Η ριβονουκλεάση P (RNase P) είναι το ένζυμο που ευθύνεται για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των πρόδρομων μορίων tRNA συμμετέχοντας έτσι στην πρωτεΐνοσύνθεση. H RNase P καταλύει την ενδονουκλεολυτική θραύση ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού παρουσία ιόντων Mg2+ παράγοντας προϊόντα με 3΄ υδροξυλικά και 5΄ φωσφορικά άκρα. Η πλειοψηφία των RNase P ενζύμων που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα είναι ριβονουκλεοπρωτεΐνες αποτελούμενες από μια RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες. Η RNA υπομονάδα της βακτηριακής RNase P είναι ένα από τα πρώτα καταλυτικά RNA που μελετήθηκαν. Η RNase P και το ριβόσωμα είναι τα μόνα γνωστά ριβοένζυμα που είναι συντηρημένα και στις τρείς φυλογεννετικές περιοχές. Δεδομένης της ζωτικής σημασίας των λεμφοκυττάρων στην ακεραιότητα του ανοσολογικού συστήματος και στην παθογένεια ευρέος φάσματος δερματολογικών και μη νοσημάτων, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την απομόνωση και τον καθαρισμό της RNase P από περιφερικά λεμφοκύτταρα υγιών μαρτύρων, ο προσδιορισμός της ενζυμικής της δραστικότητας, καθώς και η μελέτη της in vitro επιδράσεως δυο συνθετικών ρετινοειδών, του 13-cis ρετινοϊκού οξέος και της ασιτρετίνης, της αμινογλυκοσίδης νεομυκίνης Β, όπως και της διφωσφορικής χλωροκίνης στην δραστικότητα της λεμφοκυτταρικής RNase P. Το ένζυμο καθαρίστηκε με τη χρήση κατιοντοανταλλακτικής χρωματογραφίας φωσφοκυτταρίνης και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες δραστικότητάς του.Μετά από μελέτη της επίδρασης των συνθετικών ρετινοϊδών και της νεομυκίνης Β στην δραστικότητα της RNase P, προέκυψε ότι και τα τρία προκαλούν μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της δραστικότητας της RNase Ρ των ανθρωπίνων λεμφοκυττάρων. Η διφωσφορική χλωροκίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της λεμφοκυτταρικής RNase P. Λεπτομερής κινητική ανάλυση έδειξε πως η αναστολή που προκαλείται από την ασιτρετίνη είναι συναγωνιστικού τύπου, ενώ αυτή από την νεομυκίνη Β είναι μη συναγωνιστικού τύπου.Η κινητική σταθερά Km της λεμφοκυτταρικής RNase P βρέθηκε ότι ισούται με 245 nM και η Vmax με 0.42 pmol/min. Συμπερασματικά, η απομόνωση της RNase P από ανθρώπινα περιφερικά λεμφοκύτταρα καθιστά δυνατή τη μελέτη της πιθανής ανάμιξης αυτού του ριβοενζύμου στους παθογενετικούς μηχανισμούς διαφόρων αυτοάνοσων, φλεγμονωδών και νεοπλασματικών δερματοπαθειών και μπορεί να διευκολύνει τη περαιτέρω ανάπτυξη της βασιζομένης στην RNase P τεχνολογίας για τη γονιδιακή θεραπεία δερματικών και μη παθήσεων. / Ribonuclease P (RNase P) is the enzyme responsible for the 5΄ maturation of the precursor tRNA molecules, participating in tRNA biogenesis and therefore in protein synthesis. It catalyses the endonucleolytic cleavage of a phosphodiester bond in the presence of Mg2+ and results in the production of molecules that bear 3΄ hydroxyl and 5΄ phosphoric ends. Most forms of RNase P are ribonucleoproteins consisting of an essential RNA and protein subunits. The RNA component of the bacterial RNase P was one of the first identified catalytic RNAs. So far, RNase P and the ribosome are the only ribozymes known to be conserved in all kingdoms of life (bacteria, archaea and eucarya). In view of the vital importance of lymphocytes for an effective immune system, we proceeded to the RNase P isolation from human peripheral lymphocytes. The enzyme was purified with cation exchange phosphocellulose chromatography and the optimal conditions were determined. Herein, it was investigated the effect of the synthetic retinoids (cis-retinoic acid and acitretin), neomycin B, as well as chloroquine diphosphate, on the RNase P activity. Cis-retinoic acid, acitretin and neomycin B exerted a dose-dependent inhibitory effect on RNase P activity from human lymphocytes, wlile the activity was not affected in the presence of chloroquine diphosphate. A detailed kinetic analysis showed that the inhibition caused by acitretin was of competitive type, whereas that caused by neomycin B was of noncompetitive type. The kinetic constant Km of RNase P activity isolated from lymphocytes for the tRNA maturation reaction has been estimated equal to 245 nM and the Vmax value has been estimated equal to 0.42 pmol/min. Finally, the isolation of RNase P from human peripheral lymphocytes will enable the study of the possible involvement of this ribozyme in the pathogenetic mechanisms of diverse autoimmune, inflammatory and neoplastic cutaneous disorders and may facilitate the further development of RNase P-based technology for gene therapy of infectious and neoplastic dermatoses.

Η παρεμπόδιση της μόλυνσης ενός κυττάρου από τον HIV επιτυγχάνεται ή με αναστολή της αλληλεπίδρασης της ιικής gp120 με τους CD4 υποδοχείς των κυττάρων, είτε παρεμποδίζοντας τη δράση της gp41 ή τέλος αποτρέποντας τη σύζευξη της gp120 με τους CXCR4 και CCR5 υποδοχείς των χημειοκινών. Ο ρόλος όμως των χημειοκινών και των υποδοχέων τους στη διαδικασία μετάδοσης σημάτων, μέσω των οποίων ενεργοποιούνται αποπτωτικοί μηχανισμοί υγιών, μη μολυσμένων από τον HIV κυττάρων, καθιστά την gp120-CCR5/CXCR4 αλληλεπίδραση ιδιαίτερα θελκτικό επιστημονικά στόχο για το σχεδιασμό αναστολέων του κύκλου αναπαραγωγής του ιού. Σύμφωνα με πλήθος ανοσολογικών, φυσικοχημικών και δομικών μελετών η PND V3 περιοχή της gp120 και το εξωκυττάριο αμινο-τελικό πεπτιδικό τμήμα του CCR5 συνυποδοχέα αποτελούν τις κυρίως εμπλεκόμενες περιοχές στην αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών. Η μεταβλητότητα της PND V3 ακολουθίας και ο συσχετισμός της με την υιοθετούμενη διαμόρφωση, η σύνδεση της θέσης και του είδους των αμινοξέων με την ένταση της αλληλεπίδρασης και η συνάρτηση του ιικού τροπισμού με τη βιολογικά ενεργή διαμόρφωση των πεπτιδίων αποτελούν θεμελιώδη στάδια στη διαδικασία κατανόησης του μηχανισμού αλληλεπίδρασης της gp120 με τον CCR5 κυτταρικό συνυποδοχέα και των παραγόντων που την καθορίζουν. Προς αυτή την κατεύθυνση εστιάστηκε και το ενδιαφέρον της διατριβής έχοντας ως πρωτογενείς στόχους την αποτίμηση των καθοριστικών παραγόντων της αλληλεπίδρασης χρησιμοποιώντας πεπτιδικά τμήματα των πρωτεϊνών, τον προσδιορισμό του είδους της και την επίλυση της δομής των συγκεκριμένων τμημάτων μέσω Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Όπως ήταν αναμενόμενο για ελεύθερα, μικρά σε μέγεθος μόρια που είναι διαλυμένα σε νερό, τα PND V3 πεπτίδα εμφάνισαν την ιδιότητα της διαμορφωτικής ελευθερίας αλλά παρουσίασαν σημαντικό αριθμό NOE συζεύξεων, γεγονός το οποίο επέτρεψε τη σύγκλισή τους προς μία συγκεκριμένη διαμόρφωση. Η διαμόρφωση τύπου U, η οποία είχε παρατηρηθεί στις κρυσταλλικές δομές συμπλόκων της gp120, διατηρείται ανεξαρτήτως της παρουσίας του CCR5. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων της φασματοσκοπίας NMR υποδεικνύουν την ύπαρξη ασθενούς ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης μεταξύ των PND V3 πεπτιδίων και του CCR5Nt. Η συμμετοχή των πεπτιδικών τμημάτων του CCR5Nt στην αλληλεπίδραση αυξάνει προοδευτικά και φαίνεται να είναι ανάλογη του αριθμού των θετικά φορτισμένων αμινοξέων της ακολουθίας των PND V3 πεπτιδίων και προφανέστατα εξαρτώμενη από την κατιονική τους δύναμη. Τα συμπεράσματα της διατριβής σε συνδυασμό με εκείνα που παράγονται από πλήθος βιολογικών, βιοχημικών και φυσικοχημικών μελετών παράγουν νέα δεδομένα, τα οποία δύναται να χρησιμοποιηθούν στον ορθολογικό σχεδιασμό αναστολέων με αυξημένη συγγένεια δέσμευσης στον συνυποδοχέα CCR5. / The obstruction of a cell infection by HIV is succeeded either by inhibiting the interaction between the viral gp120 and the CD4 cell receptors or by preventing the gp41 action and deterring the conjuction of gp120 with the CXCR4 and CCR5 chemokine receptors. The role that chemokines and their receptors play at the process of signal transmission, through which the apoptotic mechanisms of non HIV infected cells are activated, appoints the gp120-CCR5/CXCR4 interaction as a highly attractive scientific target for the design of HIV-1 life cycle inhibitors. According to numerous immunological, physicochemical and structural studies the PND V3 region of gp120 and the extracellular N-terminal peptide fragment of CCR5 coreceptor constiture the primary regions that are involved in the interactions of occurring between the two proteins. The sequence variation of the PND V3 region and its correlation with the adopted conformation, the dependence of the position and type of amino-acid with the intensity of the interaction and the linkage of viral tropism with the peptides biologically active conformation comprise fundamental stages in the process of understanding the mechanism of gp120 – CCR5 interaction and the elements that designate it. The thesis interest was oriented towards this direction while its primary targets were the evaluation of the interaction determinants by using peptide fragments, the designation of the interaction type and the calculation of the specific peptides structures through the use of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. As expected for free peptides in solution, the peptides representing the PND V3 region of gp120 exhibit conformational flexibility, but they exhibited a large number of NOEs which allowed convergence to a specific conformation. The PND V3 peptides retain the U-turn conformation observed in the crystal structures of gp120 complexes independently of CCR5 presence. The interaction of different regions of the CCR5Nt peptide is gradually increasing proportionally to the positive charge increase in the V3 peptides. The data demonstrate that the PND V3 and CCR5Nt peptide sequences have propensities for interaction and that their binding and selectivity is determined by simple electrostatic attraction mechanisms. The thesis conclusions combined to those extracted by many biological, biochemical and physicochemical studies bring forth new data that can be used in the rational design of inhibitors that will exhibit increased binding affinity for CCR5 co-receptor.

Le virus de l'hépatite B (HBV) infecte chroniquement plus de 250 millions de personnes. Des traitements existent permettant de contrôler la production de particules infectieuses. Cependant, aucun des traitements actuels ne permet d'éradiquer complètement l'infection. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, incluant des approches immunothérapeutiques pour permettre un meilleur contrôle immunologique des infections HBV. Dans une étude récente menée au sein du laboratoire, il a été montré que l'IL-1ß est la cytokine ayant le plus fort effet antiviral contre la réplication d'HBV dans les hépatocytes. Dans le foie, la cytokine IL-1ß est principalement produite par les macrophages résidents (les cellules de Kupffer) ou infiltrant (monocytes inflammatoires différenciés en macrophages). De nombreuses études récentes ont montrés qu'HBV était capable de bloquer partiellement l'induction des réponses immunitaires innées. Il est donc important de déterminer si HBV est capable d'empêcher la production d'IL-1ß par les différents types de macrophages. L'objectif de cette thèse était d'étudier l'effet du virus sur le phénotype des macrophages et les implications de ces modifications phénotypiques sur l'établissement de l'infection dans les hépatocytes. Des monocytes du sang ou des macrophages du foie ont été purifiés, respectivement, du sang périphérique ou de résections hépatiques, et ont été exposés au virus pendant leur différentiation et/ou leur activation pour les monocytes, ou seulement pendant leur activation pour les macrophages hépatiques déjà différenciés. Il a été démontré que le virus de l'hépatite B est capable d'inhiber la sécrétion d'IL-6 et d'IL-1ß par les macrophages pro-inflammatoires. De plus, HBV est capable d'inhiber la sécrétion d'IL-1ß par les macrophages hépatiques stimulés par différents ligands. Finalement, les surnageants de macrophages pro-inflammatoires sont capables de bloquer l'établissement de l'infection, ce qui n'est pas le cas quand les macrophages ont été exposés au virus. Il apparait donc qu'HBV est capable de modifier le phénotype des macrophages pour favoriser l'établissement et la persistance de l'infection. La compréhension des mécanismes de subversion du phénotype des macrophages par le virus de l'hépatite B serait un premier pas vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques / Hepatitis B virus (HBV) chronically infects over 250 million people worldwide. Several treatments can be used to prevent the formation of de novo particles. However, they do not allow the total eradication of the infection. Therefore, it is necessary to develop new therapeutic strategies, including immune-therapeutic ones, which would be more likely to lead to an immunological control of HBV infections. We have recently shown that IL-1ß is the most effective antiviral cytokine against the replication of HBV in vitro. In the liver, IL-1ß is mainly produced by resident macrophages (also called Kupffer cells) or infiltrating cells (inflammatory monocytes differentiated into macrophages). Recent studies have shown that HBV is able to partially inhibit the induction of innate immune responses. Hence, it was necessary to determine if HBV was also able to block the production of IL-1ß by the different types of macrophages.The objective of this thesis was to study the effect of HBV on macrophage phenotypes and the impact of those modifications on the establishment of HBV infection in hepatocytes.Blood monocytes and liver macrophages were purified, respectively, from peripheral blood or hepatic resections, and were exposed to HBV during their differentiation and/or activation for monocytes, or only during activation for liver macrophages which are already in a differentiated state. HBV was able to partially inhibit the secretion of IL-6 and IL-1ß by pro-inflammatory macrophages. Moreover, HBV was able to inhibit IL-1ß secretion by liver macrophages stimulated by different ligands and, conditioned medium of pro-inflammatory macrophages could inhibit the establishment of infection in hepatocytes. This effect was reverted when macrophages were exposed to HBV, concomitantly with a lower production of IL-6 and IL-1ß.In summary, HBV is able to modify macrophage phenotypes to favour the establishment and persistence of HBV infection. The full understanding of the mechanistic basis of how HBV phenotypically modifies macrophages will be a first step towards the development of new therapeutic strategies

De études récentes suggèrent une forte relation entre susceptibilité au paludisme et réponse allergique. Des niveaux élevés d’histamine plasmatique et tissulaire ont été associés à la sévérité de la maladie chez l’homme infecté par P. falciparum et dans de nombreux modèles animaux. Histamine releasing factor (HRF), une protéine pro-inflammatoire libérant l'histamine au cours des processus allergiques, est produite par le parasite au cours des infections palustres modérées et sévères, suggérant l’implication du HRF dans l’altération des réponses immunitaires et dans la pathogenèse. Les objectifs de ce travail consistaient à évaluer le rôle de la protéine parasitaire HRF dans le développement de la réponse immunitaire et à déterminer si son expression est associée à la sévérité de la maladie en étudiant deux parasites murins, PbANKA et PbNK65, déficients pour la protéine HRF (hrfΔ). Les souris infectées avec des sporozoïtes PbANKA-hrfΔ ont montré une diminution de la fréquence du neuropaludisme associée à un déficit du développement des parasites mutants au cours du stade hépatique et à une augmentation précoce systémique d’IL-6. En outre, l'infection par les parasites PbNK65-hrfΔ est caractérisée par l’élimination du parasite conduisant à une protection durable et au développement d’une mémoire immunitaire caractérisée par une augmentation d’IL-6, une diminution de l’expression de PD-1 sur les cellules T et une amélioration de la phagocytose dépendante des anticorps, confirmant l'importance de la protéine HRF dans la virulence du parasite. HRF est le premier gène de parasite Plasmodium dont l’effet direct sur la réponse immunitaire de l’hôte est démontré. / Recent findings have raised the hypothesis that clinical susceptibility to malaria may be related to allergy-type response. In human infection with P. falciparum, as well as in murine models of malaria, increased levels of histamine have been shown to be associated with disease severity. Histamine releasing factor (HRF), shown to be implicated in the release of pro-inflammatory histamine during late-phase allergy, was demonstrated to be produced by the parasite during mild and severe malaria infections suggesting that Plasmodium HRF may affect host immune responses and contributes to the pathogenesis. The objectives of this work were to evaluate the role of Plasmodium HRF in the development of the immune response and to determine whether its expression is associated with the severity of malaria disease by studying two HRF-deficient (hrfΔ) murine parasites (PbANKA and PbNK65). Infection with PbANKA-hrfΔ sporozoites showed a decrease in the frequency of ECM due to the impairment of the development of the mutant parasites in liver stages as a consequence of the up-regulation of IL-6. Infection with PbNK65-hrfΔ parasites confirmed the importance of HRF in enhancing the virulence of the parasite. Indeed, PbNK65-hrfΔ infection results in parasite clearance leading to a long-lasting protection and immune memory as reflected by an up-regulation of IL-6, a down-regulation of PD-1 expression on T cells and in the enhancement of Ab-mediated phagocytosis. HRF is the first parasite gene which directly modulates the host immune response.

La dermatite atopique est une maladie inflammatoire cutanée caractérisée par le recrutement de nombreuses cellules inflammatoires, y compris les cellules T CD4+ detype 2, les éosinophiles et les cellules dendritiques. Les chimiokines et leurs récepteurs jouent un rôle central dans le trafic des globules blancs de la circulation sanguine vers la peau enflammée. Deux chimiokines, CCL17/TARC (thymus and activation-regulated chemokine) et CCL22/MDC (macrophage-derived chemokine) présentent un intérêt dans l'inflammation cutanée, puisqu’elles attirent principalement les lymphocytes T de type 2 exprimant le récepteur CCR4. Compte tenu du rôle de l'axe CCL17/CCL22/CCR4 dans le développement de la dermatite atopique, nous cherchons à identifier des petites molécules chimiques, appelées aussi "neutraligands", ciblant CCL17 ou CCL22. Par analogie aux anticorps neutralisants,ces molécules se fixent aux chimiokines et neutralisent leurs fonctions biologiques.Nous avons mis en place un essai de criblage à haut débit basé sur la détection de la mobilisation du calcium intracellulaire induite par CCL17 ou CCL22, et nous avons testé une collection de substances naturelles. Deux “touches”, GPN279 et GPN136,bloquent respectivement les réponses calciques induites par CCL17 et CCL22. Ces deux composés ne sont pas des antagonistes du récepteur CCR4 puisque leur préincubation avec le récepteur n'a pas inhibé les réponses calciques par CCL17 ouCCL22. Nous avons également évalué l'activité in vivo de GPN279 et GPN136 dans un modèle murin de dermatite atopique. Ces deux composés diminuent la rougeur,l'épaisseur des oreilles, l’expression des cytokines Th2 et le taux des IgE plasmatiques. En conclusion, nos résultats montrent que les neutraligands présentent un potentiel pour contrôler l’inflammation de type Th2. Ils nous aideront à mieux comprendre le rôle des chimiokines dans la dermatite atopique. / Atopic dermatitis is an inflammatory skin disease characterized by the recruitment of many inflammatory cells, including CD4+T helper 2 cells, eosinophils et dendritic cells.Chemokines and their receptors are believed to be essential for leukocyte traffickingfrom the circulation into the enflamed skin. Two chemokines, thymus and activation regulated chemokine (TARC/CCL17) and macrophage-derived chemokine(MDC/CCL22) may be of interest in skin inflammation, because they mainly attract Tcells expressing the chemokines receptor CCR4 preferentially expressed on T helper2 cells. Considering the role of CCL17/CCL22/CCR4 axis in the development of atopic dermatitis, we aim at the identification of small compounds called “neutraligands”targeting CCL17 or CCL22. By analogy to neutralizing antibodies, these molecules bind to chemokines (and not to the receptors) and neutralize their biological functions.So, we have set up a high-through put assay based on the intracellular Ca2+ increase upon activation with CCL17 or CCL22, and we screened the natural substance library. Two hit compounds, GPN279 and GPN136, blocked CCL17 and CCL22-induced Ca2+responses, respectively. The compounds did not block the CCR4 receptor since their preincubation with the receptor did not affect the Ca2+ response. Then, we evaluated the in vivo activity of GPN279 and GPN136 in a mouse model of atopic dermatitis. We show that both compounds prevented ear redness and thickness and decreased Th2-related cytokines as well as plasma IgE in a MC903-induced atopic dermatitis model. Altogether, our results show successful control of Th2 inflammation with the CCL17and CCL22 neutraligands. These new pharmacological tools will help us to better understand the role of chemokines in the pathogenesis of atopic dermatitis.

L'inflammation allergique de la peau est un état dans lequel l'hôte réagit de manière excessive à des allergènes en induisant une inflammation de type Th2. Un certain nombre d’acteurs cellulaires et moléculaires ont été impliqués dans cette pathologie, mais la façon dont ils agissent dans le réseau inflammatoire demeure largement inconnue. Les basophiles ont été reconnus pour leurs fonctions effectrices en allergie, cependant, comment ils sont recrutés et activés, ainsi que comment ils interagissent avec d'autres cellules dans l’inflammation allergique cutanée demeurent mal caractérisés. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier le recrutement, l'activation et la fonction des basophiles dans le réseau inflammatoire de la peau allergique. En employant un modèle expérimental murin de dermatite de contact allergique, combiné à des outils génétique de souris, d’immunologie et d’approches biologiques cellulaires/moléculaires, l’étude de ma thèse a démontré que l’IL-3 joue un rôle crucial dans l’extravasation des basophiles dans la peau allergique des souris (Partie I), et que l’invalidation des basophiles chez les souris Mcpt8DTR entraîne une réduction systémique des éosinophiles et des neutrophiles (Partie II). Ces études fournissent ainsi de nouvelles connaissances sur le recrutement, l'activation et la fonction des basophiles dans l'inflammation allergique de la peau. / Allergic skin inflammation is a state in which the host overreacts to otherwise innocuous allergens by inducing T helper type 2 inflammation. A number of cellular and molecular players have been implicated in the generation of allergic skin inflammation, but how they act and crosstalk in the inflammatory network remains largely unknown. Basophils have been recognized for their effector functions in allergy, however, how they are recruited to the inflamed tissue, get activated and crosstalk with other cells in inflammatory skin remain still incompletely understood. The objective of this PhD study is to investigate the recruitment, activation and function of basophils in the inflammatory network of allergic skin. Using experimental mouse model for allergic contact dermatitis, combined with mouse genetic tools, immunology and cellular/molecular biology approaches, the study of my thesis discovered that IL-3 plays a crucial role in basophil extravasation to mouse allergic skin (Part I), and that the depletion of basophils in Mcpt8DTR mice leads to a systemic reduction of eosinophils and neutrophils (Part II). These studies provide novel insights into the recruitment, activation and function of basophils in allergic skin inflammation.

Les immunoglobulines circulantes jouent un rôle critique dans l’homéostasie immune en modulant les fonctions des cellules du système immunitaire. Au cours de ma thèse, j’ai exploré les effets régulateurs des immunoglobulines G thérapeutiques (IVIG) et des immunoglobulines A monomériques circulantes (mIgA) sur l’autophagie et les réponses Th17 respectivement. Les IVIg sont une préparation thérapeutique d’IgG normales poolées. Elles ont utilisées comme agent anti-inflammatoire dans le traitement de maladies auto-immunes et inflammatoires variées. Cependant, les mécanismes ne sont pas complètement élucidés et plusieurs mécanismes mutuels et non exclusifs ont été proposés. L’autophagie est un important processus biologique impliquant la dégradation lysosomale des composants cellulaires endommagés et des protéines mal repliées. Il y a plusieurs preuves montrant l’implication de l’autophagie dans les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires incluant la découverte de polymorphismes dans des gènes liés à l’autophagie. J’ai montré que l’induction de l’autophagie par les IVIG représente un nouveau mécanisme d’action permettant leur effet thérapeutique dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Les Th17 représentent une cible attractive pour traiter plusieurs maladies inflammatoires et auto-immunes. Malgré le fait qu’elles sont le deuxième anticorps le plus abondant dans la circulation, la function immunorégulatrice des IgA n’est relativement pas explorée. J’ai montré que les IgA monomériques (mIgA) inhibent la différentiation et l’amplification des cellules Th17 humaines et la production de leur cytokine effectrice IL-17A. / Circulating immunoglobulins play a critical role in the immune homeostasis by modulating the functions of immune cells. In my thesis, I investigated the regulatory effects of therapeutic immunoglobulin G (IVIG) and circulating monomeric immunoglobulin A (mIgA) on autophagy and human Th17 response respectively. IVIG is a therapeutic preparation of pooled normal IgG. It is used as an anti-inflammatory agent in the treatment of a wide variety of autoimmune and inflammatory diseases. However, the mechanisms are not yet fully elucidated and several mutually non-exclusive mechanisms have been proposed. Autophagy is an important biological process involving lysosomal degradation of damaged cellular components and misfolded proteins. There are several evidences that support the involvement of autophagy in autoimmune and auto- inflammatory disorders including the discovery of polymorphisms in autophagy-related genes. I show that induction of autophagy by IVIG represents a novel mechanism of action in achieving therapeutic effect in autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells represent an attractive target to treat several inflammatory and autoimmune diseases. Despite being second most abundant antibody in the circulation, the immunoregulatory function of IgA is relatively unexplored. I have shown that monomeric IgA (mIgA) inhibits differentiation and amplification of human Th17 cells and the production of their effector cytokine IL-17A.

Les maladies allergiques sont devenues un enjeu de santé publique majeur en raison d’une prévalence en constante augmentation ces dernières années, d’un risque accru de choc anaphylactique et de l’absence de traitement curatif existant. Les allergies alimentaires sont caractérisées par une évolution fréquente vers le choc anaphylactique. Les lymphocytes T régulateurs (Treg), cellules permettant le maintien de l’homéostasie immunitaire et le contrôle des réponses, sont au centre du processus de régulation des réponses allergiques. Il a été démontré qu’il existait un déficit quantitatif et qualitatif de ces cellules chez les patients allergiques et que les manifestations allergiques étaient exacerbées en l’absence de Treg. L’induction, in vivo, de ces cellules semble donc être une alternative thérapeutique prometteuse afin de prévenir et traiter les maladies allergiques en particulier, l’allergie alimentaire. L’interleukine-2 (IL-2), cytokine du système immunitaire permettant la survie, l’expansion et la différenciation des lymphocytes, notamment les Tregs lorsqu’elle est utilisée à faible dose, constitue une avancée thérapeutique majeure. L’objectif de cette thèse a été d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’IL-2 faible dose dans l’allergie alimentaire. L'IL-2 faible dose induit l’expansion et l’activation de Treg permettant la mise en place d’une protection contre les manifestations cliniques d'allergie alimentaire dans deux modèles de souris avec l'ovalbumine et l'arachide. L’abolition de cet effet clinique chez les souris dont les Treg ont été éliminés démontre la contribution majeure des Treg dans l'efficacité de la thérapie IL-2. Les mécanismes associés à la protection peuvent être corrélés à une modification locale de la balance Th1 / Th2 et une inhibition du recrutement et de l'activation des mastocytes. Nous avons démontré que l’IL-2 induit une protection clinique durable, supérieure à 7 mois, aussi bien lorsqu’elle est administrée de façon préventive (avant la phase de sensibilisation), que curative (après la sensibilisation ou le déclenchement de l’allergie). Cette protection à long terme est également dépendante des Treg dans la mesure où leur déplétion entraine la perte de protection de souris. Ces résultats, combinés à l’absence visible d’augmentation des Treg en fin de protocole, nous ont conduits à caractériser les mécanismes immunorégulateurs inhérents à ce contrôle effectif à distance et sur le long terme après traitement, en analysant notamment les sous populations de cellules régulatrices particulièrement efficace pour contrôler les réponses allergiques. Les résultats préliminaires obtenus, qu’il conviendra de reproduire, ne nous permettent pas de conclure clairement quant à la sélection des Treg spécifiques de l’allergène, ou de sous population de Treg, réputées protectrices dans l’allergie. Toutefois, nos résultats constituent la preuve de concept de l’utilisation de l’IL-2 faible dose dans l’allergie alimentaire. De même l’IL-2 a également montré son efficacité dans un modèle murin d’allergie respiratoire (ovalbumine). Nous avons aussi démontré que des voies d’administration alternatives étaient possibles, notamment la voie orale. De ce fait, un essai clinique de phase II testant l’administration d’IL-2 faible dose dans la rhinoconjonctivite va prochainement être mise en place par notre centre d’investigation clinique. Ainsi, nous espérons développer une nouvelle biothérapie, sûre, efficace et peu coûteuse, dans la prise en charge thérapeutique des allergies. / Regulatory T cells (Treg) are pivotal for maintenance of immune self-tolerance, and also regulate immune responses to exogenous antigens, including allergens. Both decreased Treg number and function have been reported in allergic patients, offering new therapeutic perspectives. The in vivo induction of these cells therefore, appears to be a promising therapeutic option in order to prevent and treat allergic diseases in particular, food allergy. Interleukin-2 (IL-2), allowing the survival, expansion and differentiation of lymphocytes, especially Treg when used at low doses, is a major therapeutic advance. Here, we evaluated the ability of low dose IL-2 (intraperitoneal route to control) allergy in an experimental model of food allergy. Low dose IL-2 (ld-IL-2) induced Treg expansion and activation that elicited protection against clinical manifestations of food allergy in two mouse models with ovalbumin and peanut. This clinical effect was lost in Treg-depleted mice demonstrating the major contribution of Treg in ld-IL-2 efficacy. Also, protection from allergy could be explained by a Treg-dependent local modification of the Th1/Th2 balance and an inhibition of mast cell recruitment and activation. Then, preventive and therapeutic effects of ld-IL-2 were observed over a 7-month period, highlighting its long-term efficacy. This long-term protection is also dependent on Treg insofar as their depletion results in the loss of protection of mice. These results, with the loss of increase of Treg at the end of the protocol, led us to better characterize the immunoregulatory mechanisms involved in the ld-IL2 long term efficacy, in particular by analyzing subpopulations of Treg particularly effective in controlling allergic responses. The preliminary results obtained, which should be reproduced, do not allow us to conclude clearly to the selection of allergen-specific Treg, or Treg subpopulation involved in the regulation of allergic responses. However, our results demonstrate the proof of concept of the use of low-dose IL-2 in food allergy. Similarly IL-2 has also shown its efficacy in a mouse model of asthma (ovalbumin). Alternative routes of administration were also demonstrated, including oral route. As a result, a clinical trial testing low-dose IL-2 in rhinoconjunctivitis will soon be initiated by our center. The present data show for the first time the therapeutic potential of ld-IL-2 for the treatment of food allergy, and should prompt hope, in the therapeutic management of allergies. Patients will be offered the first curative treatment developed in food allergies to improve their quality of life. Keywords: Allergy, Interleukin 2, biotherapy, therapeutic option, allergen-specific Treg, peripheral Treg.

L’ischémie reperfusion pulmonaire et sa traduction clinique la dysfonction primaire du greffon sont responsables d’une morbi-mortalité importante en transplantation pulmonaire aussi bien à court terme qu’à long terme. Nous avons voulu faire la démonstration de la pertinence des microparticules comme marqueur de l’ischémie reperfusion pulmonaire. Nous avons reproduit et validé la stabilité d’un modèle de perfusion ventilation ex vivo de poumon de rat aussi bien en conditions normales (pas d’ischémie pulmonaire avant reperfusion) qu’en conditions extrêmes (1 h d’ischémie chaude avant reperfusion pulmonaire). Nous avons étudié la génération de microparticules par des poumons soumis à des conditions variables d’ischémie froide et d’ischémie chaude. Les poumons soumis à de fortes conditions d’ischémie froide (20h) produisent un pic précoce de microparticules d’origine épithéliale alvéolaire, leucocytaire et endothéliale. Nous en concluons que le modèle de perfusion ventilation ex vivo de poumons de rats est un modèle pertinent pour l’étude des réactions d’ischémie reperfusion. Les microparticules apparaissent comme un marqueur précoce des lésions d’ischémie reperfusion pulmonaires dans ce modèle. / Lung ischemia reperfusion and its clinical expression as primary graft dysfunction are provider of immediate and long term morbidity and mortality for patients. We aimed at demonstrating the usefulness and relevance of microparticles as biomarkers for lung ischemia reperfusion injury. We first reproduced an ex vivo rat lung perfusion and ventilation experimental model. Stability of the model was validated for normal conditions (no ischemia before reperfusion) as well as for extreme conditions (1 hour warm ischemia before reperfusion). The generation of microparticles was studied in that model for variable conditions of cold ischemia and for warm ischemia. Lung submitted to strong ischemic injury (20hours cold ischemia) generate an early pike of microparticles originated from leukocyes, endothelial cells, and epithelial alveolar cells. We may conclude the ex vivo model of rat lung perfusion and ventilation is relevant for the study of lung ischemia reperfusion injury. Microparticles are relevant markers of rat lung ischemia reperfusion injury in our model.

Le facteur de transcription Ikaros est un régulateur essentiel de la lymphopoïèse. Ikaros est nécessaire à la différenciation des lymphocytes B et joue aussi un rôle important dans la suppression des LAL-T. Contrairement aux souris mutantes nulles pour Ikaros, les souris mutantes hypomorphes IkL/L développent des lymphocytes B matures après la naissance. Avec l’âge, toutes les souris IkL/L développent des leucémies T Notch dépendantes avec des mutations similaires à celles trouvées chez les patients atteints de LAL-T. La souris IkL/L est donc un excellent modèle pour étudier l’activation des cellules B matures et la pathogenèsedes LAL-T. Nous avons montré que la délétion spécifique du promoteur et de l’exon 1 de Notch1 dans les cellules T conduit à l’activation de promoteurs cryptiques dans la région 3’ du gène, qui génèrent des transcrits codant pour des protéines Notch1 constitutivement actives qui accélèrent la leucémogenèse dans la souris IkL/L. De plus, nous mettrons en évidence l’existence de cellules initiatrices de leucémie dans les tumeurs IkL/L puisque nous avons trouvé que des cellules ayant la capacité de s’auto-renouveler représentent 1 sur 500. Enfin, nous avons montré que les cellules B IkL/L ont une activation excessive d’ERK et dep38 après la stimulation du BCR, ce qui résulte en une hyper-prolifération et une production d’autoanticorps liés au lupus systémique érythémateux. Nos résultats suggèrent qu’Ikaros est un régulateur négatif de l’activation des lymphocytes B. / The Ikaros transcription factor is a critical regulator of lymphopoeisis. Ikaros is needed for the differentiation of B cell and plays an important role in tumor suppression in T cells. Contrary to the other Ikaros targeted mutant mice, the IkL/L mouse develops mature B cells after birth. With age, it develops Notch dependent tumors with similar mutations as thosefound in human T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Thus, the IkL/L mouse is an excellent model to study mature B cell activation and T-ALL tumor development. Here, we have shown that the deletion of the promoter and exon1 of the Notch1 gene in IkL/L T cells activates a cryptic promoter in the 3’ region which leads to the production of truncated, constitutively activated Notch1 proteins that accelerate tumorigenesis in the IkL/L mice. Moreover, we give evidence for the existence of LICs in the IkL/L tumors as we have found a specific subpopulation of cells with a frequency of 1 in 500 which show self-renewal capacity. In addition, we demonstrated that some tumor cells have the ability to efflux the Hoechst dye and that this side population is enriched in quiescent cells. Finally, we elucidate that IkL/L B cells display an enhanced activation of ERK and p38 after BCR stimulation that results in hyper-proliferation and the production of autoantibodies relatedto systemic lupus erythematosus (SLE). Our results suggest that Ikaros is a negative regulator of B cell activation.