L’efficacité de la réponse immunitaire adaptative repose tout particulièrement sur la motilité des lymphocytes T naïfs entre la circulation sanguine et les organes lymphoïdes secondaires, leur permettant ainsi de rencontrer un antigène spécifique. De nombreuses voies de signalisation sont impliquées dans ce phénomène. En particulier, les Rho GTPases y jouent un rôle central, par leur capacité à moduler le cytosquelette d’actine. Nous avons identifié la protéine Fam65b comme nouveau régulateur de la circulation des lymphocytes T. En effet, nous avons montré que la diminution de l’expression de Fam65b dans des LT primaires humains induit une augmentation de leur polarisation, leur adhésion et leur migration in vitro. Afin d’étudier son rôle dans un contexte plus physiologique, nous avons développé au laboratoire une souris Fam65b-/-, dans laquelle l’expression de Fam65b est supprimée dans le lignage T. Les lymphocytes T issus de ces souris présentent un contenu global en F-actine réduit, une plus grande quantité de L-sélectine et d’intégrines actives à leur surface, et une migration moins rapide et moins rectiligne que leurs équivalents WT. Nous n’avons pu observer, avec nos méthodes, aucune différence significative de polarisation, de migration in vitro ou d’entrée dans les organes lymphoïdes secondaires pour les LT Fam65b-/-. Nous avons identifié les Rho GTPases comme médiateurs de ces effets de Fam65b. Nous avons observé, en cytométrie de flux, que les niveaux de RhoA-GTP et de Rac-GTP sont plus élevés dans les LT murins Fam65b-/-, et que cela est aussi vrai pour RhoA-GTP dans les LT humains exprimant de faibles niveaux de Fam65b. Nous avons identifié, dans des expériences in vitro, le mécanisme par lequel Fam65b inhibe l’activité de RhoA, puisqu’il ralentit sa charge en GTP par les protéines GEF. Nous avons montré, par des techniques de biochimie, que l’activation de RhoA en aval d’une stimulation chimiokine est permise par la dissociation de RhoA et de Fam65b, probable conséquence de la phosphorylation de Fam65b. Cette dissociation a aussi été observée pour Fam65b et Rac1, mais les mécanismes mis en jeu restent à déterminer. D’autre part, l’expression de Fam65b est sous le contrôle du facteur de transcription FOXO1, connu pour son rôle dans le contrôle de l’écotaxie (homing) via la régulation de l’expression de molécules permettant l’entrée dans les ganglions lymphatiques. Fam65b, régulateur atypique de l’activité des Rho GTPases, représente donc un lien inédit entre la voie PI3K/FOXO1 et les Rho GTPases. / The motility of naive T lymphocytes between the blood and secondary lymphoid organs is essential to the efficiency of the adaptative immune response, and allows those cells to meet their cognate antigen. Numerous signaling pathways are involved in this phenomenon, such as Rho GTPases, modulators of the actin cytoskeleton. We have identified Fam65b as a new regulator of T lymphocytes recirculation. We have shown that a decrease of Fam65b expression in human primary T cells increases the morphological polarization, the adhesion and the in vitro migration of those cells. Looking for a more physiological model, we developed, in the lab, a Fam65b KO (Knock-Out) mouse, specific to the T lineage. In those animals, T cells showed decreased levels of F-actin, an increase in the display of L-selectin and integrins, and a slower and less straight migration, compared to WT (Wild-Type) T cells. On the other hand, we weren't able to see any significant differences in the morphological polarisation, the in vitro migration or the homing capacity of the Fam65b KO T cells. We have identified Rho GTPases as mediators of the effects of Fam65b. We showed, in flow cytometry, that the amount of RhoA-GTP and Rac-GTP are increased in the Fam65b KO cells. The RhoA-GTP levels are also increased in human primary T cells expressing low levels of Fam65b. We have identified, in in vitro experiments, that Fam65b slows down RhoA loading with GTP by its GEF proteins, thus inhibiting RhoA activity. Moreover, we showed that Fam65b dissociates from RhoA after chemokine stimulation of T cells, thus allowing RhoA activation. The phosphorylation of Fam65b is a probable cause to this phenomenon. Fam65b also dissociates from Rac1 in these conditions, although no mechanism is yet known. Furthermore, the transcription factor FOXO1 controls the expression of Fam65b. FOXO1 is also known to control the homing capacity of T cells, since it controls the expression of molecules involved in the entry of lymphocytes in the lymph nodes. Fam65b, an atypical regulator of Rho GTPases activity, thus represents a new connection between the PI3K/FOXO1 and the Rho GTPases pathways.

Les microARNs (miARN) sont de petits ARN régulant l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Ils sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques nécessaires au fonctionnement cellulaire, comme le contrôle de la réponse à l’inflammation. Dans ce travail, nous avons évalué l’implication des miARN dans la réponse tubulaire rénale à l’inflammation. Au cours d’un premier travail nous avons étudié par une approche globale le profil d’expression des miARN dans des cellules tubulaires proximales de la lignée HKJ2 exposées à des cytokines pro-inflammatoires. Nous avons ainsi identifié la forte induction de miR-146a en réponse au stimulus inflammatoire. Nous avons ensuite mis en évidence in vitro que l’induction de miR-146a par l’IL-1β dans les cellules HK-2 est secondaire à l’activation de la voie NF-κB, constitue un rétrocontrôle négatif de cette voie et régule l’expression de CXCL8 en aval. In vivo, l’étude du phénotype des souris invalidées pour miR-146a dans un modèle d’agression tubulaire rénale où l’inflammation joue un rôle significatif a mis en évidence une aggravation des lésions tubulaires, de l’infiltrat inflammatoire et de la fibrose interstitielle en réponse à l’ischémie-reperfusion. Le blocage de la signalisation induite par CXCL8 par la réparixine, un inhibiteur du récepteur de CXCL8 (CXCR1), permet de limiter le développement des lésions induites par l’ischémie-reperfusion chez les souris miR-146a-/-. Dans un second travail nous avons exploré le phénotype rénal des souris invalidées pour miR-146a, connues pour développer une auto-immunité. / Independently of its cause, acute kidney injury leads to the development of tubular injury and interstitial inflammation that need to be controlled to avoid fibrosis development. We hypothesized that microRNAs (miRNAs) are involved in the regulation of the balance between lesions and adaptive repair. Using HK2 human proximal tubular epithelial cells, we studied in vitro the response to pro-inflammatory cytokines and the regulation of miR-146a. We explored its targets in HK2 cells after stimulation by IL-1β. In vivo we explored the effect of unilateral renal ischemia-reperfusion injury (IRI) in wild-type or miR-146a invalidated mice. In pro-inflammatory conditions, we identified miR-146a to be transcriptionally upregulated by ligands of the interleukin-1-toll-like receptor signaling in HK2 cells. IL-1β treatment induced miR-146a expression in a time- and concentration-dependent manner through the activation of NF-κB, as confirmed by siRNA and luciferase reporter vector experiments. MiR-146a acted as a negative feedback regulator of this critical pathway by targeting IRAK1, thus decreasing CXCL8/CXCL1 expression by injured tubular cells. In vivo, miR-146a was found to be induced in response to renal IRI in a mouse model of renal unilateral IRI seven days after the injury. In human, miR-146a was found to be induced in the renal allograft of patients who experienced acute tubular necrosis early after transplantation as compared to patients with normal allograft biopsy results (P<0.05). Mir-146a levels were also increased in urine samples collected ten days after renal transplantation in recipients of a deceased donor kidney as compared to recipients of a living donor kidney (P<0.01). In situ hybridization localized up-regulated miR-146a mostly in tubular cells after IRI. Fourteen days after unilateral IRI, miR-146a-/- mice had greater tubular injury, inflammatory infiltrate and fibrosis compared with wild-type mice. Inhibition of the CXCL8/CXCL1 signaling using reparixin, a CXCR2 inhibitor, prevented the development of tubular injury, inflammation and fibrosis after IRI in miR-146a-/- mice. In conclusion, these results highlight miR-146a as a key mediator of the renal response to injury by limiting the consequences of inflammation, a key process in the development of acute and chronic kidney diseases.

Le Lupus est une maladie systémique auto-immune complexe, caractérisée notamment par la perte de tolérance vis-à-vis d’antigènes nucléaires, qui affecte majoritairement les femmes à l’âge adulte. Cette maladie est hétérogène tant du point de vue clinique que génétique, ce qui a considérablement limité les progrès dans la compréhension de sa pathogénèse. Dans ce projet, nous avons mis à profit la technologie de séquençage de nouvelle génération de type « Whole Exome Sequencing (WES)» pour explorer la génétique du Lupus à l’échelle de familles individuelles. De plus, nous avons centré notre étude sur des formes à début pédiatrique qui sont cliniquement plus sévères que les formes adultes. Nous avons fait l’hypothèse que ce sous-groupe de patients devrait être enrichi en formes monogéniques. Nous avons ainsi inclus dans cette étude des cas familiaux de lupus ou des familles dans lesquelles il existait un patient lupique et des apparentés atteints de pathologies auto-immunes. Un séquençage WES a été réalisé dans ces familles et la validation des gènes identifiés par cette stratégie a fait l’objet de ce travail. Nous avons découvert une mutation hétérozygote gain de fonction du gène TMEM173 qui code STING, un adaptateur clé dans la signalisation de la détection des ADNs cytosoliques et la production d’interféron de type-I (IFN-I). Quatre membres de cette famille porteurs de la mutation présentent une pathologie auto-inflammatoire et auto-immune, dont un cas de Lupus, avec une expression clinique hautement variable. Une modélisation structurale in silico de la forme mutée prédisait initialement une stabilisation de la forme dimérique de STING avec pour conséquence possible une activation constitutive. En accord avec ces données, nous avons montré, en absence du ligand naturel, une activité constitutive de la forme mutée de STING exprimée dans une lignée cellulaire, ainsi qu’une localisation spontanée dans l’appareil de Golgi des fibroblastes de patients indiquant un état activé. Corrélativement, nous avons observé une concentration sérique élevée d’IFNa chez les patients ainsi qu’une signature transcriptionnelle fortement augmentée d’un panel de gènes induits par les IFN-I. A la suite de cette découverte, nous avons identifié de nouvelles mutations activatrices de STING chez des patients atteints de pathologies vasculaires et de fibroses pulmonaires sévères en relation avec un syndrome inflammatoire, et deux patients ont pu recevoir un traitement ciblant l’inhibition de la voie des IFN-I. Ce travail a permis de mettre en lumière le rôle clé de STING dans l’homéostasie du système immunitaire chez l’homme et de mieux comprendre la physiopathologie de maladies inflammatoires et auto-immunes, motivant la mise en place d’un traitement spécifique chez les patients. Au-delà de cette découverte importante pour ces malades, ce travail suggère que des variants rares et délétères permettent de décrire les causes génétiques de maladies auto-immunes dites complexes. / Lupus is a complex systemic autoimmune disease characterized by a loss of tolerance to nuclear antigens predominantly afflicting women of childbearing age. The disease is both clinically and genetically heterogeneous and this has greatly limited progress in understanding disease pathogenesis. In this project, we utilize next generation sequencing technology such as “Whole Exome Sequencing (WES)” to explore the genetics of lupus at the level of individual families. Furthermore, we focused on a rare subgroup of lupus patients, which develop the disease in childhood and usually present with a more severe clinical phenotype compared to the adult-onset form. We hypothesized that this subgroup would be enriched for monogenic forms of the disease. Thus, we recruited several families with early-onset in the proband and at least one other familial member presenting with lupus or associated autoimmune disease. WES was performed and the validation of the gene identified by this strategy is described. We identified a familial gain of function dominant mutation in TMEM173, encoding STING, a key adaptor molecule in the cytosolic DNA sensing pathway and Type-I interferon (IFN-I) production. The four affected family members demonstrate a systemic inflammatory and autoimmune condition, including lupus, with variable clinical expression. Structural modeling initially predicted a stabilized dimerization of the mutant STING and thereby a constitutive activation. In agreement with this, we found that the STING mutant spontaneously localizes in the Golgi of patient fibroblasts, and is constitutively active in the absence of its ligand in vitro. Accordingly, we observed elevated serum interferon activity and a IFN-I signature in peripheral blood. We have also identified several other patients with activating STING mutations presenting with vascular inflammation and or pulmonary fibrosis, and two patients received a treatment targeting the IFN-I signaling pathway. This discovery highlights the key role of STING in human immune homeostasis and its implication in severe inflammatory and autoimmune diseases, leading to new and more specific therapeutical approaches. Beyond these important findings with regards to patients, this work suggests that rare deleterious variants can describe the genetic cause of autoimmune pathologies previously defined as complex diseases.

Les vecteurs nanoparticulaires comme systèmes de relargage contrôlé pour des applications vaccinales font l’objet d’intenses recherches, notamment dans le domaine du VIH1. Une approche novatrice consiste à co-administrer des molécules immuno-stimulatrices avec les antigènes d’intérêt, afin d’amplifier le recrutement et l’activation des cellules dendritiques (DCs). Un tel vecteur vaccinal stimulerait l’intensité de la réponse immunitaire et une immunité au niveau des muqueuses vaginales et anales pourrait être obtenue après vaccination. Des nanoparticules de poly(acide lactique) (NP-PLA) ou de chitosane/sulfate de dextrane (NP-CSD) ont été utilisées comme véhicules et adjuvants de protéines du VIH1, gp140 et p24. Le poly(I:C), ligand de TLR3 est la molécule immuno-stimulatrice retenue pour ses propriétés adjuvantes. Les NP-PLA et NP-CSD présentent un potentiel équivalent pour l’adsorption de protéines. Par contre, si les NP-CSD permettent l'adsorption du poly(I:C) (95%), elle est moins reproductible sur les NP-PLA. Pour chaque formulation, la capacité à induire in vitro la maturation des DCs a été évaluée en suivant les marqueurs CD25, CD80, CD83, par cytométrie en flux. L’adsorption de poly(I:C) sur les NP-PLA ou les NP-CSD amplifie les capacités de maturation de ces nanoparticules, un effet synergique étant observé avec les NP-CSD. Nos travaux montrent que la co-adsorption d’un TLR ligand, avec des antigènes protéiques du VIH sur des nanoparticules biodégradables, est possible et confère à la formulation vaccinale un effet immuno-stimulant in vitro. In vivo, les formulations vaccinales contenant du poly(I:C) induisent de très forts taux d’anticorps sériques chez la souris. / Use of nanoparticulate vectors in vaccination as controlled release systems based on biodegradable polymers has been widely studied, particularly for HIV vaccine research. An innovative approach is to co-administer antigens of interest with immuno-stimulatory molecules to amplify the recruitment and activation of dendritic cells (DCs). Such a vaccine candidate could boost the intensity of the immune response, and mucosal immunity in vaginal and anal secretions could be obtained after vaccination.We used nanoparticles of poly(lactic acid) (NP-PLA) or chitosan / dextran sulfate (NP-CSD), as vehicles and adjuvants for HIV-1 proteins, gp140 and p24. Poly (I:C), TLR3 ligand molecule, is the immuno-stimulatory molecule chosen for its adjuvant properties. The NP-PLA and NP-CSD have shown their great potential as carriers of proteins. By cons, if NP-CSD allows the adsorption of poly(I:C) with a yield of 95%, the adsorption is less reproducible on NP-PLA. For each formulation, the ability to induce in vitro maturation of DCs was evaluated by following the marker CD25, CD80, CD83, by flow cytometry. Adsorption of poly(I:C) on the NP-PLA or the NP-CSD amplifies the maturation abilities of particles and has a synergistic effect with the NP-CSD.Our work shows that co-adsorption of a TLR ligand with HIV protein antigens onto biodegradable nanoparticles is possible and gives an immuno-stimulant effect to the vaccine formulation in vitro. In vivo, vaccine formulations containing poly(I:C) induce very high levels of serum antibodies in mice.

Deux grandes classes de cellules composent le pool de lymphocytes T (LT) CD8 mémoires. D'une part, les LT CD8 mémoires conventionnels sont générés via la reconnaissance spécifique d'antigènes dérivés de pathogènes ou de tumeurs. D'autre part, les LT CD8 mémoires innés sont générés via différents mécanismes impliquant de fortes stimulations par des cytokines γc indépendamment de la reconnaissance d'antigènes du non soi. Le phénotype extrêmement similaire de ces deux populations cellulaires ne permet pas de les distinguer in vivo. En conséquence, la population de LT CD8 mémoires innés est relativement peu caractérisée. Mon travail de thèse comportait donc deux objectifs majeurs : 1 / Identifier des marqueurs permettant de distinguer in vivo ces deux classes de LT CD8 mémoires. 2/ Caractériser la population de LT CD8 mémoires innés. Dans cette étude, nous démontrons qu'au sein du pool de LT CD8 mémoires, seules les cellules conventionnelles expriment la chimiokine CCL5 et le récepteur NKG2D. Ces deux biomarqueurs permettent ainsi pour la première fois de distinguer les LT CD8 mémoires innés et conventionnels in vivo, à la fois chez la souris et chez l'homme. Grâce à l'expression de NKG2D, nous démontrons que ces LT CD8 mémoires innés possèdent des caractéristiques typiques de cellules mémoires, notamment une réactivité augmentée ainsi qu'un programme génétique comparable à celui des LT CD8 mémoires conventionnels. Néanmoins, cette population cellulaire conserve certaines caractéristiques de cellules naïves. Ainsi, le répertoire TCR diversifié de cette population cellulaire permet à ces cellules de participer à des réponses immunitaires primaires contre différents pathogènes. Enfin, dans un contexte inflammatoire, les LT CD8 mémoires innés présentent un défaut d'accès au tissu pulmonaire comparé aux LT CD8 mémoires conventionnels. Ceci corrèle avec un déficit d'expression de certaines intégrines par les LT CD8 mémoires innés. L'ensemble de nos résultats démontre que les LT CD8 mémoires innés, caractérisés par l'absence d'expression de CCL5 et NKG2D, constituent une population cellulaire hybride, à la frontière entre cellules naïves et cellules mémoires conventionnelles / The pool of memory CD8 T cells is composed of two major cell classes. On one hand, conventional memory CD8 T cells are generated consequently to the specific recognition of pathogen or tumor derived antigens. On the other hand, innate memory CD8 T cells are generated through several mechanisms involving strong yc cytokine stimulation in the absence of cognate antigen recognition. However, these cell classes harbor a very similar phenotype. As a consequence, innate memory CD8 T cell population remains poorly characterized. This PhD has two main objectives : 1 / Identify new biomarkers that enable the discrimination between memory CD8 T cell classes 2/ Characterize the population of innate memory CD8 T cells in physiological condition Our results show that among the pool of memory CD8 T cells, only the conventional ones express the chemokine CCL5 and the NK receptor NKG2D. These two biomarkers enable for the first time the discrimination of memory CD8 T cell classes in physiological settings, in both mouse and human. Thanks to these new tools, we show that innate memory CD8 T cells hold typical memory features, such as an increased reactivity compared to naïve cells and a genetic program similar to the one of conventional memory cells. Nevertheless, this cell population also retains some features typical of naïve cells. The diversified TCR repertoire of this cell population allows it to participate to primary immune responses against various intracellular pathogens. Moreover, like naïve cells, innate memory CD8 T cells fail to access peripheral tissues upon local inflammation, which correlate with an absence of expression of some integrins. Altogether, these results demonstrate that innate memory CD8 T cells, characterized by the absence of expression of CCL5 and NKG2D, represent a hybrid cell population, at the boundary between naïve cells and conventional memory cells

La réponse immuno-inflammatoire au cours du choc septique associe une importante réponse inflammatoire initiale responsable de l'état de choc et le développement secondaire d'altérations du système immunitaire. Les polynucléaires neutrophiles (PNN) jouent un rôle central dans la réponse immunitaire. Des données récentes de la littérature décrivent également un rôle immunosuppresseur jusqu'alors méconnu pour ces cellules. Nous avons exploré leur possible implication dans la physiopathologie du choc septique.Le but de ce travail était l'exploration des altérations phénotypiques, fonctionnelles et transcriptomiques des PNN lors de la phase immunosuppressive du choc septique. Nos résultats montrent une diminution de la capacité de migration des PNN ainsi qu'une diminution de la production de composés bactéricides (myéloperoxydase, lactoferrine) alors que la réponse aux cytokines et la phagocytose n'apparaissent pas altérées. Le contenu en myéloperoxydase et la présence de PNN immatures CD10dimCD16dim étaient indépendamment associés à une mortalité plus élevée. De manière intéressante, CD177 était le gène le plus différentiellement exprimé entre les patients et les volontaires sains. CD177 et CD10 étaient inversement corrélés. Ainsi, la diminution du chimiotactisme, la perte de myéloperoxydase, la présence de cellules immatures et leurs liens avec la mortalité pourraient contribuer au contexte d'immunosuppression présent chez les patients septiques. Au final, les pistes d'exploration futures convergent vers la population de PNN immatures et le rôle spécifique du CD177 dans les états septiques sévères / Severe septic syndromes deeply impair innate and adaptive immunity and are responsible for sepsis-induced immunosuppression. While neutrophils represent the first line of defense against infection, little is known about their phenotype and functions few days after sepsis, when the immunosuppressive phase is maximal (i.e., between day 3 and 8). The objective of this study was thus to perform a global evaluation of neutrophil alterations in immunosuppressed septic patients based on phenotypic, functional and transcriptomic studies. Our results highlight a markedly altered neutrophil chemotaxis (functional and chemokine receptor expressions), oxidative burst, lactoferrin content and an increased number of circulating immature granulocytes (i.e., CD10dimCD16dim). In contrast, phagocytosis and activation capacities were conserved. It is interesting to note that a diminished myeloperoxidase expression appeared as the best predictor to identify a group of septic shock patients at high risk of death. Similarly, patients with lower proportions of CD10dimCD16dim granulocytes had a significant better survival compared with patients presenting a higher percentage. CD177 mRNA, coding for an activation molecule in chemotaxis but also known to be overexpressed in immature cells, had the highest fold change modulation between patients and controls. Considering the potential dual roles of CD177 neutrophil (i.e., maturation / chemotaxis), its participation in septic shock pathophysiology deserves further investigation. To conclude, circulating neutrophils present with phenotypic, functional and morphological alterations few days after sepsis onset. These dysfunctions may participate in the deleterious role of sepsis-induced immunosuppression. The present results open new perspectives in the mechanisms favoring nosocomial infections after septic shock. They deserve to be further investigated in a larger clinical study and in animal models recapitulating these alterations

L’administration de Facteur VIII thérapeutique (FVIII) chez les patients hémophiles A entraine l’apparition d’anticorps anti-FVIII appelés « inhibiteurs » chez 30% des hémophiles A sévères. Ceci constitue alors une impasse thérapeutique. Si de nombreuses investigations ont permis de caractériser les effecteurs lymphocytaires T et B impliqués dans cette réponse immunitaire, elles n’ont toutefois pas permis de proposer aux patients des stratégies thérapeutiques pour prévenir l’apparition des inhibiteurs du FVIII. La première partie de ma thèse explore la possibilité de prévenir la réponse immunitaire anti-FVIII en inhibant la capture et l’apprêtement antigénique du FVIII par les cellules présentatrices de l’antigène (CPA). Il avait été montré précédemment que les deux structures hautement mannosylées du FVIII, sur les asparagines 239 et 2118, étaient reconnues par le CD206 exprimé par les cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes, et que cette voie d’endocytose menait à l’apprêtement antigénique du FVIII. Je me suis donc intéressée à la possibilité de réduire l’immunogénicité du FVIII en éliminant ces deux glycosylations. La seconde partie de ma thèse porte sur la possibilité de prévenir ou d’éradiquer la réponse immunitaire anti-FVIII en inhibant une molécule de la signalisation du récepteur des lymphocytes B (LB) : la tyrosine kinase de Bruton (BTK). La BTK jouant un rôle central dans la signalisation des LB, l’inhibition de celle-ci a montré un intérêt thérapeutique dans le cas de certaines pathologies malignes et auto-immunes. J’ai donc exploré le potentiel thérapeutique d’un inhibiteur de la BTK dans la réponse immunitaire anti-FVIII. / Administration of therapeutic factor VIII (FVIII) to hemophilia A patients leads to the development of anti-FVIII antibodies called “inhibitors” in 30% of severe hemophilia A patients. Despite a well characterization of T and B effectors cells involved in this immune response, there is still no therapeutic strategy proposed to the patients to prevent the occurrence of FVIII inhibitors. The first part of my thesis explores the possibility to prevent the anti-FVIII immune response by blocking FVIII capture and processing by antigen presenting cells (APC). It has been previously demonstrated that the two highly mannosylated structures on FVIII, on asparagines 239 and 2118, were recognized by the CD206 expressed on human monocyte-derived dendritic cells. This endocytic pathway led to FVIII processing and presentation to T cells. Therefore, I have investigated the possibility to reduce FVIII immunogenicity by eliminating those two glycosylations. The second part of my thesis focuses on the possibility to prevent or eradicate the anti-FVIII immune response by inhibiting a molecule involved in B cell receptor signaling: the Bruton’s tyrosine kinase (BTK). BTK plays a key role in B cells signaling and inhibition of BTK has shown a great interest in B cell malignancies, but also in some auto-immune diseases. Therefore, I have investigated the therapeutic potential of a new BTK inhibitor against the development of the anti-FVIII immune response.

Le TRALI immunologique est un syndrome de détresse respiratoire aiguë rare, provoqué par la présence d’alloanticorps dans les produits transfusés. Il est classiquement étudié au moyen d’un modèle de souris qui reçoivent un anticorps monoclonal contre les molécules d’histocompatibilité de classe I, anti-H-2d. Or les mécanismes qui conduisent au TRALI restent encore largement incompris. Dans ce travail de thèse, je montre que l’inhibition des récepteurs P2X1 à l’ATP et du canal calcique TRPC6, diminue le développement des œdèmes péri-artériolaires pulmonaires lors d’un TRALI, suggérant un rôle des cellules musculaires lisses. Les expériences de déplétions cellulaires spécifiques montrent que les plaquettes et les neutrophiles ne sont pas nécessaires pour l’initiation du TRALI, contrairement à ce qui avait été montré par d’autres équipes. Les monocytes et/ou les macrophages sont par contre indispensables. J’ai aussi développé un modèle de TRALI immunologique utilisant des souris transgéniques pour le récepteur humain FcγRIIA, et un anticorps recombinant muni d’une partie Fc d’IgG1 humaine. Mes travaux montrent que le TRALI est plus sévère dans les souris transgéniques, accompagné d’une activation plus importante des plaquettes et des neutrophiles. Ce modèle permet d’envisager l’étude des mécanismes du TRALI sous un nouvel angle, plus proche de la physiopathologie humaine, ainsi que celle de la contribution des parties Fc des anticorps humains. / Immunological TRALI is a rare acute respiratory distress syndrome induced by the presence of alloantibodies in transfused products. A mouse model using a monoclonal antibody against the major histocompatibility complex class I, anti-H-2d, is usually used to study its mechanisms. Nevertheless, there is a lack in our understanding regarding the course of events. In this thesis, I show that the inhibitions of the ATP-gated receptor P2X1 and of the TRPC6 channel reduce the development of periarteriolar pulmonary edema occurring during TRALI, pointing to a role of smooth muscles cells. Specific cell depletions show that platelets and neutrophils are dispensable for TRALI initiation, in contrast to previous reports. Monocytes and/or macrophages are however necessary. I also developed a model of immune TRALI using transgenic mice expressing the human receptor FcγRIIA, and a recombinant antibody with a human IgG1-Fc fragment. My work reveal a more severe TRALI response in transgenic mice, with enhanced activation of platelets and neutrophils. This model allow a finer study of mechanisms underlying TRALI, moving towards the human actors of the pathology. We can also use this novel approach to assess the contribution of human Fc fragment.

Le système immunitaire inné est un mécanisme de défense commun à tous les métazoaires. Son activation peut être délétère lorsqu'elle est incontrôlée. L'étude des mécanismes qui sous-tendent cet équilibre entre l'activation ou non de la réponse immunitaire innée est à la base de mes travaux de thèse. La similarité entre les voies moléculaires - comme la voie NF-KB - relayant la réponse immunitaire innée chez les insectes et les mammifères fait de la drosophile un excellent modèle pour explorer la réponse immune. Après une stimulation immunitaire, l'arrêt des voies moléculaires de l'immunité est nécessaire pour éviter le développement de maladies auto-immunes ou du cancer. Mon premier projet s'est attaché à comprendre un mode de régulation original dépendant du temps, dans une des voies NF-KB de la drosophile. Mon deuxième projet··concerne l'activation de la réponse immunitaire. Une· protéine nucléaire contrôle l'implication de machinerie épigénétique dans le contrôle de l'expression d'une des voies NF-KB de la drosophile. Le tout permet de mieux saisir la dynamique de régulation de la réponse innée. / The innate immune system is a defense mechanism common to all metazoans. lts activation can be deleterious when it is uncontrolled. The study of the mechanisms underlying this balance between the activation or not of the innate immune response is the basis of my thesis work. The similarity of the molecular pathways - such as the NF-KB pathway - relaying the innate immune response in insects and mammals makes Drosophila an excellent model for exploring the immune response.After immune stimulation, stopping the molecular pathways of immunity is necessary to prevent the development of autoimmune diseases or cancer. My first project focused on understanding a time-dependent mode of regulation in one of Drosophila's NF-KB pathways. My second project concerns the activation of the immune response. A nuclear protein contrai the involvement of epigenetic machinery in controlling the expression of one of Drosophila's NF-KB pathways. Ali this makes it possible to better grasp the dynamics of regulation of the innate response.

De nombreuses études ont impliqué des TLR dans le développement et la progression tumorale. Précédemment, il a été démontré que les cellules tumorales expriment TLR7, un récepteur à ARNsb, et qu’une forte expression de TLR7 par les cellules tumorales de patients atteints de cancer du poumon est associée à un mauvais pronostic. Dans un modèle murin de cancer du poumon, cet effet pro-tumoral a été reproduit lors de l’injection d’agoniste de TLR7. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de déterminer les mécanismes impliqués dans les effets pro-tumoraux de TLR7. La stimulation de ce récepteur au niveau des cellules tumorales induit une production plus importante de CCL2 et GM-CSF, ainsi qu’un fort recrutement de MDSC au site de la tumeur. Ces MDSC, de par leurs propriétés immunosuppressives sont responsables de l’effet pro-tumoral à la suite de la stimulation de TLR7. Nous avons également mis évidence que la stimulation de TLR7 était pro-métastatique dans un modèle murin de cancer du poumon et que les MDSC étaient également impliquées dans cet effet. Ces effets pro-métastatiques associés au TLR7 ont été confirmés chez l’homme, grâce à l’étude de transcrits de molécules associées à l’invasion, l’angiogénèse, la transition épithélio-mésenchymateuse et les métastases. Enfin nous avons démontré la présence de ligand de TLR7 chez les patients atteints de cancer du poumon et démontré que l’injection intratumorale de virus respiratoires, IAV et RSV, a un effet pro-tumoral dans notre modèle de cancer du poumon. Ces virus respiratoires pourraient donc être à l’origine de la surexpression de TLR7 et du mauvais pronostic associé à ce récepteur chez les patients atteints de cancer du poumon. Ces recherches ont donc permis de mettre en évidence de nouveaux facteurs aggravants dans le cancer du poumon, dont les virus respiratoires, et de découvrir les mécanismes impliqués. / Numerous studies have implicated some TLR in tumor development. Previously, we have demonstrated that lung tumor cells express TLR7, a receptor for ssRNA, and that high TLR7 expression confers to NSCLC patients bad clinical outcome. In mice models of lung cancer, we further demonstrated that the injection of TLR7 agonists led to a pro-tumoral effect.My thesis work has firstly demonstrated the mechanisms involved in the pro-tumoral effects of TLR7 in lung cancer: TLR7 stimulation on tumor cells induces a high production of CCL2 and GM -CSF, as well as a sharp MDSC recruitment within the tumor. These MDSC, by their immunosuppressive properties, are implicated in the pro-tumoral effect upon TLR7 stimulation. We also demonstrated that TLR7 stimulation was pro-metastatic in a mice model of lung cancer and that MDSC were also involved in this effect. These pro-metastatic effects associated with TLR7 have been confirmed in humans through the studies of transcripts and proteins involved in invasion, angiogenesis, Epithelial–mesenchymal transition and metastasis. Finally, we demonstrated that TLR7 ligands are present in tumor microenvironment of lung cancer patients and that intratumoral injection of respiratory viral infections such as IAV and RSV, have a pro-tumoral effect in lung cancer mice model. These respiratory viruses could therefore be at the origin of the overexpression of TLR7 and the poor clinical outcome associated with this receptor in lung cancer patients. This research has thus made possible to highlight new aggravating factors in lung cancer, including respiratory viruses, and to discover the mechanisms involved.