De nombreuses études en oncoimmunologie portent sur l’échec immunitaire dans le contexte de progression tumorale, mais elles sont plus rares à porter sur un contexte de régression, lorsque le système immunitaire est efficace. De ce fait, bien souvent la littérature met en avant le rôle cytotoxique des lymphocytes T CD8+, ou bien leur anergie dans le contexte de progression tumorale, causée par des cellules myéloïdes telles que les MDSC ou les macrophages de phénotypes M2, considérés comme pro-tumoraux. J’ai pour ma part étudié la réponse immunitaire dans le cadre d’une régression tumorale. Des cellules TC1 transplantées en s.c. dans des souris C57BL6/J, donnent des tumeurs solides d’environ 6mm de diamètre 11 jours plus tard. A ce moment là (J0), les souris sont vaccinées à proximité de la tumeur (priming), par un vaccin contenant la sous-unité B non toxique de la Shiga toxine couplée au peptide E7 de l’HPV16 (exprimé par les TC1), combiné à de l’IFNα. Une semaine plus tard (J7), un « boost » est effectué. Après le boost, la croissance tumorale cesse puis la tumeur régresse. L’analyse cinétique par cytométrie révèle un infiltrat immunitaire important pendant, et précédant la régression tumorale. La nature de cette infiltrat varie avec le temps. A J5, un infiltrat myéloïde est observé, suivi d’un infiltrat lymphocytaire à partir de J8. Une déplétion des cellules T CD8+ inhibe la régression tumorale, alors que dans les souris CXCR3-/-, dans lesquelles les CD8+ ne sont pas déplétés mais leur recrutement est fortement affecté, une régréssion tumorale est possible malgré un infiltrat T CD8+ très faible. Cela laisse penser que d’autres acteurs que les LT cytotoxiques sont nécessaires à la régression tumorale, comme probablement les cellules myéloïdes qui infiltrent le tumeur avant les cellules T. L’analyse de cette population montre une activation des monocytes et macrophages (MHC II+), avec un pic d’activation autour de J9, au début de la régression. La capacité cytotoxique de ces cellules, mesurée in vitro par immunofluorescence est augmentée comparée à des myéloïdes isolées de tumeurs de souris en progression. De plus, l’ajout d’un anticorps anti-TNFα inhibe partiellement cette cytotoxicité. Cela montre qu’après vaccination, les monocytes/macrophages sont capables de tuer les cellules tumorales. Une déplétion partielle des macrophages au moment de la vaccination, à l’aide du PLX3397 (inhibiteur du CSF1R), réduit l'efficacité de la vaccination. Les cellules myéloïdes, lorsqu'elles sont présentes, contribuent fortement à la régression tumorale induit par le vaccin composite, et leur action implique probablement des interactions avec les LT CD8+. C'est ce que suggère l'observation de tumeurs vaccinées dans des souris IFNϒ-/-, dans lesquelles l'efficacité vaccinale est aussi inhibée. Cette thèse montre qu’après une stimulation appropriée, qui peut, comme ici, mimer une infection virale, les cellules myéloïdes peuvent participer activement à la régression tumorale. / Most oncoimmunology studies are performed in an immune failure context of progressing tumor. They rarely describe tumor regressions, when the immune response is efficient. As a result, the literature tends to highlight the cytotoxic role of CD8+ T cell or their anergy in the context of tumor progression, caused by myeloid cells such as the MDSC or M2 polarized macrophages, considered as protumoral. My PhD work has been focused on the immune response in a context of tumor regression. TC1 cells transplanted s.c. in C57 BL6 J mice, give rise to solid tumors of approximately 6 mm diameter 11 days later. At that time (day 0), mice are vaccinated peritumorally for a priming with a composite vaccine containing the subunit B of the Shiga toxin coupled to E7 peptide from HPV16 (present on TC1), combined with the IFNα. A week later (day 7), a boost is made. After the boost, tumor growth stops and the tumor regress. Kinetic cytometric analysis revealed a significant immune infiltrate during and prior to tumor regression. The nature of this infiltrate varies with time. On day 5, a myeloid infiltrate is observed, followed by a lymphocytic infiltrate which is conspicuous after day 8. Depletion of CD8+ T cells inhibits tumor regression, while in CXCR3- /- mice, in which the CD8+ are not depleted but their recruitment is severely affected, tumor regression is possible despite a very low CD8+ T cell infiltrate. This suggests that some effectors, other than cytotoxic T cells, are required for tumor regression, including probably myeloid cells that infiltrate the tumor before T cells. The analysis of this population shows an activation of monocytes and macrophages (MHC II+) with a peak of activation around day 9, early in the regression. The cytotoxic capacity of these cells was tested in vitro, by depositing F4/80+ cells from vaccinated tumors or not, on a TC1 cell monolayers in culture. Only myeloid cells from vaccinated tumors appear to kill tumor cells, and adding an anti-TNFα inhibits this cytotoxicity. This shows that after immunization, monocytes/macrophages are capable of killing tumor cells. A partial depletion of macrophages at the time of vaccination, after treatment with PLX3397 (CSF1R inhibitor), reduces the vaccine efficacy. Myeloid cells contribute significantly to the observed tumor regression, and their action involves interactions with CD8+ T cells. This hypothesis is consistent with the observation of tumors in vaccinated IFNϒ- /- mice, in which the vaccine efficacy is also inhibited. This thesis shows that after an appropriate stimulation, for instance, here, by mimicking a viral infection, myeloid cells can actively participate in tumor regression.

La tolérance immunologique assure le maintien de l’intégrité des organismes contre les pathogènes tout en respectant les constituants du soi. La dérégulation de ce mécanisme entraîne la survenue de maladies autoimmunes qui touchent de 5 à 10% de la population générale. Un mécanisme clé de la tolérance immunologique est la délétion clonale des lymphocytes T auto-réactifs après qu’ils ont reconnu leur antigène spécifique au cours de leur maturation dans le thymus. Il a été montré qu’un vaste répertoire d’autoantigènes est exprimé par les cellules épithéliales médullaires du thymus (mTECs) sous l’action de la protéine AIRE (AutoImmune Regulator).
Les études présentées dans ce travail participent à améliorer la compréhension du fonctionnement de AIRE. Au-delà de la fonction de transactivation de AIRE, nous avons montré, avec le reséquençage à haut débit (RNAseq) des mTECs, que les transcrits des autoantigènes induits par AIRE ont des extrémités 3’UTRs courtes associées à l’utilisation des sites de polyadénylation (pA) alternatifs. Nous avons identifié par analyse de données de CLIPseq une fixation préférentielle du complexe de terminaison de la transcription au niveau des pAs alternatifs des gènes sensibles à AIRE. Nous avons également mis en évidence l’interaction de AIRE au complexe de terminaison de la transcription. Parmi plusieurs partenaires de AIRE associés à ce complexe, nous avons montré par interférence d’ARN et RNAseq le rôle de CLP1 dans le choix des pAs alternatifs. De plus nous montrons que CLP1 est le seul membre du complexe de terminaison à être préférentiellement exprimé dans les mTECs matures. Fonctionnellement, nous avons mis en évidence une stabilité plus importante pour les transcrits des autoantigènes induits par AIRE en bloquant la transcription des mTECs ex-vivo par traitement à l’Actinomycine D. Nous montrons également l’existence d’un raccourcissement 3’UTR général dans les mTECs matures par rapport aux mTECs immatures et autres tissus de la souris, auquel se combine le raccourcissement spécifique des gènes dépendant de AIRE. Après avoir identifié par des analyses de Gene Ontology une activité cellulaire exacerbée dans les mTECs matures vs immatures, nous confirmons l’activité transcriptionnelle exacerbée des mTECs matures in-vivo grâce à l’incorporation de 5Ethynyl Uridine (EU) dans les ARN néosynthétisés après injection intrathymique. Le raccourcissement des transcrits des auto-antigènes associé à leur stabilité accrue suggère qu’ils échappent à la répression transcriptionnelle médiée par les microARNs. Ce travail a permis d’identifier les bases moléculaires de la régulation post-transcriptionnelle des autoantigènes dans le thymus. Dans l’étude faite en collaboration avec l’équipe de Jakub Abramson du laboratoire Weizmann, démontre que Sirt1, une désactylase ADN dépendante, est exprimé de façon abondante dans les mTEC AIRE+ et ce grâce à l’utilisation de profil d’expression génétique, de cytométrie en flux et d’analyses d’immunoblot de différents types cellulaires thymiques. De plus lorsque Sirt1 est inactivé, dans les lignées germinales et des lignées TEC, l’expression des gènes AIRE dépendants diminuent et donc avec elle la tolérance immune induite par AIRE. La capacité désacétylase de Sirt1 est nécessaire pour l’expression des gènes induits par AIRE dans les mTECs. Sirt1 cible surement d’autres molécules nucléaires, impliquées dans la voie de AIRE. Elle pourrait avoir un rôle plus étendu dans la régulation du système immunitaire et être présent à la périphérie. Cette étude a mis en évidence un rôle important de Sirt1 dans la tolérance centrale dans le thymus à travers la régulation des gènes induits par AIRE. (...) / No abstract

Le système immunitaire inné est un mécanisme de défense commun à tous les métazoaires. Chez l’Homme comme chez la drosophile, son activation peut être délétère lorsqu’elle est incontrôlée. L’étude des mécanismes qui sous-Tendent cet équilibre entre l’activation ou non de la réponse immunitaire innée est à la base de mes travaux de thèse. En utilisant le modèle Drosophila melanogaster, j’ai caractérisé la protéine Big-Bang comme un acteur important de la balance immunitaire intestinale. Mes résultats démontrent que Big-Bang est un constituant des jonctions obturantes de l’épithélium intestinal. Son absence provoque une rupture de tolérance immunitaire envers la flore bactérienne endogène et d’autre part une sensibilité accrue aux pathogènes invasifs. Mes travaux de thèse ont également permis de caractériser Akirine, une protéine nucléaire qui agit au niveau des facteurs NF-ΚB de la drosophile à l’Homme. Mes résultats démontrent qu’Akirine est un sélecteur qui agit de concert avec le complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF et NF-ΚB pour transcrire un sous-Ensemble de gènes pro-Inflammatoires. / The innate immune response is required by all metazoan to defend themselves against microorganisms. When abnormally activated however, innate immune responses cause deleterious chronic inflammation. The study of the fragile equilibrium between immune responses and tolerance has fundamentally shaped the projects of my PhD work.First, using Drosophila melangoaster as a model, I characterized Big-Bang as a major player of the immune balance in the gut. I could show that Big-Bang is a bona fide component of midgut epithelium septate junctions. Consequently, big-Bang deficient flies have an impaired tolerance against commensal microorganisms and are susceptible to invasive gut pathogens, ultimately leading to a premature death of flies.I focused the second part of my PhD work on the characterization of Akirin, a nuclear protein required for the activation of NF-ΚB response from Drosophila to humans. My results showed that Akirin is a selector molecule, acting together with NF-ΚB and the SWI/SNF chromatin-Remodeling complex to sustain the transcription of a subset of pro-Inflammatory genes.

La maladie d'Alzheimer (MA) se caractérise par l’accumulation de l’amyloïde β (Aβ) dans le cerveau. Des indications suggèrent un lien étroit entre la MA et la neuroinflammation. Cependant, l’aspect moléculaire des réactions immunitaires innées contre l’Aβ n’a pas été élucidé. Nous avons utilisé la drosophile pour étudier l'impact des réactions immunitaires innées sur la MA. Au cours de ma thèse, j'ai: (1) mis en place un modèle drosophile de la MA pour l’étude du rôle des réactions inflammatoires, (2) montré que la voie inflammatoire IMD exerce un rôle neuroprotecteur empêchant le développement de phénotypes associés à la MA (3) généré l’interactome de la voie IMD utile lors de l’étude des mécanismes liant la MA à la neuroinflammation, et (4) introduit un crible génétique visant à identifier des gènes modificateurs de la MA. Nous estimons que nos résultats pourraient servir de base à de nouvelles interventions thérapeutiques contre la MA. / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by the accumulation of amyloid β (Aβ) in the brain. Several lines of evidences point towards a strong link between AD and neuroinflammation. However, the exact molecular events of the innate immune reactions against Aβ need to be elucidated. We used Drosophila as a model organism to study the impact of innate immune reactions on AD. During my PhD I have been able to: (1) establish a Drosophila model to study the inflammatory responses inAD, (2) demonstrate that the Drosophila inflammatory IMD pathway plays a neuroprotective role in the development of AD-like phenotypes, (3) generate the IMD interactome dataset that could help elucidate the mechanisms linking AD to neuroinflammation, and (4) introduce a forward genetic screen for the identification of modifier genes of AD. We believe that the outcomes from our Drosophila studies could provide the basis for new therapeutic interventions against AD.

Lors de la réponse immunitaire de la drosophile, la voie Toll est activée lors d'un challenge immunitaire par des bactéries à Gram positif ou des champignons. Ce mécanisme est initié soit par la reconnaissance de motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) qui activent la voie de reconnaissance, soit par des facteurs de virulence et des protéases produits par les agents pathogènes qui activent la voie des signaux de danger. Le travail que j'ai effectué a pour but de caractériser les différentes molécules impliquées dans ces cascades protéolytiques en amont de Toll. Cela permettra de reconstituer ces cascades in vitro et de comprendre comment elles sont organisées, comment et où des complexes peuvent être formés. La première partie concerne les approches génétiques utilisées pour générer des mutants des gènes pouvant être impliqués dans l'activation de la voie Toll par la voie des PAMPs. La deuxième partie se concentre sur un homologue inactif de protéase à sérine appelé spheroide et sur son implication dans la voie de reconnaissance des signaux de danger. Pour la première fois, nous avons pu démontrer qu'une protéase inactive est requise dans la cascade protéolytique, et plus particulièrement dans la détection des signaux de danger après un challenge immunitaire par des bactéries pathogènes à Gram positif. / The Toll pathway in Drosophila immune response is activated upon immune challenge with Gram positive bacteria and fungi. This can be achieved either through recognition of Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs), which triggers the recognition cascade; or by virulence factors and proteases produced by the pathogens, which triggers the danger signal cascade. The work I have done aimed to characterize the various molecules involved in proteolytic cascade supstream of Toll. This will help to reconstitute these cascades in vitro and understand how they are organized, how and where complexes could be formed. The first part focuses on genetic approaches used to generate mutants for genes suggested to be involved in the activation of Toll pathway via the recognition cascade. The second part focuses on an inactive serine protease, aserine protease homolog spheroide and its involvement in the danger signal cascade. For the first time, we could demonstrate that an inactive protease is required in the proteolytic cascade,involved in the sensing of danger signais upon immune challenge with pathogenic Gram-positive bacteria.

Il y a eu des rapports récents sur la réponse antitumorale chez la drosophile. Notre objectif est d'examiner le rôle des signaux immunitaires innés contre les tumeurs RasV12-­GFP chez les mouches adultes. J'ai créé un modèle de tumeur chez les drosophiles adultes en transplantant la lignée de cellules tumorales RasV12-­GFP. Cette étude présente des preuves que les voies immunitaires innées sont toutes, dans une certaine mesure, impliquées dans la réaction contre les tumeurs de la drosophile. Bien que les données soient très préliminaires, elles illustrent les réponses complexes dans les mouches, qui constitueront certainement la base de l'étude future du groupe. Néanmoins, les données in vivo suggèrent clairement que d'une part, les cellules oncogènes sont capables de proliférer massivement sur le côté du corps de la mouche et d'autre part, les mouches succombent finalement à la charge oncogène. Le profilage de l'expression génique suite à l'injection oncogène de cellules RasV12 nous amène également à nous interroger sur les récepteurs inconnus ou les signaux de danger, qui pourraient se coordonner dans les mouches pour lutter contre ces cellules. D'autres travaux permettront d'élucider le mécanisme moléculaire de reconnaissance et de réaction de l'insecte à ces cellules tumorales. / There have been recent reports on antitumor response in Drosophila. Using the fly model this might open new avenues in the field of tumor immunology. Our aim is to examine roles of these innate immune signaling against RasV12-­GFP tumors in adult flies. I established tumor developing adult flies by transplanting RasV12-­GFP tumor cell line. This study presents evidence that the innate immune pathways are all to some extent involved in the reaction against tumors in Drosophila. Although the data is highly preliminary, it illustrates the complex responses in the flies, which will definitely form the basis of the future study of the group. Nevertheless, the in vivo data clearly suggests that firstly, the oncogenic cells are able to proliferate massively in side the fly body and secondly, the flies finally succumb to the oncogenic load. The gene expression profiling following the oncogenic RasV12 cell injection also leads us to ask question about the unknown receptors or danger signals, which might be coordinating in the flies to fight against these cells. Further work will unravel the molecular mechanism of recognition and reaction of the insect to these tumorous cells.

TREM-1 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1) est un récepteur exprimé par les cellules de l’immunité innée qui amplifie l’inflammation initiée par les TLRs (Toll-like Receptors) et est impliquée dans plusieurs pathologies inflammatoires aigües et chroniques. À ce jour, peu de choses sont connues quant aux mécanismes moléculaires d’activation de TREM-1. Ainsi, nous avons développé des outils pour pouvoir stimuler TREM-1 de façon monovalente et multivalente. Ces travaux montrent que TREM-1 est activé par multimérisation et qu’il est régulé différemment sur les neutrophiles et monocytes. En effet, sur les monocytes activés au LPS, l’activation de TREM-1 s’effectue en deux étapes tandis qu’une seule est nécessaire dans les neutrophiles. Grâce à des approches de protéomiques, nous avons confirmé la dimérisation de l’ectodomaine de TREM-1 en solution. De plus, la multimérisation semble aussi être médiée par le ligand naturel de TREM-1, qui est, entre autres, libéré par les neutrophiles activés au LPS. Le travail présenté ici est une première étape vers la compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à l'interaction de TREM-1 et son ligand, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques / Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1 (TREM-1) is a receptor expressed on innate immune cells which amplifies inflammatory signals initially triggered by TLRs (Toll-like receptors) and TREM-1 has been characterized as a major player in the pathophysiology of acute and chronic inflammatory diseases. Currently, the molecular mechanisms leading to the activation of TREM-1 remain unknown. We have developed specific tools to stimulate TREM-1 in a monovalent and divalent way. Here we show that TREM-1 is activated by multimerization and is differentially regulated on neutrophils and monocytes. Indeed, TREM-1 activation on primary human monocytes by LPS required a two-step process while one is required on neutrophils. Using proteomic approaches, we have confirmed that TREM-1 ectodomain dimerizes in solution. Furthermore, the multimerization seems to be mediated by the natural ligand of TREM-1, which is released by LPS activated neutrophils. Collectively, our findings uncover molecular mechanisms leading to TREM-1 and its ligand interaction, painting the way of new therapeutics

Les cellules T invariantes associées aux muqueuse (MAIT) sont des lymphocytes innés caractérisés par l'expression d'un récepteur des cellules T semi-invariant (iTCR) et restreints par la molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe Ib, MR1. Chez l'homme, les cellules MAIT sont abondantes dans le sang (1 à 10%), l'intestin (3 à 5%) et le foie (20 à 40%) et réagissent contre des métabolites microbiens. En raison de leur rareté dans les souris de laboratoire classiques, les études sur les cellules MAIT murines ont été principalement effectuées sur des souris transgéniques (Tg) pour des TCR MAIT. Cependant, ces cellules MAIT Tg ne récapitulent pas de manière adéquate le phénotype des cellules MAIT humaines. Ici, nous décrivons une souche de souris congénique que nous avons générée qui possède des cellules MAIT qui ressemblent aux cellules MAIT humaines. Nous utilisons cet outil pour étudier les caractéristiques des cellules MAIT murines. L'étude de souches de souris consanguines d'origine sauvage montre que la souche CAST/Ei présente une fréquence des cellules MAIT nettement supérieur à celle retrouvée dans la souche C57BL/6. Un seul locus est impliqué et a été localisé dans la région TCRα. Ceci a permis la génération d'une souche "MAIT" congénique, qui ont été en outre croisé à une souris Tg pour un rapporteur GFP du facteur transcriptionnel RORγt sur la base de données antérieurs montrant que les MAITs humaines expriment ce facteur. Grâce à cet outil, nous montrons que les MAITs murines sont CD4−CD8−/lo, ont un phénotype mémoire effecteurs (CD44+) et coexpriment PLZF et RORγt. Ces MAITs murines sont orientées vers une localisation tissulaire (CCR6+CCR7−) et résident préférentiellement dans les tissus non lymphoïdes périphériques, y compris les poumons, le foie et la peau. Après stimulation du TCR, les MAITs produisent des cytokines TH1/2/17 et sont aussi activées par de antigènes bactériens (par exemple semi-purifié fraction bactérienne ou 5-OP-RU) d'une manière dépendant de MR1. Les MAITs ont une forte expression de récepteurs de cytokines (IL-7R, IL-18Rα, IL-12Rβ) et peuvent ainsi répondre à des cytokines innées. Lors d'une infection expérimentale des voies urinaires, les MAITs migrent vers la vessie et ont une activité protectrice anti-bactérienne. Au total, nos résultats démontrent que les cellules MAIT murines ressemblent étroitement à leurs homologues humains. Ce nouveau modèle murin sera un outil puissant pour faire avancer notre compréhension de la biologie des cellules MAIT en situation normale et pathologique. / Mucosal-associated invariant T cells (MAIT) are innate lymphocytes that express a semi-invariant T cell receptor (iTCR) and are restricted by the major histocompatibility complex (MHC) related molecule, MR1. In human, MAIT cells are abundant in the blood (1-10%), gut (3-5%), and liver (20-40%). They react against microbial-derived riboflavin metabolites that are common in bacteria and yeast. Due to the paucity of MAIT cells in classical inbred laboratory mice, studies on mouse MAIT cells were mostly performed in TCR-transgenic (Tg) mice. However, these Tg MAIT cells do not adequately recapitulate the phenotype of human MAIT cells. Herein, we present a recently generated congenic mouse strain harboring MAIT cells that closely resemble human MAIT cells and use this tool to study the characteristics of natural mouse MAIT cell. An analysis of wild-derived inbred mouse strains revealed that CAST/Ei strain has increased frequency of MAIT cells than C57BL/6 mice. This was linked to a locus on the TCRα region. Introduction of such locus into C57BL/6 mice generated a “MAIT” congenic strain, which were further crossed to Rorc(γt)-GfpTG reporter strain based on previous findings of RORγt expression on human MAIT cells. Using this tool, we show that natural mouse MAIT cells are CD4−CD8−/lo, display an effector memory phenotype (CD44+), and coexpress the transcription factors PLZF and RORγt. They exhibit tissue-homing properties (CCR6+CCR7−) and preferentially reside in peripheral non-lymphoid tissues, including lung, liver, and skin. Upon TCR ligation, MAIT cells produce TH1/2/17 type cytokines and react to bacterial-derived antigens (i.e. semi-purified bacterial fraction or 5-OP-RU) in an MR1-dependent manner. They have high expression of cytokine receptors (IL-7R, IL-18Rα, IL-12Rβ) and may respond to the corresponding innate cytokines. During experimental urinary tract infection, MAIT cells migrate to the bladder and display a protective anti-bacterial activity. Altogether, our results demonstrate that mouse MAIT cells resemble their human counterparts more closely than previously recognized and therefore this new mouse model will be a powerful tool for advancing our understanding of MAIT cell biology in health and disease.

Les vésicules extracellulaires (EVs) participent à la communication intercellulaire. Dans la littérature actuelle, elles sont divisées en deux classes principales selon leur origine intracellulaire. En premier lieu, les exosomes sont formés à l'intérieur des endosomes multivésiculaires et sont libérés lors de la fusion de ces compartiments avec la membrane plasmique (MP). La taille des exosomes est contrôlée au cours de leur biogenèse et varie de 50 à 150 nm. Deuxièmement, les EVs sont formées par bourgeonnement direct et sécrétion à partir de la MP. Ces EVs sont plus hétérogènes et leur taille varie de 50 à 1000 nm. Malgré le fait que la nature hétérogène de EVs soit clairement documentée dans la littérature, la composition en protéines et les mécanismes exacts de la biogenèse des différentes EVs restent un sujet de débat en cours. Le but principal de ce travail était de redéfinir autant de sous-types différents d’EVs que possible, en trouvant des marqueurs protéiques spécifiques, et d'étudier les outils possibles pour affecter spécifiquement leur sécrétion. Dans ce projet, nous avons mis en place plusieurs outils utiles pour la caractérisation d’EVs. Tout d'abord, mes principaux efforts ont été concentrés sur la mise en place de plusieurs protocoles d'isolation et d'analyse d’EVs. Cela a conduit à la production d'une cartographie des protéines vésiculaires, qui si elle est appliquée pour caractériser les EVs, permettra de mieux les identifier par leur composition. Deuxièmement, j'ai étudié la façon dont la sécrétion de ces sous-populations d’EVs peut être modulée par l'inhibition de quelques protéines de la famille RAB et par certaines drogues. Enfin, grâce à une collaboration établie au sein de l'unité, j'ai eu l'occasion de participer à une comparaison des propriétés fonctionnelles entre les EVs et les virus sécrétés simultanément par les cellules infectées. Mes résultats confirment l'hypothèse selon laquelle l'origine intracellulaire des EVs sera reflétée dans leur composition. Les résultats présentés confirment la coexistence de plusieurs classes d'EVs et donnent un aperçu sur les moyens de les caractériser dans une préparation d’EVs donnée. En outre, nous fournissons un exemple de l'application de notre ensemble de protéines dans les études portant sur la biogenèse des EVs. / Extracellular vesicles (EVs) are participating in intercellular communication. Classically, in the current literature, they are divided into two main classes depending on their intracellular origin. Firstly, exosomes are formed within multivesicular endosomes and released upon fusion of these compartments with plasma membrane. The size of exosomes is controlled during their biogenesis and ranges from 50 to 150 nm. Secondly, EVs are formed by direct budding and pinching off from the plasma membrane. These EVs are more heterogeneous and their size varies from 50 to 1000 nm. Despite the fact that a heterogeneous nature of EVs is clearly documented in the literature, the exact protein content and biogenesis mechanisms of different EVs remain a matter of on-going debate. The principal goal of this work was to re-define as many different subtypes of EVs as possible, by finding specific protein markers, and investigate possible tools to affect specifically their secretion. In this project, we set up several tools useful for EV characterization. Firstly, my main efforts were concentrated on establishment of several protocols to isolate and analyse EVs. This led to the foundation of a vesicle protein cartography, which if applied to characterize EVs, will allow better understanding of the composition of the studied EVs. Secondly, I investigated how secretion of these EV subpopulations might be modulated by inhibition of a few RAB proteins and by some drugs. Finally, thanks to a collaboration established within the unit, I had the opportunity to participate in a comparison of the functional properties between EVs and viruses secreted simultaneously by infected cells. My results confirmed the hypothesis that the intracellular origin of EVs will be reflected in their composition. The results presented in this study point at the coexistence of several EV classes and provide insights on how to demonstrate their presence in a given EV preparation. In addition, we provide an example of the application of our set of proteins in studies addressing EV biogenesis.

La phagocytose est un mécanisme cellulaire essentiel de l’organisme. Elle joue un rôle à la fois dans le maintien de l’homéostasie tissulaire mais également dans le système immunitaire. Ce processus, réalisé par des cellules phagocytaires, telles que les cellules dendritiques, les polymorphonucléaires neutrophiles ou les macrophages, permet l’ingestion et l’élimination quotidienne de particules de grandes tailles (>0,5 µm) : bactéries, champignons ou débris cellulaires. Il est induit par de nombreux récepteurs phagocytaires tels que les récepteurs aux fragments cristallisables des immunoglobulines (FcR) et les récepteurs au complément (CR3). Ceux-ci induisent des cascades de signalisation différentes mais aboutissant, toutes deux, à un remodelage du cytosquelette d’actine et de la membrane plasmique. Il y alors formation d’une coupe phagocytaire entourant et enfermant la particule à internaliser dans un compartiment clos appelé phagosome. Alors que de nombreuses études ont permis de disséquer l’organisation des coupes phagocytaires induites par les FcR, le mécanisme de fermeture des phagosomes n’était pas élucidé. Par ailleurs, les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des phagosomes suite à l’engagement des CR3 sont moins bien décrits. Au cours de ce travail, nous avons analysé le rôle de la dynamine 2, une GTPase impliquée dans les mécanismes de fission des vésicules d’endocytose, au cours de la formation et de la fermeture des phagosomes. Nous avons utilisé un système expérimental original utilisant la microscopie à ondes évanescentes pour montrer, que la dynamine 2 est recrutée avec l’actine dans les coupes phagocytaires en formation et qu’elle s’accumule au site de fermeture des phagosomes dans des macrophages vivants. L’inhibition de son activité GTPase induit une inhibition de l’efficacité de phagocytose et un défaut de la dynamique de l’actine lors de l’extension des coupes phagocytaires. De façon surprenante, la dépolymérisation de l’actine conduit à un défaut de recrutement de la dynamine 2 au site de la phagocytose mettant en évidence une régulation croisée entre la dynamine 2 et l’actine. Enfin cette étude a montré que la dynamine 2 joue un rôle critique dans la scission du phagosome. Dans un second temps, nous avons initié l’étude des mécanismes impliqués dans la régulation de l’activité du récepteur au complément CR3. L’activation de ce récepteur phagocytaire, qui fait partie de la famille des intégrines, requiert un ancrage à l’actine nécessaire à la signalisation vers la polymérisation d’actine et à la formation des coupes phagocytaires. L’ensemble de ces résultats contribue à une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires fins impliqués dans la phagocytose. / Phagocytosis is an important cellular mechanism. It plays a role in both the maintenance of tissue homeostasis and in the immune system. This process, performed by phagocytic cells, including dendritic cells, polymorphonuclear neutrophils or macrophages, enables daily ingestion and elimination of large particles (> 0.5 microns) e.g. bacteria, fungi or cellular debris. It is induced by many phagocytic receptors such as the receptors for crystallizable fragments of immunoglobulins (FcR) and complement receptor (CR3). These receptors induce different signaling cascades but ultimately lead to a remodelling of the actin cytoskeleton and the plasma membrane. Next there is the formation of a phagocytic cup which surrounds and encloses the ingested particle in a closed compartment called the phagosome. While many studies have dissected the phagocytic cup organization induced by the FcR, the mechanism of phagosome closure was not understood. Furthermore, the molecular mechanisms involved in phagosome formation following CR3 engagement are less well described. In this work, we analyzed the role of dynamin 2, a GTPase involved in fission mechanisms of endocytosis vesicles, and in the formation and closure of phagosomes. We used an original experimental system using the total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) to show that dynamin 2 is recruited with actin during phagocytic cup formation and accumulates at the site of phagosome closure in living macrophages. The inhibition of its GTPase activity induced an inhibition of phagocytosis and a defect in actin dynamics during pseudopod extension. Surprisingly, the depolymerization of actin lead to a defective recruitment of dynamin 2 at the phagocytic site showing there is a cross-regulation between dynamin 2 and actin. Finally, this study showed that dynamin 2 plays a critical role in the scission of the phagosome. Secondly, we initiated the study of the mechanisms involved in regulating the activity of the complement receptor CR3. Enabling this phagocytic receptor, part of the integrin family, requires anchoring actin which is necessary for signaling to the actin polymerization and the formation of phagocytic cups. All these results contribute to a better understanding of the molecular mechanisms involved in phagocytosis purposes.