While the human immunodeficiency virus (HIV) can be managed with antiretroviral therapy (ART), there is no cure for the disorder. If ART is discontinued, viral RNA levels rapidly increase in most individuals due to the presence of a cell-mediated hidden replication competent viral burden known as the viral reservoir. In order to successfully cure this disease, a mechanism to eliminate the viral reservoir must be developed. Preliminary research completed using a toll-like-receptor agonist 7 (TLR7) has shown favorable results supporting this goal. In a simian immunodeficiency virus (SIV) model, dosing rhesus macaques (RMs) with TLR7 agonists resulted in the development of controlled viremia. A controlled RM is a SIV positive animal that is able to maintain an undetectable viral load without continued therapeutic intervention. In cases of controlled SIV/HIV, viral RNA no longer replicates despite the discontinuation of all treatment. This implies that the viral reservoir is either completely eliminated or severely reduced. In this study, we quantified expression levels of several immune checkpoint and activation markers including CD69, CD39, CXCR5, TCF7, PD-1, PD-L1, TIGIT, CTLA-4, Tim-3, and Lag-3 on isolated peripheral blood mononuclear immune cells (PBMCs) [including CD4+ T cells, CD8+ T cells, natural killer (NK) cells, and B cells] in both controlled and non-controlled RMs. Our goal was to identify possible mechanisms by which controlled RMs are able to successfully modulate the host immune response after discontinuing TLR7 agonist treatment. The subjects each received one of two different TLR7 agonists (GS-9620 and GS-986). Isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained from two controlled RMs and two non-controlled RMs. Samples were analyzed using flow cytometry to identify and quantify levels of markers above. Expression levels of PD-1 and PD-L1 were elevated in PBMCs obtained from non-controlled RMs when compared to levels seen in controlled RMs. In contrast, levels of TIGIT and CTLA4 were downregulated in samples obtained from the controlled RMs. This suggests that immune checkpoint markers responsible for viral control and SIV/HIV pathogenesis have different functional roles. Additionally, the controlled RMs showed high expression of CD69 and CD39 on B cells and increased levels of CXCR5 on CD4+ T cells. This suggests that newly activated B cells likely contribute to the observed improvements in immune function. The results obtained provide favorable support for the potential role of immune checkpoint blockade as an HIV-specific immunotherapy that may contribute to the development of a controlled population. However, it is worthwhile to note that this study was completed using a relatively small sample size (n=4). Thus, interpretations of the findings herein must be replicated with a larger sample prior to forming any definitive conclusions.

De nombreuses études ont impliqué des TLR dans le développement et la progression tumorale. Précédemment, il a été démontré que les cellules tumorales expriment TLR7, un récepteur à ARNsb, et qu’une forte expression de TLR7 par les cellules tumorales de patients atteints de cancer du poumon est associée à un mauvais pronostic. Dans un modèle murin de cancer du poumon, cet effet pro-tumoral a été reproduit lors de l’injection d’agoniste de TLR7. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de déterminer les mécanismes impliqués dans les effets pro-tumoraux de TLR7. La stimulation de ce récepteur au niveau des cellules tumorales induit une production plus importante de CCL2 et GM-CSF, ainsi qu’un fort recrutement de MDSC au site de la tumeur. Ces MDSC, de par leurs propriétés immunosuppressives sont responsables de l’effet pro-tumoral à la suite de la stimulation de TLR7. Nous avons également mis évidence que la stimulation de TLR7 était pro-métastatique dans un modèle murin de cancer du poumon et que les MDSC étaient également impliquées dans cet effet. Ces effets pro-métastatiques associés au TLR7 ont été confirmés chez l’homme, grâce à l’étude de transcrits de molécules associées à l’invasion, l’angiogénèse, la transition épithélio-mésenchymateuse et les métastases. Enfin nous avons démontré la présence de ligand de TLR7 chez les patients atteints de cancer du poumon et démontré que l’injection intratumorale de virus respiratoires, IAV et RSV, a un effet pro-tumoral dans notre modèle de cancer du poumon. Ces virus respiratoires pourraient donc être à l’origine de la surexpression de TLR7 et du mauvais pronostic associé à ce récepteur chez les patients atteints de cancer du poumon. Ces recherches ont donc permis de mettre en évidence de nouveaux facteurs aggravants dans le cancer du poumon, dont les virus respiratoires, et de découvrir les mécanismes impliqués. / Numerous studies have implicated some TLR in tumor development. Previously, we have demonstrated that lung tumor cells express TLR7, a receptor for ssRNA, and that high TLR7 expression confers to NSCLC patients bad clinical outcome. In mice models of lung cancer, we further demonstrated that the injection of TLR7 agonists led to a pro-tumoral effect.My thesis work has firstly demonstrated the mechanisms involved in the pro-tumoral effects of TLR7 in lung cancer: TLR7 stimulation on tumor cells induces a high production of CCL2 and GM -CSF, as well as a sharp MDSC recruitment within the tumor. These MDSC, by their immunosuppressive properties, are implicated in the pro-tumoral effect upon TLR7 stimulation. We also demonstrated that TLR7 stimulation was pro-metastatic in a mice model of lung cancer and that MDSC were also involved in this effect. These pro-metastatic effects associated with TLR7 have been confirmed in humans through the studies of transcripts and proteins involved in invasion, angiogenesis, Epithelial–mesenchymal transition and metastasis. Finally, we demonstrated that TLR7 ligands are present in tumor microenvironment of lung cancer patients and that intratumoral injection of respiratory viral infections such as IAV and RSV, have a pro-tumoral effect in lung cancer mice model. These respiratory viruses could therefore be at the origin of the overexpression of TLR7 and the poor clinical outcome associated with this receptor in lung cancer patients. This research has thus made possible to highlight new aggravating factors in lung cancer, including respiratory viruses, and to discover the mechanisms involved.

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The objectives of this work were: carry out a literature review about neuroinflammation in PD; assess possible alterations in production of inflammatory cytokines in blood cultures of patients presenting with PD activated by TLR agonists; evaluate the percentages of the two main monocyte subpopulations, as well as TLR2 and TLR4 expression in these subpopulations in peripheral blood of patients presenting with PD. Patients presenting with PD (n = 31) and healthy individuals (n = 31), matched by gender and age, were evaluated and the patients were assessed regarding the severity of their neurological and psychiatric symptoms using the Hoen & Yahr scale (H&Y) and the Unified Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS). Blood cultures were activated with TLR2 agonists (Pam3Cys), TLR4 (LPS), or TLR7/8 (R848). Cytokines (TNF, IL-1β, IL-6, IL-12p70, and IL-10) were Abstract 12 quantified in the serum and supernatant of blood cultures using Cytometer bead array. Monocytes (CD14+CD16– and CD14+CD16+) and TLR2 and TLR4 expression were identified using flow cytometry. Cytokine concentrations in the serum of patients and controls were similar and no significant association was found between cytokine concentrations and UPDRS scores. However, after activation of blood cultures of patients, a significant decreased response to TLR2 (TNF, IL-1β, IL-6, IL-10) and TLR7/8 (IL-6) agonists was observed. No correlation was observed between the concentrations of cytokines induced by TLR2 or TLR7/8 agonists and UPDRS scores. The percentages of monocytes CD14+CD16– and CD14+CD16+ did not significantly differ between patients and controls, and no alterations in TLR2 or TLR4 expressions were detected in these monocyte subpopulations in patients. The results indicate that leukocytes, especially monocytes, of patients presenting with PD show decreased capacity to respond to the activation via TLR2. This decrease may be associated with the previous activation of TLR2 in vivo, making the cells tolerant to new stimuli ex vivo. Assessing the activation of monocytes in peripheral blood, via TLR, may help the evaluation of the neurodegenerative/ neuroinflammatory process in PD, contributing to a better understanding of the pathophysiology of this disease. / A doença de Parkinson (DP) é uma afecção neurodegenerativa que ocorre devido à perda neuronal na substância negra, produtora de dopamina. Evidências sugerem que várias citocinas inflamatórias estão aumentadas no cérebro e no sangue de pacientes com DP. Essas citocinas podem ser induzidas por ativação dos receptores similares a Toll (Toll-like receptors, TLR). No sangue periférico, os monócitos expressam TLR e podem participar na imunopatogenia de doenças neurodegenerativas. Os objetivos deste trabalho foram: realizar uma revisão de literatura sobre neuroinflamação na DP; avaliar possíveis alterações na produção de citocinas inflamatórias em hemoculturas de pacientes com DP ativada por agonistas de TLR; avaliar as porcentagens das duas principais subpopulações de monócitos e a expressão de TLR2 e TLR4 nestas subpopulações no sangue periférico de pacientes com DP. Foram avaliados 31 pacientes com DP e 31 indivíduos sadios, pareados por gênero e idade, sendo os pacientes avaliados quanto à gravidade dos sintomas neurológicos e psiquiátricos utilizando-se as escalas H&Y (Hoen & Yahr scale) e UPDRS (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale). As hemoculturas foram ativadas com agonistas de TLR2 (Pam3Cys), TLR4 (LPS) ou TLR7/8 (R848). As citocinas (TNF, IL-1β, IL-6, IL-12p70 e IL-10) foram quantificadas no soro e nos sobrenadantes das culturas utilizando citometria (Cytometer bead array). Os monócitos (CD14+CD16– e CD14+CD16+) e a expressão de TLR2 e TLR4 nestes foram identificados por citometria de fluxo. As concentrações de citocinas nos soros de pacientes e controles foram similares e não houve Resumo 10 associação significativa entre as concentrações das citocinas e os escores da UPDRS. No entanto, após ativação das hemoculturas dos pacientes, foi observada significativa resposta diminuída aos agonistas de TLR2 (TNF, IL- 1β, IL-6, IL-10) e de TLR7/8 (IL-6). Não foi observada correlação entre as concentrações de citocinas induzidas pelos agonistas de TLR2 ou de TLR7/8 e os escores de UPDRS. As porcentagens dos monócitos CD14+CD16– e CD14+CD16+ não diferiram significativamente entre os pacientes e os controles, e não foram detectadas alterações nas expressões de TLR2 ou TLR4 nestas subpopulações de monócitos nos pacientes. Os resultados indicam que os leucócitos, especialmente os monócitos, de pacientes com DP apresentam diminuída capacidade de resposta à ativação via TLR2. Essa diminuição pode estar associada à ativação prévia de TLR2 in vivo, tornando as células tolerantes a novos estímulos ex vivo. Avaliar a ativação de monócitos no sangue periférico, via TLR, pode auxiliar na avaliação do processo neurodegenerativo/neuroinflamatório na DP, contribuindo para a melhor compreensão da patofisiologia desta doença.

La connaissance du système immunitaire est une étape clé dans la compréhension et la prévention des infections bactériennes, virales, des maladies auto-immunes et du cancer. Les lymphocytes B (LB) sont spécialisés dans la fonction de présentation de l'antigène et sont responsables de la production d'anticorps de haute affinité qui permettent l'élimination des agents infectieux. Après l'engagement du récepteur des cellules B (BCR), les LB polarisent rapidement leur centre organisateur des microtubules (MTOC) et les molécules du CMH de classe II vers l'interface BCR-Antigen (Ag), ce qui déclenche la libération de protéases lysosomales permettant l'extraction de l’Ag immobilisé à la surface des macrophages ou cellules dendritiques, un processus essentiel pour les LB à acquérir leur fonction de présentation antigénique. Toutefois, la signalisation par le BCR n'est pas le seul facteur déterminant dans l'activation des cellules B périphériques. La reconnaissance des motifs moléculaires de virus et bactéries par les Toll Like Receptors (TLRs) est importante dans la perte de tolérance des cellules B. Les TLR sont divisés en deux familles: les TLR1, 2, 4, 5, 6 et 11, qui détectent la présence de protéines et lipides bactériens et sont exprimés à la membrane plasmique, et les TLR3, 7-8 et 9, localisés dans les endosomes et qui détectent la présence d’ARN simple brin, ou double brin et ADN non méthylé respectivement. Compte tenu de leur localisation endosomale, les TLR3, 7, 8 et 9 sont des acteurs clés dans la discrimination entre le soi non-infectieux et le non-soi infectieux. Dans les cellules dendritiques, les TLR7 et 9 sont retenus dans le réticulum endoplasmique avec une molécule chaperonne, UNC93B1. Suite à leur stimulation, ils migrent vers les compartiments lysosomaux où ils subissent un clivage protéolytique par l'AEP, une asparagine endopeptidase, pour être fonctionnels. D'autre part, il a été récemment montré que les molécules MHC de classe II intracellulaires sont capables de promouvoir l’activation complète des TLR3, 4 et 9 via une interaction directe avec la tyrosine kinase Btk dans les macrophages et les cellules dendritiques. Notre travail a porté sur l’identification de nouvelles molécules régulant la signalisation des TLR7 et 9 dans les cellules B. Nos résultats, jusqu'à présent, montrent que la signalisation du TLR7 mais pas celle du TLR9 semble être régulée par la molécule chaperone associée au CMHII, la chaîne invariante ou Ii. En effet, dans les cellules B, au repos et après stimulation, le TLR7 réside dans les lysosomes avec la chaîne invariante. Après stimulation, la chaîne invariante interagit spécifiquement avec TLR7 et sa molécule adaptatrice MyD88 favorisant la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires telles que L’IL-6 et le TNF-α. Étonnamment, en absence de Ii ou lorsque l'expression de Ii est diminuée suite à une infection virale, TLR7, mais pas TLR9, relocalise dans le réticulum endoplasmique (RE) conduisant ainsi à une exacerbation des fonctions innées du TLR7 telles que la production des cytokines, mais pas les fonctions adaptatives du TLR7 telles que la présentation croisée associée aux molécules de classe I. Ces résultats suggèrent un nouveau rôle pour la chaîne invariante en agissant comme un régulateur négatif de la signalisation du TLR7. / Knowledge of the immune system is a key step in the understanding and prevention of bacterial, viral infections, autoimmune diseases and cancer. B Lymphocytes (BL) are specialized in the function of antigen presentation and are responsible for the production of high affinity antibodies that allow the elimination of infectious agents. After the engagement of the B Cell Receptor (BCR) , BL rapidly polarize their microtubule organizing center (MTOC) and MHC class II molecules towards the BCR- Antigen (Ag) interface, which triggers the release of lysosomal proteases allowing the extraction of immobilized Ag present on the surface of macrophages or dendritic cells. This process is essential for LB to acquire their antigen presenting function. However, the BCR signaling is not the only determining factor in the activation of peripheral B cells. Recognition of molecular patterns from viruses and bacteria by Toll Like Receptors (TLRs) is important in the loss of B cell tolerance. TLRs are divided into two families: TLR 1 , 2, 4 , 5, 6 and 11, which detect the presence of bacterial proteins and lipids and are expressed at the plasma membrane, and TLR3 , 7-8 and 9 , located in the endosomes and detect the presence of single-stranded RNA, double-stranded RNA and unmethylated DNA respectively. Given their endosomal localization, TLR3, 7, 8 and 9 are key players in the discrimination between the non-infectious self and the infectious non- self. In dendritic cells, TLR7 and 9 are retained in the endoplasmic reticulum with a chaperone molecule, UNC93B1. Following their stimulation, they migrate to the lysosomal compartments where they undergo a proteolytic cleavage by AEP, an asparagine endopeptidase, to be functional. On the other hand, it has recently been shown that MHC class II molecules are able to promote intracellular full activation of TLR3, 4 and 9 through a direct interaction with the Bruton’s tyrosine kinase Btk in macrophages and dendritic cells. Our work has focused on the identification of new signaling molecules that regulate TLR7 and 9 function in B cells. Our results, so far, show that TLR7 and not TLR9 signaling is regulated by the chaperone molecule associated with MHC class II, the invariant chain Ii. Indeed, in resting and stimulated B cells, TLR7 resides in lysosomes with the invariant chain. Upon stimulation, the invariant chain interacts specifically with TLR7 and its adaptor molecule MyD88 promoting the secretion of proinflammatory cytokines such as IL-6 and TNF-α. Surprisingly, in the absence of Ii or when the expression of Ii is reduced due to a viral infection, TLR7, but not TLR9, relocates in the endoplasmic reticulum (ER) leading to an exacerbation of the innate functions of TLR7 such as the production of cytokines, but not TLR7 adaptive responses such as cross-presentation associated with MHC class I molecules. These results suggest a new role for the invariant chain by acting as a negative regulator of TLR7 signaling in B cells.

Les antigènes saccharidiques associés aux tumeurs (TACAs) sont considérés comme des marqueurs de cellules tumorales. Le développement de candidats vaccins synthétiques capables d'induire des réponses immunitaires robustes dirigées contre ces TACAs est un vaste champ d'investigation depuis de nombreuses années. Dans cette optique, mon travail s'est principalement focalisé sur la conception d'un candidat vaccin à trois composantes qui peut activer spécifiquement les cellules dendritiques, les cellules TH et les cellules B. La première partie de la thèse consistait à effectuer une étude approfondie des méthodes submonomère et monomère en solution pour accéder à une plateforme β-tripeptoïde O-α-GalNAc (épitope des cellules B), servant de mime du cluster trimérique de l'antigène Tn (GalNAc-α-O-Ser/Thr). Pour renforcer la stimulation du système immunitaire, un agoniste du récepteur Toll 7 (TLR7) préalablement synthétisé (exprimé par les cellules dendritiques) a été ensuite couplé à cette plateforme par l'intermédiaire de l'acide amino-caproïque, pris comme espaceur. L'édifice candidat vaccin a ensuite été complété par conjugaison au peptide OVA 323-339 (épitope des cellules TH ) grâce à la réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire CuAAC. Enfin, l'aptitude du candidat vaccin à induire une réponse anti-Tn a été évaluée par l'équipe du Pr. C. Leclerc de l'Institut Pasteur de Paris. En parallèle de ces études, nous avons mis au point des conditions de ligation multivalente par couplage thiol-ène (TEC) pour l'obtention de peptoïdes S-glycosylés. / Tumor-Associated Carbohydrate Antigen (TACAs) are considered as cancer cells markers. The development of synthetic vaccine candidates which are able to induce a robust immune response against these TACAs is a field of great interest since many years. In this context, my work has been focused mainly on the design of a three-component vaccine candidate with the ability to activate specifically dendritic cells, T H cells and B cells. The first part of the thesis consisted in making a deep study on the submonomer and monomer methods for solution-phase synthesis of a β-tripeptoid O-α-GalNAc scaffold (B epitope). Its role is to mimic the Tn (GalNAc-α-O-Ser/Thr) trimeric cluster which is naturally present on tumor cells surface. To strengthen the stimulation of the immune system, a TLR7 agonist (receptor express by dendritic cells) has been, firstly, coupled through an amino-caproic acid spacer. The vaccine candidate has been next completed by conjugation with the OVA 323- 339 peptide (TH epitope) using the Copper-catalized Alkyne-Azide Cycloaddition (CuAAC). Finally, the capacity of this construction to generate anti-Tn response have been evaluated by the groupe of C. Leclerc of Institut Pasteur of Paris. At the same time, we have also developed conditions for multivalent ligations using thiol-ene coupling (TEC) to obtain a β-tripeptoid S-α-GalNAc scaffolds.

Les patients atteints de lupus érythémateux systémique ont une augmentation de la prévalence du syndrome métabolique (MetS) mais les mécanismes sous-jacents ne sont pas connus. Le récepteur de type Toll 7 (TLR7), qui reconnait de l’ARN simple brin, joue un rôle important dans la défense anti-microbienne de l’hôte, mais contribue également au développement et à la progression du lupus. Cependant, l’implication de TLR7 dans le MetS est inconnue. L’objectif de mon projet de thèse était d’explorer l’idée nouvelle que la signalisation de TLR7 peut conduire non seulement au lupus mais aussi à des anomalies métaboliques.Nous avons trouvé que l’obésité induite par un régime riche en gras (régime HFD) a conduit à une exacerbation du lupus et de paramètres métaboliques dans des souris TLR8ko, qui développent spontanément une auto-immunité de type lupique à cause d’une augmentation de la signalisation de TLR7 dans les cellules dendritiques (DCs). Au contraire, sous un régime HFD, les souris TLR7/8ko n’ont pas développé de lupus, et les souris TLR7ko et TLR7/8ko ont été protégées contre les anomalies métaboliques incluant l'augmentation de poids et l’intolérance au glucose. De manière intéressante, dans des souris sauvages (WT) le régime HFD a conduit à une augmentation de l’expression de TLR7 et de la production de TNF par les DCs spléniques et hépatiques, et ce phénotype était plus profond dans les souris TLR8ko. Mon étude montre l’implication de la signalisation de TLR7 dans l’interconnexion entre le lupus et les anomalies métaboliques, donc cibler TLR7 pourrait constituer une nouvelle approche comme thérapie contre le lupus et les maladies métaboliques. / Systemic lupus erythematosus (SLE) patients have increased prevalence of metabolic syndrome but the underlying mechanisms are unknown. Toll-like receptor 7 (TLR7) that detects single stranded-RNA plays a key role in antimicrobial host defence, but also contributes in the initiation and progression of SLE. However, the implication of TLR7 in MetS is unknown. The objective of my PhD project was to explore the novel idea that TLR7 signalling can lead not only to SLE but also to metabolic abnormalities. We found that high fat diet (HFD)-induced obesity led to exacerbation of lupus and metabolic parameters in TLR8ko mice, which develop spontaneous lupus-like disease due to increased TLR7 signalling by dendritic cells (DCs). In contrast, upon HFD TLR7/8ko mice did not develop SLE, and both TLR7ko and TLR7/8ko mice were protected from metabolic abnormalities including body weight gain and glucose intolerance. Interestingly, in wild-type mice HFD led to an increase of TLR7 expression and TNF production by hepatic and splenic DCs, and this phenotype was more profound in TLR8ko mice. My study uncovers the implication of TLR7 signalling in the interconnection of SLE and metabolic abnormalities, thus targeting TLR7 might be a novel approach as a tailored therapy in SLE and metabolic diseases.

Les femmes développent une réponse immunitaire plus forte que celle des hommes. Ceci les protège vis-à-vis des infections virales ou bactériennes, mais augmente également leur risque de développer une pathologie auto-immune. Le lupus érythemateux systémique (LES) est une pathologie auto-immune prototypique à fort dimorphisme sexuel, avec 9 femmes affectées pour 1 homme. TLR7 (Toll-like receptor 7) est un TLR endosomal spécifique de l'ARN simple brin. Ce récepteur joue un rôle crucial dans la réponse antivirale mais aussi dans la rupture de tolérance à la base de la pathologie lupique. Sa surexpression dans un modèle murin suffit à induire le développement spontané d'un lupus. Au contraire, son invalidation dans des souches de souris développant un lupus spontané, est protectrice. Chez l'Homme, TLR7 est exprimé dans les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), les monocytes, ainsi que dans les lymphocytes B (LB). Son engagement induit la production de médiateurs pro-inflammatoires par les pDC et les monocytes, et la maturation et la production d'anticorps par les LB. Le gène TLR7 est porté sur le bras court du chromosome X. Un mécanisme compensatoire du dosage des gènes portés sur les gonosomes intervient dans les cellules des mammifères, où un des deux chromosomes X est aléatoirement inactivé pendant le développement embryonnaire. Or ce mécanisme est imparfait et, chez les femmes, au minimum 15% des gènes portés sur l'X sont susceptibles d'échapper à son inactivation. Vu l'effet du dosage de Tlr7 dans les modèles murins du lupus, et de la localisation de TLR7 sur le chromosome X humain, nous avons cherché à déterminer si TLR7 serait sujet à l'échappement à l'inactivation de l'X chez les femmes. Pour cela nous avons développé une approche basée sur l'analyse sur cellule unique de l'expression d'un marqueur allélique au niveau des transcrits de TLR7. Nos résultats démontrent que ce gène échappe à l'inactivation du chromosome X dans 30% environ des LB, monocytes et pDC de femmes saines. De plus, nous avons observé par une technique d'hybridation in situ la transcription simultanée des deux allèles. L'expression bi-allélique de TLR7 est associée à une augmentation significative de l'ARNm de TLR7 dans les LB naïfs. Enfin, nos résultats démontrent que les LB naïfs exprimant les deux allèles de TLR7 sont préférentiellement enrichis dans les cellules différentiées dont la commutation de classe a été induite par un ligand de TLR7. De la même façon, les cellules plasmocytaires où TLR7 échappe à l'inactivation de l'X sont enrichies parmi les cellules prolifératrices en réponse à l'engagement de TLR7. En conclusion, ce travail démontre que le gène TLR7 échappe à l'inactivation de l'X chez plusieurs types de cellules immunitaires, que le dosage des transcrits du gène s'en trouve augmenté chez les lymphocytes B, et que la réponse biologique à l'engagement TLR7 est plus importante chez les lymphocytes B à expression bi-allélique. Par ailleurs, de premiers résultats mettent en évidence l'échappement de TLR7 à l'inactivation de l'X chez des hommes atteints du syndrome de Klinefelter (47, XXY). Ceci pourrait expliquer leur susceptibilité équivalente à celle des femmes au développement du lupus. / Women develop stronger immune responses than men, with positive effects on the resistance to viral or bacterial infections but magnifying also the susceptibility to autoimmune diseases like systemic lupus erythematosus (SLE), which affects 9 women per 1 man. Toll-like receptor 7 (TLR7) is an endosomal single-stranded RNA sensor that plays a key role in the initiation of the antiviral response. TLR7 dosage, however, is also a crucial determinant in SLE, and Tlr7 overexpression suffices to induce spontaneous lupus-like disease. Conversely, Tlr7 knock-out abolishes SLE development in lupus-prone mice. In humans, TLR7 is expressed in plasmacytoid dendritic cells (pDCs), monocytes and B lymphocytes. TLR7 engagement increases B cell maturation and production of antibodies, but also the production of pro-inflammatory cytokines by pDCs and monocytes. Human TLR7 is encoded on the short arm of the X chromosome. The cells of female mammals randomly inactivate one X chromosome in the course of embryonic development to equalize gene dosage between the sexes. However, 15% of X-linked human genes consistently escape inactivation so that both alleles are expressed in individual cells. Because increased dosage of TLR7 expression due to non-inactivation could contribute to autoimmunity, we investigated allelic expression of TLR7 in individual immune cells from women using a TLR7 allelic marker observable on mRNA molecules. Our results show that TLR7 escapes X chromosome inactivation in about 30% of B cells, pDCs and monocytes. TLR7 bi-allelic expression was observed also in situ by RNA-FISH. Naive B cell TLR7 bi-allelic expression is accompanied by higher TLR7 mRNA expression. Our results demonstrate that TLR7 escape from X-inactivation is associated with an enhanced plasma cell proliferative response to TLR7 ligands, and promotes immunoglobulin class switch induced by T cell help and TLR7 engagement. Our study provides proof of principle that TLR7 escapes from X chromosome inactivation in several types of immune cells of women and results in greater transcriptional expression, and shows also that cellular function in bi-allelic B cells is augmented in a TLR7-specific manner. Bi-allelic expression of TLR7 in women is thus a potential risk factor in the pathogenesis of SLE. Our initial results show also that TLR7 escapes from X inactivation in the immune cells of men with Klinefelter syndrome (47, XXY), which may explain a risk of SLE equivalent to women's.

Peu d’hommes sont touchés par les maladies auto-immunes (MAI), maladies où la réponse immune est très forte et attaque l’hôte. La polyarthrite rhumatoïde (PR), une maladie inflammatoire chronique, suit cette règle avec 3 femmes pour 1 homme atteint. Dans cette thèse, nous analysons les différences en fonction du sexe et les raisons d’un tel biais. D’après des observations chez l’animal, nous nous sommes demandés si les rares hommes atteints de PR ont une augmentation du nombre de copies d’un gène impliqué dans la réponse immune et porté par le chromosome (Chr) X. Contrairement aux femmes, les hommes n’ont qu’un Chr X et de ce fait qu’une copie de ce gène. Cependant, nous avons montré par différentes techniques, que ces patients avaient 10% de cellules portant 2 copies de ce gène, et que cette augmentation venait de cellules ayant 2 Chr X. Nos recherches soulignent l’importance du Chr X dans l’auto-immunité et ouvrent un nouveau champ d'investigation pour les hommes atteints de MAI. / Few men are affected by autoimmune diseases (AID), diseases where the immune response is very strong and attacks the host. Rheumatoid arthritis (RA), a chronic inflammatory disease, follows this rule with 3 women affected for 1 man. In this thesis, we analyse gender differences and the reasons for such bias. Based on observations in animals, we wondered whether the rare men with RA have an increased copy number of a gene involved in the immune response and carried by the X chromosome (Chr). Unlike women, men have only one X Chr and one copy of this gene. However, we showed by different techniques that these patients had 10% of cells carrying 2 copies of this gene, and that this increase came from cells with 2 X Chr. Our research emphasizes the importance of the X Chr in autoimmunity and opens up a new field of investigation for men with AID.

Plusieurs stratégies thérapeutiques innovantes dans le traitement du cancer ciblent les Toll-like receptor (TLR) par l'utilisation d'agonistes synthétiques dont les plus utilisés ciblent les TLR7 et -9. Ces TLR sont exprimés de façon prédominante par les cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDC). Les pDC produisent de grandes quantités d'IFN de type I et peuvent cross-présenter des antigènes, permettant de faire le lien entre l'immunité innée et adaptative. Ces cellules sont donc un sujet d'investigation pour le développement de nouvelles immunothérapies anticancéreuses. Cependant, les voies de signalisation exactes induites après engagement du TLR7 chez les pDC humaines restent à être déterminées. Pour cela, nous avons étudié dans une première partie les voies de signalisation induites par des ligands de TLR7 dans les pDC humaines. Cette étude nous a permis de mettre en évidence une nouvelle voie de signalisation conduisant à l'expression rapide des gènes induits par l'IFN (ISG) et ce de façon indépendante de l'IFN de type I. Dans une deuxième partie, nous avons déterminé si cette voie particulière peut être induite dans les pDC après stimulation du TLR9 et nous nous sommes intéressés à identifier les facteurs signalétiques responsables de l'activation de cette voie de signalisation. Enfin, nous avons caractérisé les cellules dendritiques circulantes chez les patients porteurs de mélanome afin de savoir si ces cellules sont mobilisables et activables dans l'optique de la mise en place d'une immunothérapie ciblant les TLR. Ces travaux renforcent l'idée que les pDC constituent une cible de choix pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques anti-tumorales.

Les récepteurs Toll-like 7 et 8 jouent un rôle important dans l’activation de la réponse immunitaire innée et adaptative. Leur stimulation conduit à la production des cytokines pro-inflammatoires et d’interférons de type I. L’imiquimod et son dérivé le résiquimod sont les premières molécules de faible poids moléculaire décrites comme agonistes du TLR7 et TLR8. Ces deux molécules ont montré des activités anticancéreuses et adjuvantes très importantes. Récemment, les TLR 7 et 8 ont fait l’objet de plusieurs publications visant à développer de nouveaux agonistes TLR7 et/ou TLR8 dans la perspective d’être utilisés comme adjuvants vaccinaux. Malgré les rôles essentiels de TLR7 et TLR8 dans la stimulation du système immunitaire, une activation immunitaire chronique peut être responsable de plusieurs maladies infectieuses et auto-immunes. D’où l’importance de développer également des antagonistes TLR7 et/ou TLR8.Ce travail de thèse est consacré à la synthèse et le développement de nouvelles molécules hétérocycliques, analogues de l’imiquimod et de résiquimod, dans le but d’identifier de nouveaux ligands TLR7 et/ou TLR8. Des voies de synthèse innovantes, permettant une modulation chimique importante grâce à des couplages croisés pallado-catalysés, ont été mises au point et ont permis d’obtenir une cinquantaine de molécules appartenant à trois séries chimiques différentes de type imidazo[1,2-a]pyrazine, imidazo[1,5-a]quinoxaline et pyrazolo[1,5-a]quinoxaline. De nombreux essais d’alkylation ont été tentés sur ces trois séries chimiques afin d’introduire une large variété de substituants sur le cycle à cinq sommets. L’application du couplage croisé de Sonogashira nous a permis d’établir une liaison C-C et introduire diverses chaines alkyles. Ces composés ont été testés pour leur activité agoniste et antagoniste TLR7 et 8. Aucun des composés cibles n'a présenté d’activité agoniste TLR7 et TLR8, dans l'intervalle des concentrations testées. Par contre, tous les composés ont montré une activité antagoniste sélective du TLR7. Les composés les plus actifs, 5.35a et 5.35b, membres de la série pyrazolo[1,5-a]quinoxaline ont montré des IC50 de l’ordre de 10 μM. Ces résultats prometteurs nous ont permis la découverte d’une activité antagoniste TLR7 importante pour la série pyrazolo[1,5-a]quinoxaline, une série très peu développée dans la littérature. La modulation chimique des molécules actives nous permet de donner naissance à de nouveaux leaders, qui peuvent jouer un rôle important dans la thérapie de plusieurs maladies infectieuses et auto-immunes. / Toll-like receptors 7 and 8 play an important role in immune system activation. Their stimulation leads to the production of pro-inflammatory cytokines and type I interferons. Both receptors recognize viral ssRNA, as well as synthetic tricyclic imidazoquinoline derivatives such as imiquimod (TLR7 agonist) and resiquimod (TLR7/8 agonist). These two molecules showed significative anti-cancer and adjuvant activities. Many reports in the literature have been focused on the development of new TLR7/8 agonists belonging to different chemical series. These agonists strongly induce the production of T helper 1-polarizing cytokines and may therefore serve as promising candidate vaccine adjuvants. Despite the essential roles of TLR7 and TLR8 in the immune system stimulation, chronic immune activation may be responsible for several infectious and autoimmune diseases. Consequently, the development of TLR7 inhibitors may play an important role in the therapy of these diseases.In this study, we are interested in the synthesis and development of new heterocyclic molecules, analogs of imiquimod and resiquimod, in order to identify new TLR7 and/or TLR8 ligands. Different synthetic pathways have been developed, using cross coupling reactions, in order to obtain a wide variety of molecules belonging to three chemical series: imidazo[1,2-a]pyrazine, imidazo[1,5-a]quinoxaline et pyrazolo[1,5-a]quinoxaline. Various alkylation reactions were attempted on these three chemical series in order to introduce a wide variety of substituents on the five-membered ring. The application of Sonogashira's cross-coupling allowed us to establish a C-C bond and introduce various alkyl chains. All compounds have been tested for their TLR7/8 agonistic and antagonistic activity using HEK-Blue™-hTLR7/8 cells. The synthesized compounds are completely inactive as TLR7/8 agonists and are selective TLR7 antagonists. Two compounds of the pyrazolo[1,5-a]quinoxaline series, compound 5.35a and 5.35b, bearing butyl and isobutyl chain respectively, are potent and selective TLR7 antagonists with low micromolar IC50. Results allowed us to discover significative activity for the pyrazolo[1,5-a]quinoxaline series as selective TLR7 antagonists, which may therefore play an important role in the therapy of several infectious or autoimmune diseases.