El cáncer de mama es el más frecuente en las mujeres de todo el mundo. Además de los factores genéticos, epigenéticos y hormonales, existen evidencias epidemiológicas y experimentales de que los factores nutricionales tienen un papel en la etiología y el desarrollo de esta enfermedad. Los lípidos de la dieta se han relacionado directamente con el cáncer, fundamentalmente, el de mama. El grupo investigador ha contribuido al mejor conocimiento de los efectos y de los mecanismos de acción de las dietas hiperlipídicas de aceite de maíz, rico en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) n-6, y de aceite de oliva virgen extra, rico en ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) n-9 y diversos compuestos bioactivos, en el cáncer de mama experimental. El objetivo de este trabajo ha sido investigar si los efectos moduladores diferenciales de estas dietas, estimulador y potencialmente protector respectivamente, durante la promoción de la carcinogénesis mamaria podrían ejercerse mediante cambios en la composición de la membrana de las células tumorales. El trabajo se soporta en el modelo experimental de cáncer de mama inducido en la rata hembra Sprague-Dawley con dimetil-benz(a)-antraceno (DMBA). Con el fin de aislar los distintos dominios de la membrana, se puso a punto un método de obtención de membranas resistentes a detergentes (DRMs) en hígado y, posteriormente, se validó en los adenocarcinomas mamarios experimentales. A continuación, se caracterizó el contenido lipídico de la membrana celular tumoral para, finalmente, analizar los cambios inducidos por las diferentes dietas experimentales en el contenido tanto proteico como lipídico de la membrana y sus dominios. Los resultados mostraron que las membranas de las células tumorales mamarias son ricas en colesterol y ceramida. Además los ácidos grasos mayoritarios son saturados (SFA), seguidos de MUFA y, finalmente, PUFA. Dicha composición se vio modificada diferencial y específicamente por efecto de los lípidos de la dieta. Así, la dieta rica en aceite de maíz enriqueció la membrana en PUFA n-6, concretamente la membrana soluble, a la vez que aumentó el contenido en colesterol, sugiriendo una mayor formación de Chol-Rafts. Por otro lado, la dieta rica en aceite de oliva aumentó los niveles de MUFA n-9 en dominios que no correspondían a membrana soluble. Además, dicha dieta aumentó la ratio ceramida/ esfingomielina, sugiriendo una mayor formación de Cer-Rafts, aumentó los niveles de la proteína pro-apoptotica CD95 y disminuyó los de Cav1 en caveolas. Asimismo, ambas dietas disminuyeron los niveles de ácido palmítico, especialmente la dieta rica en aceite de oliva. Estos resultados estuvieron de acuerdo con la mayor malignidad, clínica y morfológica, de los tumores de los animales alimentados con la dieta de aceite de maíz y la menor agresividad de los tumores del grupo de aceite de oliva. Además, estuvieron en línea con la disminución de los niveles de actividad de p21Ras, la down-regulation de la vía Akt y la inducción de la apoptosis previamente demostrada para la dieta de aceite de oliva. / Breast cancer is the most common malignancy among women all over the World. Besides the genetic, epigenetic and hormonal factors, there is epidemiologic and experimental evidence that nutritional factors have a role in the aetiology and the development of this disease. The dietary lipids have been directly related with cancer, mainly breast cancer. The research group has contributed to the better knowledge of the effects and the mechanisms of action of the high corn oil diets, rich in polyunsaturated fatty acids (PUFA) n-6, and the high extra virgin olive oil diets, rich in monounsaturated fatty acids (MUFA) n-9 and several bioactive compounds, in the experimental breast cancer. The aim of this work has been to investigate whether the differentially modulatory effects of these diets, stimulatory and potentially protective respectively, on the promotion of mammary carcinogenesis could be exerted by changes in tumour cell membrane composition. This work is supported on the experimental breast cancer model induced in the female Sprague-Dawley rat with 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA). In order to isolate the different membrane domains, a method for obtaining detergent resistant membranes (DRMs) was standardized in rat liver and, subsequently, it was validated in experimental mammary adenocarcinomas. Next, the lipid content of tumour cell membrane was characterized and, finally, possible changes induced by the different experimental diets on the protein and lipid composition of tumour cell membrane and its different domains were analyzed. The results showed that the mammary tumour cell membranes are rich in cholesterol and ceramide. In addition, the major fatty acids are saturated (SFA), followed by MUFA and, finally, PUFA. This composition was differentially and specifically modified by the effect of dietary lipids. Thus, the high corn oil diet enriched membrane in PUFA n-6, particularly the soluble membrane, besides increasing the cholesterol content, suggesting a greater formation of Chol-Rafts. On the other hand, the high olive oil diet increased the MUFA n-9 levels in domains different than soluble membrane. In addition, this diet increased the sphingomyelin/ceramide ratio, suggesting an increased formation of Cer-Raft, and the levels of the pro-apoptotic protein CD95, and decreased the Cav1 levels in caveolae. Likewise, both diets reduced the palmitic acid content, specially the olive oil diet. These results were in agreement with the greater malignancy, both clinical and morphological, of tumours from animals fed the high corn oil diet and the lower aggressiveness of tumours from the olive oil diet group. Moreover, they were in accordance with the decreased p21Ras activity, the down-regulation of the Akt pathway and the apoptosis induction previously demonstrated for the high olive oil diet.

La microinjecció intracitoplasmàtica d'un espermatozoide (ICSI) ha estat el mètode d'elecció de l'esterilitat masculina severa des de que l'any 1992 Palermo i cols, publicaren el primer naixement obtingut mitjançant aquesta tècnica. El risc genètic de la ICSI ha sorgit al tractar factors masculins idiopàtics i severs (Meschede i cols, 1997), ja que el dany produït a l'oòcit mitjançant aquesta tècnica és mínim si s'utilitza la metodologia adequada (Palermo i cols, 1996). Cal tenir en conte la possibilitat d'obtenir embrions anormals després de la microinjecció d'espermatozoides cromosòmicament anormals de pacients amb oligoastenozoospèrmia severa.Als anys setanta es va descriure defectes en l'aparellament i en la recombinació a la meiosi en pacients estèrils (Hultén i cols, 1970; Pearson i cols, 1970). Des de llavors s'ha utilitzat els estudis meiòtics en biòpsia testicular com a eina diagnòstica de l'esterilitat masculina. S'han trobat anomalies meiòtiques en el 6% dels pacients estèrils (Egozcue i cols, 1983) i aquest percentatge arriba fins a 17.5% en pacients amb oligoastenozoospermia (OA) (Vendrell i cols, 1999). Aquestes anomalies poden donar lloc a bloqueigs meiòtics que provocaran azoospèrmies o oligozoospèrmies amb un percentatge més elevat d'espermatozoides amb anomalies cromosòmiques (Egozcue i cols, 2000).Alguns estudis han demostrat, utilitzant hibridació in situ de fluorescència (FISH), un increment de les disomies d'alguns cromosomes i d'espermatozoides diploids en pacients amb oligoastenozoospermia (OA) que realitzen cicles de FIV-ICSI (Pang i cols., 1999; Vegetti i cols. 2000; Bernardini i cols., 2000). Rubio i cols (2001) i Calogero i cols. (2001) presenten aquesta associació, relacionant-la amb una baixa taxa d'embaràs. L'objectiu d'aquesta tesi es avaluar el risc genètic dels pacients amb oligoastenozoospèrmia sotmesos a un programa de FIV-ICSI. S'han realitzat tres treballs amb els següents propòsits:1. Analitzar la freqüència d'anomalies cromosòmiques, mitjançant FISH, en els espermatozoides de pacients estèrils.2. Valorar els resultats clínics dels cicles d'ICSI en pacients amb OA en funció de les anomalies meiòtiques que presenten.3. Analitzar la incidència d'anomalies cromosòmiques en embrions procedents de pacients amb anomalies de la meiosi masculina.4. Avaluar la contribució del Diagnòstic Genètic Preimplantacional a la millora dels resultats dels cicles d'ICSI en pacients amb anomalies meiòtiques.En el primer estudi es van analitzar 9373 espermatozoides de 19 pacients estèrils i es van comparar amb un grup control de 5 homes sans. Es va analitzar la freqüència de diploïdies i de disomies pels cromosomes X, Y i 18. No es va trobar diferències en el percentatge de disomies del cromosoma 18, però sí es va trobar diferències en la incidència de disomies dels cromosomes sexuals i d'espermatozoides diploïdies.En el segon estudi es van avaluar 224 cicles de FIV-ICSI realitzats per 137 pacients amb OA severa, agrupats en tres grups en funció del resultat del estudi meiòtic (meiosi normal, bloqueig parcial de la meiosi o anomalies sinàptiques). No es va trobar diferències significatives en quant a la taxa de fecundació, embaràs, implantació i avortament entre els diferents grups.En el tercer estudi s'han analitzat 27 cicles de DGP-AS per alteracions meiòtiques. S'ha observat un elevat nombre d'embrions anormals (42.5%) en aquests pacients però no es demostra que seleccionant els embrions normals per a la transferència s'aconsegueixi unes taxes d'embaràs i d'implantació més altes que les d'un grup de 44 pacients amb les mateixes característiques que no realitzen DGP-AS.L'estudi dels pacients abans de sotmetre's a un cicle de FIV -ICSI és important per avaluar el seu risc genètic. És recomanable fer estudis de FISH en espermatozoides i també estudis meiòtics en biòpsia testicular per poder donar un consell genètic a la parella i, en casos d'alt risc, plantejar si és convenient realitzar DGP-AS per augmentar les possibilitats d'èxit al transferir embrions cromosòmicament normals. / Since Palermo et al. (1992) reported the first delivery of an infant born as a result of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) this technique has become the method of choice for the treatment of severe male infertility.Genetic risk associated with the use of ICSI has arisen when patients with severe male factor are treated (Meschede at al., 1997). The oocyte damage is minimized by the use of proper tools and methodology (Palermo et al., 1997). The possibility of obtaining chromosomally abnormal embryos after the injection of unbalanced sperm from men with severe oligoasthenozoospermia (OA) must be taken into account. Meiotic studies have been incorporated as a cytogenetic diagnostic tool in the screening of male infertility since the early 1970s (Hultén et al., 1970; Pearson et al., 1970). Investigation of the meiotic division in spermatpgenic cells from testicular biopsies resulted in the description of specific meiotic abnormalities limited to the germ cell line, affecting homologue chromosome pairing and recombination. These anomalies can lead to meiotic arrest that often results in azoospermia or oligozoospermia (Egozcue et al., 2000).Some studies that used fluorescent in situ hybridization (FISH) have reported an increase in some chromosome disomies and diploid spermatozoa in patients with OA undergoing ICSI cycles (Pang et al., 1999; Vegetti et al., 2000; Bernardini at al., 2000). Rubio et al. and Calogero at al. also reported this association resulting in lower pregnancy rates.The aim of this study is to analyse the genetic risk of oligoasthenozoospermic patients participating in an ICSI programme. Three studies were done with the following objectives:1. To analyse the frequency of chromosome abnormalities in the spermatozoa of infertile men using FISH. 2. To value the clinic outcome of ICSI in relation to the meiotic abnormalities in patients with OA.3. To analyse the incidence of chromosome abnormalities in the embryos from patients with meiotic disorders.4. To evaluate whether ICSI results could be improved by selecting embryos through Preimplantational Genetic Diagnostic (PGD) in couples, whom male partner presents meiotic abnormalities.In the first study 9373 spermatozoa from 19 infertile patients were analysed and they were compared with a control group of 5 healthy men. Frequency of diploid sperm and disomy for chromosomes X, Y and 18 were analysed by FISH. No differences in the frequency of disomy 18 were found, but statistically differences in the incidence of sex chromosomes and of diploidy were observed.The second study evaluates 224 ICSI cycles from 137 men with OA in whom diagnostic meiotic analyses had been performed. There were no significant differences in fertilization, pregnancy, implantation or abortion rates in relation to the meiotic pattern (normal meiosis, meiotic arrest or synaptic anomalies).In the third study, 27 cycles of PGD for meiotic disorders were analysed. A high number of abnormal embryos was observed (42.5%), though no improvement in pregnancy and implantation rates were obtained comparing with a control group of 44 patients with meiotic abnormalities that performed ICSI cycles without PGD.The screening of patients before ICSI is important to assess genetic risk. Meiotic studies and FISH in ejaculated or testicular spermatozoa are highly recommended and should be consider as a part of the genetic study in these patients. Reproductive counselling and further strategies should consider the results obtained in the genetic study. In this sense, PGD should be advised in cases with a high genetic risk to increase the chances of replacement of chromosomally normal embryos.

La presente tesis está formada por dos bloques principales, uno centrado en la caracterización biodemográfica y genética (empleando el mtDNA) de la población del archipiélago de las Azores (Portugal) y otro enfocado en el propio DNA mitocondrial (DNAmt), concretamente en el desarrollo de una metodología para la clasificación poblacional en haplogrupos y en el estudio de la tasa de mutación de la región de control. Para proceder a la caracterización biodemogáfica y genética del archipiélago de las Azores y hacer inferencias sobre el origen de sus pobladores, se han utilizado diferentes aproximaciones: 1) Estudio del DNAmt en individuos no emparentados de origen azoreano, representativos de los 3 grupos de islas: Oriental, Central y Occidental; 2) Caracterización de la estructura genética de la isla de Flores a lo largo del tiempo (grupo Occidental) utilizando apellidos; y 3) Caracterización biodemográfica (endogamia, exogamia, migración y consanguinidad) de las distintas parroquias de Flores (grupo Occidental) para el periodo comprendido entre 1675 y 1875. Los resultados obtenidos permiten concluir los siguientes puntos: 1) La población de las Azores se presenta como una población con valores de endogamia medio-altos, y valores de consanguinidad similares a los obtenidos para Portugal continental y en otras poblaciones del sur de Europa. 2) Cuando se considera globalmente el archipiélago, el "pool" genético mitocondrial de los azoreanos presenta una elevada diversidad, aunque el grupo Occidental se diferencie de forma significativa respecto de los otros dos grupos de islas. 3) La fuerte reducción poblacional que ocurrió en todo el archipiélago, y particularmente en Flores, no parece haber tenido consecuencias significativas en la estructura genética de la población de la isla. 4) El análisis filogeográfico del DNAmt ha permitido verificar que la gran mayoría de los linajes de DNAmt encontrados en las Azores tienen su origen en poblaciones europeas, principalmente en Portugal continental. Además, se han podido detectar linajes típicos de poblaciones africanas y de poblaciones del Próximo Oriente. En relación al estudio del DNAmt, se ha desarrollado una metodología jerárquica que permite la clasificación del DNAmt en haplogrupos en poblaciones caucasoides. Asimismo, el análisis del DNAmt en familias de origen azoreano, ha permitido realizar las siguientes aseveraciones: 1) La heteroplasmia no puede ser considerada como una condición excepcional, como se halla mayoritariamente establecido, siendo un fenómeno bastante frecuente. 2) Existe la posibilidad de que el DNAmt recombine 3) No se ha verificado contribución paterna del mismo. 4) El valor de la tasa de mutación para el D-loop es de 4.1878_10-6 mutaciones/pb/generación, un valor que está en el rango superior de los valores obtenidos en las estimaciones filogenéticas. / The present thesis focuses on tow major areas: one centred on the biodemographic and genetic 8using mtDNA) characterization of the archipelago of the Azores, and the other focusing on the study of the own mitochondrial DNA (mtDNA). This last one, dealing specifically with in the development of a methodology to classify haplogrups and in the study of the mutation rate of the control region.The parameters considered to characterise, biodemographically and genetically this population, as well as to infer about the origin of its founders were: 1) The study of mtDNA of unrelated individuals with Azorean ancestry, from the 3 groups of islands: Eastern, Central and Western; 2) Characterization of the genetic structure of the island of Flores (Occidental group), from its discovery to present, using surnames; 3) Biodemographic characterization (endogamy, exogamy, migration and consanguinity) of the parishes of Flores (Occidental group), between the years of 1675 and 1875.The results obtained allowed to conclusions that: 1) The Azores present medium-high values of endogamy and consanguinity values similar to those observed in mainland Portugal and other south Europeans populations; 2) When considered as a all, the archipelago exhibits high degree of diversity, despite the significant differentiation of the Occidental group when compared to the other groups islands; 3) The strong population decrease that affected the archipelago and particularly the Flores island, have no major consequences on its genetic structure; 4) According to the phylogeographic analysis of mtDNA the majority of the lineages found in the Azores have their origins in European populations, primarily in mainland Portugal. There were also detected typical lineages from African and Near East populations. Based on the study of the mtDNA it was possible to develop a hierarchical methodology that allows the classification of DNAmt haplogroups in Caucasoid populations. The results obtained based on the study of the mtDNA in families allows to conclude that: 1) Heteroplamy must not be regard as an exceptional event, but as a very frequent phenomenon; 2) It is possible that mtDNA recombine; 3) There are no paternal contribution of mtDNA. 4) The value of the mutation rate for the D-loop is of 4.1878_10-6 mutations/pb/generation, a value that is in the upper end of that obtained using phylogenetic estimations.

Les aneuploidies cromosómiques són la causa més comuna d'abortaments en nadons humans. L'origen d'aquestes anomalies principalment es deu a errors que es produeixen en la gametogènesi femenina. En els mamífers, la gametogènesi presenta un marcat dimorfisme sexual. Mentre que en els mascles aquest és un procés continu que comença amb la pubertat i es duu a terme durant gran part de la vida adulta, en les femelles la producció d'oòcits s'inicia durant la vida fetal, quedant bloquejat abans dels naixement i no es reemprén fins a la maduresa sexual. Aquest fet fa que, tot i la major implicacio de la gametogènesi femenina en l'origen de les aneuploidies en humans, la majoria d'estudis realitzats fins a l'actualitat usin mostres masculines.Durant la producció de les gàmetes, les cèl.lules pateixen una divisió reduccional del genoma, anomenada meiosi, que es basa en l'existència de dues rondes de divisió cel.lular precedides d'una única ronda de replicació del genoma. D'aquesta manera es garenteix mantenir la diploidia de la espècie de generació en generació. La primera divisió meiòtica és molt característica, i en ella els cromosomes homòlegs s'aparellen i intercanvien material entre ells. Aquests processos són bàsics per al bon curs d'aquesta divisió cel.lular. En aquesta tesi es presenta un complet estudi fet en oòcits humans en els quals s'ha analitzat com es duu a terme l'aparellament dels cromosomes homòlegs així com la relació que existeix entre els processos d'aparellament i recombinació en humans.Els resultats obtinguts, tant en oòcits euploides com aneuploides, demostren que l'aparellament dels cromosomes homòlegs és molt eficient. La taxa d'error trobada és molt inferior a la d'oòcits desequilibrats així com d'embrions aneuploides. Aquestes dades suggereixen que altres processos, com podria ser la recombinació, estan involucrats en la producció d'oòcits desequilibrats. Les dades obtingudes en aquesta tesi doctoral tambe impliquen diferencies significatives entre la meiosi en ratolins i humans que podrien suggerir la búsqueda de nous models animals per tal d'estudiar determinats aspectes de la reproducció humana. A més, aquesta tesi presenta els primers resultats d'una nova tècnica de cultiu d'oòcits que pot permetre l'estudi de la gametogènesi femenina més exhaustivament en un futur pròxim. / Aneuploidy is the major cause of human miscarriages. These anomalies are mainly caused by errors produced during female gametogenesis. In mammals, gametogenesis presents a sexual dimorphism: while in the males, this is a continuous process that starts at puberty and it is carried on during most of the adult life-span, in the females it starts during fetal life, it is blocked before completion before birth and it is not resumed until sexual maturity is achieved. Thus, due to the difficult sample collection, although its major implication in human aneuploidy etiology, most of the studies performed uses male samples. During gametogenesis, cells undergoes meiosis which reduces the genome to haploidy thanks to a single replication of the DNA followed by two rounds of cell divisions. This way species diploidy is maintained after fertilization. During the first meiotic division, homologue chromosomes pair and exchange material between them. These processes are thought to be crucial for the progress of the meiotic division. In this thesis dissertation a complete analysis of the pairing process in human oocytes as well as the relationship between pairing and recombination in humans is presented.Our results, obtained both in euploid and aneuploid oocytes, show homologues pairing process is an extremely efficient process, leading to a very low error rate. This is significantly lower than the frequency of unbalanced oocytes or aneupoid embryos found in humans, suggesting that other processes, as recombination, may be involved in the production of unbalanced oocytes. This study also reports the existence of important differences between human and mouse meiosis that would promote the search of another animal model in order to study particular aspects of human reproduction. Moreover, in this thesis dissertation a new human oocyte culture technique is described. In our opinion, this technique may enable the study in deep of the human female meiotic prophase in a near future.

La radioteràpia és un dels tractaments indicats contra el càncer. En el cas de les dones, l'exposició a la radiació ionitzant (RI) pot produir una fallada en la funció ovàrica. Per tant, l'estudi exhaustiu dels efectes dels raigs X en les gònades femenines, i, més concretament, en les seves cèl·lules germinals, es fa necessari; així com la cerca d'un agent radioprotector, per tal de disminuir-ne aquests efectes secundaris. Aquesta tesi doctoral apropa la recerca bàsica a la clínica i els seus quatre objectius principals es centren en determinar l'existència dels efectes de la RI (raigs X), de mutàgens químics (afidicolina) i de possibles radioprotectors (triptorelina); així com la determinació de regions genòmicament inestables en l'espècie Rattus norvegicus. La línia germinal de rates femella ha estat la base d'aquest estudi. No obstant, les cèl·lules objecte d'anàlisi han estat les cèl·lules somàtiques (fibroblasts fetals) descendents dels oòcits I fecundats de les femelles adultes dels diferents grups de tractament. D'aquesta manera, s'ha pogut estudiar la inestabilitat cromosòmica radioinduïda (RICI) transgeneracional amb diferents paràmetres citogenètics. Paral·lelament, s'ha realitzat un estudi reproductiu analitzant directament les femelles tractades. S'ha demostrat que hi ha RICI transgeneracional. Els efectes de l'exposició a la RI d'oòcits I de rates femelles adultes es transmeten a la seva descendència. Aquesta RICI es presenta amb administració aguda i fraccionada de la dosi, i amb resultats semblants. Pel que fa a l'estudi reproductiu, no s'observa un efecte de la radiació amb els nostres paràmetres. Els fibroblasts fetals de l'espècie R. norvegicus presenten inestabilitat cromosòmica espontània. Aquesta s'observa tant pels paràmetres quantitatius com pels qualitatius i es manté en tots els experiments que s'han fet. L'administració del mutagen químic afidicolina als cultius de fibroblasts fetals de rata provoca dany citogenètic. Aquests efectes directes són clarament superiors quan el mutagen químic s'aplica a cèl·lules amb RICI transgeneracional indicant que aquesta en potencia els efectes. L'anàleg agonista de l'hormona GnRH estudiat, la triptorelina, confereix radioprotecció als oòcits I dels fol·licles primordials de les femelles adultes irradiades. El grau de radioprotecció d'aquest fàrmac depèn del paràmetre analitzat, de la dosi i del tipus d'administració de la radiació ionitzant. En paràmetres citogenètics, la radioprotecció d'aquest anàleg és molt més pronunciada a dosi aguda (fins a un 44 %). Traslladant els nostres resultat a l'espècie humana, els nostres resultats en rata indicarien que els ovaris prepuberals i els ovaris de pacients adultes tractades amb aquest anàleg agonista de la GnRHa són més radioresistents que els ovaris de pacients adultes no tractades amb l'anàleg, confirmant estudis clínics i histològics anteriors. La triptorelina també té un efecte protector enfront de la inestabilitat cromosòmica espontània, que es traduiria en una millora de la funció gonadal. Aquesta és evident quant als paràmetres citogenètics estudiats, i s'observa com a tendència pel que fa a les condicions reproductives de les femelles. En relació a l'estudi de regions inestables, s'han identificat disset seqüències telomèriques intersticials classificades com a freqüents i molt freqüents i s'han caracteritzat set llocs fràgils induïts per l'afidicolina en fibroblasts fetals d'aquesta espècie. Ambdós tipus de seqüències estan implicats en processos evolutius i en esdeveniments d'inestabilitat cromosòmica de l'espècie. Per acabar, s'ha determinat que les bandes cromosòmiques en rata no es trenquen a l'atzar, sinó que hi ha regions que pateixen més alteracions cromosòmiques que altres i que, per tant, són més inestables. Tenint en compte els efectes transgeneracionals de la RI, els efectes d'un mutagen químic, la inestabilitat cromosòmica espontània, els llocs fràgils i les seqüències telomèriques intersticials, les zones més inestables del cariotip de rata es localitzen en els cromosomes RNO1, RNO2 i RNO3. Les bandes cromosòmiques RNO1q22, RNO1q43, RNO2q32 i RNO3p12 són les més inestables del cariotip d'aquesta espècie. / Radiotherapy is one of the indicated treatments against cancer. In women, exposure to ionising radiation (IR) can induce a failure in the ovarian function. Therefore, there is a need for an exhaustive analysis of the X-ray effects in the female gonads and to search for a radio protector agent, so as to decrease these secondary effects. This Ph.D. thesis attempts to infer conclusions from fundamental research and to apply this in a clinical capacity. Its four prime objectives are focused on the existence of effects of IR (X rays), of chemical mutagens (aphidicolin) and of possible radio protectors (triptorelin); and the determination of unstable genomic regions in the species Rattus norvegicus. The basis of this study was the germinal line of female rats. However, the objects of analysis were the somatic cells (foetal fibroblasts) originating from the oocytes I of adult females from different treatment groups. In this way, transgenerational radiation-induced chromosomal instability (RICI) was studied with different cytogenetical parameters. At the same time, a reproductive study was performed directly on the treated females. The existence of transgenerational RICI was demonstrated. Effects of the IR exposure of oocytes I from adult female rats are transmitted to their offspring. This RICI is present in acute and fractioned dosage administration, with similar results. Relating to the reproductive study, no radiation effect was seen with our parameters. Foetal fibroblasts of R. norvegicus present spontaneous chromosomal instability. It is observed with both the quantitative and qualitative parameters and it is maintained in all the experiments performed. Chemical mutagen aphidicolin administration to the foetal rat fibroblasts cultures causes cytogenetical damage. These direct effects are clearly superior when the chemical mutagen is applied to cells with transgenerational RICI, which indicates that RICI enhances its effects. The GnRH hormone agonist studied, triptorelin, confers radioprotection to the oocytes I from the primordial follicles of adult irradiated females. The degree of radioprotection of this drug depends on the analysed parameter, and on the dose and type of administration of ionising radiation. Relating to cytogenetical parameters, radioprotection of this analogue is much more pronounced at an acute dose (up to 44%). If we relate our results to the human species, they would indicate that prepubertal ovaries and those from adult patients treated with this GnRH agonist are more radioresistant than those from non-treated adult patients. This would confirm former histological and clinical studies. Triptorelin also affords protection from spontaneous chromosomal instability that would be translated into an improved gonadal function. This effect is evident relating to the cytogenetical parameters and it is observed as a tendency with respect to the reproductive conditions of the females. Concerning to the study of unstable regions, seventeen interstitial telomeric-like sequences, classified as frequent and very frequent, and seven aphidicolin-induced fragile sites in rat foetal fibroblasts were detected. Both types of sequences are involved in evolutive processes and in chromosomal instability events of this species. To finish, it was determined that chromosomal bands in rats do not break at random. There are chromosomal regions more unstable than others, as they suffer more chromosomal aberrations than others. The more unstable zones of the rat karyotype are located in chromosomes RNO1, RNO2 and RNO3, taking into account the transgenerational effects of IR, the effects of a chemical mutagen, the spontaneous chromosomal instability, fragile sites and interstitial telomeric-like sequences. Furthermore the more unstable chromosomal bands of this species are RNO1q22, RNO1q43, RNO2q32 and RNO3p12.

La derivació de línies de cèl∙lules mare embrionàries (ESCs) depèn de factors relacionats tant amb l’embrió com amb el procés de derivació, el coneixement dels quals és de gran importància per tal d’incrementar l’eficiència d’establiment d’aquestes línies. Les ESCs de ratolí (mESCs), en concret, representen un model d’especial rellevància en ciència bàsica per tal d’optimitzar uns protocols de derivació. La present tesi doctoral pretén aclarir alguns dels paràmetres que podrien ser importants durant el procés de derivació de mESCs a partir de blastòmers aïllats dels estadis embrionaris de 4 i 8 cèl∙lules. En la primera part del treball, s’ha analitzat la influència del mètode de derivació, el nombre de blastòmers aïllats i l’estadi embrionari, en l’eficiència d’establiment de línies de mESCs. Els resultats obtinguts indicaren que l’eficiència d’establiment és més elevada quan es produeix en un medi de cultiu definit sense sèrum evitant, així, la diferenciació espontània. Pel que respecta a la influència del nombre de blastòmers aïllats, tant en estadi de 4 com 8 cèl∙lules, el rendiment del procés incrementa utilitzant un major nombre de blastòmers aïllats, de manera que la màxima eficiència es produeix quan s'utilitza la meitat de l'embrió com a màxim per no comprometre la viabilitat del mateix. Finalment, els estadis embrionaris que van aportar una major eficiència de derivació de línies van ser els estadis posteriors a la compactació (mòrula i blastocist). No es van trobar diferències entre els estadis de 4 i 8 cèl∙lules. Recentment, s’ha determinat la importància de les unions adherents amb E‐cadherina en la derivació i el manteniment de línies de mESCs i també humanes (hESCs). En una segona part del treball es va estudiar la importància d’aquest tipus d’unió tant en la proliferació com en l’inici del procés de derivació a partir de blastòmers únics aïllats en estadi de 8 cèl∙lules (grup 1/8). Amb aquest objectiu es va unir una proteïna quimèrica formada pel domini extracel∙lular de l'E‐cadherina i el domini Fc de la IgG1 humana (E‐cad‐Fc) a la superfície dels blastòmers del grup de 1/8. Aquesta proteïna quimèrica es creu que desencadena una cascada de senyalització semblant a la que es produiria quan dos o més blastòmers contacten a través d’unions amb E‐cadherina nativa, el que es tradueix en un increment en la taxa de divisió dels blastòmers individuals i en l’eficiència de derivació de mESCs després d’una exposició de 24 h. Finalment, donat que existeixen evidències moleculars i citològiques que indiquen que els blastòmers podrien tenir la seva localització en la ICM o el trofectoderma (TE) del blastocist prefixada ja en estadis embrionaris primerencs, l’aïllament d’un blastòmer concret de l’embrió amb un destí preferencial a formar part de la ICM podria incrementar l’eficiència del procés de derivació. En la part final del treball, es va intentar determinar si l’aïllament de blastòmers concrets en estadi de 4 cèl∙lules produeix eficiències de derivació diferents en funció de l’ordre i l’orientació dels plans de divisió en estadi de 2 cèl∙lules. A partir d’experiments de seguiment dels blastòmers al llarg del desenvolupament amb un colorant lipofílic vam determinar que els blastòmers procedents de la primera divisió en sentit equatorial tendien a formar part del TE del blastocist. No es va trobar una tendència clara per als blastòmers procedents de la primera divisió en estadi de 2 cèl∙lules en sentit meridional. Els experiments de derivació de línies de mESCs, en canvi, mostraren eficiències de derivació semblants per tots els grups estudiats. Se sap que l’aïllament de blastòmers pot incrementar el seu potencial de desenvolupament, de manera que tots ells tindrien les mateixes possibilitats de formar una línia de mESCs. / The derivation of embryonic stem cell lines (ESCs) depends on factors related to both the embryo and the derivation process, which knowledge is of great importance to increase the establishment efficiency of these lines. Mouse ESCs (mESCs), in particular, represent a model of special relevance in basic science to optimize the derivation protocols. This thesis aims to clarify some of the parameters that could be important during mESCs derivation from isolated blastomeres at 4‐ and 8‐cell stages. In the first part of this work, we tested the influence of the derivation method, the number of isolated blastomeres and the embryonic stage on the derivation efficiency of mESCs. Results indicated that the establishment efficiency is higher when a defined medium is used without adding fetal calf serum, thus avoiding spontaneous differentiation. Regarding the influence of the number of isolated blastomeres, both at 4‐ and 8‐cell stages, the efficiency of the process increases using a higher number of isolated blastomeres, so that maximum efficiency is observed when using the half the embryo as a maximum to not compromise the viability of it. Finally, the embryonic stages that offer greater efficiency of mESCs lines were post‐compacted stages (morula and blastocyst). No differences were found between 4‐ and 8‐cell stages. Recently, it has been determined the importance of E‐cadherin adherents junctions in the derivation and maintenance of mESCs lines and also in human (hESC). In the second part of this work, we studied the importance of this type of junction in both proliferation and in the beginning of the derivation process from single and isolated blastomeres at the 8‐cell stage (group 1/8). To this end, we adhered a chimeric protein consisting of the extracellular domain of E‐cadherin and the Fc domain of human IgG1 (E‐cad‐Fc) on the surface of 1/8 blastomeres. This chimeric protein is thought to simulate the signaling produced when two or more blastomeres contact through native E‐cadherin junctions. This resulted in an increased division rate of individual blastomeres and in the derivation efficiency of mESCs after an exposure of 24 h. Finally, given that there are molecular and cytological evidence suggesting that early blastomeres may have a predefined fate in their future allocation in the ICM or trophectoderm (TE) of the blastocyst, the isolation of a particular blastomere which has a predetermination to be allocated in the ICM could increase the derivation efficiency. At the end of the work, we tried to determine if the isolation of individual blastomeres at the 4‐cell stage cells produced an increased derivation efficiency based on the order and orientation of the division plans at the 2‐cell stage. From lineage tracing experiments with a lipophilic dye, we observed that blastomeres from the first division in an equatorial orientation tend to contribute to the TE with more cells. We did not find a clear tendency from blastomeres originated from a meridional division. Experiments about mESC derivation showed similar efficiencies from all the groups studied. It is known that the isolation of blastomeres may increase their developmental potential, so they all would have the same chance to derive an ESC line.

La obesidad es un trastorno metabólico complejo que ha alcanzado proporciones epidémicas en los países desarrollados y en desarrollo. Por otra parte, la obesidad es un factor de riesgo importante que a su vez aumenta el riesgo de desarrollar otras enfermedades tales como la resistencia a la insulina, diabetes tipo 2 y enfermedades cardiovasculares. El conocimiento de las causas y mecanismos que desencadenan el desarrollo de estas enfermedades es de vital importancia para su prevención y tratamiento. Sin embargo, los mecanismos por los que la obesidad se origina, desarrolla y predispone a otras complicaciones metabólicas no se entienden completamente. El desarrollo de los adipocitos y de la obesidad han sido estudiados a través de diferentes modelos celulares y animales. Las proteínas “high movility-AT-hook-Group-1” (HMGA1) han sido implicados en ambos procesos, aunque se desconoce su función concreta. Para ello, en este estudio hemos examinado los efectos metabólicos de HMGA1 sobreexpresión en el tejido adiposo en vivo. Para ello, hemos generado ratones transgénicos que sobreexpresan HMGA1 específicamente en el tejido adiposo. La sobreexpresión de HMGA1 en el tejido adiposo redujo la adiposidad en los ratones transgénicos. Además, estos animales eran normoglucémicos y normoinsulinémicos. Asimismo, los ratones transgénicos presentaron una mayor tasa metabólica. A pesar de la reducción de la adiposidad y de la reducción de la superficie media de los adipocitos, no se detectaron diferencias importantes en los adipocitos del tejido adiposo blanco (epWAT). Sin embargo, se detectó un proceso de remodelación activa de este depósito. Por el contrario, los animales transgénicos mostraron una menor masa de tejido adiposo y graves alteraciones morfológicas en el tejido adiposo marrón (BAT). Estos cambios implicaron la inhibición de los genes y proteínas implicados en el programa de diferenciación, biogénesis mitocondrial y la función y metabolismo de los lípidos de los adipocitos marrones, lo que llevó a la alteración de la capacidad termogénica del tejido. El estudio de la expresión de genes de epWAT y BAT de ratones transgénicos mostró la desregulación de las vías de genes implicados en el ciclo celular, ácidos grasos y el metabolismo de la insulina y la adipogénesis. Cuando se alimentaron con una dieta alta en grasas (HFD), los ratones transgénicos ganaron menos peso y mostraron menor adiposidad que los controles. Por otra parte, los ratones transgénicos mostraron una disminución del peso del epWAT y la disminución del área del adipocito. En consonancia con la falta de acumulación de grasa, lípidos y metabolitos relacionados con el metabolismo lipídico, los ratones transgénicos mostraron una reducción en los niveles de adipoquinas. En contraposición a los ratones controles que desarrollaron obesidad y resistencia a la insulina tras ser alimentados con una HFD, los ratones transgénicos ganaron menos peso y mostraron una mayor sensibilidad a la insulina. Además, los ratones transgénicos presentaron mayor infiltración de macrófagos en epWAT aunque no se observó un cambio de M2 anti-inflamatorios hacia macrófagos proinflamatorios M1. Asimismo, se observó una reducción en los niveles de citoquinas pro-inflamatorias en los ratones transgénicos, tales como IL-6, MCP-1 y TNFa, que estaban elevadas en el epWAT de los ratones controles alimentados con HFD. En resumen, estos resultados indican que la sobreexpresión de HMGA1 en el tejido adiposo altera la diferenciación terminal de los adipocitos; protegiendo a los ratones transgénicos de la obesidad inducida por la dieta grasa, de la resistencia a la insulina y de la intolerancia a la glucosa. Por tanto, este estudio sugiere que las HMGA1 podría ejercer un papel clave en la adipogénesis y en el desarrollo del tejido adiposo. / Obesity is a complex metabolic disorder that has reached epidemic proportions in both developed and developing countries. Moreover, obesity is a major risk factor that enhances the risk of developing other diseases such as insulin resistance, type 2 diabetes and cardiovascular diseases. These pathologies represent a great threat to global human health. Knowledge of the causes and mechanisms that trigger the development of these diseases is of vital importance for its prevention and treatment. However, the mechanisms through which obesity originates, develops and predisposes to other metabolic complications are not fully understood. Adipocyte and obesity development have been largely study through many cellular models. In addition, several rodent and non-rodent models have been generated for the better understanding of obesity phisiopathogenesis. As High Mobility –AT-hook- Group-1 (HMGA1) proteins have been implicated on adipogenesis in vitro, we sought to examine the metabolic effects of HMGA1 overexpression in adipose tissue in vivo. To this aim, we generated a line of transgenic mice specifically overexpressing HMGA1 in adipose tissue. Overexpression of HMGA1 in adipose tissue reduced adiposity in aP2-HMGA1 transgenic mice. In addition, these animals were normoglycaemic and normoinsulinemic. Furthermore, transgenic mice presented higher metabolic rate. Although reduced adiposity and reduced adipocyte mean area, no major differences in the adipocytes from epididymal white adipose tissue (epWAT) were detected. However, an active remodelling process was detected in this depot. In contrast, aP2-HMGA1 transgenic animals showed reduced adipose tissue mass and serious morphological alterations in brown adipose tissue (BAT). These changes implicated downregulation of genes and proteins involved in specific brown adipocyte differentiation programme, mitochondrial biogenesis and function and lipid metabolism, leading to impaired thermogenic capacity of BAT. Gene expression analysis of epWAT and BAT from transgenic mice showed dysregulation of gene pathways involved in cell cycle, fatty acid and insulin metabolism, and adipogenesis. When fed a high fat diet (HFD), transgenic mice gained less weight and showed lower adiposity than wild type littermates. Moreover, transgenic mice showed decreased epWAT weight and decreased mean adipocyte area. Consistent with the lack of fat accumulation, lipid related metabolites and adipokine secretion were reduced in transgenic mice in comparison to wild type mice. In contrast to wild-type obese and insulin resistant mice, transgenic mice remained protected against dietinduced obesity, insulin resistance and glucose intolerance. In addition, transgenic mice presented high macrophage infiltration in epWAT. Transgenic mice showed an increase in the percentage of total macrophages, although no shift from M2 anti-inflammatory to M1 proinflammatory macrophage population was observed. This was parallel to a reduction in the levels of pro-inflammatory cytokines, such as IL-6, MCP-1 and TNF-a, which were elevated in epWAT of HFD-fed wild-type mice. Taken together, these results indicate that specific HMGA1 overexpression in the adipose tissue impaired terminal differentiation of adipocytes. These effects protected transgenic mice from high fat diet-induced obesity, insulin resistance and glucose intolerance. Thus, this study suggests that HMGA1 proteins may be active players in adipogenesis and adipose tissue development, although the exact mechanism of action still remains unclear.

L'os és un teixit connectiu altament organitzat i especialitzat, la funció principal és la mecànica, proporcionant l'afecció als músculs i per tant permetent que el cos es mogui. Actualment, el tractament quirúrgic estàndard es basa en la immobilització i la introducció d'empelts ossis però presenta algunes complicacions, com ara les infeccions, les no unions i la morbiditat de la zona donant. Avui en dia, milions de pacients pateixen defectes ossis i en concret, als EEUU es diagnostiquen entre 10.000 i 20.000 nous casos d'osteonecrosi del cap de fèmur (ONFH) a l’any. La medicina regenerativa (RM) i l'enginyeria tissular (TE) són dos camps de la ciència que es centren en el desenvolupament de teràpies per reemplaçar i regenerar els teixits perduts o danyats per millorar la qualitat de vida del pacient. La combinació de biomaterials, cèl·lules i senyals és l’eina clau per al desenvolupament d'un producte RM i TE. Un dels camps més desenvolupats en RM és la medicina regenerativa ortopèdica, en concret per al teixit ossi. Hi ha diferents estratègies que combinen cèl·lules autòlogues amb matrius que han demostrat certa eficàcia en el tractament de lesions òssies. Després de la fase de descobriment de nous medicaments de teràpia avançada, i per tal d’aconseguir el registre del nou producte, hi ha la fase de desenvolupament, que inclou la realització d'estudis preclínics (fet per dur a terme la prova de concepte, la seguretat i toxicologia) i els estudis clínics. En primer lloc es van determinar i caracteritzar els components de la preparació d’enginyeria tissular (TEP) amb la finalitat d’obtenir un producte estandarditzat. Aquesta preparació consisteix en un component cel·lular que són les cèl·lules mesenquimals estromals (MSC), tant humanes com ovines unides en una matriu de partícules òssies desantigeneïtzades i liofilitzades. Es va realizar un model de defecte ossi de mida crítica (CSBD) en ovella amb la finalitat d'investigar l'efecte de la TEP en una situació extrema, i es va demostrar la seva seguretat i capacitat per sintetitzar nou os i remodelar l’os existent. Seguidament la TEP es va provar en un model animal rellevant de translació de la malaltia òssia basat en el mètode reportat per Vélez i col·laboradors per a la modelització de ONFH en ovelles demostrant la seva eficàcia i seguretat. També s’ha demostrat que les MSC estan involucrades en la síntesi d'os nou ja que es van trobar progenitors ossis marcats després del tractament de la ONFH, tot i així no es poden descartar els mecanismes paracrins. Per tant, el desenvolupament de la TEP podria contribuir en general a la RM per tal de satisfer les exigències d'una societat que envelleix. / Bone is a highly organized and specialized connective tissue, whose main function is the mechanics, providing attachment to muscles and therefore allowing the body to move. Currently the gold standard surgical treatment is based on the immobilization and introduction of bone grafts but it presents some complications, such as infections, non-unions, and donor site morbidity. Nowadays, millions of patients are suffering from bone defects and specifically, 10,000 to 20,000 new cases of osteonecrosis of femoral head (ONFH) are diagnosed only in the USA every year. Regenerative medicine (RM) and tissue engineering (TE) are two areas of science fields focused on the developing of therapies to replace and regenerate lost or damaged tissues to improve the quality of life the patient. The combination of biomaterials, cells and signals is the key tool for the development of a RM and TE product. One of the most developed fields in RM is the orthopedic regenerative medicine, in specifically for bone tissue. There are different strategies combining autologous cells with scaffolds that have shown some efficacy for treating bone injuries. After discovery phase of any new advanced therapy medicinal products, there is the development phase that includes the conduction of preclinical studies (made to perform the proof of concept, safety and toxicology) and clinical studies before the registration of the new product. First the components of the tissue engineered preparation (TEP) were determined and characterized in order to have a standardized material. It consists in MSC (mesenchymal stromal cells) both human and ovine sources are used as a cellular component seeded in a deantigenized and lyophilized bone particles as a scaffold. Then critical size bone defect (CSBD) was modeled in sheep in order to investigate the effect of the TEP in an extreme situation, demonstrating its safe ability to synthesize new bone and bone remodeling. Afterwards TEP was tested in a relevant translational animal model of bone disease based on the method reported by Velez and collaborators for modelling ONFH in sheep demonstrating its efficacy and safety. Also demonstrating that MSC were involved in the synthesis of new bone, because labeled bone progenitors are shown after ONFH treatment, although paracrine mechanisms can not be discarded. Therefore, the development of TEP could contribute to the overall RM to meet the requirements of an aging society.

Los receptores EPH (receptores de efrina) constituyen la subfamilia más grande de los receptores tirosina quinasas en mamífero. Se unen a las efrinas, ancladas a las membranas celulares mediante un enlace glicosilfosfatidilinositol (GPI) (efrinas de tipo A) o mediante una dominio transmembrana seguido por un dominio citoplasmático (efrinas de tipo B). El complejo receptor-ligando activa una cascada de señalización tanto en las células que expresan los receptores EPH como en las células adyacentes, que expresan las efrinas. Este mecanismo se denomina “forward” y “reverse signalling”, respectivamente. La interacción entre receptor y su ligando puede desencadenar una amplia gama de respuestas celulares incluyendo la adhesión, repulsión y la segregación/posicionamiento celular durante la separación de los tejidos en las primeras fases de desarrollo embrionario. Los mecanismos que regulan estas distintas respuestas dependen en gran medida del tipo celular y del tejido. Aunque, los receptores EPH han sido ampliamente caracterizados para sus funciones durante el desarrollo embrionario, se encuentran re-expresados en una variedad de tumores malignos humanos. No obstante, dependiendo del tipo de tumor, de su estadio y de la actividad quinasa, los receptores EPH pueden actuar induciendo o inhibiendo la progresión del cáncer. Los receptores EPH de tipo B están involucrados en la homeostasis del epitelio intestinal y la pérdida de función de estos receptores es un evento clave en la progresión del cáncer de colon, sobretodo de adenoma a carcinoma. El receptor EPHA3, identificado y aislado por primera vez ellas membranas de células pre-B de leucemia linfoblástica aguda, se encuentra ampliamente expresado durante el desarrollo embrionario, particularmente en el tejido nervioso y corazón. Tal como se espera de su primera identificación, se ha demostrado que también está involucrado en muchos tipos de cáncer. Los efectos inactivantes de distintas mutaciones somáticas encontradas en varios tipos de cáncer, sugieren fuertemente que la proteína EPHA3 suprime las propiedades de las células cancerígenas a través un mecanismo que dependería de su unión con la efrina y de su actividad quinasa. Dos estudios independientes de secuenciación de ADN empleando técnicas de nueva generación, descubrieron una alta frecuencia de mutaciones en EPHA3 en una amplia cohorte de tumores de colon humano y, más importante, la mayoría de estas mutaciones se descubrieron afectar la actividad quinasa o el dominio de unión con el ligando. Sin embargo, la función de EPHA3 en la tumorigenesis intestinal no ha sido investigada a fondo. Por lo tanto, en este estudio se utilizaron dos líneas celulares de cáncer de colon humano, LS174 y DLD1, para sobre-expresar de forma inducible por doxiciclina el receptor EPHA3. Hemos observado que la reintroducción de EPHA3 en líneas de cáncer de colon no afecta el crecimiento de las células cultivadas en sustratos sólidos, en medio semi-solido (soft-agar) o como xenotrasplantes en ratones inmunodeprimidos. Además, se utilizó un modelo transgénico de ratón en el que el gen EphA3 ha sido suprimido y descubrimos que la inactivación específica de uno o los dos alelos de este gen no inicia el proceso tumorígenico en el intestino de los ratones. Tampoco observamos cambios en el tamaño o en el número de tumores intestinales en ratones donde la tumorigenesis intestinal se inició genéticamente (modelo de ratón Apcmin/+) o farmacológicamente (tratamiento con azoximetano). También hemos observado que la sobreexpresión de EPHA3 en células de cáncer de colon no afecta su capacidad de migración o de invasión en ensayos in vitro. Para profundizar el papel de EPHA3 en el proceso metastático, se usó un modelo murino de metástasis de pulmón observando que la reintroducción de EPHA3 en células de cáncer de colon inyectadas en las colas de ratones inmunodeprimidos no altera su capacidad migratoria y de generar metástasis en otros órganos in vivo. Estos resultados confirman los datos de inmunhistoquimica donde observamos ausencia de diferencias en los niveles de tinción de EPHA3 en los nódulos linfáticos respeto a los tumores primarios de pacientes con cáncer colorrectal localmente avanzado (estadio Dukes C). Por último, el análisis inmuhistoquimico de los niveles de tinción de EPHA3 en pacientes con cáncer colorrectal (estadio Dukes C) no reveló ninguna correlación con la supervivencia y otras características clinicopatologicas de estos pacientes. En conclusión, en este estudio, reportamos que el mecanismo de señalización quinasa dependiente del receptor EPHA3, aunque está frecuentemente inactivado en cáncer colorrectal, no juega un papel como supresor de la tumorigenesis intestinal durante ningún estadio de la progresión del tumor, tanto in vitro como in vivo. Estos resultados, esclarecen el papel de EPHA3 en cáncer colorrectal y evidencian la importancia de estudios funcionales para confirmar el papel de los genes identificados como posibles candidatos de la progresión tumoral empleando técnicas avanzadas de secuenciación genómica de tumores. / EPHs, which make up the largest family of mammalian receptor tyrosine kinases, bind cell surface–associated Ephrins that have either a glycosylphosphatidylinositol (GPI) membrane anchor (A-type Ephrins) or a transmembrane region followed by a conserved cytoplasmatic tail (B-type Ephrins). Clustering of EPH receptors and their ligand at the surface of adjacent cells activates downstream signaling in both the EPH- and Ephrin-expressing cells, termed forward and reverse signaling, respectively. Eph–ephrin interactions can trigger a wide array of cellular responses including cell adhesion, repulsion and cell sorting/positioning during tissue boundary and the mechanisms leading to these different responses are highly dependent on the cell type and tissue context. Although most extensively characterized for their roles in development, Eph receptors are re-expressed in a variety of human malignancies. However, depending on the tumor type, disease stage and kinase function, EPH overexpression can promote or inhibit tumor progression. The role of EPHB receptors was discovered to be involved in the homeostasis of the normal intestinal epithelium and loss of function of B-type EPHs is a key event of colorectal cancer progression, mainly from adenoma to carcinoma. The EPHA3 receptor, originally recognized and isolated from membranes of pre-B acute lymphoblastic leukemia cells, is widely expressed during embryonic development, with the highest levels occurring in the nervous system and heart. As expected from its first identification, it was then implicated as having a key role in many cancers. The inactivating effects of many somatic mutations found in different cancers, strongly suggest that wild-type EPHA3 receptor suppresses the malignant properties of cancer cells in an ephrin-and kinase-dependent manner. Two independent studies of next-generation DNA sequencing using large cohorts of human colorectal cancer samples showed unexpected high mutation frequency in EPHA3 and, importantly many of these mutations were found to impair the kinase activity or ligand binding domain. However, the function of EPHA3 in intestinal tumorigenesis has not been thoroughly investigated. Thus, in this study we generated a doxycycline-dependent EPHA3 overexpression system in two different human colon cancer cell lines, LS174 and DLD1. Importantly, we found that the reintroduction of EPHA3 in colon cancer cells did not affect their growth on a solid substrate, soft agar or as xenografts in immunodeficient mice. Moreover, using a full knockout mouse model we show that targeted inactivation of one or both alleles of EphA3 did not initiate the tumorigenic process in the murine intestine, and had no effects on tumor size/multiplicity after tumor initiation either genetically or pharmacologically. Restoring EPHA3 levels in colon cancer cells did not modulate their motility/invasion in vitro. In addition, to more closely investigate the role of EPHA3 in the metastatic process, we used a mouse model of lung metastasis and found that the ectopic overexpression of EPHA3 in human colon cancer cells, injected in to the tail vein of immunodeficient mice, does not affect their capability in vivo to migrate and colonize distant organs. These results are consistent with our immunohistochemistry data showing no EPHA3 expression differences in primary Dukes C tumors and matched lymph node metastases. Finally, immunohistochemical analysis of EPHA3 tumor levels did not reveal associations with survival or clinicopathological features of Duke C colorectal cancer patients. In conclusion, here we report that the kinase dependent signaling of EPHA3, despite frequently inactivated in colorectal cancer, does not play a tumor suppressive function in intestinal tumorigenesis and, importantly, in any stage of the cancer progression using either in vivo or in vivo experimental models. These results significantly contribute to our understanding of the role of EPH signaling during colorectal carcinogenesis, and highlighting the need for detailed functional studies to confirm the relevance of putative cancer driver genes identified in sequencing efforts of the cancer genome.

All living organisms need timekeeping mechanisms to track and anticipate cyclic changes in their environment. The ability to prepare for and respond to daily and seasonal changes is endowed by circadian clocks. The systemic features and molecular mechanisms that drive circadian rhythmicity are highly conserved across kingdoms. Therefore, Drosophila melanogaster with its relatively small brain (ca. 135.000 neurons) and the outstanding genetic tools that are available, is a perfect model to investigate the properties and relevance of the circadian system in a complex, but yet comprehensible organism. The last 50 years of chronobiological research in the fruit fly resulted in a deep understanding of the molecular machinery that drives circadian rhythmicity, and various histological studies revealed the neural substrate of the circadian system. However, a detailed neuroanatomical and physiological description on the single-cell level has still to be acquired. Thus, I employed a multicolor labeling approach to characterize the clock network of Drosophila melanogaster with single-cell resolution and additionally investigated the putative in- and output sites of selected neurons. To further study the functional hierarchy within the clock network and to monitor the “ticking clock“ over the course of several circadian cycles, I established a method, which allows us to follow the accumulation and degradation of the core clock genes in living brain explants by the means of bioluminescence imaging of single-cells. / Alle lebenden Organismen benötigen Mechanismen zur Zeitmessung, um sich auf periodisch wiederkehrende Umweltveränderungen einstellen zu können. Zirkadiane Uhren verleihen die Fähigkeit, tages- und jahreszeitliche Veränderungen vorauszuahnen und sich an diese anzupassen. Die Eigenschaften des zirkadianen Systems, als auch dessen molekularer Mechanismus scheinen über sämtliche Taxa konserviert zu sein. Daher bietet es sich an, die leicht handhabbare Taufliege Drosophila melanogaster als Modellorganismus zu benutzen. Das relativ kleine Gehirn (ca. 135.000 Neurone) und die herausragende genetische Zugänglichkeit der Fliege prädestinieren sie dazu, das zirkadiane System in einem komplexen, aber dennoch überschaubaren Kontext zu untersuchen. Die vergangenen 50 Jahre chronobiologischer Forschung an Drosophila führten zu einem tiefgreifenden Verständnis der molekularen Mechanismen, die für tageszeitliche Rhythmizität verantwortlich sind. Anhand zahlreicher histologischer Untersuchungen wurde die neuronale Grundlage, das Uhrneuronennetzwerk im zentralen Nervensystem, beschrieben. Nichtsdestotrotz, gibt es noch immer keine detaillierte neuroanatomische und physiologische Charakterisierung der Uhrneurone auf Einzelzellebene. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit die umfangreiche Beschreibung der Einzelzellanatomie ausgewählter Uhrneurone sowie die Identifikation mutmaßlicher post- und präsynaptischer Verzweigungen. Darüber hinaus war es mir möglich, eine Methode zur Messung von Biolumineszenzrhythmen in explantierten lebenden Gehirnen zu etablieren. Mit einem Lumineszenzmikroskop können die Proteinoszillationen einzelner Uhrneurone über die Dauer mehrerer zirkadianer Zyklen aufgezeichnet werden, wodurch neue funktionale Studien ermöglicht werden.