EPR spectroscopy of site-directed spin labeled proteins is extremely informative in the studies of protein dynamics; however, it is difficult to interpret the spectra in terms of the conformational dynamics in atomic detail.In the present work we aimed to investigate the site-specific structural dynamics of proteins by using MD simulations upon analyzing and interpreting the EPR data. The major goal of this work is to know how far the computer simulations can meet the experiments. As a first step, MD simulations are performed to identify the location and orientation of the tyrosine radical in the R2 subunit of ribonucleotide reductase. The MD results show that the tyrosine is moving away from the diiron center in its radical state. This data is in agreement with EPR results and suggests reorientation of the tyrosine radical when compared to its neutral state. In further studies, the behavior of a methanethiosulfonate spin label, R1, in various environments of the protein is characterized by using MD simulations. RMSD analysis and angle ß distributions of the nitroxide show that R1 in buried sites in a protein helix is significantly immobile and in surface exposed sites it is highly mobile. Analyses of MD data suggest that internal rotations of x4 and x5 dihedrals of R1 are dominant in the R1 dynamics.Our studies also show that interaction with the surrounding residues show significant influence on the dynamics of R1. MD simulations data of the vinculin tail protein, both in water and in vacuo, are compared to the experimental results for further analysis of 12 different R1 sites in various environments.In a study on the photosynthetic reaction center(RC),MD is used to identify the location of the R1 binding site (H156)and thereby exploring the conformational dynamics in the RC protein upon light activation. The distance between the primary quinone, QA, and H156R1 determined from MD is in reasonable agreement with that measured by EPR.

Diese Dissertation befaßt sich mit kinetischen und dynamischen Analysen an spinmarkierten Proteinen mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR-S) in Kombination mit weiteren biophysikalischen Methoden. Die Spinmarkierung der hier untersuchten Proteine (z.B. Bakteriorhodopsin (EF-loop) bzw. Reverse Transkriptase) erfolgt durch spezifische Substitution ausgewählter Aminosäure-Seitenketten durch eine radikalische Seitenkette ("R1", MTS-Spinlabel an Cystein gebunden). Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt in der Methodenentwicklung eines neuen Simulationsverfahrens für ESR-Spektren basierend auf einer speziellen Molekulardynamik-Simulation (MD-S). Das Verfahren nutzt den von Robinson et al. (J.Chem.Phys.96:2609-2616) vorgeschlagenen Trajektorien-basierten Berechnungsalgorithmus für ESR-Spektren. Hierfür sind zahlreiche Trajektorien der umgebungsabhängigen Umorientierungsdynamik von R1 mit Längen von jeweils über 700 ns erforderlich. Diese Trajektorien werden im hier präsentierten Simulationsverfahren mit minimalem Zeitaufwand in drei Stufen generiert: i) statistisch korrekte Erfassung des gesamten verfügbaren Konformationsraums von R1 in positionsspezifischer Proteinumgebung mittels einer kurzen (ca. 10 ns) speziellen MD-S (in-vacuo, 600 Kelvin); ii) Berechnung eines Potentials im Eulerwinkelraum welches das spezifische Umorientierungsverhalten der radikalischen R1-Kopfgruppe widerspiegelt; iii) Trajektorienberechnung mittels Simulation der potentialabhängigen Brownschen Umorientierungsdynamik eines virtuellen Teilchens bei 300 Kelvin (Einteilchen-Simulation). Die Statistiken wichtiger dynamischer Prozesse während der speziellen MD-S werden analysiert und mit Langzeit-Dynamiken aus herkömmlichen MD-S unter physiologischen Bedingungen verglichen. Zusätzlich wird ein Simulationsverfahren zur Identifikation von Wasserstoff-Brücken vorgestellt. In einem weiteren Kapitel dieser Arbeit werden Konzeption, Aufbau und Test einer Temperatursprung-ESR-Anlage beschrieben.

1. Aufgrund der Resultate mit der Mutante MM10, die trotz Disulfidbrücke noch unverminderte Aktivität und Rotation zeigte, wurde der Frage nachgegangen, ob der EF1-Komplex in der Lage ist, die Rotation durch einen Bruch der alpha-helikalen Struktur von gamma oder durch Rotation um eine Einfachbindung der Disulfidbrücke aufrechtzuerhalten. Quervernetzungen vom Hexagon mit gamma in der Mitte und am unteren Ende konnten das Enzym blockieren. Von den vier betrachteten Mutanten KG11, MM26, MM25 und MM24 fiel der MM26 bereits nach der Isolierung raus. Der MM25 wies nicht mehr als 70% Quervernetzung auf. Bei dem KG11 und dem MM24 konnte jedoch eine 99%-ige Quervernetzung nachgewiesen werden. Mit diesen zwei Cystein-Doppelmutanten wurden weitere Quervernetzungen gefunden, die ebenso wie der MM10 aktiv nach Oxidation sind, aber tiefer im Enzym liegen und die ATP-Hydrolyse trotz Blockade durch Quervernetzung aufrecht erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass eine Rotation um die Einzelbindungen innerhalb der Disulfidbrücke unwahrscheinlich ist, und daher die Aktivität des quervernetzten Enzyms nur durch eine Aufwindung der gamma-Helix erklärt werden kann. 2. Die Voraussetzung für ein EFOF1-Kostrukt zum optischen Nachweis der Relativrotation unter Synthesebedingungen war der Einbau von zwei verschiedenen Tags zur spezifischen Bindung. Von den vier Mutanten SE3, SE4, SW7 und WH1 zeigten die beiden SE-Mutanten keine Stabilität bei der Isolierung im Bezug auf die Kopplung zwischen FO- und F1-Teil. Mit dem SW7-EFOF1 wurde eine Mutante gefunden, die mit einer guten Aktivitäts- und Rotationsausbeute nach einer Aufreinigung mittels Streptactin-Affinitätchromatographie durch ihre Stabilität als Ausgangspunkt für das Rotationsexperiment unter ATP-Synthese dienen kann. Der WH1, dessen atp-Operon dem des SW7 gleicht, brachte trotz seines veränderten Vektorursprungs keine Verbesserung.

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