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Mittels Quorum sensing können Bakterienzellen die Expression von Genen Zelldichte-abhängig steuern. Dies spielt eine besondere Rolle bei der Expression von Virulenzfaktoren oder Antibiotikaproduktion, der Biofilmentwicklung oder Phänomenen wie genetischer Kompetenz, Sporulation oder Biolumineszenz. Vibrio harveyi, ein Gram-negativer, mariner, frei lebender Organismus, reguliert die Expression von Biolumineszenz-Genen Zelldichte-abhängig nach dem Prinzip des Quorum sensing und sollte im Rahmen dieser Arbeit als Modell für die Mechanismen der Signaltransduktion untersucht werden. Dazu wurden die Proteine der Lux-Signaltransduktionskaskade heterolog in E. coli überexprimiert und teilweise gereinigt. Mittels in vitro Phosphorylierung konnten die enzymatischen Aktivitäten der Proteine erstmals biochemisch charakterisiert werden. Für die Hybridsensorkinase LuxN konnte neben einer Kinase-Aktivität ein Phosphotransfer auf das Histidin-Phosphotransferprotein LuxU gezeigt werden. Die Autophosphorylierungsaktivität ist dabei eindeutig von der Konzentration des Signalmoleküls, eines Acyl-Homoserinlaktons, abhängig. Eine ebenfalls eindeutig nachgewiesene Phosphatase-Aktivität von LuxN, die zur Dephosphorylierung von LuxU führt, war dagegen konstitutiv. Damit konnte ein auf biochemischen Daten basierendes Modell der Signaltransduktion von V. harveyi postuliert werden. Basierend auf den Ergebnissen von Topologieuntersuchungen mittels luxN-Reportergenfusionen und Protease-Zugänglichkeitsstudien konnten neue Hinweise auf die Membrantopologie der Hybridsensorkinase ermittelt werden. Diese lassen auf ein Modell mit neun Transmembranhelices schließen, bei der der N-terminus des Proteins im Periplasma der Zelle lokalisiert zu sein scheint.

Die Biofiltration kommt bei der Eliminierung einer Vielzahl von Abluftkomponenten zum Einsatz. Diese Studie konzentrierte sich auf die Mikroorganismen von zwei Biofiltern, die der Eliminierung von Hexan im Labor- und Industriemaßstab dienen. Mehr als 80 Bakterienstämme wurden aus einem industriellen Biofilter einer Ölmühle isoliert. Der Isolierungsansatz dieses Biofilters ergab 16 bakterielle Gruppen, die als Mitglieder der Proteobacteria, Actinobacteria, und Firmicutes identifiziert wurden. Die Gattungen Gordonia und Sphingomonas und Stämme des Nevskia-Zweigs zeigten hohe Wachstumserträge auf Hexan. Die aktiv am Abbau beteiligte Population im Biofiltermaterial wurde durch die Inkubation von Filtermaterial mit deuteriertem Hexan und anschließender PLFA-Analyse charakterisiert. Die signifikante Markierung der Fettsäuren 16:1 cis10, 18:1 cis9 und 18:0 10methyl betonten die Bedeutung der Gordonia-Isolate als aktive Hexanabbauer, die auch die höchsten Wachstumsraten auf Hexan zeigten. Die Markierung von Biomarkern wie 16:0 iso und 19:0 cyclo11-12 wies außerdem auf die Beteiligung weiterer Taxa beim Hexanabbau hin. Die Vertreter der Gammaproteobacteria zeigten ebenfalls gutes Wachstum auf Hexan und charakteristische Fettsäuren dieser Gruppen konnten ebenfalls markiert werden. Dies impliziert eine Beteiligung auch dieser Gruppen am Abbauprozess von Hexan. Alle Hauptfettsäuren des PLFA-Profils des Biofiltermaterials konnten markiert werden. Folglich dominierte die Hexanabbauende Population die mikrobielle Population des Biofilters. Eine polyphasische Klassifizierung der Isolate beider Biofilter wies auf neue Gattungen und Arten hin. Die Ergebnisse der Wachstumstests verdeutlichten die Wichtigkeit der Kombination von Isolierungsansätzen mit Isolierungs-unabhängigen Methoden wie den Analysen des Fettsäureprofils der Biofiltergemeinschaft.

Streptomyceten sind in der Lage verschiedene, schwer zugängliche Naturstoffe abzubauen. Darunter stellt das Chitin, aufgrund der chemischen Zusammensetzung, nicht nur eine Kohlen-, sondern auch eine wichtige Stickstoff-Quelle dar. Neben den vielfältigen Chitinasen wird dem chitinolytischen System von Streptomyceten eine neue Klasse von Proteinen zugewiesen, die spezifisch verschiedene Formen des kristallinen Chitins sowie Chitosan erkennen und mit unterschiedlichen Affinitäten an sie binden. Das CHB1-Protein (18,7 kDa) zeigt eine starke Tendenz zu Aggregatbildung. Die biochemischen Untersuchungen lassen schließen, dass intermolekulare Disulfidbrücken dabei eine eher unwesentliche Rolle spielen und deuten auf hydrophobe Wechselwirkungen als Ursache der CHB1-Aggregierung hin. Vergleichsstudien mit CHB1-Deletionsmutanten demonstrierten, dass die Aggregation durch N- und C-terminale Domänen nicht beeinflusst wird. Die Bindestudien zeigten die Wichtigkeit der beiden Domänen für die Chitinerkennung. Eine Computervorhersage zeigte in CHB1 ein hohes Potential für die N- bzw. O-Glykosylierung von mehreren N- und T-Resten, darunter auch eines NXS/T-Glykosylierungs-Motivs. Vorläufige weitere Studien lassen eine Verknüpfung des Proteins mit kurzen Oligosacchariden vermuten. Fluoreszenzmikroskopische in situ Untersuchungen der Co-Kulturen von Streptomyceten und Mucor rouxii ermittelten eine enge Interaktion von CHB1 und chitinhaltigen Pilz-Hyphen, die als neues Subprinzip der Biofilm-Entwicklung definiert werden kann. Durch Anwendung von CHB1 wurde auch ein neuer, spezifisch für hoch assoziierte Chitin-Assemblierungen Test für Chitinsynthase-Aktivität entwickelt, welcher eine schnelle Identifizierung von Chitinsynthase-Proben ermöglicht. CHB1 wurde als Hilfsmittel in Studien zur Chitin-Biogenese in Saccharomyces cerevisiae eingesetzt.

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PII-Proteine, zu denen GlnB und GlnK zählen, sind ubiquitär verbreitete kleine Regulatorproteine, die den internen Stickstoffzustand der Zelle sensieren und weiterleiten und hierdurch maßgeblich an der Regulation des Stickstoffmetabolismus beteiligt sind.Ziel dieser Arbeit war es, das GlnK1-Protein aus dem methanogenen Archeaon Methanosarcina mazei Stamm Gö1 umfassend zu charakterisieren und seine potentielle Rolle in der Regulation des Stickstoffmetabolismus aufzuklären. Das M. mazei GlnK1-Protein weist den typischen Tyrosin51-Rest auf, der in Bakterien stickstoffabhängig posttranslationell modifiziert wird. Sowohl in vitro als auch in vivo Experimente haben jedoch gezeigt, dass GlnK1 in M. mazei nicht stickstoffabhängig modifiziert wird. Weitere strukturelle Unterschiede zu bakteriellen PII-Proteinen haben Experimente zur Bildung von Heterotrimeren aufgezeigt. Trotz dieser deutlichen Unterschiede haben Komplementationsversuche ergeben, dass das archaeelle GlnK-Protein in der Lage ist, E. coli GlnK funktionell zu komplementieren. Dieses läßt darauf schließen, dass das GlnK1-Protein in M. mazei auch in der Regulation des Stickstoffmetabolismus involviert ist. Um dieses zu bestätigen, wurde eine chromosomale M. mazei glnK1-Mutante generiert. Hierfür war es erforderlich, zunächst ein funktionelles System zur Transformation von M. mazei Gö1 zu entwickeln. Es gelang, (i) durch Selektion einer potentiellen spontanen Zellwandmutante von M. mazei, die eine stark verbesserte Plattierungseffizienz aufwies, sowie (ii) durch mehrere Modifizierungen des von W. Metcalf (Urbana) entwickelten Liposomen-vermittelten Transformationsprotokolls für Methanosarcina-Stämme M. mazei Gö1 genetisch zugänglich zu machen. Wachstumsanalysen des konstruierten M. mazei glnK1-Mutantenstamms zeigten einen partiell reduzierten Wachstumsphänotyp unter stickstofflimitierenden Bedingungen. Quantitative Reverse Transkriptions-PCR Analysen ausgewählter Gene ergaben allerdings, dass das GlnK1 keinen Einfluss auf die Transkription stickstoffregulierter Gene ausübt.Sowohl biochemische Experimente mit gereinigtem Enzym als auch in vivo Versuche zeigten jedoch, dass das GlnK1-Protein mit der Glutamin-Synthetase (GlnA) interagiert und hierdurch deren Enzymaktivität inhibiert. Ein aktivierender Effekt auf die GlnA Enzymaktivität wurde hingegen bei Anwesenheit von 2-Oxoglutarat beobachtet, welches den internen Stickstoffstatus wiederspiegelt. Aus der Gesamtheit der Ergebnisse läßt sich folgendes hypothetisches Regulationsmodel ableiten: Unter Stickstofflimitierung wird 2-Oxoglutarat akkumuliert, welches die Glutamine-Synthetase Aktivität stark stimuliert; bei einem Übergang zu Stickstoffüberschuss wird die Glutamine-Synthetase sowohl durch einen reduzierten 2-Oxoglutarat-Spiegel als auch durch direkte Protein-Interaktion mit GlnK1 inaktiviert. Letzteres dient der Feinregulation und ermöglicht schnell auf eine veränderte Stickstoffversorgung reagieren zu können.

The KdpFABC complex from E. coli functions as a high affinity K uptake system and belongs to the superfamily of P-type ATPases. So far, no information is available about the orientation of the subunits within the complex as well as its oligomeric state. By chemical crosslinking, gel filtration, electron transmission microscopy and single particle FRET analysis this study shows that the KdpFABC complex occurs as a homodimer with a dissociation constant between 30 to 50 nM. Furthermore, by means of single particle analysis of transmission electron micrographs, the solution structure of the complex at 1.9 nm resolution could be solved, thus providing the first structural analysis resolving all subunits of the holoenzyme. Based on crystal structures, it is generally assumed that P-type ATPases undergo large domain movements during catalysis. However, these conformational changes have never been shown directly. By use of single molecule FRET with alternating laser excitation, distance changes could be measured directly within KdpB during ATP hydrolysis. With this technique, distances and dwell times were determined for three conformational states in the working enzyme as well as in the orthovanadate- and the OCS-inhibited state.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Struktur der Untereinheit B des natriumabhängigen Kplus-Aufnahmesystems KtrAB aus Vibrio alginolyticus. Sie gehört zu einer Superfamilie von Kaliumtransportproteinen, die auf der im KcsA-Kanal gefundenen MPM-Topologie beruht. Eine MPM-Domäne besteht aus zwei Transmenbranhelices, die durch einen in die Membran zurückgefalteten P-Loop verbunden sind. Im KcsA-Kanal arrangieren sich vier dieser Untereinheiten um eine zentrale Pore. Im Unterschied zum KcsA-Kanal aus S. lividans sind in dieser Superfamilie die MPM-Domänen durch cytoplasmatische Loops miteinander verbunden. Die KtrB-Topologie beruht zur Zeit nur auf Modellen und wird in dieser Arbeit genauer untersucht. Dabei konnte die MPM-Faltung mittels PhoA-Fusionen für die Bereiche B-D von VaKtrB bestätigt, und die sogenannte Turret -Struktur, wie sie im KcsA-Kanal gefunden wurde, nachgewiesen werden. Bei Modellierungstudien der KtrB-Topologie fiel im Besonderen die M2C-Helix auf, woraufhin Durell und Guy drei Unterteilungen für diesen Bereich vorschlugen: M2C1: alpha-Helix; M2C2: flexibler Bereich; M2C3: teilweise amphiphile Helix. Es herrschen zwei Modelle dieser Helix vor, wobei sie sich vor allem in der Lokalisation von M2C2 und M2C3 unterscheiden. Im ersten bildet M2C2 einen gestreckten Übergang von M2C1 zu M2C3, die waagerecht in die Membranoberfläche eingelagert ist. Im 2. Modell liegt M2C2 innerhalb der Kavität als Schleife vor und M2C3 steckt senkrecht in der Membranoberfläche. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten (Cysteinzugänglichkeit für Maleimide, PhoA-Fusionen, ESR-Spektroskopie) erhärten das 1. Modell und unterstützen die These, dass M2C2 einen flexiblen Bereich innerhalb von M2C bildet, der wichtig für den Transport bzw. dessen Regulation ist. Die Faltung der M2C-Helix konnte allerdings nicht abschließend geklärt werden. Desweiteren deuten die Daten dieser Arbeit auf eine wässrige Verbindung bis tief in KtrB vom Periplasma her hin.