A importância da praga Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) deve-se não somente aos danos provocados às lavouras de milho, mas a capacidade de se alimentar de uma ampla variedade de famílias de plantas. Lagartas desta espécie são capazes de se adaptar a dietas contendo inibidores de peptidase de soja (IPS). Há uma hipótese de que a microbiota intestinal neste inseto poderia estar envolvida com estes mecanismos de adaptação. Neste contexto, um dos objetivos do trabalho foi verificar se estas bactérias poderiam alterar a expressão gênica de serino peptidases e atividade enzimática nestes lepidópteros em ensaios in vitro. Observouse que no tratamento com tetraciclina, não houve influência na alteração da expressão gênica e da atividade quantitativa das respectivas serino peptidases nas lagartas provenientes dos ambientes diferentes. Ao mesmo tempo, objetivou-se estudar se haveria uma contribuição das bactérias na atividade proteolítica intestinal de S. frugiperda ao longo do processo digestivo de insetos, analisando se influenciam no perfil qualitativo das serino peptidases intestinais destas lagartas em zimograma. As lagartas de campo que sofreram a primeira exposição à uma dieta com antibiótico aumentaram a atividade de duas peptidases provavelmente trípticas, também sintetizadas nos tratamentos com IPS e IPS com antibiótico provavelmente como provável resposta adaptativa. Para analisar o efeito do IPS e da tetraciclina em folhas ingeridas por lagartas criadas em laboratório e coletadas em campo, além da influência da dieta natural (cartucho de milho) e da dieta artificial sobre a composição e diversidade da microbiota fecal de S. frugiperda, foi feito o sequenciamento das regiões V3-V4 do gene 16S rRNA de procariotos utilizando a plataforma de alto desempenho Illumina Miseq. Os valores médios de diversidade de UTOs do índice Shannon detectados nas fezes de S. frugiperda foram mais baixos nas amostras de dieta artificial e o segundo índice médio mais baixo foi calculado naquelas provenientes de cartucho de milho no campo, revelando que ambas as amostras apresentaram menor diversidade de espécies na composição da comunidade bacteriana. A abundância relativa em nível de filo bacteriano gerada para todos os conjuntos de amostras fecais demonstrou que os filos mais predominantes foram Proteobacteria (73,3%) e Firmicutes (24,2%), sendo ambos os filotipos mais abundantes nos grupos de insetos. Os quatro filotipos mais abundantes em nível de gênero corresponderam a Enterococcus (23,5%), Acinetobacter (20,5%), Stenotrophomonas (11,4%) e Klebsiella (10,4%). Verificamos que a dieta foi a principal variável que modulou a estrutura das comunidades bacterianas das fezes de S. frugiperda. Entretanto, não é possível afirmar se haveria uma contribuição das peptidases das bactérias simbiontes ao processo digestivo de insetos. Com estes novos dados taxonômicos, poderemos isolar as bactérias a partir das fezes destas lagartas e estudar a significância funcional destes simbiontes tais como, detoxificação de compostos tóxicos como inibidores de peptidases de plantas, papel digestivo e nutricional destas bactérias para as lagartas desta espécie. / The importance of the pest Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is due not only to corn crops damage, but the ability to attack a wide variety of plant families. Caterpillars of this species are able to circumvent diets containing soybean peptidase inhibitors (SPI). There is a hypothesis that this insect gut microbiota might be involved in these adaptation mechanisms. One of the goals of this study was to determine whether these bacteria could alter the serine peptidase gene expression or enzymatic activity in vitro assays in these Lepidoptera. It was observed that there was no alteration of the gene expression and the quantitative activity of serine peptidases in the caterpillars collected from both different environments fed with tetracycline leaves. At the same time, other objective was to study if there was a contribution from bacteria in the gut proteolytic activity of S. frugiperda in the digestive process of insects, analyzing its influence in the qualitative profile of serine peptidase gut worms in zymogram. The field caterpillars that suffered the first exposure to a diet with antibiotic increased the activity of two probably tryptic type peptidases which were also synthesized in IPS and IPS plus antibiotic treatments, probably as likely adaptive response. In order to analyze the effect of IPS and tetracycline in leaves eaten by caterpillars reared in the laboratory and collected in the field, beyond the influence of the natural diet (maize cartridge) and artificial diet on the composition and diversity of fecal microbiota of S. frugiperda, the sequencing using high performance Miseq Illumina platform was done in V3-V4 regions of 16S rRNA gene typical of prokaryotes. The average values of Shannon index related to OTUs diversity detected in the feces of S. frugiperda were lower in artificial diet samples and second lower mean index was calculated from those collected in the field, showing that both samples showed lower species diversity in the composition of bacterial communities. The relative abundance of bacterial phylum level generated for all fecal samples showed that the most prevalent phyla were Proteobacteria (73.3%) and Firmicutes (24.2%). Both phylotypes are predominant in insect groups. The four most abundant phylotypes at genus level accounted for Enterococcus (23.5%), Acinetobacter (20.5%), Stenotrophomonas (11.4%) and Klebsiella (10.4%). We found that the diet was the main variable that modulated the bacterial communities structure in the feces of S. frugiperda. However, it is not possible to state that there would be a contribution of peptidase bacterial symbionts to the digestive process of insects. With these new taxonomic data, we may isolate bacteria from S. frugiperda feces and study the functional significance of these symbionts such as detoxification of toxic plant compounds as inhibitors of peptidases, the digestive and nutrition role of these bacteria for the caterpillars species.

As bactérias fototróficas freqüentemente apresentam florescimentos em lagoas de estabilização utilizadas no tratamento de esgoto sanitário, formando uma camada de cor púrpura na sua superfície. Portanto, o estudo das condições que propiciam tais florescimentos, a diversidade microbiana, o potencial de remoção da matéria orgânica e o estabelecimento das relações entre tais conhecimentos, permitem compreender o metabolismo do sistema. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de bactérias (domínio Bacteria), bactérias fototróficas púrpuras e bactérias redutoras de sulfato (BRS) em lagoas de estabilização do Vale do Ribeira (Cajati, SP). Para tal, foram realizadas coletas sazonais (primavera, verão, outono e inverno) na sub-superfície, camada intermediária e interface água-sedimento, em dois horários (14:00 h e 02:00 h), nas lagoas anaeróbia e facultativa. Para analisar os diferentes grupos de microrganismos, utilizou-se a técnica de PCR/DGGE, com primers específicos. Nas análises de filogenia realizou-se o seqüenciamento parcial do gene RNAr 16S e da subunidade M do centro de reação fotossintético das bactérias fototróficas púrpuras. Análises físico-químicas, tais como sulfato, DQO, sólidos, nitrogênio e fósforo foram realizadas, além da determinação da concentração de oxigênio dissolvido, pH, temperatura e radiação solar fotossinteticamente ativa incidente. No outono observou-se maior diversidade de microrganismos do domínio Bacteria, bactérias fototróficas púrpuras e BRS, enquanto na primavera foi verificada a menor diversidade desses microrganismos para as duas lagoas. Na lagoa facultativa foi observada maior diversidade do domínio Bacteria e das BRS em relação à lagoa anaeróbia. Verificou-se maior diversidade de bactérias fototróficas púrpuras na lagoa anaeróbia, caracterizada por duas populações predominantes nas quatro estações e nas diferentes profundidades. A concentração de matéria orgânica (DQO) variou de 60,3 mg/L (inverno) a 298,0 mg/L (primavera) e a maior concentração de sulfato observada foi de 51,0 mg/L (inverno). Bacilo curvo Gram negativo, semelhante à bactéria fototrófica púrpura não sulfurosa, presente em amostra proveniente da sub-superfície da lagoa anaeróbia foi purificado e apresentou 92% de similaridade com Rhodopseudomonas palustris. Em ambas as lagoas foram identificadas bactérias semelhantes a Chromobacterium suttsuga (95%), Clostridium sp. (99%), Rhodobacter sphaeroides (99%), Rhodopseudomonas palustris (99%), Lampropedia hyalina (97%), Campylobacter fetus (99%), Desulfovibrio vulgaris (95%), Rhodospirillum rubrum (95%) e diferentes bactérias não cultivadas. / The phototrophic bacteria frequently blossom in the stabilization lagoons that are used in sanitary sewer treatment, forming a purple layer on its surface. Therefore, the study of the conditions that propitiate such blooms, the microbial diversity, the removal of the organic matter and the establishment of the relations between them permit to understand the metabolism of the system. The objective of this work was to evaluate the diversity of the bacteria (Bacteria domain), purple phototrophic bacteria and sulfate reducing bacteria (SRB) in stabilization lagoons of Vale do Ribeira (Cajati - SP). For this, it was made seasonal collects (spring, summer, autumn and winter) from the sub-surface, intermediate layer and interface water-sediment, at two times (14:00 h and 02:00 h) of the anaerobic and facultative lagoons. To analyze the different groups of microorganisms it was used the PCR/DGGE technique, with specific primers; for the phylogenic analysis it was realized the DNA partial sequencing of the 16S RNAr gene and of the subunit M of the photosynthetic center of reaction of the purple photosynthetic bacteria. It was determined: the concentration of dissolved oxygen, pH, temperature and photosynthetically active incident solar radiation, and the physical-chemistry analysis as: COD, solids, nitrogen and phosphorus. In the autumn it was observed greater diversity of microorganisms of the Bacteria domain, the group of the purples phototrophic bacteria and SRB, while in the spring it was verified minor diversity of these microorganisms in the two lagoons studied. In the facultative lagoon it was observed greater diversity of the Bacteria domain and of the SRB with respect to the anaerobic lagoon. It was verified greater diversity of the purple phototrophic bacteria in the anaerobic lagoon, of what in the facultative lagoon, which was characterized by the two predominant populations in the four seasons and in the different points of collect. The concentration of the organic matter (COD) varied from 60,3 mg/L (winter) to 298,0 mg/L (spring) and the greater concentration of sulfate observed was of 51,0 mg/L (winter). Arched bacillus Gram-negative similar to purple not sulfurous bacteria, from a sample of the sub-surface of the anaerobic lagoon was purified and presented 92% of similarity with Rhodopseudomonas palustris. In both lagoons it was identified bacteria similar to Chromobacterium suttsuga (95%), Clostridium sp. (99%), Rhodobacter sphaeroides (99%), Rhodopseudomonas palustris (99%), Lampropedia hyalina (97%), Campylobacter fetus (99%), Desulfovibrio vulgaris (95%), Rhodospirillum rubrum (95%).

A metagenômica trouxe novas perspectivas ao estudo de comunidades microbianas no ambiente, permitindo explorar tanto a diversidade taxonômica de microrganismos ainda não-cultivados, como o acesso direto a genes e vias metabólicas. Neste trabalho, foram construídas bibliotecas metagenômicas a partir de amostras de sedimentos de mangue da Baía de Guanabara (RJ), impactadas com hidrocarbonetos de petróleo e metais pesados. Proteobacteria (33,3%), bactérias afiliadas a redutoras-de-sulfato (29,7%) e Firmicutes (20%) representaram os grupos principais nas amostras ambientais, baseado em análises filogenéticas de rDNA 16S, ao passo que isolamentos seletivos utilizando diesel e naftaleno permitiram a recuperação preferencial de delta-Proteobacteria e actinomicetos. Bibliotecas metagenômicas dos sedimentos enriquecidos com óleo diesel, com insertos entre 25 e 35 Kb clonados em fosmídeos, foram triadas para detecção de genes catabólicos de monoxigenases (alkB1) e expressão de epóxido-hidrolases, esterases, lipases e monoxigenases em ensaios de alto desempenho (HTS, high throughput screening). Clones reativos a alkB1 foram detectados, porém não foram funcionais nas condições de HTS testadas. Nas bibliotecas de fosmídeos triadas, vários clones apresentaram atividade enzimática, sendo que dois apresentaram atividade de lipase-esterase com alta seletividade, elevada taxa de conversão de substratos e excesso enantiomérico (ee >99%). Os resultados de HTS comprovaram a eficiência do uso da clonagem direta de DNA ambiental na expressão de vias metabólicas de interesse com potencial de aplicação biotecnológica. / Metagenomics brought a new perspective to the study of microbial communities in the environment, enabling access to the taxonomic diversity of uncultured microorganisms, as well as direct access to genes and metabolic pathways. In the current study, metagenomic libraries were constructed from mangrove sediment samples of the Guanabara Bay (RJ, Brazil), impacted with oil hydrocarbons and heavy metals. Proteobacteria (33.3%), sulfate-reducing affiliated bacteria (29.7%) and Firmicutes (20%) represented the main groups in the environmental samples based upon 16S rDNA phylogenetic analysis, whereas selective isolation using diesel and naphtalene yielded delta-Proteobacteria and actinomycetes. Metagenomic libraries of diesel-enriched sediment samples, with 25 to 35 Kb fosmid inserts, were screened for detecting monooxigenase genes (alkB1) and expression of epoxide hydrolases, esterases, lipases and monooxigenases in high throughput screening (HTS) assays. Clones reactive to the alkB1 probe were detected, but were not functional under the HTS conditions used. Several functional clones were detected in the clone library, and two showed lipase-esterase activity with high rates of substrate conversion and enantiomeric ratio (ee >99%). The results obtained on HTS showed the efficiency of the direct cloning of environmental DNA for the expression of metabolic pathways with potential biotechnological application.

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La lignocellulose est le composant principal des parois végétales et donc le biopolymère végétal le plus abondant sur Terre. Sa transformation en molécules d’intérêt industriel est donc une voie prometteuse pour diminuer la consommation de ressources fossiles. Au sein de la plateforme des carboxylates, la transformation de la lignocellulose repose sur l’utilisation de communautés bactériennes. Mais s’ils sont augmentés par des approches de prétraitement du substrat, les rendements sont encore faibles. Afin de les améliorer, nous avons ici testé les capacités de dégradations de communautés microbiennes issues de l’enrichissement de rumen bovin et d’intestin de termites. Afin de caractériser l’effet de la source d’inoculum et du prétraitement du substrat sur le fonctionnement des communautés sélectionnées, une approche de séquençage 16S a été utilisée. Celle-ci a permis la comparaison des compositions de communautés obtenues, mais également de leurs dynamiques au cours de la transformation du substrat lignocellulosique. Les conditions de culture imposées semblent avoir un effet très fort sur la composition des communautés sélectionnées puisque malgré leurs différences, celles-ci présentent d’importantes similitudes et sont bien plus proches que ne l’étaient les inocula initiaux. Enfin, les communautés associées à la dégradation du substrat lignocellulosique montrent des dynamiques très marquées, caractérisées par une importante baisse de diversité et la dominance de quelques populations bactériennes seulement lors du maximum de dégradation. / Lignocellulose is the main component of vegetal cell wall and is thus the most abundant biopolymer on Earth. Its conversion into industrially relevant molecules is of concern to reduce fossil resources consumption. In the dedicated carboxylates platform, lignocellulose conversion relies on the metabolic potential of microbial consortia, but lignocellulose transformation rates can still be improved, despite substrate pretreatment approaches. In order to improve these rates, we here tested the transformation capacities of microbial communities originated from cow rumen and termite guts. 16S sequencing was used to characterize the effects of inoculum source and substrate pretreatment on the selected communities’ functioning. It allowed the comparison between obtained communities, but also between their dynamics during lignocellulose transformation. Culture conditions appeared to have a strong effect on the selected communities, which presented high similarities despite differences between initial inocula. Finally, communities associated to lignocellulose degradation showed marked dynamics, with a strong decrease in diversity indexes and the dominance of a few bacterial populations during the degradation maximum.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Mata Atlântica brasileira concentra uma das maiores diversidades biológicas da Terra com cerca de 7% das espécies animais e vegetais do planeta. Esse bioma abriga atualmente mais de 50% das espécies de anuros do Brasil (c.a. 500 espécies), mas sofre intensa perda e fragmentação de habitat. Um dos principais fragmentos da Mata Atlântica, a Reserva Ecológica de Guapiaçu (REGUA) abriga vasta anurofauna, com cerca de 71 espécies já descritas. Acredita-se, porém, que muitas ainda precisam ser identificadas e estudadas. A identificação de espécies baseada em caracteres moleculares vem se mostrando uma alternativa para dar suporte à identificação morfológica, e dentro deste contexto os genes de DNA mitocondrial, como o 16S, são utilizados para a realização de barcode. O objetivo deste estudo foi testar a metodologia de identificação molecular de espécies (DNA barcode) na comunidade de anfíbios anuros da REGUA utilizando o gene mitocondrial 16S. Para isso, foram coletados tecidos de 99 indivíduos, entre adultos e girinos de 23 espécies, agrupados em seis famílias distintas. Desses 99 indivíduos, 88 foram amplificados corretamente para o gene em referência e foram realizadas, com sucesso, a determinação de espécies de 84 anuros (95,45%) da REGUA. As espécies de Scinax albicans, Scinax flavoguttatus e Hylodes charadranaetes, cujas identificações haviam sido determinadas com base em critérios morfológicos, agruparam em clados de mesmo gênero, porém de espécies diferentes quando analisadas pelas metodologias neighbor-joining e maximum-likelihood. Além de altos valores de distância intraespecífica (2,18%, 3,49% e 3,77%, respectivamente) e distâncias interespecíficas nulas (0%) temos a indicação de possíveis equívocos em determinações de espécies feitas exclusivamente por critérios morfológicos. Nesse caso, as discordâncias morfológica e molecular são exclusivamente de girinos, demonstrando a dificuldade na identificação morfológica e a escassez de chaves de identificação dessas espécies em estágio larval. Os resultados mostram que o gene mitocondrial 16S teve seu uso na identificação de anuros da REGUA confirmada e apontam que, em casos de estudos com indivíduos em estágios larvais, como em girinos, a metodologia de barcode, quando complementada a identificação morfológica, suporta a correta identificação das espécies de anfíbios anuros. / The Brazilian Atlantic Forest focuses one of the greatest biological diversity of the Earth with about 7% of the planet's animal and plant species. This biome is currently home to more than 50% of anurans species from Brazil (c.a. 500 species), but it suffers severe loss and fragmentation of habitat. One of the main fragments of the Atlantic Forest, the Reserva Ecológica de Guapiaçu (REGUA) houses a wide anuran fauna, with about 71 species had already described. It is believed, however, that lots of them still need to be identified and studied. The identification of these species based on molecular characters has proven to be an alternative to support a morphological identification, and in this context the mitochondrial DNA genes, such as 16S are used to perform barcode. The goal of this study was to test the methodology for molecular identification (DNA barcode) in anurans of REGUA community using 16S mitochondrial gene. For this, tissues of 99 individuals, including adults and tadpoles of 23 species, grouped into six different families were collected. Of these 99 individuals, 88 were amplified correctly to the reference gene and were successful determination of 84 species of anurans (95.45%) of the REGUA. Scinax albicans, Scinax flavoguttatus and Hylodes charadranaetes species whose identifications had been determined based on morphological criteria, grouped into clades of the same gender, but different species when analyzed by methodologies neighbor-joining and maximum-likelihood. In addition to high intraspecific distances (2,18%, 3,49% and 3,77% respectively) and interspecific distances to nil (0%), we have an indication of possible mistakes of species determinations made by a morphological criterion. In this case, the morphological and molecular disagreements are exclusively on tadpoles, demonstrating the difficulty of morphological identification and the shortage of identification of these species larval stage. The results show that the 16S mitochondrial gene had its use in identifying the anurans REGUA confirmed and indicate that the case studies with individuals in larval stages, as in tadpoles , the methodology of the barcode when complemented morphological identification, supports the correct identification of species of anurans amphibians .

A Terra Preta Antropogênica (TPA) tem essa denominação porque é encontrada em sítios arqueológicos, onde viveram grupos pré-históricos e é considerada um dos solos mais férteis do mundo. Nela é encontrada grande quantidade de material deixado por grupos indígenas como fragmentos cerâmicos, artefatos líticos, e especialmente carvão pirogênico. Estudos realizados com o carvão pirogênico verificaram que ele aumenta a capacidade de trocas catiônicas nesses solos. Por meio de microscopia de fluorencência, foi observada a presença de microrganismos habitando esse carvão, no entanto, não se sabe quais seriam. Devido à falta de informações sobre a diversidade bacteriana nessas estruturas, este trabalho estudou a diversidade bacteriana em amostras de carvão pirogênico de solos TPA coletadas nos sítios Lagoa Balbina (Amazônia Central- Amazonas) e Mina I (Amazônia Oriental - Pará), através de técnicas moleculares independentes de cultivo. O estudo visou também comparar essa diversidade com a encontrada no solo de onde carvão foi isolado. As estruturas de carvão foram separadas fisicamente dos solos e seu DNA genômico total extraído e usado como molde em reação de PCR utilizando oligonucleotídeos do gene 16S rRNA para o Domínio Bacteria. O produto da PCR foi clonado em vetor e os clones foram sequenciados e comparados com o banco de dados de 16S rRNA do RDPX. Com a construção das bibliotecas de clones do gene 16S rRNA a partir das amostras de carvão pirogênico observou-se que existe maior número de bactérias desconhecidas no carvão pirogênico do que no solo onde ele foi isolado. Acidobacteria foi o filo predominante nas bibliotecas de carvão pirogênico das duas localidades de estudo, assim como na biblioteca do solo do sítio Mina I. Já na biblioteca do solo do sítio Lagoa Balbina houve predominância do filo Firmicutes. Por meio do método de rarefação foi possível constatar uma menor riqueza de UTOs nas comunidades bacterianas presentes nas estruturas de carvão pirogênico quando comparado à riqueza de UTOs das comunidades bacterianas cujo habitat é o solo. Mas quando se compara a riqueza de UTOs entre as estruturas de carvão isoladas das duas localidades, observa-se que a riqueza é maior no sítio Mina I. Os valores obtidos com os índices de diversidade revelaram menor diversidade de UTOs nas bibliotecas obtidas para o carvão pirogênico das duas regiões estudadas se comparado dos valores para as bibliotecas obtidas do solo da mesma região. Os valores obtidos com os métodos não paramétricos revelaram maior riqueza de UTOs para as bibliotecas do carvão do sítio Mina I e solo TPA do sítio Balbina. A análise da PCA revelou que as bibliotecas do sítio Balbina mostraram-se altamente similares. Em adição, a análise com S-Libshuff, verificou que todas as bibliotecas comparadas são significativamente diferentes quanto à composição das comunidades bacterianas. O carvão pirogênico não é uma estrutura inerte, pois é capaz de ser habitado por diferentes bactérias e a sua estrutura da comunidade bacteriana é diferente daquela de onde ele foi segregado / Anthropogenic Dark Earth (ADE) has this denomination because it is found at archeological sites, where prehistoric groups lived, and it is considered one of the most fertile soils of the world. In this soil a great amount of material left by indigenous groups was found as ceramic fragments, lithic workmanships, and especially pyrogenic black carbon. Studies accomplished with the pyrogenic black carbon verified that it increases the capacity of cationic changes in soils. Through fluorescence microscopy, the presence of microorganisms was observed inhabiting that black carbon, however, this community is still unknown,due to the lack of information about the bacterial diversity in those structures.This work studied the bacterial diversity in samples of pyrogenic black carbon of ADE soils, collected at the sites Lagoa Balbina (Central Amazon) and Mina I (Oriental Amazon), through molecular techniques independent of cultivation. The study also sought to compare that diversity with the one of the soil where black carbon was isolated. The structures of black carbon were separate physically from the soils and total genomic DNA was extracted and used as template in a PCR reaction, using primers of the 16S rRNA gene for the Bacteria Domain. The PCR product was used for construction of clone libraries and the clones were sequenced and compared with the 16S rRNA of RDPX database. The 16S rRNA gene clone libraries from the samples of pyrogenic black carbon, it shown that is a larger number of unknown bacteria in the black carbon than in the soil where it was isolated. Acidobacteria was the predominant phylum in the pyrogenic black carbon libraries from the both studied places, as well as in the soil library from Mina I site. However in the library Lagoa Balbina site there was predominance of the phylum Firmicutes. Through the rarefaction method it was possible to verify a smaller richness of OTUs in the bacterial communities presents in the pyrogenic black carbon structures when compared to the OTUs richness of the bacterial soil communities.But, when the OTUs richness is compared among the isolated structures of pyrogenic black carbon of the two places, it is observed that the richness is higher in the Mina I site. The values from diversity indexes revealed smaller diversity of OTUs in the pyrogenic black carbon libraries when compared with the soil libraries for the two studied areas. The obtained values with the nonparametric methods revealed larger OTUs richness in the black carbon library of Mina I site and in the ADE soil library of the Balbina site. The PCA analysis showed that the libraries of the site Balbina site were highly similar. In addition, the analysis with S-Libshuff verified that all of the compared libraries were significantly different in bacterial communities composition. The pyrogenic black carbon is not an inert structure, once it is capable of being inhabited by different bacteria, and its bacterial community structure is different from that one where is was segregated

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1109551 bytes, checksum: 5f0d13927b00626f1a0d15b78536b7bc (MD5) Previous issue date: 2009-07-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This is the first study of genetic diversity of the Archaea community associated to coffee fruits (Coffea arabica L.). It was performed in cherry coffee fruits of cultivars Bourbon Amarelo, Bourbon Vermelho, Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho and Catucaí Vermelho in different altitudes. The archaeal diversity during natural drying of depulped grains in cement covered yard was also studied. The addition of proteases during the coffee fruits metagenomic DNA extraction cell lysis step provided better recovery of DNA from Archaea. Comparing different hypervariable regions of 16S rDNA by DGGE (Denaturing Gradiente Gel Electrophoresis), the highest diversity resolution was obtained with the V3 region, for the cultivar Catucaí Vermelho at an altitude of 936m. The Archaea endophytic community analysis in four C. arabica cultivars revealed varied genotypic profiles among the samples. Three samples that showed distinct DGGE profiles were chosen for 16S rDNAs libraries construction. Sequencing of 63 clones revealed 12 OTUs and the prevalence of sequences related to Euryarchaeota phylum, mainly the halophylic genera Halobacterium, Halococcus, and Haloferax. Sequences with high identity with Methanobrevibacter, with the thermophilic Thermoplasma, and sequences related to uncultivated Archaea from marine environment were also found in the Euryarchaeota phylum. Of the four sequences belonging to the Crenarchaeota phylum, three phylogenetically clustered with uncultivated archaea from soil, and one with sequences from a marine environment. Rarefaction curve analysis and the estimated Coberture pointed out that the libraries constructed were large enough to cover the most of Archaea diversity in cherry coffee. The archaeal diversity study during natural drying revealed higher increase in OTUs number beginning at the seventh day up to the last day. Cluster analysis of DGGE fingerprints distinguished the population of the first days of drying from those in the last ones. The absence of physiological studies of uncultivable Archaea, especially in mesophilic environments, limits the knowledge of metabolism of these microorganisms and the determination of endophytes role in coffee fruits. Although, metagenomic studies of microbial community associated to coffee fruits will help to identify archaeal genes and establish relations among the presence of certain microorganisms and precursors of those compounds that make up the aroma and the flavor in the final quality of the beverage. / Este é o primeiro estudo de diversidade genética da comunidade de Archaea associada a frutos de café (Coffea arabica L.). Ele foi realizado em amostras de frutos no estádio cereja das cultivares Bourbon Amarelo, Bourbon Vermelho, Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho e Catucaí Vermelho, em diferentes altitudes. A diversidade de arqueas presentes durante a secagem natural de grãos despolpados em terreiro revestido com cimento também foi estudada. A adição de proteases durante a etapa de lise celular para extração de DNA metagenômico de frutos de café propiciou melhor recuperação de DNA de Archaea. A maior resolução da diversidade na comparação de diferentes regiões hipervariáveis do rDNA 16S por DGGE foi obtida quando se utilizou a região V3 para a amostra da cultivar Catucaí Vermelho em altitude de 936m. A análise da comunidade endofítica de Archaea em quatro cultivares de C. arabica revelou um variado perfil genotípico entre as amostras. Três amostras que apresentaram perfis de DGGE distintos entre si foram escolhidas para construção de bibliotecas de rDNAs 16S. O sequenciamento de 63 clones revelou a existência de 12 UTOs e a prevalência de sequências relacionadas ao filo Euryarchaeota, principalmente de arqueas halofílicas dos gêneros Halobacterium, Halococcus e Haloferax. Ainda no filo Euryachaeota, foram identificadas sequências com alta identidade com Methanobrevibacter, com a hipertermófila Thermoplasma e com sequências relacionadas à arqueas não cultiváveis de ambiente marinho. Das quatro sequências pertencentes ao filo Crenarchaeota, três agruparam filogeneticamente com sequências de arqueas não cultiváveis do solo, e uma com sequências de ambiente marinho. A análise das curvas de rarefação e o cálculo das coberturasmostraram que as bibliotecas construídas foram grandes o suficiente para cobrir a maior parte da diversidade de Archaea presentes em frutos de café cereja. No estudo da diversidade de Archaea durante a seca natural observou-se um aumento do número de UTOs a partir do sétimo dia,permanecendo até o último dia do processo. A análise de agrupamento dos perfis distinguiu as populações presentes nos dias finais de secagem. A ausência de estudos fisiológicos de arqueas não cultiváveis, especialmente de ambientes mesófilos, limita o conhecimento do metabolismo destes micro-organismos e a determinação do papel das endofíticas dos frutos de café. Contudo, estudos metagenômicos da comunidade microbiana associada a frutos de café ajudarão a identificar genes de Archaea e a estabelecer relações entre a presença de determinados micro- organismos e de compostos precursores daqueles que compõe o aroma e sabor na qualidade final da bebida.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1207373 bytes, checksum: f279fd080120df1d02002fe650c0e5bf (MD5) Previous issue date: 2008-08-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The complexity and limited knowledge of the epiphytic and endophytic microbiota in coffee cherries, especially the unculturable ones, make it a challenging task the characterization of this microbiodiversity and its possible role as producers of precursors to compounds inherent to higher quality coffees. The present study was conducted to evaluate the diversity of endophytic bacteria in coffee cherries (Coffea arabica L.) from plantations located in North Zona da Mata, Minas Gerais, Brazil. Fragments of 16S rDNA were PCR-amplified using specific primers for the phyla Actinobacteria, Firmicutes, and Proteobacteria classes α, β and γ, using as template metagenomic DNA extracted from coffee cherries. Amplicons were evaluated by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) fingerprinting and also used to create a library of 16S rDNA clones. PCR-DGGE showed a variable genetic diversity profile in the DNA sample and revealed at least 38 Operational Taxonomic Units (OTU). PCR products sequenced showed that the endophytic bacterial community is composed, in addition to others, by representatives phylogenetically affiliated to the phyla Firmicutes and Proteobacteria, classes β and γ, for both cultivated and uncultivated microorganisms. The presence of endophytic bacteria belonging to Burkholderia and Klebsiela oxytoca is suggested based on the phylogenetic analyses of sequenced DNA fragments purified from the bands of the xviDGGE gels. A total of 50 clones of endophytic γ-Proteobacteria and 25 clones of endophytic Firmicutes from the 16S rDNA library were partially sequenced and identified. The result of sequence analyses showed three genera of Firmicutes among which 60% showed high identity with Bacillus, 8% with Staphylococcus, and 4% with Paenibacillus. Rarefaction and coverage analyses showed that the number of clones screened from the bacterial clone library was sufficient to reflect the diversity of endophytic Firmicutes in coffee cherries and that the number of unique sequence types sampled from this library approached the total number of unique sequences within the library. The populations of endophytic bacteria in coffee cherries are diverse and cover different phyla. In this study, for the first time, a library of 16S rDNA clones was constructed to access the diversity of endophytic bacteria in coffee cherries, both of culturable and unculturable microorganisms. The functional role of these bacteria in coffee cherries, as well as the genetic and functional diversity of other groups of microorganisms, is under investigation. The knowledge on this diversity is essential to determine the role of endophytic microorganisms in the production and interchange of precursors metabolites associated with the highest quality of the coffee beverage. Additionally, these studies will help the understanding of the physiological and genetic principles involved in the complex host-microorganism and microorganism-microorganism interactions. / A complexidade da microbiota epifítica e endofítica presente em frutos de café e o limitado conhecimento dos microrganismos, especialmente dos nãocultiváveis, dificultam a caracterização da microbiodiversidade e da possível atividade e contribuição dela para a formação de precursores de compostos que definem a qualidade superior da bebida do café. O presente estudo teve como objetivo avaliar a diversidade bacteriana endofítica associada aos frutos de café (Coffea arabica L.) coletados em fazenda localizada na Zona da Mata Norte de Minas Gerais, Brasil. Fragmentos de rDNAs 16S foram diretamente amplificados por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) a partir de primers específicos para os filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria pertencentes às classes α, β e γ, utilizando, como molde, DNA metagenômico extraído de frutos de café. Os amplicons foram submetidos à Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) e utilizados para construção de bibliotecas de clones de rDNAs 16S. A PCR-DGGE mostrou variado perfil de diversidade genética na amostra de DNA, com a presença de pelo menos 38 Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs). Os produtos de PCR purificados e seqüenciados mostraram que a comunidade de bactérias endofíticas é composta, entre outros, por representantes relacionados filogeneticamente aos filos Firmicutes e Proteobacteria pertencentes às classes β e γ, dentre os quais se destacam microrganismos cultiváveis e não-cultiváveis. A presença de bactérias endofíticas pertencentes ao gênero Burkholderia e à espécie Klebsiela oxytoca é sugerida com base nas análises filogenéticas realizadas a partir do seqüenciamento de DNA obtido de bandas purificadas do gel de DGGE. Um total de 50 clones positivos da biblioteca de rDNAs 16S de γ-Proteobacteria endofíticas e 25 clones positivos da biblioteca de rDNAs 16S de Firmicutes endofíticos foram parcialmente seqüenciados e identificados. O resultado da análise das seqüências mostrou 3 gêneros de Firmicutes na biblioteca de rDNAs 16S, sendo que 60% mostraram alta identidade com Bacillus, 8% com Staphylococcus e 4% com Paenibacillus. Análises de rarefação e de cobertura mostraram que a biblioteca foi representativa e suficiente para refletir a diversidade de Firmicutes endofíticos de frutos de café e que a seqüência única detectada na amostra aproxima-se do número total de seqüências únicas dentro desta biblioteca. As populações de bactérias endofíticas presentes em frutos de café são diversas e compreendem diferentes filos. Neste estudo foi construída, pela primeira vez, uma biblioteca de clones de rDNAs 16S para acessar a diversidade de bactérias endofíticas, cultiváveis e não-cultiváveis, em frutos de café. O papel funcional dessas bactérias nos frutos de café, assim como a diversidade genética e funcional de outros grupos de microrganismos, continua sendo investigado. O conhecimento dessa diversidade é de fundamental importância para se determinar a participação destes microrganismos na produção e interconversão de metabólitos precursores daqueles que estão associados à qualidade superior da bebida do café. Adicionalmente, esses estudos podem auxiliar no entendimento dos princípios fisiológicos e genéticos envolvidos nas complexas interações microrganismo-hospedeiro e microrganismo-microrganismo.

Os bastonetes Gram positivos irregulares (BGPIs) compõem um grupo de espécies bacterianas com ampla diversidade fenotípica e que podem estar presente no meio ambiente, na microbiota humana e de animais. A identificação acurada de BGPIs em nível de gênero e espécie empregando métodos bioquímicos convencionais é bastante limitada, sendo recomendado, portanto, o uso de técnicas moleculares. No presente estudo, foram identificadas amostras de BGPIs oriundas de espécimes clínicos de humanos, de produtos farmacêuticos e de áreas limpas através da análise de sequencias do gene 16S rRNA e de outros genes conservados (housekeeping genes). Os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes 16S rRNA e rpoB demonstraram C. striatum multi-resistente (MDR) como responsável por surto epidêmico em ambiente hospitalar da cidade do Rio de Janeiro. Quinze cepas de C. striatum foram isoladas em cultura pura a partir de secreção traqueal de pacientes adultos submetidos a procedimentos de entubação endotraqueal. A análise por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) indicou a presença de quatro perfis moleculares, incluindo dois clones relacionados com cepas MDR (PFGE I e II). Os dados demonstram a predominância de PFGE I entre cepas MDR isoladas de unidades de terapia intensiva e enfermarias cirúrgicas. Uma potencial ligação causal entre a morte e a infecção por C. striatum MDR (PFGE tipos I e II) foi observada em cinco casos. Adicionalmente, acreditamos que este seja o primeiro estudo de identificação de espécies de Nocardia relacionadas com infecções humanas pela análise da sequencia multilocus (MLSA) no Brasil. Diferente dos dados observados na literatura (1970 a 2013) e obtidos pelos testes fenotípicos convencionais, a caracterização molecular de quatro lócus (gyrB-16S-secA1-hsp65) permitiu a identificação das espécies N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica e N. exalbida/gamkensis relacionadas com quadros de nocardiose em humanos. Cepas de N. nova isoladas de diferentes materiais clínicos de um único paciente apresentaram padrões de susceptibilidade antimicrobianos idênticos e dois perfis PFGE, indicando a possibilidade de quadros de co-infecção por N. nova em humanos. Em outra etapa da investigação, amostras de BGPIs obtidos de ambientes de salas limpas que não puderam ser identificadas por critérios convencionais foram submetidas a análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterizadas 95,83% em nível de gênero e 35,42% em espécies. Para gêneros mais encontrados no estudo, foram analisados os genes rpoB e recA de dezessete cepas de Microbacterium e utilizado o MLSA para a identificação de sete cepas identificadas como Streptomyces. Os ensaios permitiram a identificação de três cepas de Microbacterium e de uma única amostra de Streptomyces ao nível de espécie. A análise da sequencia do gene rpoB também se mostrou eficaz na identificação de espécies de cepas de Corynebacterium. Finalmente, para as cepas ambientais pertencentes à classe Actinobacteria os dados morfológicos, bioquímicos e genotípicos permitiram documentar a cepa 3117BRRJ como representante de uma nova espécie do gênero Nocardioides, para o qual o nome Nocardioides brasiliensis sp. nov. e as cepas 3712BRRJ e 3371BRRJ como representante de um novo gênero e espécie para o qual o nome Guaraldella brasiliensis nov. foi proposto. / Irregular Gram positive rods (coryneform bacteria; IGPRs) comprise a group of species that has a wide phenotypic diversity and makes the conventional identification limited and that may be present in the environment, humans and animals hosts. In order to provide further accurate identification of these microorganisms in a genus and species terms it is recommended the use of molecular methods. In this study, we analyzed the 16S rRNA gene sequences and other conserved genes (housekeeping) in order to elucidate the identification of clinical isolates, pharmaceutical and clean room areas. We have documented a nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant (MDR) C. striatum in Rio de Janeiro. C. striatum identification was confirmed by 16S rRNA and rpoB gene sequencing. C. striatum was mostly isolated in pure culture from tracheal aspirates of adults undergoing endotracheal intubation procedures. The analysis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) indicated the presence of four PFGE profiles, including two related clones of MDR strains (PFGE I and II). The data demonstrated the predominance of PFGE I, mostly isolated from patients of intensive care units and surgical wards. A potential causal link between death and MDR C. striatum (PFGE I and II) infection was observed in five cases. We also performed the identification of Nocardia species of human infections by multilocus sequence analysis (MLSA) and characterized their antimicrobial and phenotypic profiles. An overview from 1970 to 2013 of the case reports on Nocardia species related to human infections, except mycetomas, in Brazil, was also accomplished. Molecular characterization by four-locus (gyrB-16S-secA1-hsp65) has provided the species identification N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica and N. exalbida/gamkensis. N. nova strains isolated from different clinical specimens of one patient showed identical antimicrobial susceptibility patterns. PFGE analysis performed to determine the genetic relatedness of these N. nova strains two distinct profiles, which were designated A and B. This is the first report on identification of Nocardia species by MLSA in Brazil. The IGPRs obtained in clean room environments that could not be identified by conventional criteria were studied by 16S rRNA gene sequence analysis that allowed the identification of 95.83% at genus level and of 35.42% at the species level. The most common genus found in the clean room environments were Microbacterium and Streptomyces. The analysis of rpoB and recA genes sequence of seventeen Microbacterium strains contributed to the identification of three strains at species level. MLSA of seven Streptomyces strains identified a single sample at the species level. Moreover, the rpoB gene sequence analysis was effective in identifying Corynebacterium strains at species level. A new genus and species were found among clean room environmental strains belonging to the Actinobacteria class. Based on the morphological, genotypic and biochemical data presented in this study the 3117BRRJ strain represent a novel specie of the genus Nocardioides, for which the name Nocardioides brasiliensis sp. nov. was proposed and the 3712BRRJ and 3371BRRJ represent a new genus and species for which the name Guaraldella brasiliensis nov. were proposed.