The phylum Chaetognatha is a mysterious group of organisms that has eluded scientists for more than a century because of their unique morphology and developmental characteristics, i.e. protostome (mouth develops from blastopore; e.g. mollusks, annelids, arthropods) versus deuterostome (anus develops from blastopore; e.g. echinoderms and chordates) offer few clues to their evolutionary origins. Some early morphological studies argued that chaetognaths were derived mollusks or nematodes according to gross ultrastructural data, while other studies focused on the coelomic cavity. 33 Although 18S rRNA is widely used in molecular phylogeny studies, it has limits such as long- branch chain attractions and a slow rate of evolutionary change. Long-branch chain attractions are a phenomenon in phylogenetic analyses when rapidly evolving lineages are inferred to be closely related, regardless of their true evolutionary relationships. Hence other genes are used in this study to complement the 18S rRNA such as the cytochrome oxidase genes. The cytochrome oxidase genes are highly conserved throughout all eukaryotic organisms and they are less ambiguous to align as compared to the ribosomal genes, making them better phylogenetic markers as compared to the 18S rRNA gene. This study focuses on using a molecular approach (ARDRA, PCR, phylogenetic tree reconstruction) to determine the phylogeny of pelagic chaetognaths found on Pelican Island, Galveston, Texas. 18S rRNA, Cytochrome Oxidase I and Cytochrome Oxidase II genes were used to help decipher the phylogeny of this group. All analyzed genes in this study (18S rRNA, COI, and COII) grouped the Pelican Island chaetognaths with the protostomes. The maximum parsimony bootstrap tree for the 18S rRNA gene, grouped the samples closest to the arthropods (protostome). For the COI and COII genes, the minimum evolution bootstrap tree grouped the 8 collected samples more closely to two other protostome phyla: the mollusks and annelids (COI) while bootstrapping with the COII grouped the samples with the nematodes (with >66 percent bootstrap). My findings are significant because they reveal phylogenetic results of a protostome lineage for the Chaetognatha using 3 genes, one of which (COII) has not been greatly studied for the Chaetognatha.

Τα ισόποδα αποτελούν τη μοναδική τάξη οργανισμών ανάμεσα σε όλα τα Καρκινοειδή που πέτυχε να εποικήσει όλους τους τύπους ενδιαιτημάτων, από τα βάθη των ωκεανών μέχρι τα βουνά, τις έρημους και τις τροπικές περιοχές. Παρόλα αυτά, οι φυλογενετικές σχέσεις εντός της τάξης των ισοπόδων παραμένουν σε πολλά σημεία ασαφείς. Η οικογένεια Tylidae, που περιλαμβάνει 27 αμφίβια είδη, ανήκει σύμφωνα με τη σημερινή συστηματική κατάταξη στην υπόταξη Oniscidea, τη μοναδική που περιλαμβάνει αντιπροσώπους με χερσαίο ή ημι-χερσαίο τύπο διαβίωσης. Αν και υπάρχουν αμφιβολίες ως προς τη μονοφυλετική προέλευση αρκετών από τις 9 υποτάξεις που περιλαμβάνουν θαλάσσιους αντιπροσώπους, η προέλευση των Oniscidea θεωρείται αδιαμφισβήτητα μονοφυλετική. Εντούτοις, δεν υπάρχει ακόμη συμφωνία ως προς την ακριβή τοποθέτηση του κλάδου των Tylidae στο φυλογενετικό δέντρο των Oniscidea. Ο βασικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων των αμφιβίων ισοπόδων της οικογένειας Tylidae με τα υπόλοιπα ισόποδα, με έμφαση στις σχέσεις με τα υπόλοιπα Oniscidea. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν μοριακοί δείκτες από 14 γένη ισοπόδων, τα οποία αντιπροσωπεύουν όλους τους τύπους διαβίωσης, από τον αποκλειστικά θαλάσσιο έως τον αποκλειστικά χερσαίο. Η πειραματική προσέγγιση περιλάμβανε τον πολλαπλασιασμό αλληλουχιών του πυρηνικού γονίδιου 18s rDNA και των μιτοχονδριακών 16s rDNA και COI με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμέρασης (PCR), τον προσδιορισμό της αλληλουχίας τους και τη φυλογενετική ανάλυσή τους με μεθόδους μέγιστης φειδωλότητας, μέγιστης πιθανοφάνειας και μπεϊεσιανής συμπερασματολογίας. Οι μιτοχονδριακές αλληλουχίες εμφανίζουν πολύ υψηλά ποσοστά νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, και σε συνδυασμό με τη χαμηλή αξιοπιστία των δέντρων που παράγονται φαίνεται πως έχουν απωλέσει εντελώς το φυλογενετικό τους σήμα. Η αλληλουχία του 18s rDNA έχει μήκος 2400-3400 bp και αποτελείται από 4 συντηρημένες περιοχές και 3 υπερ-μεταβλητές. Για τις φυλογενετικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν μόνο οι συντηρημένες περιοχές, που συνιστούν ένα σύνολο 1597 διακριτών χαρακτήρων. Στα αποτελέσματα από όλες τις υπολογιστικές μεθόδους η οικογένεια Tylidae τοποθετείται στο τελικό δέντρο σε αδελφό κλάδο του τάξου Crinochaeta της υπόταξης Oniscidea. Εντούτοις, παρατηρήθηκε πως η οικογένεια Ligiidae τοποθετείται σε κλάδο μη-συγγενικό προς τα υπόλοιπα χερσαία ισόποδα, υπονοώντας πως η υπόταξη Oniscidea δεν είναι μονοφυλετική. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, χωρίσαμε τα δεδομένα μας σε αλληλουχίες από θαλάσσιους και σε αλληλουχίες από χερσαίους αντιπροσώπους, πραγματοποιώντας ένα σύνολο από πρόσθετες αναλύσεις. Από τα αποτελέσματα φαίνεται πως η υπόταξη Oniscidea είναι μονοφυλετική και η αντίθετη αρχική υπόθεση οφείλεται σε ‘θόρυβο’ στο φυλογενετικό σήμα των συντηρητικών περιοχών του 18s rDNA. Τέλος, από τις πρόσθετες αναλύσεις προκύπτουν, με ισχυρή στατιστική στήριξη, φυλογενετικά δέντρα που υποστηρίζουν τη συστηματική κατάταξη που είχε προτείνει ο Erhard από τις μορφολογικές του μελέτες, τοποθετώντας τα Tylidae εντός του τάξου ‘Holoverticata’. / Isopods comprise a unique order among the Crustaceans that has settled effectively all possible habitats on the planet. The phylogenetic relationships, though, between the 10 suborders remain unresolved, as many of them might prove to be non-monophyletic taxa. The family Tylidae consists of 27 amphibian species and is traditionally classified in the suborder Oniscidea, which includes all the terrestrial and semi-terrestrial isopods and that is thought to be unambiguously monophyletic. However, the previous phylogenetic studies have proposed many hypotheses concerning the relations between the Tylidae and the other Oniscidea, lacking any plausible consensus. In order to resolve those phylogenetic relations, we used two mitochondrial sequences (16s, COI) and one nuclear (18s) from 14 genera of isopods. Our experimental approach included PCR amplification, sequencing and computational phylogenetic analyses by means of maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian inference. The mitochondrial sequences present extreme values of nucleotide substitutions and evident saturation, a fact that prohibits their use in further analyses. The 18s sequences vary significantly in size (2400-3400 bp) and consist of 4 conserved and 3 hyper-variable regions. Only the conserved regions were used for analysis, resulting to a dataset of 1597 discrete nucleotide characters. Regardless of the method used, the family Tylidae appeared as a sister-clade of the taxon Crinochaeta (suborder Oniscidea) in the cladograms. We noticed, though, that the taxon Diplochaeta (Oniscidea: Ligiidae) appeared (with low bootstrap values) in a distant clade of all the other Oniscidea, a result that does not support the monophyletic origin of the Oniscidea. In order to test the validity of this result, we splitted our dataset and conducted additional, separate analyses for the sequences of the marine isopods and those of the terrestrial isopods. Our results indicate that the suborder Oniscidea is monophyletic, so the initial opposite hypothesis was due to weak phylogenetic signal. Finally, our cladograms support, with significant confidence, the systematic classification that Erhard (1998) had proposed through his studies on morphological characters of the Oniscidea, placing together the family Tylidae and the taxon Crinochaeta under the name ‘Holoverticata’.

Το ριβοσωματικό RNA (rRNA) παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της ακριβούς αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας. Σύμφωνα με πρόσφατες κρυσταλλικές δομές υψηλής ευκρίνειας της μικρής υπομονάδας του προκαρυωτικού ριβοσώματος, η περιοχή αποκωδικοποίησης αποτελείται κυρίως από rRNA, περιλαμβάνοντας κυρίως τις έλικες 18 και 34, καθώς και τις αδενίνες Α1492 και Α1493 της έλικας 44 του 16S rRNA. Επιπροσθέτως, ο ρόλος του rRNA στην ακριβή αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας έχει αποκαλυφθεί εκτενώς μέσω κατασταλτικών ή αντικατασταλτικών μεταλλάξεων, οι οποίες αυξάνουν ή μειώνουν τη λανθασμένη ανάγνωση του mRNA, αντίστοιχα. Πολλές από τις μεταλλάξεις αυτές αφορούν στο 16S rRNA της Escherichia coli. Μεταξύ αυτών είναι η μετάλλαξη C310G στην έλικα 12, η G1206C στην έλικα 34 και η G517A στην έλικα 18. Στο πρώτο μέρος της παρούσης μελέτης εξετάσθηκε το αντίκτυπο των αντίστοιχων μεταλλάξεων com1 (C310G), com6 (G1206C) και rdn2 (G517A) στο 18S rRNA του Saccharomyces cerevisiae. Τα κύτταρα yeast μετασχηματίστηκαν με rDNA πλασμίδια αγρίου-τύπου (wt) ή μεταλλαγμένα, τα οποία έφεραν τις προαναφερθείσες μεταλλάξεις. Τα κύτταρα που ελέγχθηκαν ήταν το αγρίου τύπου (rdnwt), τα μεταλλάγματα rdn2, com1, καθώς και τα διπλά μεταλλάγματα com1rdn2 και com6rdn2. Το αντίκτυπο της μετάλλαξης com6 εξήγχθη έμμεσα από το διπλό μετάλλαγμα com6rdn2, αφού το μετάλλαγμα com6 δεν ήταν διαθέσιμο στο Εργαστήριο (Τα στελέχη αυτά χορηγήθηκαν από το Εργαστήριο της Dr Susan Liebman, University of Illinois at Chicago, USA). Όσον αφορά στη μελέτη ανάπτυξης των στελεχών αυτών, τα στελέχη com1 παρουσίασαν εξαιρετικά αργή ανάπτυξη παρουσιάζοντας 3 φορές αύξηση του χρόνου διπλασιασμού τους σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt. Αντίθετα, το μετάλλαγμα rdn2 παρουσίασε παρόμοιο φαινότυπο ανάπτυξης με τα rdnwt. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα διπλά μεταλλάγματα com1rdn2 και com6rdn2 παρουσίασαν μικρότερο χρόνο διπλασιασμού από τα κύτταρα rdnwt. Όσον αφορά στη μεταφραστική ακρίβεια, το μετάλλαγμα com1 παρουσίασε 1,5 φορά αύξηση στο ρυθμό λανθασμένης ενσωμάτωσης του αμινοξέος λευκίνη σε μία αυξανόμενη αλυσίδα πολυφαινυλαλανίνης κατά την in vitro μετάφραση ενός poly(U) εκμαγείου, σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt. Αντίθετα, η μετάλλαξη rdn2 οδήγησε σε μεταφραστική υπερακρίβεια, αφού δεν βρέθηκε καμία ενσωμάτωση λανθασμένου αμινοξέος ανά 10.000 κωδικόνια mRNA. Το διπλό μετάλλαγμα com1rdn2 εμφάνισε παρόμοια επίπεδα μεταφραστικής ακρίβειας με κύτταρα rdnwt. Έτσι, οι μεταλλάξεις com1 και rdn2 επηρρεάζουν τη μεταφραστική ακρίβεια σε ίσο βαθμό, αλλά προς αντίθετες κατευθύνσεις. Το άλλο διπλό μετάλλαγμα της παρούσης μελέτης com6rdn2 παρουσίασε επίσης παρόμοια επίπεδα μεταφραστικής ακρίβειας με το rdnwt, αποκαλύπτοντας έτσι πως η μετάλλαξη com6 οδηγεί επίσης σε μείωση της μεταφραστικής πιστότητας. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το αντίκτυπο των μεταλλάξεων com1, com6 και rdn2 στην ακρίβεια της μετάφρασης είναι ανεξάρτητο και προσθετικό και όχι συνεργιστικό. Επιπρόσθετη επιβεβαίωση προήλθε με την in vitro μετάφραση εκμαγείων poly(U) παρουσία παρομομυκίνης (PM), ενός αμινογλυκοζιτικού αντιβιοτικού γνωστού για την αύξηση της ενσωμάτωσης λανθασμένων αμινοξέων στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα τόσο στα προκαρυωτικά, όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το στέλεχος com1 παρουσίασε 3 φορές αύξηση στη συχνότητα λάθους κατά τη μετάφραση σε σχέση με το rdnwt, επιβεβαιώνοντας το χαρακτηρισμό του ώς επιρρεπές σε λάθη μετάλλαγμα. Αντίθετα, το στέλεχος rdn2 εμφάνισε μισή περίπου συχνότητα λαθών κατά τη μετάφραση σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt, σε συμφωνία με το προηγούμενο χαρακτηρισμό του ως υπερακριβές μετάλλαγμα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με in vivo μελέτες ανθεκτικότητας έναντι της PM τόσο σε υγρές όσο και σε στερεές καλλιέργειες (τρυβλία petri). Το μετάλλαγμα com1 βρέθηκε το πιο ευαίσθητο όλων, αφού το 50% αναστολής της ανάπτυξής του παρατηρήθηκε σε μόλις 5 μΜ PM σε σχέση με τα 75 μΜ για το στέλεχος rdnwt. Αντίθετα, η τιμή IC50 της PM για το rdn2μετάλλαγμα βρέθηκε ίσο προς 500 μΜ. Το διπλό μετάλλαγμα com1rdn2 παρουσίασε παρόμοια επίπεδα ευαισθησίας στην PM με rdnwt, ενώ το άλλο διπλό μετάλλαγμα com6rdn2 αποδείχθηκε ως πιο ανθεκτικό (IC50 = 125 μΜ), υποδηλώνοντας ότι η com6 πρέπει να είναι λιγότερο επιρρεπής σε λάθη σε σχέση με την com1 μετάλλαξη. Πειράματα in vivo ανθεκτικότητας στην PM (σε τρυβλία petri) επιβεβαίωσαν τα επίπεδα ευαισθησίας που αποκαλύφθηκαν με τις υγρές καλλιέργειες. Η μελέτη των μεταλλάξεων αυτών ολοκληρώθηκε με πειράματα πρόσδεσης στις θέσεις A και P του ριβοσώματος. Οι μεταλλάξεις που μειώνουν την μεταφραστική πιστότητα οδηγούν και σε αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης μορίων αμινο-ακυλο tRNA (aa-tRNA) στη θέση Α του ριβοσώματος, ενώ αντίθετα οι μεταλλάξεις που αυξάνουν την ακρίβεια της μετάφρασης συνοδεύονται και από μείωση της ικανότητας πρόσδεσης aa-tRNAs στη θέση Α του ριβοσώματος. Με τέτοιες μελέτες βρέθηκε ότι η μετάλλαξη com1 οδήγησε σε αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης στη θέση Α, αντίθετα με την rdn2, όπου διαπιστώθηκε ακόμη μικρότερη ικανότητα πρόσδεσης και σε σχέση με τα ριβοσώματα αγρίου τύπου. Τα διπλά μεταλλάγματα έδειξαν λίγο μεγαλύτερη ικανότητα πρόσδεσης σε σχέση με αυτά του αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωσαν το χαρακτηρισμό των com1 και com6 ως μεταλλάξεις μείωσης της μεταφραστικής ακρίβειας σε αντίθεση με τη μετάλλαξη rdn2, η οποία οδηγεί σε υπερακρίβεια. Όσον αφορά στην ικανότητα πρόσδεσης aa-tRNAs στη θέση P του ριβοσώματος σε σχέση με τα ριβοσώματα αγρίου τύπου (rdnwt), αυτή βρέθηκε μεγαλύτερη στην περίπτωση της com1 μετάλλαξης και μικρότερη στην περίπτωση της rdn2 μετάλλαξης, υποδηλώνοντας ότι η com1 οδηγεί σε μεγαλύτερο ρυθμό πρωτεϊνοσύνθεσης σε σχέση με την υπερακριβή rdn2 μετάλλαξη. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε σε συνεργασία με το Εργαστήριο Βιοχημείας του κ. Χρήστου Γεωργίου (Τμήμα Βιολογίας, Παν. Πατρών), για το άν υπάρχει κάποια συσχέτιση μεταξύ της μεταφραστικής πιστότητας και του οξειδωτικού στρες στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε δύο καλά μελετημένα μεταλλαγμένα στελέχη S. cerevisiae στο Εργαστήριό μας με αντίθετες επιπτώσεις στη μεταφραστική ακρίβεια. Αυτά ήταν το sup45 μετάλλαγμα (επιρρεπές σε λάθη με συχνότητα λάνθασμένης ενσωμάτωσης αμινοξεών ίση προς 0,0166) καθώς και το τριπλό μετάλλαγμα sup45rdn4rdn6 (συχνότητα λάθους: 0,0057), στο οποίο γίνεται η επαναφορά της μεταφραστικής ακρίβειας στα επίπεδα των μορίων αγρίου τύπου (0,0036). Οι μεταλλάξεις rdn4 και rdn6 αφορούν στην έλικα 27 του 18S rRNA, ενώ η μετάλλαξη sup45 πρόκειται για μία κατασταλτική μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί για τον πράγοντα τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης eRF-1. Οι οξειδωτικοί δείκτες που μετρήθηκαν ήταν η μαλονική διαλδεϋδη (MDA: κύριο προϊόν υπεροξείδωσης λιπιδίων), η οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSSG), οξειδωμένα μη πρωτεϊνικά μόρια (NPSSR), καθώς και οξειδωμένα πρωτεϊνικά μόρια (PSSP). Οι αντιοξειδωτικοί δείκτες που μετρήθηκαν ήταν τα ανηγμένα πρωτεϊνικά μόρια που φέρουν ελεύθερες σουλφυδρυλομάδες (PSH), καθώς και το κλάσμα PSH/PSSP μέσα στα κυτταρικά εκχυλίσματα. Εν συντομία, το επιρρεπές σε λάθη κατα τη μετάφραση μετάλλαγμα sup45 μείωσε τα επίπεδα των οξειδωτικών δεικτών σε αντίθεση με το πιο ακριβές τριπλό μετάλλαγμα sup45rdn4rdn6, στο οποίο παρατηρήθηκε αύξηση των δεικτών αυτών. Περαιτέρω επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων αυτών προήλθε με την χρήση παρομομυκίνης κατά την ανάπτυξη των στελεχών αυτών (μειώνει τη μεταφραστική πιστότητα) και τη διεξαγωγή των μετρήσεων αυτών των δεικτών οξειδωτικού στρες εκ νέου. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με χρήση PM έδειξαν στις περισσότερες περιπτώσεις σημαντική μείωση των επιπέδων οξειδωτικού στρες. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα του δεύτερου μέρους της Μεταπτυχιακής αυτής Διατριβής υποδηλώνουν ότι στα ευκαρυωτικά κύτταρα η μείωση της μεταφραστικής πιστότητας οδηγεί σε μείωση του οξειδωτικού στρες σε αυτά και το αντίστροφο. / The ribosomal RNA (rRNA) plays a key role in the process of the accurate decoding of genetic information. According to recently derived high-resolution crystal structures of the prokaryotic small ribosomal subunit, the decoding site is mainly composed of RNA, including helices 18 and 34 as well as adenines A1492 and A1493 of helix 44 of the 16S rRNA. Furthermore, the role of ribosomal RNA in the accurate decoding of genetic information has been largely uncovered by suppressor or antisuppressor mutations that increase or decrease misreading respectively. Many of these mutations are in 16S rRNA of Escherichia coli. Among these are C310G in helix 12, G1206C in helix 34 and G517A in helix 18. In the first part of this study we examined the function of the corresponding mutations com1 (C310G), com6 (G1206C) and rdn2 (G517A) in 18S rRNA of Saccharomyces cerevisiae. Yeast cells were transformed with wild-type or mutant rDNA plasmids carrying the afore-mentioned site-directed mutations. The strains examined were the wild-type (rdnwt), mutants rdn2, com1 and the double mutants com1rdn2 and com6rdn2. The properties of mutation com6 were only deduced from the double mutant com6rdn2, since mutation com6 was not available individually. The mutants were first constructed in Prof. Susan Liebman’s laboratory at the University of Illinois at Chicago, USA. Strains com1 were viable but exhibited an extraordinary slow growth phenotype as they displayed a 3-fold increase of their doubling time over the rdnwt. On the other hand, rdn2 mutants displayed a growth phenotype similar to that of rdnwt cells. Interestingly, the double mutants com1rdn2 and com6rdn2 abolished the slow growth phenotype and grew faster than rdnwt. Regarding translational accuracy, com1 mutant displayed a 1.5-fold increase of the rate of misincorporation of the nearcognate amino acid leucine in a growing polyphenylalanine chain with poly(U) as template over rdnwt. In contrast, mutation rdn2 displayed impressive hyperaccuracy as it was found that none nearcognate aminoacid is added in 10.000 mRNA codons. Moreover, the double mutant com1rdn2 exhibited misreading levels similar to those of the rdnwt. Thus, com1 and rdn2 affect the decoding process to an equal degree but in reverse ways. The other double mutant under study, com6rdn2 also displayed an error frequency similar to that of rdnwt revealing that com6 is an error-prone mutation as well. These results imply that the effects of mutations com1, com6 and rdn2 on translational accuracy are independent and additive rather than synergistic. Additional confirmation came by in vitro translation of poly(U) templates in the presence of paromomycin (PM), which is an aninoglycoside antibiotic known to induce suppression of the genetic code. Strain com1 displayed a 3-fold increase of error frequency over rdnwt, confirming its characterization as an error-prone mutant. In contrast, rdn2 displayed an error frequency about half of that observed for the rdnwt, compatible with its characterization as a hyperaccurate mutant. The previous results were confirmed by in vivo resistance studies toward PM in liquid cultures and on Petri plates. Mutant com1 was the most sensitive of all, as 50% inhibition of its growth was observed at only 5 μΜ PM compared to 75 μΜ for rdnwt. In contrast, the IC50 value of PM for the rdn2 mutant was 500 μΜ. The double mutant com1rdn2 exhibited a resistance to PM similar to rdnwt, and the other double mutant com6rdn2 was more resistant (IC50 = 125 μΜ), implying that com6 should be a less error-prone mutation than com1. In vivo resistance to PM (on petri dishes) confirmed the sensitivity levels found in liquid cultures. The study of these mutations was completed by A- and P-site binding experiments. An increase in A-site binding of aa-tRNA may arise from a higher affinity to accept noncognate tRNAs and is related to error-prone mutations, whereas a decrease is related to error-restrictive mutations. Binding of Phe-tRNA to A-site of com1 mutants was much higher than in rdnwt. In contrast, binding to A-site of rdn2 was much lower than in rdnwt. Finally, the double mutants showed an A-site binding capacity slightly higher than the wild-type. These results confirmed that com1 and com6 are error-prone mutations, whereas rdn2 an error-restrictive mutation. With regards to P-site, com1 displayed a higher binding capacity and rdn2 a lower binding capacity compared to wild-type, indicating that com1 may have a higher protein synthesis activity than rdn2. In the second part of this study, we (in cooperation with Dr Christos Georgiou’s lab; Dept. of Biology, University of Patras) investigated whether any correlation between the translational fidelity and oxidative stress exists in eukaryotic cells. We used mutants already studied in our lab for their effects on translational fidelity and other aspects of protein synthesis. These were the sup45 mutant encoding the eRF-1 release factor and the triple mutant sup45rdn4rdn6 which carries, in addition to sup45, mutations rdn4 and rdn6 in helix 27 of the 18S rRNA. Mutant sup45 is error-prone (E.F. = 0.0166), while rdn4, rdn6 are both error-restrictive. The triple mutant sup45rdn4rdn6 diplays an error frequency of 0.0057, equal to the sum of the error frequencies of the individual mutations. The error frequency of the rdnwt is 0.0036. The oxidative markers measured were malondialdehyde (MDA, the main product of lipid peroxidation), oxidized glutathione (GSSG), oxidized non protein molecules (NPSSR), and oxidized protein molecules (PSSP). On the other hand, the antioxidative markers measured were t reduced protein molecules carrying –SH groups (PSH), as well as the ratio PSH/PSSP in the cell. In brief, the error-prone mutant sup45 was shown to decrease the concentrations of the various oxidative markers, while the comparatively error-restrictive triple mutant sup45rdn4rdn6 was shown to increase them. To further test the hypothesis that the oxidative status of a yeast cell may be related to the level of translational accuracy, we repeated the above experiments using PM. Our results with PM showed in most cases a decrease in the concentrations of the various oxidative markers. This is compatible with the notion that an increase in translational errors causes a decrease in oxidative stress and vice versa.

Lake Baikal, in Siberia, Russia, contains the highest biodiversity of any extant lake, including an impressive radiation of gammaroidean amphipods that are often cited as a classic case of adaptive radiation. However, relationships among Baikal's amphipods remain poorly understood. The phylogenetic history of 32 Lake Baikal amphipod species, representing most major lineages of the endemic fauna, was examined using three genes (COI, 16S rRNA, and 18S rRNA), and 152 morphological characters. Results support monophyly of the largest and most diverse of the Baikalian families, the Acanthogammaridae. Analyses suggest that a second Baikalian family, the fossorial Micruropodidae, is paraphyletic and composed of two divergent clades, one of which includes Macrohectopus branickii, a morphologically specialized pelagic planktivore traditionally assigned its own family. The extreme morphological and ecological divergence of Macrohectopus from its close genetic relatives, and conversely, the large genetic distances among other morphologically similar micruropodids, suggest that morphological and molecular evolution have often been uncoupled during the radiation of Baikal's amphipods. This study suggests that the amphipod fauna of Lake Baikal is polyphyletic; originating from two independent invasions of the lake.

No description available.

Orientador: Lara Durães Sette / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T06:41:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Passarini_MichelRodrigoZambrano_D.pdf: 6997453 bytes, checksum: 0a905c32bd8d912eb875c88cff54de8e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O oceano representa um habitat promissor na busca por novos micro-organismos, os quais podem apresentar capacidade de produzir enzimas de interesse industrial diferentes das produzidas por seus parceiros terrestres. Neste contexto, duas amostras da esponja marinha Dragmacidon reticulatum foram coletadas no litoral Norte do Estado de São Paulo, objetivando a caracterização da diversidade fúngica por métodos dependentes e independentes de cultivo, bem como a avaliação da produção, expressão da enzima e caracterização do gene da lacase. Com relação à parcela cultivada das amostras, 108 fungos filamentosos foram isolados. Destes, 64 ribotipos distintos foram submetidos aos experimentos de taxonomia polifásica e aos relacionados com a lacase. Análises macro- e microscópicas, moleculares (genes ribossomais ITS/28S) e pela técnica de MALDI TOF ICMS, resultaram na caracterização de 38 isolados distribuídos em 23 gêneros pertencentes ao Filo Ascomycota e um ao Filo Zygomycota. Este foram posteriormente depositados na Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria (CBMAI). Dentre os isolados obtidos, uma potencial espécie nova de Penicillium foi identificada. Os resultados da triagem enzimática permitiram a seleção de dois isolados identificados como Nigrospora sp. CBMAI 1328 (0,30 U L-1) e Arthorpyrenia sp. CBMAI 1330 (0,40 U L-1), os quais foram submetidos à uma nova avaliação da atividade e expressão (RT-PCR) com indução de íons cobre e caracterização do genes da lacase. A adição de íons cobre na concentração de 5 mM, proporcionou aumento das atividades enzimáticas dos isolados CBMAI 1328 e CBMAI 1330 em 3,9X (25,2 U L-1) e 1,2X (9,0 U L-1) após 120 h, respectivamente. Os resultados da expressão dos genes da lacase para o isolado CBMAI 1328 foram os mesmos encontrados pela indução com cobre (maior expressão em 5 mM após 120 h), entretanto para o isolado CBMAI 1330, a maior expressão foi após 96 h sem adição de cobre. Os resultados da caracterização dos genes da lacase revelaram a possivel existência de 3 novos putativos genes de lacases marinhas. Com relação à parcela não cultivada, foi possível a identificação de 7 gêneros e de um fungo não cultivado (uncultured fungi) do Filo Ascomycota bem como 3 gêneros e um fungo não cultivado (uncultured fungi) do Filo Basidiomycota a partir da técnica de DGGE e do sequenciamento direto do gene RNAr ITS e do gene 18S. Em ambas as abordagens utilizadas, a maior diversidade foi encontrada na amostra DR9. Os dados derivados do presente trabalho, ressaltam a importância em se utilizar a taxonomia polifásica, bem como empregar metodologias dependente e independente de cultivo (em paralelo) para um melhor e maior conhecimento da real diversidade em amostras ambientais. Estes resultados ampliam o conhecimento dos fungos filamentosos recuperados de esponjas marinhas e demonstram o potencial biotecnológico destes micro-organismos / Abstract: The ocean represents a promissing habitat in the search for new microorganisms, which may have the ability to produce enzymes of industrial interests different from that produced by their terrestrial counterparts. In this context, two samples of the marine sponge Dragmacidon reticulatum were collected on northern coast of São Paulo State, aiming at the characterization of fungal diversity by cultureddependent and -independent approaches as well as the evaluation of the production, characterization and expression of laccase enzyme gene. Regarding the cultivated portion of the samples, around 108 filamentous fungi were isolated, belonging to 64 different taxonomic groups (ribotypes), which were subjected to enzymatic activity assays. Polyphasic taxonomy approaches (macro- and microscopic, molecular - ITS/28S ribosomal genes - and MALDI TOF ICMS analyses) resulted in the characterization of 38 isolates distributed in 23 genera belonging to the phylum Ascomycota and one to the phylum Zygomycota, which were deposited in the Brazilian Collection of Micro-organisms from Environment and Industry (CBMAI). Among the isolates recovered one possible new species of Penicillium was identified. Enzymatic screening allowed the selection of two isolates identified as Nigrospora sp. CBMAI 1328 (0,30 U L-1) and Arthorpyrenia sp. CBMAI 1330 (0,40 U L-1), which were subjected to a new activity evaluation and expression (RT-PCR) with the induction of copper ions and the laccase genes characterization. The addition of copper ions in a concentration of 5 mM resulted in an increase in the enzymatic activities of CBMAI 1328 and CBMAI 1330 strains in 3,9X (25,2 U L-1) and 1,2X (9,0 U L-1) after 120h, respectively. The results of the expression of the laccase genes for CBMAI 1328 strain were the same found by induction with copper (expression increased in 5 mM after 120 h), however for CBMAI 1330 the higher expression was after 96 h without addition of copper. Results of laccase genes characterization revealed the existence of three possible putative new marine laccase genes. Regarding to the uncultured portion of the samples, from the DGGE and direct sequencing of the ITS rRNA gene and 18S gene approaches, was possible to identify seven species of fungi and one uncultured fungus from phylum Ascomycota and three species and one uncultured fungus from phylum Basidiomycota. For both approaches used the greatest diversity was achieved in the DR9 sample. Data derived from the present work highlight the importance of using polyphasic taxonomy as well as applying culturedependent and culture-independent methodologies (in parallel) in order to have a better and greater knowledge of the real diversity in environmental sample. These results expand the knowledge of fungi recovery from marine sponges and demonstrate the biotechnological potential of these micro-organisms / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Le mycobiome digestif comprend l’ensemble des espèces de champignons contenu dans le tube digestif. Au cours de cette thèse, nous avons réalisé dans un premier temps une revue de la littérature sur le mycobiome digestif afin d’établir le répertoire des espèces de champignons décrites dans le tube digestif et leur implication dans les infections digestives et systémiques. Puis dans un second temps, notre travail expérimental a combiné l’approche culture et l’approche moléculaire basée sur le séquençage des clones pour explorer la diversité du mycobiome digestif. Nous avons répertorié une variété d’amorces PCR dans la littérature ciblant le gène 18S rRNA et ITS rRNA. En appliquant ces outils moléculaires et la culture à l’analyse d’une selle chez un sujet obèse nous avons détecté 16 espèces de champignons dont 11 espèces sont associées à l’alimentation avec 8 espèces de champignons observées pour la première fois dans les selles.Ensuite, la même approche appliquée à une selle collectée chez un sujet anorexique a permis de détecter 8 espèces de champignons dont 5 espèces associées au régime alimentaire du sujet et 3 espèces retrouvées pour la première fois dans les selles humaines.Dans un dernier temps en utilisant la même méthodologie, nous nous sommes intéressés à la diversité du mycobiome en fonction de l’origine géographique des sujets. Pour cela, nous avons exploré la communauté du mycobiome dans les selles provenant des quatre continents Afrique, Asie, Amérique et l’Europe. Dans ce travail, nous avons détecté 40 espèces de champignons provenant de l’environnement dont certains pathogènes opportunistes. / The human gut mycobiome, comprising of all fungal species detected in the gut. The Human Microbiome Project and the Metagenomics of the Human intestinal tract projects has led to new interest in the study of the human gut mycobiome. Recently, culture-independent approaches including PCR-based molecular clone libraries sequencing and high-throughput sequencing allowed to explore the diversity of gut mycobiota. In this thesis, firstly, we reviewed fungal species described in the human gut and their implication in systemic infections. We reported from literature fungal species described in healthy individuals compared to repertoire described in diseased individuals.Secondly, in our experimental work we used molecular and culture approaches to explore gut mycobiota diversity related to host physiology. We selected various set of PCR primers from literature targeting 18S rRNA gene and ITS rRNA gene. Combining molecular and culture tools in stool specimen from an obese individual we detected 16 fungal species, 11 were linked to food and 8 species were found for first in the human stools. Using the same approaches in an anorexic individual stool we identified 8 fungal species, five were associated to subjected diet collected and three fungal species were observed for the first time in the human stools. From these two studies, we observed that the gut mycobiome diversity is part associated to diet.Using the same methodology, we to explored gut mycobiota diversity according to different geographical locations. For this, fungal diversity was screened in stools samples from four continents Africa, America, Asia and Europe.

This thesis presents a comprehensive phylogenetic and taxonomic study of an acoel subgroup, the Childiidae. Members of this taxon are characterized by well-developed male copulatory organs with conical/cylindrical stylets. The phylogenetic analyses, by means of total evidence approach, based on three molecular markers (18S and 28S rRNA genes and Histone H3) and 50 morphological characters reaffirm the non-monophyly of the Childiidae sensu Dörjes, 1968 (Actinoposthiidae and Childia+Paraphanostoma). The total evidence phylogeny strongly support the Childia+Paraphanostoma clade separate from other former members of the Childiidae, which are now placed in Actinoposthiidae. The monophyly of Childia+Paraphanostoma is well corroborated by several morphological characters. A new taxon Childia is defined, in accordance with the PhyloCode, comprising all former Paraphanostoma species and a member of the monotypic genus C. groenlandica. A new diagnosis for the current members of Childia is provided. Several structures, shown to hold promising phylogenetic signals for unraveling acoel relationships, such as musculature pattern, sperm and male copulatory organs, are investigated, using a combination of traditional and modern techniques (ultrastructure, immunocytochemistry and confocal microscopy), with main focus on Childia and its closest relatives. New characters are described and their phylogenetic significance assessed. Morphological characters relating to body-wall musculature, statocyst muscles, male copulatory organ musculature and ultrastructure, and sperm cytoplasmic granules are shown to carry important phylogenetic signals at lower taxonomic levels, while most of the characters related to sperm ultrastructure are useful at higher taxonomic levels within the Acoela. The data obtained undermine the phylogenetic use of the seminal bursa in Childia. In addition to this, it is shown that most of the classical morphological characters used in acoel taxonomy, obtained using traditional histological methods, may be misleading in identifying monophyletic entities within the Acoela. The most corroborated synapomorphies, identified in this thesis, are used in determining the taxonomic placement of a new viviparous acoel, Childia vivipara, into the taxon Childia.

No description available.

Le jujubier (ou Ziziphus mauritiana Lam.) est une espèce à usages multiples (fruits, fourrage, bois de service) prioritaire pour le reboisement et l’arboriculture fruitière dans le Sahel. Dans ce contexte où les sols sont souvent dégradés et pauvres en minéraux (P en particulier), la mycorhization et la fertilisation phosphatée pourraient jouer un rôle important dans l’amélioration de la croissance et de la productivité des jujubiers.L’objectif principal de ce travail était d’améliorer la croissance et la production fruitière de Z. mauritiana par l’inoculation mycorhizienne dans deux vergers au Sénégal. Il avait pour objectifs spécifiques (i) d’évaluer les réponses à l’inoculation avec des CMAs de différentes espèces de Ziziphus et de provenances de Z. mauritiana en serre, (ii) d’évaluer l’impact de l’inoculation avec R. irregularis IR27 sur la croissance, la survie et la production fruitière de Z. mauritiana, (iii) d’évaluer l’impact de l’inoculation sur la diversité des communautés de CMAs associés à Z. mauritiana en plantation et (iv) de déterminer la persistance de R. irregularis IR27 dans les racines de Z. mauritiana en plantation. Le champignon R. irregularis IR27 s’est avéré le plus efficace parmi les CMAs testés dans ce travail. Le couple Z. mauritiana /R. irregularis IR27 a donc été choisi comme modèle pour étudier l’impact de l’inoculation sur la production fruitière de deux provenances, Gola (variété indienne sélectionnée pour ses fruits de grosse taille) et Tasset (provenance locale à fruits de petite taille) dans deux sites contrastés (Amally et Keur Mangari). Nos résultats ont montré un effet positif de l’inoculation sur la croissance, la survie et le taux de mycorhization de Z. mauritiana à 13 et 24 mois respectivement à Amally et à Keur Mangari. L’inoculation a également augmenté la production fruitière des jujubiers à 18 et 30 mois de plantation à Keur Mangari. Ces résultats montrent la grande capacité de R. irregularis IR27 à compétir face aux CMAs indigènes. Le séquençage Illumina MiSeq du gène 18S a permis de révéler un impact négatif de l’inoculation sur la diversité et la richesse des communautés de CMAs natifs à Amally contrairement à Keur Mangari où l’inoculation n’a pas eu d’impact ni sur la diversité ni sur la richesse des CMAs. Le gène RPB1 s’est révélé pertinent comme marqueur pour détecter R. irregularis IR27 dans les racines de Z. mauritiana inoculés et évaluer par qPCR l’intensité de la colonisation racinaire des jujubiers par R. irregularis IR27 qui a représenté 11 à 13% à 13 mois de plantation à Amally et 12 à 15% à 24 mois de plantation à Keur Mangari. Cependant, il s’avère important d’évaluer à plus long terme l’impact de R. irregularis IR27 et son devenir dans les racines de Z. mauritiana en plantation dans une large gamme de conditions environnementales. / The jujube (or Ziziphus mauritiana Lam.) is an important multipurpose species (e.g. fruits, fodder, wood) for reforestation and fruit farming in the Sahel. In this context where soils are often degraded and deficient in P, mycorrhization and phosphorus fertilization could play a major role on improvement of jujube growth and productivity. The main objective of this work was to improve growth and fruit production of Z. mauritiana by mycorrhizal inoculation in two orchards at Senegal. This work aims (i) to evaluate the responses of different species of Ziziphus and provenances of Z. mauritiana to inoculation with AMF in greenhouse conditions, (ii) to assess the impact of inoculation with R. irregularis IR27 on growth, survival and fruit production of Z. mauritiana, (iii) to assess the impact of inoculation on diversity of native AMF communities associated to Z. mauritiana after planting and (iv) to determinate the persistence of R. irregularis IR27 in roots of Z. mauritiana after planting.The fungus R. irregularis IR27 proved to be the most effective AMF tested in this work. The pair Z. mauritiana /R. irregularis IR27 has been chosen as model to study the impact of inoculation on fruit production of two provenances, Gola (Indian variety selected for its large size fruits) and Tasset (local cultivar with small-sized fruits) in two sites with contrasting rainfall (Amally and Keur Mangari). Our results showed a positive effect of inoculation on growth, survival and mycorrhizal colonization of Z. mauritiana plants at 13 and 24 months after planting at Amally and Keur Mangari respectively. Inoculation increased also fruit production of jujubes at 18 and 30 months after planting at Keur Mangari. These results indicated the high ability of R. irregularis to compete with indigenous AMF. The MiSeq Illumina sequencing of 18S rRNA gene revealed a negative impact of inoculation on AMF richness and diversity at Amally, unlike at Keur Mangari where inoculation had no impact on AMF richness and diversity. The RPB1 gene proved to be an appropriate marker to detect of R. irregularis IR27 in inoculated Z. mauritiana roots and to evaluate by qPCR the root colonization of R. irregularis IR27 which accounted for 11 to 13% at 13 months after planting at Amally and 12 to 15% at 24 months after planting at Keur Mangari. Therefore, it is important to assess at long-term the impact of R. irregularis IR27 and its persistence in inoculated Z. mauritiana roots in large environmental conditions.