PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence. / PHEX is an important protein in the process of osseous mineralisation. Mutations or deletions of a part of the PHEX gene cause X-linked hypophosphatemia (XLH). This disease is characterized by hypophosphatemia, accompanied by defects of bone mineralisation, rickets and osteomalacia. With the hypophosphatemia, the circulating levels of vitamin D should be increased, which is not the case where an abnormal regulation of the production of vitamin D takes place. However, in spite of the fact that this protein is a peptidase, no physiological substrate has been identified. PHEX is a membrane type II integral protein member of the M13 family of zinc metalloendopeptidasee. These proteins have a short N-terminal cytosolic domain, a transmembrane domain of approximately 20 amino acids and a large extracellular C-terminal portion where the active site of the enzyme is located. PHEX is expressed predominantly in bones and teeth in osteoblasts and odontoblasts, respectively. PHEX is expressed at initiation of mineralization. Patients suffering from XLH and the Hyp mouse, which has been used widely as an animal model of the human disease, show large quantities of the FGF23 protein. Moreover, FGF23 is implicated in another disease connected to phosphate metabolism, the autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR) where activating mutations in FGF23 cause roughly the same symptoms as XLH. FGF23 is produced mainly by osteoblasts and osteocytes. FGF23 causes hypophosphatemia by decreasing the expression of the type II sodium phosphate cotransportor, partly responsible for renal phosphate reabsorption. The hypothesis suggested in the literature would be that PHEX would activate or inactivate important peptides for osseous mineralisation. More specifically, the activation or the inactivation of these peptides would have a role in the control of FGF23 expression. According to the assumption mentioned previously, the regulation of PHEX could thus have an effect on mineralization. An increasing quantity of data on the regulation of PHEX is now available. For example, vitamin D decreases the expression of PHEX while glucocorticoids and growth hormone increase its expression. In a first study, we examined the possibility that a peptide connected to osseous mineralization could control the expression of PHEX. We determined that PTHrP1-34 can control in a negative way the expression of PHEX in UMR-106 cells, a cell line of osteoblastic origin. This regulation involves the cAMP/protein kinase A pathway. Moreover, this decrease in PHEX expression is also observed at day 7 in primary cultures of mineralizing rat osteoblasts. Next, we looked more closely at PHEX cellular localization. We used a mutant of PHEX, mutant E4Q identified in an XLH patient, where the mutated amino acid is found in the cytosolic domain of PHEX. This change does not interfere with the catalytic site of the enzyme since this PHEX mutant can still cleave a synthetic substrate as well as wildtype protein. This mutation disrupts a di-acidic motif present in the cytosolic domain of PHEX. We showed that this di-acidic motif is reponsible for the interaction of PHEX with COPII, a protein complex involved in the formation of secretion vesicles. Moreover, it would seem that this di-acidic motif is important, probably by its interaction with COPII, to the incorporation of PHEX in matrix vesicles, which are important in the mineralization process. Finally, competition assays showed that mineralization could be disturbed when the wildtype PHEX cytosolic tail is overexpressed, as opposed with the mutated cytosolic tail. This suggests that the interaction with COPII and the subsequent incorporation of PHEX in matrix vesicles or other proteins that possesses this motif could be important for mineralization. Finally, the last study examined the role of FGF23 on mineralization. We showed, by the overexpression of FGF23 in the mouse MC3T3 osteoblast cell line, that FGF23 can cause senescence of these cells. On the other hand, proliferation is not affected. Moreover, differentiation seems to occur at a faster rate, as indicated by earlier mineralization. Overexpression of FGF23 would accelerate differentiation and induce senescence. This is in agreement with the literature where KLOTHO, a FGF23 cofactor that increase the affinity of FGF23 for its receptor, when inactivated, shows a similar phenotype that includes senescence and aging.

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O objetivo desse estudo foi avaliar a citotoxicidade do alendronato de sódio (ALN), em diferentes concentrações, sobre osteoblastos em cultura celular. Foi utilizado para o experimento meio sem droga (controle) e meio contendo a droga em diferentes concentrações a saber: 0,5; 1; 5; 10; 20 e 40 mg/ml. Para o estudo foi utilizado uma linhagem de osteoblastos de rato (Osteo-1). A viabilidade celular foi inferida a partir da análise da atividade mitocondrial das células através do método da redução do MTT nos tempos experimentais de 0, 24, 48 e 72 horas. Após análise estatística (teste de Mann-Whitney, p<0,05), os resultados mostraram que, com exceção da concentração de 40mg/ml, todos os grupos apresentaram células viáveis, embora todas as concentrações de ALN tenham reduzido a atividade mitocondrial em mais de 50% em relação ao grupo controle, sugerindo que o ALN nessas concentrações estudadas foi citotóxico para os osteoblastos. / The aim of this study was to analyze the cytotoxicity of a bisphosphonate (sodium alendronate) on rat osteoblasts. The experimental groups were GI (control) no sodium alendronate, and GII, GIII, GIV, GV, GVI, and GVII with sodium alendronate at the concentrations of 0.5, 1, 5, 10, 20, and 40mg/ml, respectively. The cell viability was evaluated by MTT assay in experimental times 0, 24, 48, and 72 h. Data were statistically analyzed. Cultures treated with sodium alendronate showed cell viability percentages significantly lower (p < 0.05) than those of the control groups. In GVII, no viable cell was observed in all experimental times. It could be concluded that sodium alendronate, on direct contact with rat osteoblasts, is cytotoxic in all concentrations studied.

A fotobioestimulação por laser e LED é uma tendência terapêutica inovadora e não invasiva. Os efeitos fotofísicos e fotoquímicos dessa terapia geram imunomodulação, aceleram a cicatrização e angiogênese, bem como reduzem a dor. Dessa forma tem se buscado o emprego desses estímulos no tecido ósseo, porém ainda inexistem padrões definidos para obter a melhor fotobioestimulação nas células ósseas. O objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade da fotobioestimulação na viabilidade celular e mineralização de células da granulação óssea de ratos (rGO). Células rGO na 6ª passagem foram plaqueadas em placas de 96 poços para os ensaios de viabilidade celular (1x10³) e em placas de 24 poços para os ensaios de cicatrização de feridas in vitro (1x104), mineralização e atividade da fosfatase alcalina (FALC) (4x104). As células receberam DMEM (10% SFB) e irradiações com laser (AlGaAs- 660nm e AlGaInP-810nm) e LED (637±15nm). Os grupos experimentais foram: laser vermelho (3 e 5 J/cm²), laser infravermelho (3 e 5 J/cm²) e LED (3 e 5s), além dos grupos controles, positivo (C+) e negativo (C-, 1%SFB). Para os ensaios de mineralização e atividade de fosfatase alcalina, além do meio convencional, grupos com meio osteogênico e os mesmos tratamentos luminosos foram acrescentados. A viabilidade celular foi avaliada pelos testes do MTT e cristal violeta nos períodos de 24, 48, 72 e 96h. O ensaio de cicatrização de feridas in vitro foi avaliado por meio da porcentagem da área de fechamento da ferida nos períodos de 12, 24, 36, 48h. O teste de mineralização foi feito por meio do teste com vermelho de alizarina nos períodos de 14, 21 e 28 dias enquanto que a atividade da FALC foi medida em 7, 14 e 21 dias. A análise estatística foi realizada através dos testes ANOVA complementados por Tukey (p<0,05). Os resultados mostraram que as terapias com luz de maneira geral aumentaram a viabilidade o fechamento da ferida in vitro, principalmente os grupos laser vermelho e LED5s (p<0,05). Pode-se observar um bom desempenho do grupo LED5s no ensaio de mineralização, onde nos grupos que receberam meio osteogênico houve um efeito somatório com a ação da fotobioestimulação promovendo maior produção de nódulos in vitro. Também, as terapias com luz, estimularam a produção de nódulos mineralizados nos grupos que receberam meio convencional de forma a superar o C+ osteogênico (p<0,05), denotando uma ação de indução osteogênica a partir da fotobioestimulação. A fosfatase alcalina foi estimulada pelos tratamentos com luz no período de 7 dias (p<0,05). Em conclusão, as terapias com laser e LED foram capazes de estimular a viabilidade e migração celular e eventos de mineralização em osteoblastos, sendo que o laser vermelho e LED promoveram os melhores resultados. / Photobiomodulation by laser and LED is a new therapeutic non-invasive trend. Photophysical and photochemical effects occur in immunomodulation, acceleration of wound healing and angiogenesis and reduction of pain. These effects are desired in bone tissue but there are no defined parameters for light irradiation and no consensus for the best effect on osseous cells. The aim of this study was to evaluate photobiomodulation effects on cell viability and mineralization events of rat osseous granulation cells (rGO). Cells in 6th passage were plated in 96-well plates for viability tests (1x10³ cells), and 24-well plates for in vitro wound healing test (1x104 cells), mineralization and alkaline phosphatases (AF) activity (4x104 cells). Cells were cultured in DMEM (10% bovine fetal serum) and irradiation with lasers (AlGaAs-660nm e AlGaInP-810nm) and LED (637±15nm). Experimental groups were red laser (3 and 5 J/cm²), infrared laser (3 and 5 J/cm²), LED (3 and 5s), positive(C+) and negative controls (C-, 1% bovine fetal serum). For mineralization and AF assays, other groups with osteogenic medium and same light treatments were added. Cell viability was evaluated by MTT and crystal violet tests at 24, 48, 72 and 96h. In vitro wound healing test evaluated the percentage of wound closure area by cells migration at 12, 24, 36, 48h. Mineralization test was done by alizarin red at 14, 21 and 28 days. AF activity was measured at 7, 14 and 21 days. Statistical analysis was performed by ANOVA complemented by Tukeys test (p<0,05). Results showed that light therapies in general increased viability and wound healing closure, mostly red laser and LED5s (p<0,05). Best results in mineralization stimulation were observed for LED5s. In groups with osteogenic medium, a synergistic effect of photobiomodulation resulted in higher numbers of mineral nodules. Light groups stimulated higher mineral nodule formation than positive control (p>0.05) even in groups with regular medium, showing an osteogenic induction by light. Increased AF activity was observed at 7 days in light treatment groups (p<0,05). In conclusion, laser and LED photobiostimulation increased viability, cell migration and mineralization events in osteoblasts with best results for red laser and LED.

A técnica do enxerto de granulação óssea tem demonstrado bons resultados na recuperação do periodonto e na melhora dos parâmetros clínicos dos dentes com comprometimento periodontal. Pouco se sabe porém, a respeito de qual tipo de tratamento de superfície radicular se faz mais condizente com o emprego dessa técnica. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a proliferação de células de granulação óssea sobre fragmentos radiculares com os seguintes tratamentos de superfície: Controle - somente raspagem, EDTA, terapia fotodinâmica (PDT- laser InGaAIP - 30mW, 30s, 45J/cm², 660nm + azul de toluidina), e ácido cítrico com tetraciclina. Todos os grupos teste receberam previamente tratamento com raspagem e alisamento com 20 golpes de cureta. Células de granulação óssea foram cultivadas em quadruplicata sobre os fragmentos por um período de 24, 48 e 72 horas. Após esse período de cultivo os fragmentos foram fixados para análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Cinco campos por fragmento foram usados para a visualização e contagem de células aderidas a superfície radicular (centro, campo superior direito e esquerdo e campo inferior direito e esquerdo). A análise da calibração do examinador foi feita através de uma combinação de testes estatísticos como erro casual de Dahlberg, erro sistemático e correlação de Pearson (p<0,05). A análise da amostra foi realizada através do ANOVA de medidas repetidas complementado por Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05). Os resultados demostraram diferenças estatisticamente significantes, quanto ao numero de células, para as superfícies tratadas com terapia fotodinâmica no período de 72 h (p<0,05). Através de nossos resultados concluímos que o tratamento radicular com terapia fotodinâmica favorece a proliferação de células de granulação óssea humanas in vitro. / The osseous granulation graft has been demonstrating good results on the periodontal healing, resulting the improvement of clinical periodontal parameters. There are very few knowledge about what kind of dental surface would be more proper for the application of this technique. The aim of this study was to evaluate the proliferation of osseous granulation cells on human root fragments treated by different techniques as scaling and root planning (control), citric acid plus tetracycline, EDTA and photodynamic therapy (PDT InGaAIP, 45J/cm², 30mW, 30s, 660nm, toluidine blue O). All test groups were previously treated which 20 curette strikes. Osseous granulation cells was culture in quadruplicate on these fragments for 24h, 48h and 72h. After that, all fragments were fixed and prepared for analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). Aiming to counting the cells adhered on the roots, we obtained electron micrographs of 5 areas (center, upper right and left field, lower right and left field). The examiner calibration was analyzed by Dahlberg Casual Error measurement, systematic error test and Pearson correlation test (p<0.05). Statistical analysis was performed by ANOVA, followed by Tukey test, with a 5% level of significance (p<0.05). There were significant differences in cell number after 72h culture in favor of PDT group (p<0,05). We can conclude that the surface treatment of roots which PDT favor the proliferation of osseous granulation cells in vitro.

Dental implants are designed to replace tooth loss, due to periodontal diseases, trauma or decay. Among the biomaterials used for this purpose, titanium and zirconia have been investigated for some years, with excellent mechanical properties and biocompatibility. Surface treatments such as anodizing, with the incorporation of Mg, Ca and P in the structure of the titanium oxide films, were used in order to increase tribocorrosion resistance and improve the osseointegration process. The cellular response to surfaces is mediated, among other factors, by the extracellular matrix (ECM) . However, very little is still known about the ECM proteomics during mineralization. Our objective was a longitudinal comparison of osteoblastic behavior on different materials, in terms of mineralization volume and actin cytoskeleton status, associated with the proteomic analysis of the extracellular matrix. The three types of biomaterial surfaces (pure titanium, anodized titanium and zirconia) were imaged by confocal 3D microscopy and analyzed in terms of roughness. MC3T3 cells were cultivated on the biomaterials for 7, 14 and 21 days, with osteogenic medium containing calcein. The cells were then fixed, stained with Rhodamine phalloidin and DAPI, and imaged by confocal laser scanning microscopy. The quantification of mineralization and actin cytoskeleton was performed by a novel technique, based on the acquired 3D images. For the proteomic analysis, the specimens were washed, decellularized and the ECM was collected in buffer solution. The anodized titanium surface is more porous when compared to that of cp-Ti and zirconia, and superior mineralization was obtained over it after 21 days of culture. The actin microtubular volume was increased on the three materials on the first 14 days, but on the 21th day there was a reduction over anodized titanium and zirconia, related to mineralization phase.. Conclusion: The greater mineralization obtained over anodized titanium after 21 days demonstrated an improved response provided by the surface modification. The innovative volume quantification technique adopted was useful in providing information about the cellular status and biomaterial performance. Alpha-1_4 glucan phosphorylase and Glycogen phosphorylase brain form were down-regulated on zirconia after 7 and 14 days of culture, and up-regulated on Anod Ti on the 7th day, suggesting the influence of material surface roughness and chemical composition on energy metabolism. Proteins related to bone development, like TGF-3, were found exclusively on cp-Ti on the 21st day. The small number of identified proteins demonstrates that the chosen decellularization process was effective at reducing the proteome dataset. Altogether, our results reveal new insights regarding osseointegration and how material surfaces affect this process. / Implantes dentários são projetados para substituir a perda de dentes, que pode ser causada por doenças periodontais, traumas ou cáries. Entre os biomateriais utilizados para este fim, titânio e zircônia têm sido investigados durante alguns anos, com excelentes propriedades mecânicas e biocompatibilidade. Tratamentos de superfície como a anodização, com a incorporação de Mg, Ca e P na estrutura dos filmes de óxido de titânio, foram utilizados a fim de aumentar a resistência à tribocorrosão e melhorar o processo de osseointegração. A resposta celular às superfícies é mediada, entre outros fatores, pela matriz extracelular (ECM). No entanto, muito pouco ainda é conhecido sobre a proteômica da matriz óssea durante a mineralização. Nosso objetivo foi a comparação longitudinal do desempenho de osteoblastos em diferentes materiais em termos do volume da mineralização e do status do citoesqueleto de actina, associada à análise proteômica da matriz extracelular. Imagens dos três tipos de superfícies de biomateriais (titânio puro, titânio anodizado e zircônia) foram adquiridas por microscopia confocal 3D e analisadas em termos de rugosidade. Células MC3T3 foram cultivadas na superfície dos biomateriais durante 7, 14 e 21 dias, com meio osteogênico contendo calceína. As células foram então fixadas, coradas com faloidina-rodamina e DAPI, e levadas ao microscópio confocal de varredura a laser. A quantificação da mineralização e do citoesqueleto de actina foi feita por uma nova técnica, baseada em imagens 3D. Para a análise proteômica, os espécimes foram lavados, descelularizados e a matriz extracelular foi coletada em solução tampão. A superfície de titânio anodizado é mais porosa quando comparada com a de cp-Ti e zirconia e apresentou mineralização superior após 21 dias de cultura. O volume dos microtúbulos de actina foi aumentado sobre os três materiais nos primeiros 14 dias, mas no 21º dia houve uma redução relacionada ao aumento da mineralização sobre o titânio anodizado e zirconia. Conclusão: a mineralização superior obtida sobre o titânio anodizado após 21 dias de cultura demonstrou a melhoria provocada pela modificação de superfície. A nova técnica adotada para a quantificação do volume foi útil para fornecer informações sobre o status celular e o desempenho dos biomateriais. Alpha-1_4 glucano fosforilase e glicogênio fosforilase forma cerebral foram sub-expressas sobre a zircônia após 7 e 14 dias de cultura e sobre-expressas sobre o titânio anodizado no 7º dia, sugerindo a influência da rugosidade e composição química da superfície dos materiais no metabolismo de energia. Algumas proteínas relacionadas com o desenvolvimento ósseo, como a TGF- 3, foram encontradas exclusivamente sobre o cp-Ti no 21º dia. A pequena quantidade de proteínas identificadas demonstra que o processo de descelularização adotado foi eficiente em reduzir o conjunto de dados da análise proteômica. Em suma, nossos resultados revelam novos detalhes sobre a osseointegração e como a superfície dos materiais podem afetar esse processo.

O tratamento de superfície dos implantes dentários é um critério importante para a osseointegração. Considerando a variedade de modificações das superfícies encontradas, estas podem acelerar ou melhorar o processo de osseointegração. Para tanto foram estudadas as características da composição química e a rugosidade, a partir das quais foram encontradas diferentes respostas celulares em estudos comparativos in vitro. O objetivo deste estudo foi comparar a adesão e o crescimento dos OSTEO-1 em implantes dentários com diferentes tratamentos de superfície. Foram utilizados quatro tipos de implantes dentários comercialmente disponíveis, com os seguintes tratamentos de superfície: (A) jateamento e condicionamento ácido com revestimento de fosfato e cálcio (CaP); (B) duplo condicionamento ácido; (C) condicionamento ácido; (D) oxidação anódica. Os implantes de mesmo tamanho foram fixados com dispositivo biocompatível no fundo dos poços das placas de cultura de 12 poços e cobertas com meio de cultura de células. Os OSTEO-1 foram colocados no corpo do implante. Nos períodos de 24, 48 e 72 horas mais tarde, as culturas foram submetidas ao ensaio de redução de MTT para avaliar a viabilidade celular. Os dados foram utilizados para analisar a adesão celular (24h) e para obter as curvas de crescimento das células (24, 48 e 72h). Os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados foram comparados por ANOVA, complementado pelo teste de Tukey (p <0,05). Os OSTEO-1 aderiram ao corpo de todos os tipos de implantes testados. A maior taxa de crescimento celular foi observada em culturas semeadas sobre tratamento de superfície A. O menor crescimento celular foi apresentado por culturas semeadas no tratamento de superfície D (p <0,05). Com base nesta investigação in vitro é possível concluir que todos os implantes dentários testados, independentemente do tratamento de superfície, não são citotóxicos para os OSTEO-1. No entanto, as características físico-químicas do tipo de tratamento de superfície dos implantes dentários influencia o crescimento celular. A superfície A pareceu ter o comportamento mais compatível com os OSTEO-1, uma vez que promoveu mais crescimento celular. / The surface treatment of dental implants is a major feature for osseointegration. The variety of surface modifications found may be speed up or enhance the osseointegration process. In much was studied the chemical composition and characteristics of roughness, from which found different cellular responses in comparative studies in vitro.The aim of this study was to compare the adhesion and growth of osteoblast-like cells in response to dental implants characterized by different superficial treatments. Four types of dental implants with different superficial treatments were used. The commercially available implants presented the following superficial characteristics: (A) sandblasted with acid-etched and calcium phosphates (CaP) coating; (B) double acid-etched; (C) anodized, or (D) acid-etched. The implants of the same size (n= 3 per group/experimental time) were fixed with a biocompatible device on the bottom of the wells of 12 wells cell culture plates and covered with cell culture medium. Osteoblast-like cells (Osteo 1 cell line) were plated on the top of the implants (5x104 cells/implant). Twenty-four, 48 and 72 hours later, the cultures were submitted to the MTT reduction assay to assess cell viabilities. Data was used for analyze cell adhesion (24 h) and to obtain cell growth curves ( 24, 48 and 72 h). The experiments were done in triplicate. Data were compared by ANOVA complemented by the Tukey\'s test (p<0.05). Osteoblast-like cells adhered on the top of all types of implants tested. The highest cell growth was observed in cultures plated on the top of sandblasted with acid-etched and CaP coating surfaces. The smallest cell growth was presented by cultures plated on double acid-etched surfaces (p < 0.05). Based on this in vitro investigation, it is possible to conclude that all dental implants tested irrespective to the surface treatment, are non-cytotoxic for osteoblast-like cells. However, the physicochemical chacteristics of the type of dental implants surface treatment influences the cell growth. In fact, the surface treated by sandblasting with acid-etched and CaP coating seemed to the most compatible with osteoblast-like cell biology, once it promoted the highest cell growth.

A osseointegração de implantes de titânio (Ti) é dependente da interação entre a superfície de Ti e células, a qual é modulada por diversas vias de sinalização intracelular. Sabe-se que as quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs), membros da família das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), atuam tanto na osteogênese, quanto na adipogênese e, portanto, podem estar envolvidas no processo de osseointegração de Ti. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar se a interação entre células-tronco mesenquimais (CTMs) e superfícies de Ti usinada e com nanotopografia é modulada, ao menos em parte, por ERK1/2 e o consequente efeito da inibição dessas ERKs na diferenciação osteoblástica e adipocítica. Para isso, CTMs derivadas de medula óssea de ratos foram cultivadas sobre discos de Ti usinados e com nanotopografia em condições osteogênicas e adipogênicas, na presença ou não do inibidor de ERK1/2, PD98059, em concentração previamente determinada (25 &mu;M) e foram avaliados parâmetros relacionados à diferenciação osteoblástica e adipocítica. Os resultados mostraram que a expressão gênica dos marcadores osteoblásticos RUNX2, osterix (OSX), fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OC) foi aumentada pela inibição da via de sinalização de ERK1/2 nas células crescidas sobre Ti usinado e apenas ALP e OC, naquelas crescidas sobre Ti com nanotopografia. A expressão proteica de RUNX2 foi discretamente maior nas células crescidas sobre Ti usinado, mas não sobre Ti com nanotopografia, quando ERK1/2 foram inibidas e essa inibição não afetou a formação de matriz extracelular mineralizada, independentemente da superfície de Ti avaliada. Com relação à diferenciação adipocítica, a inibição da via de sinalização de ERK1/2 aumentou a expressão gênica dos marcadores adipocíticos PPAR&gamma;, adiponectina (ADIPOQ) e proteína ligadora de ácido graxo do adipócito ( AP2) nas células crescidas sobre ambas as superfícies de Ti, com efeito mais acentuado na superfície usinada, sem afetar a formação de acúmulo lípidico. Em conclusão, os resultados mostraram que a inibição de ERK1/2 favoreceu a diferenciação osteoblástica de CTMs crescidas sobre a superfície de Ti usinada, mas não sobre Ti com nanotopografia. Além disso, a inibição de ERK1/2 favoreceu a diferenciação adipocítica de CTMs crescidas sobre as superfícies de Ti com nanotopografia e usinada, sendo o efeito mais acentuado na usinada. Considerando aplicações terapêuticas, esses resultados são relevantes para direcionar o desenvolvimento de superfícies de biomateriais que atuem em vias de sinalização que sabidamente modulam o processo de osteogênese. / Osseointegration of titanium (Ti) implants depends on interaction between Ti surface and cells, which is modulated by several intracellular signaling pathways. Extracellular signal-regulated kinases (ERKs) are members of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) family and act on both osteogenesis and adipogenesis and, therefore, may be involved in the process of Ti osseointegration. In this context, the aim of this study was to evaluate if the interaction between mesenchymal stem cells (MSCs) and Ti surfaces, either machined or with nanotopography, is modulated, at least in part, by ERK1/2 and the effect of ERK1/2 inhibition on osteoblast and adipocyte differentiation. Rat bone marrow MSCs were cultured on Ti discs either machined or with nanotopography under osteogenic and adipogenic conditions, in presence or not of the ERK1/2 inhibitor, PD98059, at a concentration previously determined (25 &mu;M) and it was evaluated parameters related to osteoblast and adipocyte differentiation. The results showed that gene expression of the bone markers RUNX2, osterix (OSX), alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OC) was increased by ERK1/2 signaling inhibition in cells grown on machined Ti and only ALP and OC in cells grown on Ti with nanotopography. RUNX2 protein expression was slightly higher in cells grown on machined Ti, but not on Ti with nanotopography, when ERK1/2 signaling was inhibited and such inhibition did not affect extracellular matrix mineralization, irrespective of the evaluated Ti surface. Regarding adipocyte differentiation, ERK1/2 signaling inhibition increased gene expression of the adipose tissue markers PPAR&gamma;, adiponectin (ADIPOQ) and adipocyte fatty acid-binding protein (AP2) in cells grown on both Ti surfaces, with more prominet effect on machined one, without affecting lipid accumulation. In conclusion, our results showed that ERK1/2 signaling inhibition favored osteoblast differentiation of MSCs grown on machined Ti, but not on Ti with nanotopography. In addition, ERK1/2 signaling inhibition favored adipocyte differentiation of MSCs grown on both Ti surfaces, being more noticeable on machined one. Considering therapeutical applications, these results are relevant to drive the development of biomaterial surfaces to act on signaling pathways that regulate the process of osteogenesis.

A desmineralização óssea superficial tem se demonstrado favorável à consolidação de enxertos e ao comportamento celular, entretanto os mecanismos envolvidos ainda não estão esclarecidos. Os subsídios para o embasamento biológico da desmineralização, proporcionado por publicações anteriores, sugeriram que modificações na superfície óssea teriam influenciado o comportamento de pré-osteoblastos em cultura. Assim, este estudo objetivou comparar o efeito de duas concentrações de ácido cítrico na desmineralização de superfícies ósseas onde foram cultivadas células pré-osteoblásticas (MC3T3-E1), e analisar parâmetros de superfície comparando superfícies desmineralizadas a não desmineralizadas. Setenta amostras ósseas bicorticais foram removidas das calvárias de 35 ratos e divididas em grupos para as análises: 1) Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para avaliação da área de recobrimento e espessura da camada de células sobre as amostras (n = 15) durante 24, 48 e 72 horas: Grupo AC.10 amostras desmineralizadas por 30 segundos com ácido cítrico 10 %; Grupo AC.50 amostras desmineralizadas por 30 segundos com ácido cítrico 50 %; e Grupo C (controle) amostras não desmineralizadas; 2) Microscopia Confocal para análise da área de expressão e intensidade de fluorescência das BMP-2, -4 e -7: AC.10 seis amostras desmineralizadas conforme item 1); AC.50 seis amostras desmineralizadas conforme item 1); C três amostras não desmineralizadas; 3) Microscopia Confocal para análise da rugosidade superficial média (Ra e Sa): Grupos AC.10 e AC.50 com cinco amostras cada, desmineralizadas conforme o item 1), sendo cada amostra seu próprio controle (análises antes e depois da desmineralização). Também foram avaliadas as distâncias entre picos (P-P) e entre picos e vales (P-V) antes e depois da desmineralização; 4) Microscopia Eletrônica de Varredura / Espectroscopia de Energia Dispersiva (MEV / EDS) para análise da composição superficial: mesmas amostras do item 3) foram avaliadas antes e depois da desmineralização quanto à porcentagem atômica (%A) de carbono, oxigênio, magnésio, fósforo, enxofre e cálcio. Análises estatísticas foram feitas adotando nível de significância de 95 %. Amostras desmineralizadas apresentaram células morfologicamente em estágios mais avançados de diferenciação do que as não desmineralizadas. A área de recobrimento superficial foi significantemente maior após 24 horas de cultura nos grupos teste do que no controle e a espessura da camada de células também foi maior nos grupos teste às 48 e 72 horas. Houve significantemente maior expressão de BMP-2 e -7 nos grupos teste do que no controle e, apenas AC.10 demonstrou maior expressão de BMP-4 do que os demais grupos, sem significância em relação a AC.50. Os parâmetros de superfície Ra e Sa foram inconclusivos, mas P-P e P-V diminuíram consideravelmente após a desmineralização para distâncias compatíveis com superfícies favoráveis à adesão e diferenciação celular. A análise da composição química superficial revelou diminuição da %A de enxofre e magnésio nos grupos teste. A concentração do ácido, embora não tenha apresentado diferença significante para a maioria das análises, pareceu ter influência positiva nos resultados para o ácido cítrico 10 %. Concluiu-se que a desmineralização superficial parece promover a proliferação e diferenciação celular, proporcionando superfícies com características de composição e topografia que favorecem o comportamento celular verificado. / The superficial bone demineralization has proved to be a favorable procedure for bone grafts consolidation and cell behavior, however the underlying mechanisms have not been clarified yet. Therefore, this study aimed to compare the effect of two concentrations of citric acid on demineralization of bone surfaces where pre-osteoblastic cells (MC3T3-E1) were cultivated, and analyze surface parameters comparing demineralized bone surfaces with non-demineralized surfaces. Seventy bicortical bone samples were harvested from the calvaria of 35 rats and divided into groups as follows: 1) Scanning Electron Microscopy (SEM) to evaluate the coating area and thickness of cells layers cultured on the samples (n = 15) for 24, 48, and 72 hours: Group CA.10 samples demineralized for 30 seconds with 10 % citric acid; Group CA.50 samples demineralized for 30 seconds with 50 % citric acid, and Group C (control) non-demineralized samples; 2) Confocal Microscopy for analysis of expression area and intensity of fluorescence of BMP-2, -4, and -7: CA.10 six samples demineralized as item 1); CA.50 six samples demineralized as item 1); Group C three non-demineralized samples; 3) Confocal Microscopy for surface mean roughness analysis (Ra and Sa): Groups CA.10 and CA.50 made up of five samples each and demineralized according to item 1), each sample was its own control (analysis before and after demineralization). The distances between peaks (P-P) and between peaks and valleys (P-V) were also evaluated before and after demineralization; 4) Scanning Electron Microscopy / Energy dispersive Spectroscopy (SEM / EDS) to analyze the surface composition: the same samples of item 3) were evaluated before and after demineralization for atomic percentage (%A) of carbon, oxygen, magnesium, phosphorus, sulfur and calcium. Statistical test was made by adopting the 95 % significance level. Demineralized samples showed cells with morphology in the later stages of differentiation than non-demineralized ones. The coating surface area by cells was significantly higher after 24 hours of culture in the test groups than in the control and the thickness of the layers were also greater in the test groups at 48 and 72 hours of evaluation. There was significantly higher expression of BMP-2 and -7 in test groups than in the control group, and only the CA.10 group showed higher BMP-4 expression than the other groups, but the difference was not statistically significant compared to the CA.50 group. Ra and Sa surface parameters were inconclusive, however P-P and P-V decreased considerably after demineralization to distances compatible with surfaces favorable to cell adhesion and cell differentiation. The chemical composition analysis of the surfaces revealed a decrease in the %A for sulfur and magnesium in test groups. Although the acid concentration did not shown significant difference for most analysis, it seemed to have a positive influence for the results with citric acid 10 %. It was concluded that the surface demineralization seems to promote cell proliferation and differentiation, providing surfaces with composition and topography that can favor observed cell behavior.

The decontamination process of titanium implants surface is important for the successful treatment of peri-implantitis. The methods of decontamination can be classified in two major groups: chemical or physical. However, the best method of decontamination of implant surfaces is yet undertermined. The aim of this study is to analyze the effectiveness of decontamination of titanium implants surface by chemical conditioning agents and photodynamic therapy, by Scanning Electron Microscopy (SEM) and to analyze the adhesion and proliferation of osteoblastic cells on the previously decontaminated surfaces. Commercially available implants of different brands: Biomet 3i® (Nanotite NT; Osseotite - OT), Straumann® (SLActive SLA) and Neodent® (Acqua Drive CM ACQ; Neoporos Drive CM CM) were acquired in the market and analyzed in SEM images in 3 different areas (n= 1/group) to determine surface roughness parameters and wettability properties. After that, the surface of dental implants was inoculated with Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.) strains for 4 days and prepared for SEM analysis to determine the percentage area of contamination in a software for image analysis. Samples were then decontaminated by two different chemical treatments (citric acid 10% and ethylenediamine tetraacetic acid EDTA - 24%) and photodynamic therapy (methylene blue associated with LASER), both with a 3-minutes application time. In the control group, surfaces were decontaminated with chlorhexidine 0.12% for 3 minutes. The area of decontamination was determined in ImageJ software for SEM images analysis. After decontamination, the adhesion and proliferation of human osteoblastic osteosarcoma cell lineage (Saos-2) on the surface of uncontaminated sterile implants (control; n: 1/period) and decontaminated implants (n: 3/period/group) were investigated. Saos-2 cells [5x104] were seeded on implant surfaces and incubated for 24h (adhesion assay) and 72h (proliferation assay), determined on SEM images. No significant differences were found among the different implants regarding roughness parameters, with exception Rv (SLA: 19.57}4.01 vs. OT: 8.36}7.91; p=0.0031). Chemical composition varied among implants depending on surface treatment, with all groups showing prevalence of Titanium. Values showed greater contact angle (wettability analysis) for NT (hydrophobic) and smaller for ACQ (highly hydrophilic) (p<0.0001). Nanotite/Biomet 3i® showed significantly greater percentage of area contaminated by bacteria (68.19% } 8.63%; p=0.050; Kruskal Wallis/Dunn) than ACQ (57.32% } 5.38%). Osseotite/Biomet 3i® resulted in a smaller remaining contaminated area (50.89% } 9.12%) after decontamination treatments. Increased Saos-2 cells adhesion and proliferation were observed on SLA after 24h (p= 0.0006; ANOVA/Tukey) and 72h (<0.001; ANOVA/Tukey). Decontaminated groups showed significantly less number of cells adhered to the surfaces at 24h and 72h than uncontaminated controls (p < 0.005; ANOVA post hoc Sidak). Regarding decontamination methods, no differences in the number of cells attached to implants treated by photodynamic therapy and chemical agents compared to chlorhexidine at 24h, but implants treated by photodynamic therapy and chemical agents showed greater number of cells attached after 72h. These findings suggest that surface characteristics influenced bacterial contamination and decontamination of implant surfaces; none of the decontamination methods were able to completely remove bacterial contamination, impairing cell adhesion and spreading. These findings may explain the varying clinical results of decontamination methods in re-osseointegration. / O processo de descontaminação de implantes de titânio é importante para o sucesso do tratamento da peri-implantitite. Os métodos de descontaminação podem ser classificados em dois maiores grupos: químico ou físico. Entretanto, o melhor método de descontaminação de superfícies de implantes está ainda indeterminado. O objetivo desse estudo é analisar a efetividade da descontaminação de implantes com superfície de titânio por agentes condicionantes químicos e terapia fotodinâmica, por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e analisar a adesão e proliferação de células osteoblásticas previamente com superfícies descontaminadas. Implantes disponíveis comercialmente de diferentes marcas: Biomet 3i® (Nanotite NT; Osseotite - OT), Straumann® (SLActive SLA) e Neodent® (Acqua Drive CM ACQ; Neoporos Drive CM CM) foram adquiridos no mercado e analisados em imagens de MEV em 3 diferentes áreas (n=1/grupo) para determinar o parâmetro de rugosidade da superfície e a propriedade de molhabilidade. Depois disso, a superfície dos implantes dentários foi inoculada com cepa de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.) por 4 dias e preparada para análise da MEV afim de determinar a área de porcentagem da contaminação em um software de análise de imagem. Amostras foram então descontaminadas por dois diferentes tratamentos químicos (ácido citrico 10% e ácido etilenodiamino tetraacético- EDTA 24%) e terapia fotodinâmica (azul de metileno associado com LASER), ambos em 3 minutos com tempo de aplicação. No grupo controle, os implantes foram descontaminados com clorexidina 0.12% por 3 minutos. A área de descontaminação foi determinada no software Image J para análise das imagens de MEV. Depois da descontaminação, a adesão e proliferação da linhagem de células de osteosarcoma osteoblástica humana (Saos-2) em superfícies não contaminadas de implantes estéreis (controle; n: 1/período) e implantes descontaminados (n: 3/período/grupo) foram investigados. Células da Saos-2 [5x104] foram cultivadas sobre as superficies dos implantes e incubadas por 24 horas (ensaio de adesão) e 72 horas (ensaio de proliferação) e determinadas em imagens de MEV. Não foram encontradas diferenças significantes entre os implantes em relação a parâmetros de rugosidade, com exceção para Rv (SLA: 19.57±4.01 vs. OT: 8.36±7.91; p=0.0031). Houve variação na composição química dos implantes de acordo com o tratamento de superfície, com todos os grupos mostrando prevalência do Titânio. Houve maior ângulo de contato (análise de molhabilidade) para NT (hidrofóbico) e menor para ACQ (altamente hidrofílico; p<0.0001). Nanotite/Biomet 3i® mostrou porcentagem significativamente maior de área contaminada por bactérias (68.19% ± 8.63%; p=0.050; Kruskal Wallis/Dunn) que ACQ (57.32% ± 5.38%). Osseotite/Biomet 3i® resultou em significativa menor área contaminada remanescente (50.89% ± 9.12%) depois dos tratamentos de descontaminação. Foi observada maior adesão e proliferação de células Saos-2 em SLA após 24 (p= 0.0006; ANOVA/Tukey) e 72 horas (<0.001; ANOVA/Tukey). Os grupos descontaminados mostraram número significativamente menor de células aderidas às superfícies nos dois períodos de tempo comparativamente aos controles não contaminados (p < 0.005; ANOVA post hoc Sidak). Em relação aos métodos de descontaminação, não foram observadas diferenças no número de células aderidas aos implantes tratados por terapia fotodinâmica e agentes químicos comparados com clorexidina em 24 horas, mas os primeiros mostraram maior número de células aderidas depois de 72 horas. Esses achados sugeriram que as características de superfície influenciaram a contaminação bacteriana e a descontaminação de superfície; nenhum método de descontaminação é capaz de remover completamente a contaminação bacteriana, dificultando a adesão e proliferação celular. Esses achados poderiam explicar a variação de resultados clínicos nos métodos de descontaminação e obtenção de reosseointegração.