιαφέρον είναι στραμμένο στη δημιουργία διμερών προσδεμάτων (bivalent ligands) που μπορούν να δρουν ταυτόχρονα σε δύο υποδοχείς, η συγκεκριμένη πληροφορία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για μελλοντική δημιουργία φαρμακευτικού σχήματος που να δρα ταυτόχρονα ως αγωνιστής των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης και ως ανταγωνιστής των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης. / The present work studied the antagonistic interaction of A1/D1 receptors at the level of mRNA expression of the immediate early gene zif/268 (used as a marker of neuronal function). In parallel we studied the in vivo signal transduction of A1 and A2A adenosine receptors under dopamine deficiency in weaver mutant. The weaver mutant represents the only genetic animal model of gradual nigrostriatal neuron degeneration, which can be characterized as a pathophysiological phenocopy of Parkinson’s Disease. In the first part of the study, the co-activation of A1 and D1 receptors revealed the well-known antagonistic interaction of these receptors (possibly through the formation of A1/D1 heterodimer) in weaver mutant. An interesting result was that the activation of A1 receptors alone did induce zif/268 mRNA expression in stiatal and specific cortical neurons in weaver mutant. This induction was not expected, since A1 receptors are Gi-coupled and suppress the signal transduction pathway that leads to zif/268 induction through AC/PKA/p-DARPP-32/pCREB cascade. Further study, revealed that the A1 receptor-induced zif/268 mRNA expression is counteracted by the A2A receptor selective antagonist ZM241385 and by the D2 receptor selective agonist Quinpirole, suggesting the activation of A2A receptors and thus the activation of the “indirect pathway”. Moreover, A1 receptors activation induced the expression of enkephalin mRNA, but not of dynorphin, which are considered as marker of neuronal activation of the “indirect” and the “direct” pathway, respectively. The fact that the A1 receptor agonist did not induced zif/268 mRNA expression in +/+ animals indicates that under dopamine deficiency the A2A receptors react with a supersensitive response. This response was analyzed in weaver mouse after in vivo A2A receptor activation: a) by examining the classical signal transduction pathway of A2A receptors/AC/PKA/p-DARPP-32/pCREB, which leads to zif/268 expression and b) by studying the MAPK cascade. Results showed increased basal phosphorylation levels of DARPP-32 (dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein, MW 32kDa) of Thr-34 in weaver compared to control mice. Increased phosphoThr34-DARPP-32 would amplify the effects of the PKA and thus facilitating the signal transduction through A2A receptors/AC/PKA/p-DARPP-32/pCREB. Therefore, the A2A receptors supersensitive response under dopamine deficiency in weaver mutant seems to be due to elevated endogenous phosphorylation levels of DARPP-32. Interestingly, while the basal phosphorylation levels of ERK1/2 (MAPK44/42) are elevated in weaver mutant, they are significantly reduced after A2A receptor activation. Although we do not know the mechanism through which the endogenous ERK1/2 levels are elevated, the conclusion is that, under dopamine deficiency, A2A receptors do not activate MAPK cascade. The present in vivo study demonstrates the role of A1 and A2A adenosine receptors in the function of basal ganglia under dopamine deficiency. Our results are significant since the expreriments were performed in a genetic parkinsonian model, in which the dopaminergic neurons are gradually degenerated and thus simulate the human PD, and not in an acute toxic model. Moreover, these results could be of possible clinical relevance, since the activation of A1 receptors by endogenous adenosine would exaggerate the motor dysfunctions of PD. Furthermore, the enhanced signal transduction pathway through A2A receptors supports the suggestion that the A2A receptor antagonists as antiparkinsonian agents. Given the well-known A2A/D2 antagonistic interaction, new therapeutical prospectives would involve the development of pharmacological bivalent ligands, which can interact with the A2A/D2 receptors and act simultaneously as A2A receptor antagonists and as D2 receptor agonists.