These days, treatment of melanoma patients relies on targeted therapy with BRAF/MEK inhibitors and on immunotherapy. About half of all patients initially respond to existing therapies. Nevertheless, the identification of alternative therapies for melanoma patients with intrinsic or acquired resistance is of great importance. In melanoma, antioxidants play an essential role in the maintenance of the redox homeostasis. Therefore, disruption of the redox homeostasis is regarded as highly therapeutically relevant and is the focus of the present work. An adequate supply of cysteine is essential for the production of the most important intracellular antioxidants, such as glutathione. In the present work, it was investigated whether the depletion of cysteine and glutathione is therapeutically useful. Depletion of glutathione in melanoma cells could be achieved by blocking cysteine supply, glutathione synthesis, and NADPH regeneration. As expected, this led to an increased level of reactive oxygen species (ROS). Surprisingly, however, these changes did not impair the proliferation and survival of the melanoma cells. In contrast, glutathione depletion led to cellular reprogramming which was characterized by the induction of mesenchymal genes and the repression of differentiation markers (phenotypic switch). This was accompanied by an increased migration and invasion potential which was favored by the induction of the transcription factor FOSL1. To study in vivo reprogramming, Gclc, the first and rate-limiting enzyme in glutathione synthesis, was knocked out by CRISPR/Cas9 in murine melanoma cells. The cells were devoid of glutathione, but were fully viable and showed a phenotypic switch, the latter only in MITF-expressing B16F1 cells and not in MITF-deficient D4M3A.781 cells. Following subcutaneous injection into immunocompetent C57BL/6 mice, Gclc knockout B16F1 cells grew more aggressively and resulted in an earlier tumor onset than B16F1 control cells. In summary, this work demonstrates that inhibition of cysteine supply and thus, glutathione synthesis leads to cellular reprogramming in melanoma. In this context, melanoma cells show metastatic capabilities, promoting a more aggressive form of the disease. / Die Behandlung von Melanompatienten beruht heutzutage auf der gerichteten Therapie mit BRAF/MEK Inhibitoren und auf der Immuntherapie. Circa die Hälfte aller Patienten spricht zunächst auf die vorhandenen Therapien an. Dennoch ist die Identifizierung alternativer Therapieansätze für Melanompatienten mit intrinsischer oder erworbener Resistenz von großer Wichtigkeit. Im Melanom spielen Antioxidanzien eine essenzielle Rolle zur Aufrechterhaltung der Redox-Homöostase. Eine Störung der Redox-Homöostase wird daher als therapeutisch hochrelevant betrachtet und steht im Fokus der vorliegenden Arbeit. Eine ausreichende Versorgung mit Cystein ist essenziell zur Produktion der wichtigsten intrazellulären Antioxidanzien wie dem Glutathion. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Depletion von Cystein und Glutathion therapeutisch nützlich ist. Eine Depletion von Glutathion in Melanomzellen konnte durch eine Blockierung der Cysteinversorgung, der Glutathionsynthese und der NADPH-Regeneration erreicht werden. Dies führte wie erwartet zu einem erhöhten Level von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Überraschenderweise beeinträchtigten diese Veränderungen jedoch nicht die Proliferation und das Überleben der Melanomzellen. Im Gegenteil führte die Glutathion-Depletion zu einer zellulären Reprogrammierung, die durch die Induktion mesenchymaler Gene und der Repression von Differenzierungsmarkern gekennzeichnet war (phenotypic switch). Dies ging mit einem erhöhten Migrations- und Invasionspotential einher, welches durch die Induktion des Transkriptionsfaktors FOSL1 begünstigt wurde. Für die Untersuchung der Reprogrammierung in vivo wurde Gclc, das erste und geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Glutathionsynthese, mittels CRISPR/Cas9 in murinen Melanomzellen ausgeknockt. Die Zellen waren voll lebensfähig und zeigten erwartungsgemäß reduzierte Glutathionlevel und einen phenotypic switch. Letzterer zeigte sich jedoch nur in MITF-exprimierenden B16F1 Zellen und nicht in MITF-defizienten D4M3A.781 Zellen. Nach subkutaner Injektion in immunkompetente C57BL/6 Mäuse wuchsen die Gclc-knockout B16F1 Zellen aggressiver und führten zu einer früheren Tumorentstehung als B16F1 Kontrollzellen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Hemmung der Cysteinversorgung und somit der Glutathionmenge im Melanom zu einer Reprogrammierung führt, bei der Melanomzellen metastasierende Fähigkeiten aufweisen und somit zu einer aggressiveren Form der Erkrankung führen.

L-type calcium channels (LTCCs) control crucial physiological processes in cardiomyocytes such as the duration and amplitude of action potentials, excitation-contraction coupling and gene expression, by regulating the entry of Ca2+ into the cells. Cardiac LTCCs consist of one pore-forming α1 subunit and the accessory subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. Of these auxiliary subunits, Cavβ is the most important regulator of the channel activity; however, it can also have LTCC-independent cellular regulatory functions. Therefore, changes in the expression of Cavβ can lead not only to a dysregulation of LTCC activity, but also to changes in other cellular functions. Cardiac hypertrophy is one of the most relevant risk factors for congestive heart failure and depends on the activation of calcium-dependent prohypertrophic signaling pathways. However, the role of LTCCs and especially Cavβ in this pathology is controversial and needs to be further elucidated. Of the four Cavβ isoforms, Cavβ2 is the predominant one in cardiomyocytes. Moreover, there are five different splice variants of Cavβ2 (Cavβ2a-e), differing only in the N-terminal region. We reported that Cavβ2b is the predominant variant expressed in the heart. We also revealed that a pool of Cavβ2 is targeted to the nucleus in cardiomyocytes. The expression of the nuclear Cavβ2 decreases during in vitro and in vivo induction of cardiomyocyte hypertrophy and overexpression of a nucleus-targeted Cavβ2 completely abolishes the in vitro induced hypertrophy. Additionally, we demonstrated by shRNA-mediated protein knockdown that downregulation of Cavβ2 enhances the hypertrophy induced by the α1-adrenergic agonist phenylephrine (PE) without involvement of LTCC activity. These results suggest that Cavβ2 can regulate cardiac hypertrophy through LTCC-independent pathways. To further validate the role of the nuclear Cavβ2, we performed quantitative proteome analyses of Cavβ2-deficient neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The results show that downregulation of Cavβ2 influences the expression of various proteins, including a decrease of calpastatin, an inhibitor of the calcium-dependent cysteine protease calpain. Moreover, downregulation of Cavβ2 during cardiomyocyte hypertrophy drastically increases calpain activity as compared to controls after treatment with PE. Finally, the inhibition of calpain by calpeptin abolishes the increase in PE-induced hypertrophy in Cavβ2-deficient cells. These results suggest that nuclear Cavβ2 has Ca2+- and LTCC-independent functions during the development of hypertrophy. Overall, our results indicate a new role for Cavβ2 in antihypertrophic signaling in cardiac hypertrophy. / Durch die Regulation des Calciumeintritts in die Zellen kontrollieren L-Typ-Calciumkanäle (LTCCs) wichtige physiologische Prozesse wie die Dauer und Amplitude von Aktionspotentialen, die elektromechanische Kopplung und die Genexpression in Kardiomyozyten. Kardiale LTCCs bestehen aus einer porenformenden α1 Untereinheit und Hilfsuntereinheiten wie Cavβ, Cavα2δ und Cavγ. Von diesen Hilfsuntereinheiten ist Cavβ der wichtigste Regulator der Kanalfunktion, wobei Cavβ auch LTCC-unabhängige zelluläre und regulatorische Funktionen haben kann. Veränderungen in der Expression dieses Proteins können daher zu einer Fehlregulation der LTCC-Aktivität führen, jedoch auch zu Veränderungen von anderen zellulären Funktionen. Einer der häufigsten Risikofaktoren für kongestive Herzinsuffizienz ist die kardiale Hypertrophie, welche abhängig ist von der Aktivierung von Calcium-abhängigen prohypertrophen Signalwegen. Die Rolle von LTCCs und insbesondere von Cavβ in dieser Erkrankung ist jedoch kontrovers und muss noch weiter erforscht werden. Von den vier Cavβ Splicevarianten ist Cavβ2 die dominierende Form in Kardiomyozyten. Darüber hinaus existieren fünf verschiedene Splicevarianten von Cavβ2 (Cavβ2a-e), die sich jeweils nur in der N-terminalen Region unterscheiden. Wir konnten demonstrieren, dass von diesen Splicevarianten überwiegend Cavβ2b im Herzen exprimiert wird. Außerdem konnten wir zeigen, dass ein Teil von Cavβ2 im Nukleus von Kardiomyozyten zu finden ist. Die Expression von nuklearem Cavβ2 verringert sich während der in vitro und in vivo induzierten kardialen Hypertrophie und außerdem verhindert die Überexpression von im Kern lokalisiertem Cavβ2 die in vitro induzierte Hypertrophie komplett. Zusätzlich konnten wir demonstrieren, dass die Reduktion von Cavβ2 mittels shRNA zu einer Steigerung der Hypertrophie induziert durch die Stimulation mit dem α1-adrenergen Agonisten Phenylephrin (PE) führt, ohne dass die LTCC-Aktivität beteiligt ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cavβ2 die Entstehung von Hypertrophie durch LTCC-unabhängige Signalwege beeinflussen kann. Um die Rolle von nuklearem Cavβ2 zu bekräftigen, haben wir quantitative Proteomanalysen von Cavβ2 defizienten neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCs) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reduktion von Cavβ2 die Expression verschiedener Proteine beeinflusst, zum Beispiel wird Calpastatin, ein Inhibitor der calciumabhängigen Cysteinproteasen Calpain, herunterreguliert. Außerdem wird durch die Cavβ2 Reduktion während der Hypertrophie von Kardiomyozyten die Calpainaktivität verglichen mit den Kontrollen signifikant erhöht. Letztendlich konnten wir zeigen, dass die Inhibierung von Calpain durch Calpeptin die gesteigerte PE-induzierte Hypertrophie in Cavβ2-defizienten Zellen verhindert. Diese Ergebnisse lassen eine Calcium- und LTCC-unabhängige Funktion von nuklearem Cavβ2 während der Entwicklung von Hypertrophie, annehmen. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse auf eine neue Rolle von Cavβ2 in den antihypertrophen Signalwegen in der kardialen Hypertrophie hin.

Significant advances in fluorescence imaging techniques enable life scientists today to gain insights into biological systems at an unprecedented scale. The interpretation of image features in such bioimage datasets and their subsequent quantitative analysis is referred to as bioimage analysis. A substantial proportion of bioimage analyses is still performed manually by a human expert - a tedious process that is long known to be subjective. Particularly in tasks that require the annotation of image features with a low signal-to-noise ratio, like in fluorescence images of tissue samples, the inter-rater agreement drops. However, like any other scientific analysis, also bioimage analysis has to meet the general quality criteria of quantitative research, which are objectivity, reliability, and validity. Thus, the automation of bioimage analysis with computer-aided approaches is highly desirable. Albeit conventional hard-coded algorithms are fully unbiased, a human user has to set its respective feature extraction parameters. Thus, also these approaches can be considered subjective. Recently, deep learning (DL) has enabled impressive advances in computer vision research. The predominant difference between DL and conventional algorithms is the capability of DL models to learn the respective task on base of an annotated training dataset, instead of following user-defined rules for feature extraction. This thesis hypothesized that DL can be used to increase the objectivity, reliability, and validity of bioimage analyses, thus going beyond mere automation. However, in absence of ground truth annotations, DL models have to be trained on manual and thus subjective annotations, which could cause the model to incorporate such a bias. Moreover, model training is stochastic and even training on the same data could result in models with divergent outputs. Consequently, both the training on subjective annotations and the model-to-model variability could impair the quality of DL-based bioimage analyses. This thesis systematically assessed the impacts of these two limitations experimentally by analyzing fluorescence signals of a protein called cFOS in mouse brain sections. Since the abundance of cFOS correlates with mouse behavior, behavioral analyses could be used for cross-validation of the bioimage analysis results. Furthermore, this thesis showed that pooling the input of multiple human experts during model training and integration of multiple trained models in a model ensemble can mitigate the impact of these limitations. In summary, the present study establishes guidelines for how DL can be used to increase the general quality of bioimage analyses. / Fortschritte in den Methoden der fluoreszenz-basierten Bildgebung ermöglichen Biowissenschaftlern heutzutage noch nie dagewesene Einblicke in biologische Systeme. Die Interpretation sowie die anschließende quantitative Analyse von Bildelementen in biologischen Bilddatensätzen wird in der Wissenschaft als bioimage analysis bezeichnet. Ein wesentlicher Anteil der bioimage analysis wird noch immer von Experten per Hand durchgeführt - ein mühsamer Prozess, von dem man seit langem weiß, dass er subjektiv ist. Besonders bei Aufgabestellungen, welche die Annotierung von Bildelementen mit einem geringen Signal-Rausch-Verhältnis erfordern, wie es beispielsweise bei Fluoreszenzbildern von Gewebeproben der Fall ist, sinkt die Übereinstimmung zwischen den Bewertungen mehrerer Experten. Genauso wie jede andere wissenschaftliche Analyse, muss jedoch auch die bioimage analysis den generellen Qualitätskriterien quantitativer Forschung gerecht werden. Dies sind Objektivität, Zuverlässigkeit und Validität. Die Automatisierung der bioimage analysis mit Hilfe von computer-basierten Ansätzen ist somit erstrebenswert. Konventionelle, hartkodierte Algorithmen sind zwar vollkommen unvoreingenommen, jedoch legt ein menschlicher Benutzer jene Parameter fest, die der Algorithmus für die Extraktion der relevanten Bildelemente nutzt. Aus diesem Grund sind auch diese Ansätze zumindest partiell subjektiv. In den letzten Jahren hat Deep learning (DL) zu beeindruckenden Fortschritten auf dem Forschungsgebiet der computer vision beigetragen. Der vorherrschende Unterschied zwischen DL und konventionellen Algorithmen besteht darin, dass DL Modelle in der Lage sind die jeweilige Aufgabe auf Grundlage eines annotierten Trainingsdatensatzes zu lernen, anstatt starr den Parametern zu folgen, die der Benutzer für die Extraktion der relevanten Bildelemente vorgegeben hat. In dieser Dissertation wurde die Hypothese untersucht, ob DL, neben der Möglichkeit der automatischen Bildanalyse, auch dazu genutzt werden kann die Objektivität, die Zuverlässigkeit und die Validität der Bildanalyse zu verbessern. Ohne eine objektive Referenzannotierung muss das Training der DL Modelle jedoch auf händisch erstellten und somit also subjektiven Annotierungen durchgeführt werden. Theoretisch könnte dies dazu führen, dass das DL-Modell diese Vorgeingenommenheit übernimmt. Außerdem unterliegt das Training der Modelle stochastischen Prozessen und selbst Modelle, die auf den gleichen Trainingsdaten trainiert wurden, könnten sich danach in ihren ausgegeben Analysen unterscheiden. Demzufolge könnten also sowohl das Training auf subjektiven Annotierungen als auch die Variabilität von Modell zu Modell die Qualität der DL-basierten Analyse von biologischen Bilddaten beeinträchtigen. In dieser Dissertation werden die Einflüsse von diesen beiden Limitierungen auf Grundlage von experimentellen Daten untersucht. In den experimentellen Bilddaten werden Fluoreszenzsignale des Proteins cFOS in Hirnschnitten von Mäusen dargestellt und hier repräsentativ untersucht. Da das Vorkommen von cFOS mit dem Verhalten der Mäuse korreliert, kann die Analyse des Verhaltens der Mäuse zur Kreuzvalidierung der Analyse der biologischen Bilddaten herangezogen werden. Die Daten dieser Dissertation zeigen, dass die Integration mehrerer Experten in das Training eines Modells sowie die Integration mehrerer trainierter Modelle in ein Modell-Ensemble das Risiko einer subjektiven oder nicht reproduzierbaren Bildanalyse abschwächen können. Diese Arbeit etabliert Richtlinien dafür, wie DL verwendet werden kann, um die generelle Qualität der Analyse biologischer Bilddaten zu erhöhen.

Patients diagnosed with the rare autoimmune disease of Stiff Person Syndrome (SPS) suffer from varying motor symptoms mainly characterized by painful spasms and muscle stiffness. Among patients suffering from Stiff Person spectrum, clinical presentation, course of disease and treatment responses also differ. Regardless of disease severity, which ranges from mild and intermittent motor impairments to the most severe form progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus (PERM), autoantibodies are the underlying cause. One of the autoantibody targets associated with SPS is the glycine receptor (GlyR). Functional impairment of this protein interferes with inhibitory signal transmission in the central nervous system and subsequently causes motor symptoms. Similar to functional alterations of the GlyR upon autoantibody binding, GlyR function can be altered in patients with mutations in genes encoding GlyR subunits. Such mutations underlie hereditary hyperekplexia. Understanding the GlyR physiology and how different molecular mechanisms contribute to disease pathology is crucial for development of more targeted and effective disease options. Therefore, novel GlyR β subunit mutations identified in hyperekplexia patients were investigated towards their expression, trafficking and receptor function. The findings suggest that impaired recruitment into functional receptors at the synapses might underlie the functional alterations revealed by electrophysiological recordings for most cases. To unravel the autoantibody-related pathology causing the highly diverse clinical appearance of the Stiff Person spectrum, antibody binding abilities were studied. Neutralization assays confirmed that presence of the entire target protein, a sub-domain or a short peptide eliminates the autoantibodies from patient samples. Epitope characterization using residue exchanges within the GlyR in cell-based assays uncovered that GlyR autoantibody epitopes are polyclonal and their combination is patient-specific. Tissue-based binding assays emphasized the high variability in autoantibody distribution within spinal cord and brain sections regardless of the patients’ primary diagnosis. The irregular binding patterns among the patient groups of SPS, PERM, epilepsy and ‘others’ reflected the variation in the symptomatic arrangement. Passive transfer of GlyR autoantibodies from patients with different courses and severity of disease similarly revealed variable effects on murine motor and anxiety-related behavior. The detected small effects on motor function and post-mortem analyses indicate glycinergic disorganization and a possible onset of compensatory mechanisms. Altogether, this study demonstrates that GlyR impairment is patient-specific and of greater variability than expected. / Patienten mit der seltenen Autoimmunerkrankung Stiff Person Syndrom (SPS) leiden unter variierenden motorischen Symptomen, die sich vor allem durch schmerzhafte Spasmen und Steifigkeit der Muskeln auszeichnen. Ebenso unterscheiden sich klinisches Erscheinungsbild, Krankheitsverlauf und Ansprechen auf entsprechende Therapien innerhalb der Gruppe von Patienten, die unter dem Stiff Person-Spektrum leidet. Unabhängig vom Schweregrad, welcher von milden und intermittierenden motorischen Einschränkungen bis hin zur schwerwiegendsten Form, der sogenannten Progressiven Encephalomyelitis mit Rigidität und Myoklonus (PERM) reicht, liegen immer Autoantikörper der Erkrankung zugrunde. Eins der Zielproteine dieser mit SPS assoziierten Autoantikörper ist der Glyzinrezeptor (GlyR). Funktionelle Einschränkungen des Rezeptors stören die inhibitorische Signalübertragung im zentralen Nervensystem, wodurch die motorischen Symptome ausgelöst werden. Ähnlich zur funktionellen Veränderung durch Autoantikörper kann die GlyR-Funktion durch Mutationen in den GlyR-Untereinheiten kodierenden Genen verändert sein. Solche Mutationen verursachen hereditäre Hyperekplexie. Ein gutes Verständnis der GlyR-Physiologie sowie der Pathomechanismen, die zur Erkrankung führen, ist entscheidend für die Entwicklung gezielter und effektiver Therapieansätze. Aus diesem Grund wurden neuartige Mutationen der GlyR β-Untereinheit, die in Hyperekplexie-Patienten identifiziert wurden, hinsichtlich ihrer Expression, ihres Transports durch die Zelle und ihres Beitrags zur Rezeptorfunktion untersucht. Die Ergebnisse suggerieren, dass eine verminderte Rekrutierung der mutierten GlyR-Untereinheit in funktionsfähige Rezeptoren an der Synapse den funktionellen Veränderungen zugrunde liegen könnte. Diese wurden in elektrophysiologischen Messungen für die meisten der untersuchten Mutationen detektiert. Um die Autoantikörper assoziierte Pathologie zu verstehen, welche das stark diverse klinische Erscheinungsbild des Stiff-Person-Spektrums hervorruft, wurden die Bindungseigenschaften der Antikörper genauer untersucht. Neutralisierungsversuche zeigten, dass die Anwesenheit des gesamten Zielproteins, einer enthaltenen Domäne oder nur eines kurzen Peptids ausreicht um die Antikörper aus einer Probe zu eliminieren. Gleichzeitig zeigte die Epitop-Charakterisierung in zellbasierten Experimenten mit Austausch einzelner Aminosäurereste im GlyR, dass die Epitope polyklonal und patientenspezifisch sind. Gewebebasierte Bindungsversuche offenbarten dementsprechend eine hohe Variabilität der Autoantikörper-Verteilung in Rückenmarks- und Gehirnschnitten unabhängig von der primären Diagnose der entsprechenden Patienten. Die ungleichmäßigen Bindungsmuster der Autoantikörper von Patientengruppen mit SPS-, PERM, Epilepsie- oder anderen Diagnosen spiegelten die Varianz der Symptomkombination wider. Ebenso verursachte passiver Transfer der GlyR-Autoantikörper von Patienten mit unterschiedlichem Verlauf und Schweregrad der Erkrankung variierende Effekte auf motorisches Verhalten und Angst-Verhalten in Mäusen. Die detektierten unterschwelligen Effekte in den Verhaltenstests und post mortem-Untersuchungen deuten auf glyzinerge Desorganisation und einen möglichen Kompensationsmechanismus hin. Insgesamt demonstriert die vorliegende Studie, dass Beeinträchtigungen des GlyR patientenspezifisch und somit vielseitiger sind als vermutet.

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Les macrophages sont des cellules de l’immunité innée et sont localisés dans la majorité des organes du corps, présentant des fonctions spécifiques dépendant de leur lieu de résidence.Les macrophages d’origine embryonnaire sont la source majeure des macrophages tissulaires et sont capables de se maintenir à long terme dans la plupart des organes adultes.Cependant, il reste certains organes comme le testicule, où l’origine des macrophages n’est pas clairement déterminée. Le testicule est considéré comme un organe immuno-privilégié et a cette nécessité de protéger de tous contacts les spermatozoïdes des cellules immunitaires, qui pourraient induire une auto-immunité.Les macrophages testiculaires (tMφ) contribuent à maintenir ce statut d’organe immuno-privilégié en produisant des cytokines immunosuppressives. Pour ces raisons, les tMφ peuvent être considérés comme des “ gardiens de la fertilité”. Dans les testicules adultes, deux différentes populations de macrophages, nommées interstitielles et péritubulaires, ont été identifiées en se basant sur leurs morphologies et localisations distinctes, mais leur origine et leur mode de développement et de maintenance restent encore inconnus. En combinant des méthodes de traçage cellulaire et la mise au point d’un modèle de transfert adoptif dans des souriceaux, j’ai démontré que les macrophages d’origine embryonnaire contribuaient exclusivement à la population de tMφ interstitielle dès la naissance et que les tMφ péritubulaires proviennent exclusivement de la moelle osseuse. Après avoir caractérisé les tMφ, mes prochaines investigations se porteront sur l’étude des fonctions de chacune de ces deux populations. / Macrophages are innate immune cells residing in most of the organs of the body and ensure proper organ function. Traditionally, it has been known that macrophages can be derived from HSC progenitors in the bone-marrow (BM), but technology using fate-mapping tools has revealed that macrophages can already be generated from embryonic progenitors. Embryo-derived macrophages are a major source of tissue-resident macrophages and can self-maintain during adulthood. The origin of resident macrophages in the testis, however, so far has not been well studied.Importantly, the testis is considered as an immune-privileged organ by protecting the highly immunogenic spermatozoa sequestrated in the seminiferous tubules from the entrance of immune cells. In the adult testis, macrophages participate in the creation of an immune suppressive microenvironment preventing auto-immune attack. Therefore, testicular macrophages tMφ could be considered as the guardians of fertility. Recently,two different macrophage populations have been identified in the adult testis, called interstitial and peritubular, based on their distinct localization and morphology,but their developmental origin and homeostatic maintenance were unknown.Combining the genetic lineage tracing and the neonatal adoptive transfer model, I could demonstrate that the embryo-derived macrophages give rise exclusively to interstitial tMφ. Peritubular tMφ, however, only emerge postnatally from BM-derived progenitors. .My findings provide framework for future investigations into the distinct functions of these two tMφ populations in establishment of immune-privilege as well as the support of spermatogenesis and male hormone production.

Latrophilin, alternatively named calcium-independent receptor of α-latrotoxin (CIRL), resembles a prototype of the adhesion class G-protein coupled receptors (GPCRs). Initially identified as a high-affinity receptor for α-latrotoxin, a component of the black widow spider, latrophilins are now associated with various distinct functions, such as synaptic exocytosis, tissue polarity and fertility (Tobaben et al., 2002; Langenhan et al., 2009; Promel et al., 2012). Despite these exploratory efforts the precise subcellular localisation as well as the endogenous ligand of CIRL still remains elusive. In this work genetic experiments, imaging approaches and behavioural studies have been used to unravel the localisation and physiological function of the latrophilin homolog dCirl in Drosophila melanogaster. Containing only one latrophilin homolog together with its genetic accessibility and well-established transgenic approaches, Drosophila seemed an ideally suited model organism. The present study showed that dCirl is widely expressed in the larval central nervous system including moto- and sensory neurons. Further, this work revealed that removal of the latrophilin homolog does not greatly affect synaptic transmission but it seems that aspects of the postsynaptic structural layout are controlled by dCIRL in the fruit fly. Additionally, dCirl expression at the transcriptional level was confirmed in larval and adult chordotonal organs, specialised mechanosensors implicated in proprioception (Eberl, 1999). Expression of dCIRL at the protein level could not yet been confirmed in moto- and sensory neurons likely due to low endogenous expression. However, behavioural studies using dCirl knockout mutant larvae indicated a putative mechanosensory function of dCIRL regarding touch sensitivity and locomotion behaviour. The second part of this thesis presents a strategy to examine interactions between several presynaptic proteins in living cells. The attempt described in this work is based on the discovery that GFP when split into two non-fluorescent fragments can form a fluorescent complex. The association of the fragments can be facilitated by fusing them to two proteins that interact with each other. Therefore, the split GFP method enables direct visualization of synaptic protein interactions in living cells. In initial experiments I could show that full length reporter protein fusions with n-Synaptobrevin (n-Syb), Synaptotagmin (Syt) and Syntaxin (Syx) allow expression in Drosophila and confirmed that fusion to either end of each synaptic protein did not impair expression or influence the viability of transgenic flies. Further, transgenes containing protein fusions of Syx, Syt, and n-Syb with split GFP fragments were established in previous studies (Gehring, 2010). The present work characterises the interaction of these protein fusions during different stages of synaptic vesicle turnover at active zones such as synaptic vesicle docking at the presynaptic membrane and vesicle fusion. These results suggest that the spGFP assay seems only partly suitable for resolving fast and transient protein-protein interactions at larval Drosophila active zones in vivo. / Latrophilin, auch als Calcium-unabhängiger Rezeptor für α-Latrotoxin (CIRL) bezeichnet, repräsentiert einen Prototyp der Adhäsions G-Protein gekoppelten Rezeptorklasse. Ursprünglich als hoch-affiner Rezeptor für α-Latrotoxin entdeckt, werden Latrophiline heute mit zahlreichen verschiedenen Funktionen, wie synaptischer Exozytose, Gewebepolarität und Fertilität assoziiert (Tobaben et al., 2002; Langenhan et al., 2009; Promel et al., 2012). Trotz dieser Fortschritte sind die genaue subzelluläre Lokalisation sowie der endogene Ligand noch weitgehend unbekannt. Diese Studie verwendet genetische Ansätze, bildgebende Verfahren und Verhaltensstudien, um die Lokalisation und physiologische Funktion des Latrophilinhomologs dCirl in Drosophila melanogaster aufzuklären. Die Tatsache, dass Drosophila nur ein einziges Latrophilin Homolog besitzt, zusammen mit den genetischen Möglichkeiten und den sehr gut etablierten transgenen Methoden, machen die Fruchtfliege zu einem idealen Modellorganismus. Die erhobenen Daten belegen, dass dCirl verstärkt im larvalen Nervensystem, einschließlich motorischer und sensorischer Neurone, exprimiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in dCirl Knockout-Mutanten die basale synaptische Transmission unverändert ist, vermutlich aber Teile der postsynaptischen Struktur durch dCIRL in der Fruchtfliege kontrolliert werden. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass dCirl auf Transkriptionsebene in den larvalen und adulten Chordotonalorganen exprimiert wird, spezifische Mechanosensoren, die an der Propriozeption beteiligt sind (Eberl, 1999). Die Expression von dCIRL auf Proteinebene in motorischen und sensorischen Neuronen konnte aufgrund niedriger endogener Expressionslevel noch nicht verifiziert werden. Allerdings deuten Verhaltensstudien, die Berührungsempfindlichkeit und Lokomotion untersuchen, auf eine mögliche mechanosensorische Funktion von dCIRL in den Larven von Drosophila hin. Der zweite Teil dieser Arbeit zeigt eine Strategie auf, die es ermöglicht, das Zusammenspiel verschiedener präsynaptischer Proteine in vivo zu untersuchen. Die hier beschriebene Methode basiert auf der Entdeckung, dass sich zwei nicht-fluoreszierende Fragmente des grün leuchtenden Proteins (GFP), zu einem fluoreszierenden Komplex zusammenlagern können. Diese geteilten GFP-Fragmente (split-GFPs) werden mit zwei unterschiedlichen Proteinen fusioniert, die miteinander interagieren. Die split-GFP Methode ermöglicht so eine direkte Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen. In ersten Experimenten konnte ich zeigen, dass Synaptobrevin (n-Syb), Synaptotagmin (Syt) und Syntaxin (Syx), die mit vollständigen Fluorophoren markiert wurden, für die Expression in Drosophila geeignet sind und bestätigen, dass sowohl die N-terminale als auch die C-terminale Proteinfusion möglich ist. Zudem konnte durch diese Versuche die Überlebensfähigkeit der transgenen Fliegen überprüft werden. In vorangegangenen Studien wurden Transgene hergestellt, die Proteinfusionen von n-Syb, Syt und Syx mit split-GFP Fragmenten enthalten (Gehring, 2010). Die vorliegende Arbeit charakterisiert die Wechselwirkung dieser Proteinfusionen während unterschiedlicher Stufen der synaptischen Vesikelfreisetzung an der aktiven Zone, wie beispielsweise dem Vesikel-docking an der präsynaptischen Membran und der Vesikelfusion. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die split-GFP Technik nur bedingt geeignet ist um schnelle und transiente Protein-Protein Interaktionen an der larvalen aktiven Zone von Drosophila in vivo darzustellen.

Abstract Glioblastomas, primary brain tumors, represent a tumor entity with a dismal prognosis and a median survival of only about one year. Invasion into the healthy brain parenchyma contributes substantially to the malignancy of this type of brain tumor. Therefore, a better understanding of the mechanisms promoting the invasive behavior of these brain tumors is needed to identify new therapeutic targets. Cofilin, an actin regulatory protein, has been shown to be an important regulator of the invasive behavior of tumor cells in other types of cancer and the actin cytoskeleton is involved in the formation of a variety of cellular structures important for cell migration and invasion. Cofilin is regulated by phosphorylation on a single residue, serine 3. The aim of this thesis was to examine the role of the cofilin regulatory phosphatase chronophin for glioma cell migration and invasion. First, it was established that chronophin depletion in the cell line GBM6840 leads to an increase in the ratio of phosphorylated cofilin to total cofilin. Higher chronophin levels were correlated with a decrease in F-actin in the cell lines GBM6840 and U87 as measured in an actin spin down assay and in a flow cytometry based assay. Furthermore, it was shown that knockdown of chronophin in two different cell lines, GBM6840 and DBTRG-05-MG, strongly increased their invasiveness in vitro. Expression of human chronophin in the cell line U87 decreased its invasiveness substantially. There was no difference in cell proliferation between GBM6840 and DBTRG-05-MG cells expressing a chronophin targeting shRNA or a control shRNA and U87 cells transfected with an empty vector or a human chronophin encoding plasmid. The increase in invasiveness after chronophin depletion could be correlated with an increase in directionality in cell migration under 2D culture conditions in the cell lines U87 and GBM6840. Moreover, treatment with the ROCK inhibitor Y-27632 decreased directionality in GBM6840 cells under 2D culture conditions and reduced the invasiveness of GBM6840 chronophin shRNA cells back to control levels. Expression of a non-phosphorylatable cofilin mutant, the S3A mutant, was able to reduce invasiveness and to reduce directionality under 2D culture conditions back to control levels in GBM6840 chronophin shRNA cells. This provides important evidence for the involvement of cofilin phosphoregulation in the phenotypes described above. In vivo, when injected into NOD-SCID mice, chronophin depleted cells showed a dramatic growth reduction as compared to control and rescue cells. Transciptomic characterization of GBM6840 cells by microarray analysis and subsequent comparison of the data with microarray profiles of normal brain tissues and different glioma entities identified two specifically chronophin regulated transcripts potentially involved in tumor progression and invasion, MXI1 and EDIL3. Moreover, c-myc was identified as a significantly altered transcription factor after chronophin deregulation based on the number of c-myc target molecules in the microarray dataset. MXI1 is a potential negative regulator of c-myc dependent transcription, and was strongly downregulated after chronophin knockdown in GBM6840. In line with this, the activity of a c-myc reporter plasmid was increased after chronophin depletion in GBM6840 and reduced after chronophin expression in U87 cells. However, the protein level of the c-myc protein was reduced after chronophin depletion in GBM6840. Finally, anaylsis of the expression of proteases known to be important for glioblastoma pathogenesis revealed no major changes in protease expression between chronophin depleted and control cells. Therefore, a comprehensive analysis of chronophin in the context of glioma pathogenesis has been performed in this thesis. It has been shown that chronophin depletion strongly enhanced invasiveness of glioma cells and that it induced transcriptomic changes potentially involved in tumor progression. The proteins regulating cofilin phosphorylation are therefore valuable therapeutic targets for anti-invasive therapy in glioblastomas. Inhibitors for kinases upstream of cofilin, e.g. LIMKs and ROCKs, are available, and might be promising agents for anti-invasive therapy. / Zusammenfassung Glioblastome sind primäre Gehirntumore, die eine besonders schlechte Prognose besitzen und bei denen die mediane Überlebenszeit nur ca. ein Jahr beträgt. Zur Malignität dieses Tumortyps trägt entscheidend das Eindringen der Tumorzellen in das gesunde Hirnparenchym bei. Daher ist es notwendig die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesem Phänomen zu Grunde liegen, um neue therapeutische Zielmoleküle zu identifizieren. Cofilin, ein Protein das das Aktinzytoskellet reguliert, ist in anderen Krebsarten als wichtiger Regulator des invasiven Verhaltens von Zellen bekannt und das Aktinzytoskellet ist an der Bildung einer Vielzahl von zellulären Strukturen beteiligt, die wichtig für die Zellmigration und –invasion sind. Cofilin wird über die Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure, des Serin 3, reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Cofilin regulatorischen Phosphatase Chronophin für Zellmigration und -invasion zu untersuchen. Zuerst konnte gezeigt werden, dass eine Chronophin Depletion in der Zelllinie GBM6840 zu einer Zunahme des Anteils von P-Cofilin am Gesamtcofilin führt. Ebenso war ein hohes Chronophin Level in den Zelllinien GBM6840 und U87 mit einer Abnahme des F-Actin Levels korreliert, was in einem Aktin spin down Assay als auch mittels Durchflusszytrometrie gemessen werden konnte. Es konnte weiter gezeigt werden, dass eine shRNA vermittelte Depletion des Chronphin zu einer starken Zunahme der Invasivität in den Zelllinien GBM6840 und DBTRG-05-MG in vitro führt. Chronophin Expression in der Zelllinie U87 führte zu einer starken Abnahme der Invasivität. Es gab hingegen keinen Chronophin abhängigen Unterschied in der Proliferation von GBM6840 und DBTRG-05-MG Zellen, die entweder eine Kontroll- oder eine Chronophin gerichtete shRNA exprimierten, sowie keinen zwischen U87 Zellen, die mit einem Leervektor oder einem Chronophin codierenden Konstrukt transfiziert worden waren. Die Zunahme der Invasion nach Chronophin Depletion konnte mit einer Zunahme der Direktionalität der Zellen bei der Migration in einer 2D Umgebung korreliert werden. Desweiteren konnte durch Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 in GBM6840 Zellen eine Erniedrigung der Direktionalität bei der Migration in 2D Kultur ebenso erreicht werden, wie eine Reduktion der Invasivität von Chronophin shRNA exprimierenden GBM6840 Zellen auf Kontrollniveau. Die Expression einer nicht-phosphorylierbaren Cofilin Mutante, der S3A Mutante, erniedrigte sowohl die Direktionalität in der 2D Migration als auch die Invasivität von GBM6840 Chronophin shRNA exprimierenden Zellen zurück auf Kontrollniveau. Diese Experimente lieferten wichtige Hinweise darauf, dass die Phosphoregulation von Cofilin ursächlich an der Entstehung der Phänotypen beteiligt war, die nach Chronophin Knockdown beobachtet wurden. In vivo konnte nach Injektion in NOD-SCID Mäuse eine dramatische Wachstumsreduktion der Chronophin depletierten Zellen gemessen werden. Durch Charakterisierung des Transkriptoms der Zelllinie GBM6840 mittels Microarrays und nachfolgender Vergleich der Ergebnisse mit Microarray-Profilen von Normalhirngewebe und verschiedenen Gliomentitäten konnten zwei spezifisch Chronophin abhängig regulierte Transkripte identifiziert werden, MXI1 und EDIL3, die potentiell mit der Progression und Invasivität von Gliomen verknüpft sind. MXI1, ein potentieller negativer Regulator der c-myc abhängigen Transkription, war nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 stark herunterreguliert. In Übereinstimmung mit diesem Befund war die Aktiviät eines c-myc Reporterplasmids nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 erhöht, nach Chronophin Expression in U87 jedoch erniedrigt. Das c-myc Protein selbst wies eine deutliche Reduktion nach Chronophin Depletion in GBM6840 auf. Abschließend wurde die Expression von Proteasen untersucht, für die eine Rolle in der Gliominvasion bekannt ist. Hier wurden jedoch keine größeren Chronophin abhängigen Expressionsunterschiede gefunden. Zusammenfassend gesagt konnte eine umfassende Charakterisierung der Rolle des Chronophin in der Gliompathogenese erreicht werden. Zum einen konnte gezeigt werden, dass Chronophin ein äußerst wichtiger Regulator der Invasion ist, zum anderen dass es zu Chronophin abhängigen transkriptomischen Veränderungen kommt, die potentiell zur Malignisierung des Tumors beitragen. Daher sind die Proteine die die Cofilinphosphorylierung regulieren potentielle therapeutische Zielmoleküle für eine anti-invasive Therapie im Glioblastom. Inhibitoren für die Kinasen, die Regulatoren des Cofilin sind, die ROCK- und LIM-Kinasen, sind verfügbar und stellen möglicherweise vielversprechende Substanzen für die anti-invasive Therapie dar.

Accurate information transfer between neurons governs proper brain function. At chemical synapses, communication is mediated via neurotransmitter release from specialized presynaptic intercellular contact sites, so called active zones. Their molecular composition constitutes a precisely arranged framework that sets the stage for synaptic communication. Active zones contain a variety of proteins that deliver the speed, accuracy and plasticity inherent to neurotransmission. Though, how the molecular arrangement of these proteins influences active zone output is still ambiguous. Elucidating the nanoscopic organization of AZs has been hindered by the diffraction-limited resolution of conventional light microscopy, which is insufficient to resolve the active zone architecture on the nanometer scale. Recently, super-resolution techniques entered the field of neuroscience, which yield the capacity to bridge the gap in resolution between light and electron microscopy without losing molecular specificity. Here, localization microscopy methods are of special interest, as they can potentially deliver quantitative information about molecular distributions, even giving absolute numbers of proteins present within cellular nanodomains. This thesis puts forward an approach based on conventional immunohistochemistry to quantify endogenous protein organizations in situ by employing direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). Focussing on Bruchpilot (Brp) as a major component of Drosophila active zones, the results show that the cytomatrix at the active zone is composed of units, which comprise on average ~137 Brp molecules, most of which are arranged in approximately 15 heptameric clusters. To test for a quantitative relationship between active zone ultrastructure and synaptic output, Drosophila mutants and electrophysiology were employed. The findings indicate that the precise spatial arrangement of Brp reflects properties of short-term plasticity and distinguishes distinct mechanistic causes of synaptic depression. Moreover, functional diversification could be connected to a heretofore unrecognized ultrastructural gradient along a Drosophila motor neuron. / Kommunikation zwischen Nervenzellen ist von grundlegender Bedeutung für die Hirnfunktion. An chemischen Synapsen findet diese an hoch spezialisierten interzellulären Kontaktstellen statt, den aktiven Zonen, welche die Voraussetzung für präzise Neurotransmission schaffen und somit die synaptische Kommunikation gewährleisten. In aktiven Zonen befindet sich eine Vielzahl von Proteinen dicht gepackt, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Plastizität der Signaltransduktion vermitteln. Bisher ist es jedoch unklar, in welcher Weise die molekularen Organisationsprinzipien dieser Proteine die Funktion der aktiven Zone beeinflussen. Teilweise ist dies dem Auflösungsvermögen konventioneller Lichtmikroskopie geschuldet, das nicht ausreicht um die Architektur der aktiven Zone im Nanometer Bereich aufzuklären. Unlängst jedoch haben neue Methoden der hochaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie ihren Weg in die Neurowissenschaften gefunden. Diese sind in der Lage die Lücke zwischen optischer Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu schließen, ohne die Identität der Proteinspezies aus den Augen zu verlieren. Besonderes Interesse kommt hierbei sogenannten Lokalisationsmikroskopie Techniken zu. Diese können neben der Darstellung molekularer Organisationen im Idealfall sogar quantitative Informationen über die absolute Anzahl bestimmter Moleküle in subzellulären Bereichen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die auf klassischer Immunohistochemie beruht und dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) nutzt, um die endogene Proteinorganisation in situ zu quantifizieren. Fokussierend auf Brp (Bruchpilot), einem Protein an der aktiven Zone von Drosophila melanogaster, zeigen die Ergebnisse, dass die Zytomatrix an der aktiven Zone modular aufgebaut ist, wobei jedes Modul ~137 Brp Moleküle umfasst. Diese sind zum Großteil in etwa 15 Gruppen mit je 7 Untereinheiten angeordnet. Um auf einen quantitativen Zusammenhang zwischen der Ultrastruktur der aktiven Zone und ihrer Funktion zu schließen, wurden Drosophila Mutanten eingesetzt und mittels Elektrophysiologie funktionell untersucht. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass sich spezifische Eigenschaften von Kurzzeitplastizität in der präzisen Anordnung von Brp widerspiegeln, was Rückschlüsse auf verschiedene Ursprünge synaptischer Depression zulässt. Darüber hinaus beschrieben dSTORM Experimente erstmals, dass ein funktioneller Gradient entlang des Motoneurons mit der graduellen Veränderung der Anzahl von Bruchpilotmolekülen pro aktive Zone korreliert.

Das Empfinden von Schmerz ist für uns überlebenswichtig. Chronischer Schmerz hingegen hat seine physiologische Bedeutung verloren und wird als eigenes Krankheitsbild angesehen. Schmerzempfindung beginnt mit der Nozizeption. Die Zellkörper nozizeptiver Neurone befinden sich in den Spinalganglien (Hinterwurzelganglion, dorsal root ganglion DRG) und Trigeminalganglien (TG). In den DRG-Neuronen macht der Zwei-Poren-Kaliumkanal (K2P) TRESK die Hauptkomponente eines Kaliumstromes, des „standing outward currents“ IKSO, aus. Die physiologische Hauptaufgabe der TRESK-Kanäle liegt in der Regulation der zellulären Erregbarkeit nozizeptiver Neurone. Während einer Entzündungsreaktion werden Entzündungsmediatoren wie Histamin, Bradykinin, Serotonin und Lysophosphatidsäure (LPA) ausgeschüttet und können durch die Aktivierung ihrer G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) oder direkte Interaktion mit Ionenkanälen die nozizeptive Erregung beeinflussen. Durch Anwendung von RT-PCR und eines neu entwickelten Antikörpers wurde die Ko-Expression von TRESK-Kanälen zusammen mit Kanälen der Transient-Receptor-Potential-Kationenkanalfamilie (TRP) und LPA-Rezeptoren in DRG-Neuronen nachgewiesen. Durch rekombinante Ko-Expression von TRESK-Kanälen und LPA2-Rezeptoren in Xenopus Oozyten konnte durch Zugabe von LPA eine fast 10-fache Aktivierung des basalen K+-Stromes erzielt werden. Die Auswertung der Dosis-Wirkungskurve ergab einen EC50-Wert von 0,2 µM LPA. Die LPA-induzierte TRESK-Stromaktivierung konnte durch die Verwendung des mutierten Kanals TRESK[PQAVAD] oder durch die Zugabe des Phospholipase C (PLC) Inhibitors U73122 verhindert werden. Dies zeigt die Beteiligung des PLC-Signalwegs und die Bindung von Calcineurin an den TRESK-Kanal bei der Stromaktivierung. TRESK ist das einzige Mitglied der K2P-Familie, das eine LPA-induzierte Aktivierung des Stromes zeigt. TREK- und TASK-1-Ströme werden durch LPA inhibiert. In DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser wird Nozizeption durch die Aktivierung von TRPV1-Kanälen durch Hitze oder Capsaicin, dem Inhaltsstoff des Chilis, und zusätzlich durch die Substanz LPA verursacht. Ein weiteres Mitglied der TRP-Familie, der TRPA1-Kanal, ist bei der verstärkten Nozizeption während einer Entzündung involviert. Werden TRESK- und TRP-Kanäle in Xenopus Oozyten ko-exprimiert, verursacht LPA gleichzeitig einen Kationeneinwärts- wie auch -auswärtsstrom. Unter diesen Bedingungen verschob sich das Umkehrpotenzial in einen Bereich zwischen den Umkehrpotenzialen von Oozyten, die nur den K+-Kanal exprimieren und von Oozyten, die nur den unspezifischen Kationenkanal exprimieren. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die LPA-induzierte Ko-Aktivierung von TRP-Kanälen und TRESK zu einer Begrenzung des exzitatorischen Effekts führen kann. Die DRG-ähnlichen F11-Zellen exprimieren keine TRESK-Kanäle. Sie sind in der Lage durch Strompulse Aktionspotenziale zu generieren. Mit TRESK transfizierte F11-Zellen zeigten eine Verschiebung des Umkehrpotenzials in negative Richtung, einen größeren Auswärtsstrom und den Verlust von spannungsgesteuerten Natriumkanälen. Auch hohe Strompulse konnten keine Aktionspotenziale mehr auslösen. Bei Spannungs-Klemme-Messungen von primären DRG-Neuronen von TRESK[wt]-Mäusen erhöhte sich der IKSO nach Zugabe von LPA um über 20 %. Im Gegensatz dazu zeigten DRG-Neurone von TRESK[ko]-Mäusen unter diesen Bedingungen eine leichte Hemmung des IKSO von etwa 10 %. In Neuronen, die TRPV1 exprimieren, führte LPA nicht nur zum Anstieg des IKSO, sondern auch zur Aktivierung eines Einwärtsstromes (TRPV1). Im Vergleich dazu wurde in TRESK[ko]-Neuronen durch LPA nur der Einwärtsstrom aktiviert. In Strom-Klemme-Experimenten führte LPA-Applikation zur Entstehung von Aktionspotenzialen mit höherer Frequenz in Zellen von TRESK[ko]-Mäusen im Vergleich zu Zellen von TRESK[wt]-Mäusen. Zusätzlich wurde die Erregung, die durch Strompulse von 100 pA ausgelöst wurde, in den beiden Genotypen durch LPA unterschiedlich moduliert. Die Aktionspotenzialfrequenz in TRESK[wt]-Neuronen wurde gesenkt, in TRESK[ko]-Neuronen wurde sie erhöht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Erregung nozizeptiver Neurone durch LPA aufgrund der Ko-Aktivierung der TRESK-Kanäle abgeschwächt werden kann. Die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen wird strak durch die Aktivität und Expression der TRESK-Kanäle kontrolliert. Deswegen sind TRESK-Kanäle gute Kandidaten für die pharmakologische Behandlung von Schmerzkrankheiten. / Pain sensation is essential for survival. Chronic pain lost its physiological function and is categorized as a disease. Pain sensation is initiated by nociception. The cell bodies of nociceptive neurons are located in dorsal root ganglia (DRG) and trigeminal ganglia (TG). In DRG neurons TRESK two-pore-domain potassium channels (K2P) constitute the major current component of the standing outward current IKSO. A prominent physiological role of TRESK channels has been attributed to the regulation of pain sensation. During inflammation mediators of pain e.g. histamine, bradykinin, serotonin and lysophosphatidic acid (LPA) are released and modulate nociceptive signaling by activation of their G-protein coupled receptors (GPCR) or ionic channels. By means of RT-PCR and a newly developed antibody the co-expression of TRESK channels, channels of the transient-receptor-potential (TRP) cation channel family and LPA receptors in DRG neurons were demonstrated. Recombinant co-expression of TRESK channels and LPA2 receptors in Xenopus oocytes revealed an almost 10 fold activation of basal K+ currents upon LPA application with an EC50 of 0.2 µM LPA. Using mutant TRESK[PQAVAD] or application of the phospholipase C (PLC) inhibitor U73122 blocked current augmentation by LPA indicating cellular signaling via PLC pathway and calcineurin binding to TRESK channels. TRESK was the only member of the K2P family that showed a LPA induced activation of current. TREK- und TASK-1 currents were inhibited through LPA. In small diameter DRG neurons nociception results from TRPV1 channel activation by painful stimuli including the inflammatory substance LPA or activation of TRPA1 channels during inflammation. When TRESK and TRP channels are co-expressed in Xenopus oocytes cationic inward and outward currents were simultaneously activated by LPA. Under these conditions the reversal potential of ramp recordings was intermediate to recordings from oocytes expressing only the K+ or the unspecific cation channel. Principally this finding demonstrates that TRESK activation by an inflammatory substance dampens noxious excitation induced by the same agent. DRG-like F11 cells lacking endogenous TRESK channels generate action potential upon current stimulation. However when TRESK channels were recombinantly expressed in F11 cells, they exhibit a shift of the reversal potential to more negative values, a larger outward current and a loss of voltage-gated sodium currents. Accordingly, depolarizing pulses failed to elicit action potentials. In patch-clamp recordings from primary cultured DRG neurons of TRESK[wt] mice IKSO currents increased after application of LPA by over 20 % whereas under these conditions IKSO currents of neurons from TRESK[ko] mice decreased moderately by about 10 %. In TRPV1 positive neurons LPA application induced in TRESK[wt] neurons not only an activation of the IKSO but also an increase of the inward (TRPV1) current. In contrast, in TRESK[ko] neurons LPA only activated an inward (TRPV1) current. Under current-clamp conditions LPA application elicited spike trains in DRG neurons, with higher frequency in cells of TRESK[ko] mice than in cells of TRESK[wt] animals. In addition, upon depolarizing pulses (100 pA) excitability was differentially modulated by LPA in these genotypes. Spike frequency was attenuated in TRESK[wt] neurons and augmented in TRESK[ko] neurons. Accordingly, excitation of nociceptive neurons by LPA is balanced by co-activation of TRESK channels. It is evident that the output of sensory neurons is strongly controlled by the activity and the expression of TRESK channels, which therefore are good candidates for the pharmacological treatment of pain disorders.