Las proteínas quinasas p38 y JNK se activan por diversos tipos de estrés ambiental, tal como la radiación UV y el shock hiperosmótico, y regulan múltiples procesos biológicos, entre ellos la proliferación y la muerte celular. El conocimiento de algunas propiedades básicas de estas proteínas quinasas, como la ultrasensibilidad, histéresis y respuesta digital, es importante para el control de los procesos irreversibles. Resultados previos de nuestro grupo han mostrado que el estrés hiperosmótico induce apoptosis en los oocitos de Xenopus laevis y activación de las proteínas quinasas AMPK y JNK. Mediante el uso de este modelo celular, se muestra que p38 también se activa por shock hiperosmótico en los oocitos de Xenopus, que tiene un comportamiento ultrasensible, que no presenta histéresis, y que la activación a nivel de célula individual es bimodal. Por otro lado, se describe el papel de las proteínas quinasas de estrés p38 y JNK, así como la contribución de Smac/DIABLO y las calpaínas, en la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico. La inhibición de la vía de p38 con los compuestos SB203580 o BIRB796, o bien la inhibición de la vía de JNK con SP600125, no afectan a la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico, mientras que la inhibición simultánea de la vía de p38 y JNK con SP600125 + BIRB796 inhibe parcialmente la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3. El shock hiperosmótico induce la activación de p38α, p38β, y p38γ. La expresión de un constitutivo activo de MKK6 acelera la apoptosis inducida por shock hiperosmótico, efecto que es inhibido por SB203580 o por BIRB796. Además, la expresión de un constitutivo activo de p38 β acelera la activación de caspasa-3 y la salida de citocromo c inducida por el estrés osmótico, indicando que la isoforma β tiene un papel más pro-apoptótico que el resto de isoformas. La expresión de un constitutivo activo de MEKK1 acelera la apoptosis inducida por el shock osmótico, efecto que es parcialmente inhibido por SP600125 y con mayor claridad por SB203580 y BIRB796, indicando que ambas vías de señalización (JNK y p38) regulan la apoptosis de los oocitos. Por otro lado, el shock hiperosmótico induce la activación de JNK1-1 y JNK1-2 en los oocitos de Xenopus, y la expresión de un constitutivo activo de MKK7 junto con JNK1-1 o JNK1-2 acelera la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico. Además, el shock hiperosmótico induce la salida rápida de Smac/DIABLO mitocondrial y la activación de las calpaínas. La inhibición de las calpainas reduce la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3. El bloqueo de Smac/DIABLO inyectando un anticuerpo específico inhibe la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3, indicando que la salida temprana de Smac/DIABLO mitocondrial regula la salida tardía de citocromo c. El inhibidor general de caspasas Z-VAD.fmk retrasa la apoptosis inducida por el estrés hiperosmótico, de forma independiente a la caspasa-3, sugiriendo que alguna otra caspasa podría ser activada antes de la salida de citocromo c. En resumen, la activación sostenida de las proteínas quinasas de estrés p38 y JNK, junto a la salida rápida de Smac/DIABLO al citosol y la activación de las calpaínas son responsables de la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico. / p38 and JNK stress protein kinases are activated by different stimuli like UV and hyperosmotic shock, and regulate multiple biological processes, from proliferation to cell death. Some properties of signalling systems, like ultrasensitivity, hysteresis, and all-or-none responses at a single cell level, are considered to be basic for understanding the regulation of irreversible processes. Previous results in our group have shown that hyperosmotic stress induces apoptosis in Xenopus oocytes and activation of the stress protein kinases AMPK and JNK. Using this cell model, we show now that hyperosmotic shock activates the p38 signalling pathway in oocytes with an ultrasensitive and bimodal response in a time-dependent manner and without hysteresis. Furthermore, we describe the role of stress proteins kinases p38 and JNK, and the contribution of Smac/DIABLO and calpains in the apoptosis induced by hyperosmotic shock. Inhibition of the p38 pathway with the chemical compounds SB203580 or BIRB796, or inhibition of JNK pathway with SP600125 do not block hyperosmotic shock-induced apoptosis, while simultaneous inhibition of p38 and JNK pathways with SP600125 + BIRB796 partially reduces cytochrome c release and caspase-3 activation. Hyperosmotic shock induces activation of p38α, p38β, and p38γ. Expression of a constitutive active MKK6 accelerates apoptosis induced by hyperosmotic shock, an effect that is inhibited by SB203580 or BIRB796. Furthermore, expression of a constitutive active p38β accelerates the activation of caspase-3 and cytochrome c release induced by osmotic stress, indicating that the β isoform has a more pro-apoptotic role that other isoforms. Expression of a constitutive active MEKK1 accelerates apoptosis induced by osmotic shock, an effect that is partially inhibited by SP600125 and more clearly by SB203580 or BIRB796, indicating that both signaling pathways (JNK and p38) regulate apoptosis. Furthermore, hyperosmotic shock induces activation of JNK1-1 and JNK1-2 in Xenopus oocytes, and expression of a constitutive active MKK7 with JNK1-1 or JNK1-2 accelerates apoptosis induced by hyperosmotic shock. In addition, hyperosmotic shock induces rapid release of Smac/DIABLO from the mitochondria and calpain activation. The inhibition of calpains reduces cytochrome c release and caspase-3 activation. Blockage of Smac/DIABLO by injecting a specific antibody inhibits cytochrome c release and caspase-3 activation, indicating that early release of Smac/DIABLO regulates late citocrome c release. The general caspase inhibitor Z-VAD.fmk delays apoptosis induced by hyperosmotic stress, independently of caspase-3, suggesting that some other caspase might be activated before cytochrome c release. In summary, sustained activation of stress protein kinases JNK and p38, combined with rapid release of Smac/DIABLO into the cytosol and activation of calpains are responsible of the cell death induced by hyperosmotic shock.

Les partícules similars a virus (VLP) ofereixen un gran potencial com a candidates per a la nova producció de vacunes. En aquest treball es presenta el desenvolupament i l'optimització d'un protocol de producció de VLP de Gag d’VIH-1 mitjançant l'expressió gènica transitòria en cultius de cèl·lules HEK 293 en suspensió. La transfecció transitòria permet una generació ràpida de proteïnes recombinants en quantitat i qualitat suficient per realitzar assajos preclínics, i és particularment interessant en les fases primerenques del desenvolupament. Aquest treball es divideix en quatre capítols principals. Al primer capítol, el medi comercial lliure de sèrum Freestyle 293 s'optimitza mitjançant l'ús de components d'origen no animal. L'ús de medis químicament definits i sense components derivats d'animals és un requisit bàsic per una vacuna destinada als éssers humans. La densitat cel·lular màxima assolida utilitzant el medi de cultiu optimitzat (suplementat amb 0,9X de mescla de lípids, 19,8 mg/L d’insulina recombinant i 1,6 mg/L de transferrina recombinant) és 5,4×106 cèl·lules/ml en discontinu, gairebé el doble del que s’assoleix utilitzant el medi sense suplementar (2.9×106 cèl·lules / ml). A més a més, després de l'optimització del medi, també s'ha millorat el protocol de transfecció. La millor producció s’aconsegueix quan les cèl·lules es transfecten a la meitat de la fase logarítmica (2-3 x 106 cèl·lules/ml) amb recanvi de medi en el moment de la transfecció utilitzant 1 g/(ml de cultiu) d'ADN i 2 g/(mL de cultiu) de polietilenimina. Mitjançant l'ús d'aquest protocol, els títols de VLP es van incrementar 2,4 vegades, obtenint 2,7 × 109 VLP/ml. Tant el medi de cultiu optimitzat com el protocol de transfecció s'utilitzen a la resta del treball. Al capítol dos, la cinètica del procés de transfecció transitòria s'estudia amb l'objectiu de caracteritzar i comprendre el procés complet a nivell intracel·lular que condueix a la producció de VLP, per tal de determinar els punts importants per poder millorar el procés. Els poliplexes comencen a interactuar amb la membrana cel·lular just després de la seva addició al cultiu. Després d’una hora i mitja es detecten al citoplasma de les cèl·lules i arriben al nucli al voltant de 4 hores després de la transfecció. Després de 10 hores es pot detectar la fluorescència GFP dins de les cèl·lules, però no s'observa la sortida de les VLPs de les cèl·lules, per gemmació, fins 48 hores després de la transfecció. El moment òptim de recollida del producte s’ha fixat a les 72 hores post transfecció ja que la producció de VLPs és màxima mentre es manté una viabilitat del cultiu alta. Al capítol 3, s'estudia la millora de la producció de VLPs utilitzant compostos específics. Es proven dos grups de potenciadors de la transfecció, un grup utilitzat per facilitar l'entrada de complexes de ADN/PEI a la cèl·lula o al nucli i un altre grup seleccionat per augmentar els nivells d'expressió gènica. Entre els vuit additius utilitzats (tricostatina A, àcid valproic, butirat de sodi, DMSO, acetat de liti, cafeïna, hidroxiurea i Nocodazol) s’identifica una combinació òptima que permet obtenir el màxim d’expressió. L'addició de 20 mM d’acetat de liti, 3,36 mM d’acid valproic i 5,04 mM de cafeina augmenta els nivells de producció 4 vegades, mentre la viabilitat del cultiu es manté al 94%. Atès que l'expressió transitòria (TGE) es basa en l'expressió episomal d'ADN plàsmidic, està limitada a un període curt de producció, d’en general unes 96 h, fet que limita la productivitat. Al capítol 4, es desenvolupa un protocol nou, anomenat expressió gènica extesa (EGE). L'objectiu de l’EGE és perllongar el període de producció, combinant el recanvi de medi i la transfecció repetida del cultiu per millorar la producció de proteïnes. L'avantatge d'aquesta metodologia és avaluada per a la producció de tres productes recombinants model: la GFP intracel·lular, la GFP secretada, i una partícula similar a virus Gag-GFP (VLP). Utilitzant aquesta nova estratègia EGE, el període de producció es perllonga entre 192 i 240 h amb un augment de producció d’entre 4-12 vegades en els nivells de producció, depenent del tipus de producte considerat. / Virus-like particles (VLPs) offer great potential as candidates for new vaccine production. In this work, the development and optimization of an HIV-1 Gag VLP production protocol by transient gene expression in HEK 293 suspension cultures is presented. Transient transfection enables a rapid generation of recombinant proteins of sufficient quantity and quality to perform pre-clinical trials, and it is particularly VLP production, and to determine important time points to drive process improvement. Polyplexes start to interact with the cell membrane just after addition to the culture. After 1.5 hpt complexes are detected in the cytoplasm of the cells and reach the nucleus around 4 hours post transfection. After 10 hours post transfection GFP fluorescence is detected inside the cells, but generalized budding of VLPs from the cells is not observed until 48 hours post transfection. The optimal harvest time is determined as 72 hpt as VLP production is highest while high viability of the culture is maintained. In chapter three, the enhancement of VLP production using specific compounds is studied. Two main groups of transfection enhancers are tested, selected on the basis that they can either facilitate the entry of PEI/DNA transfection complexes into the cell or nucleus or they can increase the levels of gene expression. Among the eight transfection-enhancers tested (Trichostatin A, Valproic acid, Sodium Butyrate, DMSO, Lithium Acetate, Caffeine, Hydroxiurea and Nocodazole) an optimal combination of compounds exhibiting the greatest effect on gene expression is subsequently identified. The addition of 20 mM Lithium Acetate, 3.36 mM Valproic Acid and 5.04 mM Caffeine increases production levels by 4 fold, while maintaining cell culture viability at 94 %. As transient gene expression (TGE) is based on episomal plasmid DNA expression, conventional TGE is limited to a short production period of usually about 96 h, therefore limiting productivity. In chapter four, a novel gene expression approach termed extended gene expression (EGE) is proposed. The aim of EGE is to prolong the production period by the combination of medium exchange and repeated transfection of cell culture with plasmid DNA to improve overall protein production. The benefit of this methodology is evaluated for the production of three model recombinant products: intracellular GFP, secreted GFP, and a Gag-GFP virus-like particle (VLP). Using this novel EGE strategy, the production period is prolonged between 192 and 240 h with a 4–12-fold increase in production levels, depending on the product type considered. interesting in the early development phases. This work is divided in four main chapters. In the first chapter, the serum-free commercial medium Freestyle 293 is optimized using non-animal derived components as supplements. The use of chemically defined animal derived component free media and supplements is a basic requirement for any further use of a vaccine for humans. The maximum cell density attained using the optimized medium (supplemented with 0.9X of Lipid mixture, 19.8 mg/L of r-insulin and 1.6 mg/L of r- transferrin) was 5.4 × 106 cells/mL in batch mode, almost double of that observed using the unsupplemented medium (2.9×106 cells/mL). Moreover, after the medium optimization, the transfection protocol is also improved. Best production performance is attained when cells were transfected at mid-log phase (2–3 × 106 cells/mL) with medium exchange at the time of transfection using 1 μg/(mL of culture) of plasmid DNA and 2 μg/(mL of culture) of polyethylenimine. By using this protocol, VLP titers are increased 2.4-fold, obtaining 2.7 × 109 VLPs/mL. The optimized medium and transfection protocol defined in this chapter are used in the rest of the work. In chapter two, the kinetics of the transient transfection process is studied with the aim to characterize and understand the complete process at intracellular level leading to the this methodology is evaluated for the production of three model recombinant products: intracellular GFP, secreted GFP, and a Gag-GFP virus-like particle (VLP). Using this novel EGE strategy, the production period is prolonged between 192 and 240 h with a 4–12-fold increase in production levels, depending on the product type considered.

Un dels mecanismes implicats en la regulació de l'activitat de les proteïnes de la superfície cel·lular s'anomena shedding i consisteix en un tall proteolític que dóna lloc a l'alliberament de la regió extracel·lular d'aquestes. Aquest mecanisme està molt especialitzat i és bàsicament responsabilitat de la superfamília de metal·loproteases dependents de zinc anomenada metzincina, la qual inclou les metal·loproteases de matriu extracel·lular (MMPs) i les ADAM (A Disintigrin And Metalloprotease domain). Aquestes últimes, les proteases de la família ADAM, s'han relacionat amb tumorogènesi ja que alguns dels seus membres se sobreexpressen en tumors procedents d'una gran varietat de teixits. Tenint en compte aquesta dada diversos grups de recerca han iniciat assajos clínics amb inhibidors d'aquestes proteases que inesperadament han fracassat. L'explicació a aquest resultats la trobem, probablement, a la complexitat funcional de les ADAM deguda a la diversitat de molècules que formen el seu degradoma i, també, al desconeixement de part dels components d'aquest conjunt. Un dels membres més importants de la família ADAM, degut a la seva sobreexpressió en determinats tumors, i més ben estudiada en el laboratori és ADAM17. Aquesta proteasa té com a substrat a un factor de creixement que juga un paper important en la tumorogènesi anomenat proTGF-?. El shedding d'aquest factor de creixement és crític ja que només així s'obté la seva forma soluble activa. Donats aquests antecedents i amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement del paper d'ADAM17 en la tumorogènesi ens varem plantejar, per una banda, estudiar el paper de l'endocitosi en la regulació de la disponibilitat de proTGF-? per part d'ADAM17 a la superfície cel·lular i, per l'altra, la identificació de nous substrats d'ADAM17, mitjançant la tècnica proteòmica del DIGE (Differential Gel Electrophoresis). Els resultats del primer punt ens varen permetre concloure que proTGF-? és un factor de creixement que regula els seus nivells a la superfície cel·lular mitjançant la seva endocitosi i posterior reciclatge. A més a més, també varem poder observar que el domini citoplasmàtic de proTGF-? és important en el control de l'endocitosi ja que la seva absència clarament bloquejava aquest procés donant lloc a un increment del factor de creixement a la superfície cel·lular. Per altra banda, l'absència del domini citoplasmàtic no interfereix en la capacitat d'ADAM17 per tallar proteolíticament proTGF-? però si que incrementa la capacitat del factor de creixement per activar el seu receptor. Tot això indica que el domini citoplasmàtic del factor de creixement controla la disponibilitat de proTGF-? a la superfície cel·lular i, per tant, la capacitat de produir la seva forma activa.Respecte al segon objectiu, els resultats obtinguts varen permetre identificar tres substrats de shedding: El receptor de transferrina (TfnR) i les molècules d'adhesió desmogleina 2 (Dsg-2) i ALCAM els quals es varen confirmar com a substrats mitjançant western-blot. En el cas de la Dsg-2 varem determinar que és substrat d'ADAM17 només en condicions de sobreexpressió de la metal·loproteasa mentre que ADAM10 és la principal responsable del seu shedding. Respecte a la regulació del shedding de Dsg-2 hem demostrat que l'EGF augmenta el seu processament proteolític. Cal dir també que hem caracteritzat una nova forma de Dsg-2 que no té el domini citoplasmàtic. Molt probablement la seva formació es degui a l'activitat d'una proteasa desconeguda que no hem aconseguit caracteritzar. En el cas d'ALCAM és ADAM17 la principal responsable del seu shedding. L'estudi de la regulació del seu tall proteolític ens ha permès determinar que en condicions d'elevada confluència cel·lular augmenta el shedding d'aquesta molècula d'adhesió. / Protein ectodomain shedding is a mechanism involved in the regulation of the activity of a variety of cell surface molecules consisting in a specialized type of limited proteolysis that releases the extracellular domain of these proteins. The shedding events are basically responsibility of zinc-dependent metalloproteases of the metzincin superfamily, which includes the ADAM (A Disintigrin And Metalloprotease domain) and the matrix metalloproteases (MMPs) families. The ADAM familiy of metalloproteases have been involved in tumorigenesis since most of them are overexpressed in a wide variety of tumors. Therefore, different inhibitors of metalloproteases have been used in clinical assays which were terminated prematurely because of patients showed no survival benefits. These results were probably due either to the functional complexity of the substrates or perhaps to the ignorance of the degradome of ADAMs. On the other hand, ADAM17, probably the best known member of the ADAMs family, is the responsible for the shedding of the growth factor proTGF-? which has been also involved in tumorigenesis. It is important to know that the shedding of proTGF-?, which happens in the cell surface, is extremely important since the growth factor is active only when shed. Thus, taken all together, the aims of this work were, first, to analyze how the endocytosis regulates the availability of proTGF-? in the cell surface and, secondly, to identify new substrates of ADAM17 by DIGE (Differential Gel Electrophoresis).The results of the first aim allowed us to conclude that both endocytosis and recycling of endocytic vesicles to the cell surface regulate the availability of proTGF-? in the plasma membrane. Moreover, the cytoplasmic domain of proTGF-? regulates the endocytosis of the growth factor since its absence completely blocks its internalization. Finally, the accumulation of proTGF-? as a consequence of the inhibition of the endocytosis leads to an overactivation of its receptor.The results of the second aim allowed us to identify new substrates of shedding: The transferrin receptor (TfnR) and two adhesion molecules so-called ALCAM and Desmoglein 2 (Dsg-2). All of them were confirmed by western-blot. The main metalloprotease responsible for the shedding of Dsg-2 is ADAM10 while ADAM17 sheds it only when overexpressed. Concerning to the regulation of the shedding of Dsg-2 is important to note that EGF can activate it. Moreover, we characterized a new form of Dsg-2, which lacks of the intracellular domain, whose formation is due most likely to the activity of an unknown intracellular protease.In the other hand, the main metalloprotease responsible for the shedding of ALCAM is ADAM17. Furthermore, the analysis of the mechanisms involved in the regulation of the shedding allowed us to conclude that it increases concomitantly to the increase of cell density.

La posibilidad de obtener proteínas con aplicaciones industriales o terapéuticas mediante la tecnología del DNA recombinante ha revolucionado la industria biotecnológica. A pesar de esto, la producción de proteínas recombinantes en sistemas heterólogos aún no está optimizada, y muchas veces estas proteínas se obtienen en forma insoluble. La selección de un sistema de expresión adecuado es importante para conseguir obtener la proteína en una forma funcional y soluble. En esta tesis se ha utilizado una GFP recombinante como proteína modelo para estudiar agregación y actividad durante la producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli y en el sistema de expresión de baculovirus.Al producir nuestra proteína modelo en E. coli, ésta se obtiene mayoritariamente en forma de cuerpos de inclusión con una elevada actividad biológica. Nuestros resultados indican que aunque es posible mejorar la solubilidad de la proteína optimizando parámetros del proceso de producción, las condiciones que permiten mejorar los niveles de producción resultan en una disminución de la calidad conformacional de la proteína obtenida. Ya que no es posible maximizar al mismo tiempo el rendimiento del proceso de producción y la calidad de la proteína obtenida, el diseño del proceso deberá optimizarse en función del parámetro más relevante para el uso final de la proteína.Además, la versión soluble de esta proteína contiene una amplia gama de agregados solubles, que conforman una población heterogénea en cuanto a estructura secundaria y funcionalidad. Esto indica que los cuerpos de inclusión, que son más homogéneos que su versión soluble, pueden entenderse como una pequeña subpoblación dentro del total de especies proteicas recombinantes. Por otra parte, la calidad de la proteína recombinante representa un promedio estadístico de la calidad de cada una de estas especies.Una de las estrategias más utilizadas para mejorar la solubilidad de proteínas recombinantes consiste en la coexpresión de moduladores del plegamiento. Al coexpresar la chaperona bacteriana DnaK y su cochaperona DnaJ con nuestra GFP modelo producida en E. coli, observamos una disminución de la agregación, que estaba asociada a proteólisis. El cambio de huésped de estas chaperonas juntamente con nuestra proteína modelo para producirlas en el sistema de expresión de baculovirus en células de insecto o larvas permitió mantener la actividad foldasa de DnaKJ eliminando su actividad proteolítica asociada, ya que ésta es dependiente de proteasas bacterianas. En el sistema de expresión de baculovirus observamos mejoras en los niveles de proteína total y soluble, la estabilidad proteolítica, solubilidad y actividad biológica al ser coexpresada con las chaperonas bacterianas DnaKJ. Además, hemos podido confirmar en un sistema eucariota el concepto de que el rendimiento y la calidad de la proteína obtenida son parámetros antagónicos que no se pueden favorecer de forma simultánea en procesos de producción.Por último, también hemos podido comprobar que las chaperonas bacterianas son funcionales en un sistema eucariota. Esto permite ampliar el catálogo de moduladores del plegamiento disponibles para su uso en sistemas eucariotas. / Recombinant DNA technology boosted the production of recombinant proteins with industrial or therapeutic applications, which transformed biotechnological industry. Despite this, recombinant protein production in heterologous systems is not yet optimized, and these proteins are often obtained as insoluble deposits. Choice of an appropriate expression system is important for proteins to be produced in a soluble and functional form. In this thesis, a recombinant GFP has been used as a model protein to study aggregation and biological activity during recombinant protein production in Escherichia coli and the baculovirus expression system.In E. coli, our model protein is obtained mainly as highly active inclusion bodies. Our results show that although protein solubility can be enhanced by optimizing several parameters in the production process, conditions promoting high production levels result in decreased conformational quality of the protein. Since it is not possible to enhance simultaneously production yield and quality, process design should be optimized depending on the most relevant feature for the final use of the protein.Moreover, the soluble version of this protein contains a wide range of soluble aggregates, which constitute a heterogeneous population regarding secondary structure and functionality of the protein. This indicates that inclusion bodies, being more homogeneous than their soluble counterparts, can be regarded as a narrow subpopulation among all the recombinant protein species. Moreover, the quality of the recombinant protein represents a statistical average of the quality of each of these species.One of the most widely used strategies to improve solubility of recombinant proteins consists of coexpressing folding modulators. When the bacterial chaperone pair DnaK/DnaJ was coexpressed in E. coli together with our model GFP, we observed a decrease in aggregation, which was associated to proteolysis. Rehosting of these chaperones, together with our model protein, to the baculovirus expression system (using either cultured insect cells or larvae as hosts) allowed us to maintain the foldase activity of DnaKJ while avoiding their associated proteolytic activity, as it is dependent on bacterial proteases. By using the baculovirus expression system, we observed enhanced production levels (both total and soluble), proteolytic stability, solubility and biological activity of our recombinant protein when it was coexpressed with bacterial chaperones DnaKJ. Furthermore, the concept that yield and quality of the recombinant protein are antagonistic parameters that cannot be favored simultaneously in production processes has been proven in a eukaryotic system.Finally, we have also demonstrated that bacterial chaperones are functional in a eukaryotic system. This expands the catalogue of folding modulators available for eukaryotic systems.

La present Tesi Doctoral es troba focalitzada en les anàlisis isotòpiques del carboni i del nitrogen. L’objectiu principal és l’estudi dels patrons dietètics i, per extensió, dels patrons socioeconòmics de les comunitats del neolític mig del nord-est de la Península Ibèrica. Per a contextualitzar els resultats obtinguts, en primer lloc, s’han valorat diacrònicament les transformacions ocorregudes en els patrons de subsistència de les comunitats peninsulars des del mesolític fins al calcolític i, finalment, s’han comparat els resultats obtinguts amb altres sèries neolítiques peninsulars i de la resta d’Europa. Les noves dades isotòpiques mostren que els individus presentaven una dieta basada en recursos terrestres de cicle C3, on el principal component proteic procedia dels cereals i dels llegums cultivats i, en segona instància, dels derivats làctics procedents del bestiar domèstic. Aquests resultats també han posat de manifest un seguit de diferències alimentàries, tant intra com interpoblacionals, que han portat a evidenciar: l’existència d’una estructuració de les societats definida en funció del sexe, l’edat o la posició social; així com la importància del factor social en l’elecció de les activitats de subsistència seguides per cada comunitat. Les transformacions esdevingudes en els patrons de subsistència des del mesolític mostren la clara tendència cap a un menor consum de recursos marins i d’aigua dolça per part de les comunitats neolítiques, així com una important homogeneïtzació dietètica caracteritzada per l’adopció de l’agricultura i la ramaderia com a font de subsistència. Aquestes evidències es troben en consonància amb d’altres estudis de comunitats neolítiques europees. Finalment, a partir de l’estudi diacrònic, també s’ha pogut apreciar l’especialització de les activitats agrícoles i ramaderes, que comportà un important increment demogràfic, una major estructuració social i el creixement dels assentaments a partir del calcolític. La present Tesi Doctoral aporta, doncs, dades rellevants per a un millor coneixement de les comunitats neolítiques peninsulars i europees, tot oferint una visió global sobre el mode de vida de les comunitats prehistòriques. / The present PhD Thesis is focused on carbon and nitrogen stable isotope analysis. The main objective is to study the diet and socio-economic patterns of the Middle Neolithic communities in the northeast of the Iberian Peninsula. A geographic and chronological comparisons were made in order to assess the diachronic transformations in diet occurred from the Mesolithic to the Chalcolithic, and to define the differences and similarities with other Iberian and European series. The new isotopic data show that a diet based on C3 terrestrial resources is common to all the communities. The main protein component in the diet came from cultivated cereals and legumes and, to a lesser extent, from resources obtained from livestock, such as dairy products and occasionally meat. The results also highlighted a number of intra and inter-population differences in diet. These differences show the existence of social differentiations as regards the consumption of certain kinds of food, as well as the importance of the social factor in choosing the subsistence activities used by each community. A general tendency towards a lesser use of aquatic resources is seen from the Mesolithic to the Neolithic in Iberia and the rest of the Mediterranean, as well as a dietary homogenization characterized by the adoption of agriculture and livestock practices. These evidences were also documented for contemporary communities in the west and north of Europe. Finally, the diachronic study also assess the increasing expertise in farming activities, which led to a significant population growth, an increased social structure and the growth of the settlements from the Chalcolithic. The data presented in this PhD Thesis are relevant for a better understanding of European Neolithic communities, offering an overview of the way of life of the prehistoric communities.

La present tesi està formada per sis treballs de recerca independents que estan situats en el camp dels inhibidors de metal·locarboxipeptidases: s'estudia el seu plegament, estabilitat, estructura i funció. El primer treball inclou l'aïllament i el clonatge de l'ADNc d'un nou inhibidor de carboxipeptidases de la paparra, anomenat TCI. Els estudis realitzats sobre la forma recombinant del TCI indiquen que aquesta proteïna està fortament limitada pels seus ponts disulfur, sent molt estable enfront un ampli rang de pH i altament resistent a condicions desnaturalitzants. El TCI recombinant és un inhibidor que s'uneix fortament a TAFIa, estimulant així la fibrinòlisi in vitro, fet que li confereix potencial en aplicacions de prevenció o tractament de desordres trombòtics.El segon treball presenta l'estructura cristal·lina del TCI unit a la carboxipeptidasa A bovina i a la carboxipeptidasa B humana. El TCI està format per dos dominis que són estructuralment molt semblants a pesar de tenir un baix grau d'homologia seqüencial. Cada domini inclou una hèlix a curta seguida per una petita fulla b antiparal·lela girada i presenta una alta homologia estructural enfront proteïnes de la família de les b-defensines. El TCI s'ancora a la superfície de les carboxipeptidases de mamífer en un mode d'unió doble que no s'havia observat abans per cap altre inhibidor de carboxipeptidases.En el tercer treball s'examina la contribució de cadascun dels aminoàcids del lloc d'unió secundari de l'inhibidor de carboxipeptidases de patata (PCI) de cara a les propietats generals d'aquesta proteïna. Els estudis estructurals i enzimàtics demostren que el posicionament correcte del lloc d'unió primari per una unió i inhibició eficient de la carboxipeptidasa A depèn significativament del lloc d'unió secundari. A més, l'estudi comparatiu del plegament oxidatiu d'una sèrie de mutants del PCI utilitzant una aproximació de captura dels ponts disulfur indiquen que les forces no covalents dirigeixen el replegament d'aquesta petita proteïna rica en ponts disulfur a l'etapa de "reshuffling", que és el pas limitant del procés de plegament del PCI.En el quart treball s'ha determinat els camins de plegament oxidatiu i desplegament reductor de l'inhibidor de carboxipeptidases de sangonera (LCI). L'LCI reduït i desnaturalitzat és replega ràpidament a través d'un flux seqüencial d'espècies amb un, dos, tres i quatre ponts disulfur fins assolir la forma nativa. Dins dels intermediaris de plegament de l'LCI hi trobem dues espècies predominants de tres ponts disulfur (anomenades III-A i III-B) i una població heterogènia d'isòmers "scrambled" (quatre ponts disulfur no natius) que s'acumulen consecutivament al llarg de la reacció de plegament. Aquest estudi revela que les formes III-A i III-B contenen exclusivament ponts disulfur natius i corresponen a espècies estables i parcialment estructurades que s'interconverteixen entre elles assolint l'equilibri abans que la formació dels isòmers "scrambled" tingui lloc. En el cinquè treball s'ha purificat l'intermediari III-A directament de la reacció de plegament i se l'ha caracteritzat estructuralment per RMN. Els resultats mostren que aquesta espècie presenta una estructura força nativa, tot i que li manquen alguns elements d'estructura secundària per la qual cosa és més flexible que l'LCI natiu. III-A representa el primer exemple d'un intermediari "disulfide insecure" ("ponts disulfur insegurs") determinat estructuralment. L'oxidació directa d'aquesta espècie cap a la proteïna totalment nativa sembla estar restringida per l'enterrament de les seves dues cisteïnes dins d'una estructura semblant a la nativa. També s'han utilitzat aproximacions teòriques basades en constriccions topològiques que prediuen força bé la presència d'aquest intermediari de plegament. L'últim treball d'aquesta tesi tracta sobre l'altre intermediari majoritari de plegament de l'LCI. En aquest treball s'ha construït i analitzat extensivament un anàleg d'aquest intermediari. Els resultats obtinguts mostren que aquesta proteïna presenta una estructura global i una activitat semblants a les de la forma salvatge de l'LCI. A més, presenta un procés de plegament més ràpid i eficient que l'LCI salvatge. Tanmateix, aquest anàleg està fortament desestabilitzat, fet que indica que el quart pont disulfur dóna alta estabilitat i especificitat estructural a l'LCI. / The present thesis consists of six independent research works that are situated in the field of metallocarboxypeptidase inhibitors: their folding, stability, structure and function are studied. The first work comprises the isolation and cDNA cloning of a new carboxypeptidase inhibitor from ticks, named TCI. The studies performed on the recombinant form of TCI indicate that this protein is strongly constrained by its disulfide bonds, being unusually stable over a wide pH range and highly resistant to denaturing conditions. As a tight binding inhibitor of TAFIa, TCI stimulates fibrinolysis in vitro and thus may have potential for applications to prevent or treat thrombotic disorders.The second work presents the crystal structure of TCI in complex with either bovine carboxypeptidase A or human carboxypeptidase B. The structure of TCI consists of two domains that are structurally similar despite the low degree of sequence homology. The domains, each consisting of a short a-helix followed by a small twisted antiparallel b-sheet, show high structural homology to proteins of the b-defensin-fold family. Also, TCI anchors to the surface of mammalian carboxypeptidases in a double-headed manner not previously seen for carboxypeptidase inhibitors. In the third part, the role of each residue of the secondary binding site of potato carboxypeptidase inhibitor (PCI) in the folding, structure and function of this protein is determined. Structural and enzymatic studies demonstrate that the proper positioning of the primary site for efficiently binding and inhibition of carboxypeptidase A is significantly dependent on such a secondary contact region. In addition, a comparative study of the oxidative folding of several PCI mutants indicates that noncovalent forces drive the refolding of this small disulfide-rich protein at the reshuffling stage, the rate-limiting step of the process. The fourth work elucidates the oxidative folding and reductive unfolding pathways of leech carboxypeptidase inhibitor (LCI). Reduced and denatured LCI refolds rapidly through a sequential flow of 1-, 2-, 3-, and 4-disulfide (scrambled) species to reach the native form. Folding intermediates of LCI comprise two predominant 3-disulfide species (III-A and III-B) and a heterogeneous population of scrambled isomers that consecutively accumulate along the folding reaction. Our study reveals that forms III-A and III-B exclusively contain native disulfide bonds and correspond to stable and partially structured species that inter-convert, reaching an equilibrium prior to the formation of the scrambled isomers. In the fifth work, the III-A intermediate is directly purified from the folding reaction and structurally characterized by NMR spectroscopy. The data shows that this species displays a highly native-like structure although it lacks some secondary structure elements being more flexible than native LCI. III-A represents the first structurally determined example of a disulfide insecure intermediate; direct oxidation of this species to the fully native protein seems to be restricted by the burial of its two free cysteine residues inside a native-like structure. We show also that theoretical approaches based on topological constrains predict with good accuracy the presence of this folding intermediate. The last work of this thesis deals with the other major folding intermediate of LCI: III-B intermediate. In this work, an analog of this intermediate is constructed and extensively analyzed. The derived data shows that this protein displays the same overall structure, a similar activity, a faster and more efficient folding process than wild-type LCI, but a lower stabilization, which indicates that the fourth disulfide bond provides LCI with both high stability and structural specificity.

La malaltia de la bursitis infecciosa, o alaltia de Gumboro, és una patologia aviària d'origen viral que afecta principalment les cries d'aus. En les granges de cria d'aviram, el virus que la origina, l'IBDV, provoca una elevada mortalitat en els pollastres. La determinació de l'estructura tridimensional a alta resolució de la proteïna de la càpside d'aquest virus, la VP2, ha permès caracteritzar alguns dels elements que medien l'assemblatge i l'estabilitat de la càpside viral. També s'han identificat els residus implicats en la formació de cossos d'inclusió, que confereixen resistència a les partícules virals en l'entorn extracel·lular. D'altra banda, la determinació de l'estructura tridimensional de la polimerasa del virus, la VP1, ha aportat noves dades sobre la iniciació de la polimerització i sobre la regulació de la seva activitat per part de la VP3, la proteïna encarregada de la coordinació del cicle viral. / The infectious bursal disease, also known as Gumboro disease, is an avian pathology that affects broilers and chicks. In chicken farms, this virus, called IBDV, is responsible for high mortalities. The tridimensional structure determination at atomic resolution of this virus capsid protein, VP2, allowed us to characterize some of the elements that mediate the capsid assembly and stabilization. Furthermore, the residues implicated in the formation of inclusion bodies, that provide extra resistance to the virus in the extracellular stage, have been identified. Moreover, the tridimensional structure determination of the viral polymerase, VP1 protein, brought some light on the mechanisms involved in polymerization initiation and regulation of the activity mediated by VP3, the viral cycle coordination protein.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo y la principal causa de demencia en la vejez. El deterioro cognitivo en la EA se correlaciona con la disfunción sináptica y la pérdida de neuronas. Además de los síntomas clásicos de deterioro de la memoria episódica, los pacientes con demencia desarrollan déficits en el procesamiento de la memoria asociativa emocional y el condicionamiento del miedo. La vía de señalización de la proteina de unión al elemento de respuesta a cAMP (CREB) regula programas de expresión génica implicados en la plasticidad sináptica y la memoria. Evidencias recientes sugieren que la desregulación de vía de señalización de CREB mediada por cAMP/Ca2+ afecta negativamente a la plasticidad sináptica en el hipocampo, la memoria y la pérdida de sinapsis en modelos experimentales de Alzheimer. En esta tesis doctoral, se investigó el papel específico del coactivador transcripcional CREB regulated transcription coactivator (CRTC1) en la memoria asociativa en condiciones fisiológicas y patológicas. El condicionamiento contextual induce la rápida translocación de CRTC1 desde el citosol al núcleo en neuronas en las regiones CA1 y CA3 del hipocampo del ratón adulto. La translocación nuclear de CRTC1 está asociada con la desfosforilación de CRTC1 en la Serina 151, mientras que la fosforilación de CREB es independiente de la asociación contexto-shock. La desfosforilación de CRTC1 en Ser151 se induce específicamente en el hipocampo por el contexto condicionado pero no por la exposición al contexto o el shock. Además, el condicionamiento contextual, pero no la exposición al contexto o el shock induce la expresión de genes dependientes de CREB/CRTC1. En particular, la reducción de la translocación nuclear de CRTC1 y la transcripción de genes dependiente de CRTC1 está asociada a los déficits de memoria contextual a largo plazo en un modelo murino de neurodegeneración knockout de los genes de la presenilina 1 y 2 (PS cDKO). Además, la expresión mediante virus adeno-asociados de CRTC1 en el hipocampo revierte los déficits en la transcripción de genes dependientes de CRTC1 y los déficit de memoria asociativa. Por último, el análisis de hipocampos humanos post mortem muestra una disminución de los niveles de CRTC1 en estadios patológicos intermedios de Alzheimer Braak III/IV. Estos resultados revelan un papel crítico de la translocación nuclear de CRTC1 en la transcripción de genes implicados en la codificación de la memoria contextual en condiciones fisiológicas y de neurodegeneración. / Alzheimer´s disease (AD) is an age-dependent neurodegenerative disorder and the main cause of dementia in the elderly. Cognitive decline in AD correlates with synaptic dysfunction and neuron loss. Besides the classical episodic memory impairment symptoms, dementia patients develop deficits in encoding and retrieval of emotional associative memory and fear conditioning. The cAMP-response element binding protein (CREB) signaling pathway regulates gene expression programs mediating synaptic plasticity and memory. Recent evidences suggest that deregulation of cAMP/Ca2+-mediated CREB signaling negatively affect hippocampal synaptic plasticity, memory and synapse loss in AD models. In this doctoral thesis, we investigated the specific role of the CREB transcriptional coactivator Crtc1 in associative memory in physiological and pathological conditions. By using fear conditioning, we found that context conditioning induces rapid translocation of Crtc1 from the cytosol to the nucleus of neurons in the CA1 and CA3 regions of the adult mouse hippocampus. Crtc1 nuclear translocation is associated with Crtc1 dephosphorylation, whereas Creb phosphorylation is induced independently of a paired unconditioned stimulus. Interestingly, Crtc1 dephosphorylation is induced specifically in the hippocampus by context conditioning but not by context encoding or shock stimuli. Contextual conditioning but not context encoding or shock up regulates gene expression levels in a Crtc1-dependent manner. Notably, reduced Crtc1 nuclear translocation and Crtc1-dependent transcription is associated with long-term contextual memory impairments in a mouse model of neurodegeneration lacking the presenilin genes (PS cDKO). In addition, adeno-associated viral-Crtc1 gene transfer in the hippocampus reverses hippocampal Crtc1-dependent transcription changes and associative memory deficits. Finally, post mortem analysis shows that CRTC1 levels are reduced in human hippocampus at intermediate Braak III/IV pathological stages. These findings reveal a critical role of Crtc1 nuclear translocation and transcriptional function in contextual memory encoding in physiological and neurodegenerative conditions.

Les malalties cardiovasculars són una de les majors causes de mortalitat a escala mundial. L’infart de miocardi és el principal responsable de les cardiopaties isquèmiques. La irrigació sanguínia al cor es veu bloquejada degut a una oclusió en un capil•lar sanguini provocant mort cel•lular massiva que genera una zona miocardíaca necròtica. En la última dècada, la medicina cardíaca regenerativa s’ha focalitzat en estratègies fonamentades en l’enginyeria de teixits i la teràpia cel•lular basada en cèl•lules mare. En aquest treball, hem caracteritzat el potencial cardíac de diferents tipus cel•lulars cultivats en bastides tri-dimensionals (3D) generades a partir de l’hidrogel peptídic RAD16-I. En primer lloc, hem estudiat l’adquisició de potencial mesenquimàtic de fibroblasts humans de dermis (hNDFs) en cultius 3D i la seva diferenciació subseqüent a llinatges adipogènic i cardiogènic. Únicament els hNDFs cultivats en hidrogels de RAD16-I adquireixen una potenciació mesenquimàtica. Les cèl•lules adopten espontàniament propietats semblants a les cèl•lules mare mesenquimàtiques mentre que la diferenciació a adipogènesis i cardiogènesis requereix medi d’inducció. En segon lloc, hem comparat el grau de diferenciació cardíaca de cèl•lules mare humanes pluripotents induïdes (hiPSCs) cultivades en ambients 2D versus 3D i hem avaluat l’efecte de l’àcid ascòrbic (AA) en el procés. En el nostre treball i com ja s’havia demostrat en publicacions prèvies, l’AA va resultar accelerar i millorar la diferenciació cardíaca de hiPSCs en cultius 2D. A més, els resultats presentats suggereixen que les hiPSCs cultivades en 3D augmenten el seu grau de diferenciació i adquireixen un potencial cardiogènic 105 vegades més elevat que en els cultius 2D. En tercer lloc, hem dissenyat un pegat cardíac basat en cultius 3D de cèl•lules adultes porcines progenitores del teixit adipós del mediastí (pMATPCs) injectats en matrius naturals (pericardi humà descel•lularitzat). Hem implantat la bio-pròtesis miocardíaca in vivo i hem determinat que la bio-bastida afavoreix la migració cel•lular i la regeneració de la zona infartada en el model porcí. En conclusió, hem analitzat el potencial cardiogènic de cèl•lules adultes somàtiques (hNDFs), cèl•lules mare adultes (pMATPCs) i cèl•lules mare pluripotents (hiPSCs) en cultius 3D basats en hidrogels de RAD16-I per a futures aplicacions en el tractament de malalties cardíaques. / Las enfermedades cardiovasculares son una de las mayores causas de mortalidad a escala mundial. El infarto de miocardio es el principal responsable de las cardiopatías isquémicas. La irrigación sanguínea al corazón se ve bloqueada debido a una oclusión en un capilar sanguíneo provocando muerte celular masiva que genera una zona miocárdica necrótica. En la última década, la medicina cardíaca regenerativa se ha focalizado en estrategias fundamentadas en la ingeniería de tejidos y la terapia celular basada en células madre. Es este trabajo, hemos caracterizado el potencial cardíaco de distintos tipos celulares cultivados en andamios tridimensionales (3D) generados a partir del hidrogel peptídico RAD16-I. En primer lugar, hemos estudiado la adquisición de potencial mesenquimático de fibroblastos humanos de dermis (hNDFs) en cultivos 3D y su diferenciación subsecuente a linajes adipogénico y cardiogénico. Únicamente los hNDFs cultivados en hidrogeles de RAD16-I adquieren una potenciación mesenquimática. Las células adoptan espontáneamente propiedades parecidas a las células madre mesenquimáticas mientras que la diferenciación a adipogénesis y cardiogénesis requiere medio de inducción. En segundo lugar, hemos comparado el grado de diferenciación cardíaca de células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) cultivadas en ambientes 2D versus 3D y hemos evaluado el efecto del ácido ascórbico (AA) en el proceso. En nuestro trabajo y como ya se había demostrado en publicaciones previas, el AA resultó acelerar y mejorar la diferenciación cardíaca de hiPSCs en cultivos 2D. A demás, los resultados presentados sugieren que las hiPSCs cultivadas en 3D aumentan su grado de diferenciación y adquieren un potencial cardiogénico 105 veces más elevado que en los cultivos 2D. En tercer lugar, hemos diseñado un parche cardíaco basado en cultivos 3D de células adultas porcinas progenitoras del tejido adiposo del mediastino (pMATPCs) inyectados en matrices naturales (pericardio humano descelularizado). Hemos implantado la bio-prótesis miocárdica in vivo y hemos determinado que el bio-andamio favorece la migración celular y la regeneración de la zona infartada en el modelo porcino. En conclusión, hemos analizado el potencial cardiogénico de células adultas somáticas (hNDFs), células madre adultas (pMATPCs) y células madre pluripotentes (hiPSCs) en cultivos 3D basados en hidrogeles de RAD16-I para futuras aplicaciones en el tratamiento de enfermedades cardíacas. / Cardiac failure is the primary cause of mortality throughout the world. One of the leading causes of heart failure is myocardial infarction, which results from a reduced flow of blood to a part of the heart. This leads to cardiomyocyte death and myocardial necrosis. In the past decade, various strategies for cardiac reparative medicine have been investigated, from tissue engineering to stem cell-based therapy. Herein, we characterized the cardiac potential of different cell types cultured in three-dimensional (3D) scaffolds based on the peptide hydrogel RAD16-I. Firstly, we studied the mesenchymal potential acquisition of human Normal Dermal Fibroblasts (hNDFs) in 3D cultures and further commitment into adipogenic and cardiogenic lineages. We suggest that only hNDFs cultured in RAD16-I hydrogels undergo a mesenchymal potentiation. Cells spontaneously acquired mesenchymal stem cell-like properties whereas they required induction media to differentiate into adipogenic- and cardiogenic-like lineages. Secondly, we compared the degree of cardiac commitment of human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) when cultured in 2D versus 3D and the effect of ascorbic acid (AA), which has been proven to promote cardiac differentiation, on the process. In fact, AA seemed to accelerate and improve the cardiac commitment of hiPSCs in 2D cultures. Results suggested that hiPSCs in 3D cultures displayed an increased level of differentiation and acquired 105-fold more cardiogenic potential than cells cultured in 2D. Thirdly, we designed a cardiac patch based on 3D cultures of adult porcine Mediastinal Adipose Tissue Progenitor Cells (pMATPCs) injected into natural matrices (decellularized human pericardium). We implanted the myocardial bioprosthesis in vivo and determined that the bioscaffold supported cell migration and regeneration into the infarcted area in swine. In summary, we studied the cardiogenic potential of adult somatic cells (hNDFs), adult stem cells (pMATPCs) and pluripotent stem cells (hiPSCs) in 3D cultures based on RAD16-I hydrogels for potential future applications in the treatment of heart disease.

Durant els últims anys, el nostre grup s’ha centrat en l’estudi de models experimentals de formació de cartílag i ós amb l’objectiu d’entendre els paràmetres biomecànics i biològics que regulen la formació dels teixits que formen l’esquelet. En particular, resultats previs obtinguts en el nostre laboratori indiquen que quan els fibroblasts embrionaris de ratolí (de l’anglès, “mouse embryonic fibroblasts”, MEFs) es cultiven in vitro en el pèptid auto-ensamblable RAD16-I, emprant un sistema de cultiu tridimensional (3D), els MEFs són capaços d’adquirir una capacitat de diferenciació multipotencial, iniciant un procés espontani de diferenciació condrogènica. En aquesta tesis, es va estudiar amb més detall el procés amb l’objectiu d’entendre els possibles mecanismes moleculars que modulen el procés de diferenciació condrogènica d’aquestes cèl•lules. Per a tal efecte es va avaluar l’influencia que les propietats de la matriu poden tenir en el procés de diferenciació i la possible participació de gens involucrats en l’organització primerenca de teixits. De manera interesant, es va veure que només sota certes condicions mecàniques caracteritzades per una rigidesa de la matriu baixa (G’=0,1KPa), el sistema va ser capaç d’iniciar la diferenciació condrogènica, cosa que va semblar venir regulada per la balança entre l’inductor condrogènic BMP4 i el seu antagonista Noggin, d’una manera similar al que succeeix in vivo. Per una altra banda, en aquesta tesis es va descriure un model nou i simple en el qual es podrien estudiar in vitro els esdeveniments moleculars involucrats en la formació d’ós, a través del procés d’ossificació endocondral. Per a tal efecte, cultius tridimensionals de MEFs en procés de condrogènesis es van cocultivar amb cèl•lules endotelials. Aquestes noves condicions van permetre al sistema redirigir-se cap a una diferenciació osteogènica, provat per l’expressió del marcador hipertròfic col•lagen tipus X i la mineralització de la matriu en les zones d’interacció entre els MEFS i les cèl•lules endotelials. Tals resultat suggereixen un clar diàleg entre ambdós tipus cel•lulars. Finalment també es va descriure el desenvolupament d’un nou material per a diferents aplicacions en l’àmbit de l’enginyeria de teixits, format per la simple combinació del pèptid d’auto-assemblatge RAD16-I i el polisacàrid heparina. Es va observar que aquest material exhibia la unió i alliberació seqüencial del factor de creixement – amb domini d’unió de l’heparina – VEGF165. A part, el nou material va permetre la formació d’estructures tubulars en un cultiu 3D de cèl•lules endotelials. Aquests resultats suggereixen que aquest sistema podria promoure el desenvolupament d’un teixit vascularitzat i com a conseqüència, afavorir la regeneració d’un teixit fet malbé. Aquesta plataforma es podria emprar en diferents aplicacions de l’enginyeria de teixits fent servir molècules amb afinitat d’unió de l’heparina com el TGFβ-1, el qual és un conegut inductor condrogènic. / Nuestro grupo se ha centrado el en estudio de modelos experimentales de formación de cartílago y hueso con el objetivo de entender los parámetros biomecánicos y biológicos que regulan la formación de los tejidos que forman el esqueleto. En particular, resultados previos de nuestro laboratorio indican que cuando los fibroblastos embrionarios de ratón (del inglés, mouse embryonic fibroblasts , MEFs) se cultivaron in vitro en el péptido de auto-ensamblaje RAD16-I usando un sistema de cultivo tridimensional (3D), los MEFs adquirieron una capacidad de diferenciación multipotencial iniciando un proceso espontáneo de diferenciación condrogénica. En esta tesis, se estudió con más detalle el proceso con el objetivo de entender los posibles mecanismos moleculares que modulan el proceso de diferenciación condrogénica de estas células. Para ello se evaluó la influencia que las propiedades de la matriz ejercen en el proceso de diferenciación y la posible participación de genes involucrados en organización temprana de tejidos. De forma interesante, solamente bajo ciertas condiciones mecánicas, caracterizadas por la baja rigidez de la matriz (G’ ~ 0.1 kPa), el sistema inició la diferenciación condrogénica, la cual pareció ser regulada por el balance entre el inductor condrogénico BMP4 y su antagonista Noggin en una forma similar a la que ocurre in vivo.Además, en esta tesis se describió un nuevo y simple modelo en el cual se podrían estudiar in vitro los eventos moleculares involucrados en la formación de hueso a través del proceso de osificación endochondral. Para ello, cultivos 3D de MEFs experimentando condrogénesis fueron cocultivados con células endoteliales. De manera importante, en estas nuevas condiciones el sistema se redirigió hacia una diferenciación osteogénica probado por la expresión del marcador hipertrófico colágeno tipo X y la mineralización de la matriz en las zonas de interacción entre los MEFs y las células endoteliales, lo que sugiere un diálogo entre ambos tipos celulares. Finalmente, se describió el desarrollo de un nuevo biomaterial para aplicaciones en ingeniería de tejidos formado por la simple combinación del péptido de auto-ensamblaje RAD16-I y el polisacárido heparina. De forma interesante, este material exhibió la unión y liberación secuencial del factor de crecimiento- con dominio de unión de la heparina- VEGF165. Además, el nuevo material permitió la formación de estructuras tubulares en un cultivo 3D de células endoteliales. Estos resultados sugieren que este sistema podría promover el desarrollo de un tejido vascularizado y, como consecuencia, favorecer la regeneración en un tejido dañado. Esta plataforma podría ser usada en otras aplicaciones de ingeniería de tejidos usando moléculas con afinidad de unión de la heparina como el TGFβ-1, el cual es un conocido inductor condrogénico. / Our group is focused on experimental models of cartilage and bone development in order to understand the biomechanical and biological parameters that regulate skeletal tissue formation. Previous results in our laboratory indicated that when mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were cultured in vitro in three-dimensional (3D) scaffolds based on the self-assembling peptide RAD16-I, cells acquired multipotential capacity and engaged in a spontaneous process of chondrogenic differentiation. This thesis focuses on understanding the possible molecular mechanisms modulating the default cartilaginous commitment of these cells. Thus, the influence of matrix properties on the differentiation process was evaluated as well as the potential participation of genes involved in early tissue organization. Interestingly, cells only underwent chondrogenic differentiation under certain mechanical conditions, characterized by low stiffness (G’ ~ 0.1 kPa). Similarly to in vivo processes, the mentioned differentiation appeared to be regulated by the balance on the expression of the chondrogenic inductor BMP4 and its antagonist Noggin.Moreover, a novel and simple model was described in which the molecular events involved in bone formation through endochondral ossification could be studied in vitro. For this purpose, co-cultures of endothelial cells with 3D cultures of MEFs undergoing chondrogenesis were developed. Importantly, cells committed to osteogenic lineage under these new conditions. The osteogenic differentiation was evidenced by the expression of the hypertrophic marker collagen type X and the presence of calcium mineralized matrix at the interface between MEFs and endothelial cells, which suggested a cross-talk between both cell types. Finally, a newly designed biomaterial for tissue engineering applications was developed by combining self-assembling peptide RAD16-I and polysaccharide heparin. Interestingly, this material exhibited sequential binding and delivery of the growth factor -containing heparin binding domain- VEGF165. The new material supported the development of tubular-like structures in a 3D culture system of endothelial cells. These results suggested that this system could promote the development of a vascularized tissue and, as a consequence, promote tissue regeneration in an injured tissue. This platform could be used in other tissue engineering applications using heparin-binding affinity molecules such as TGFβ-1, which is a well-known chondrogenic inductor.