La dosimetria biològica permet estimar la dosi d’una exposició a radiacions ionitzants mitjançant l’anàlisi d’un biomarcador, i és un element imprescindible en el camp de la radioprotecció. Entre els diferents biomarcadors que es poden utilitzar, els cromosomes dicèntrics presents en metafases de limfòcits de sang perifèrica, es consideren els més útils ja que la seva freqüència s’ajusta acuradament a les variacions de dosi. Això és cert per dosis fins 4-5 Gy, a dosis superiors el nombre de cèl·lules que arriben a metafase és molt petit dificultant-se molt l’anàlisi. Per superar aquesta limitació, la inhibició del checkpoint G2/M amb l’addició de cafeïna i la optimització de la durada del cultiu, ha permès mitigar el retard mitòtic, obtenint suficients metafases per a realitzar l’estudi citogenètic. Amb aquesta nova metodologia s’ha pogut establir una corba dosi-efecte amb dosis de fins a 25 Gy, basada en un model Gompertz (no utilitzat fins al moment en dosimetria biològica). La fiabilitat d’aquest model ha estat testat tan en simulacions d’irradiació total com parcial. Per altra banda, en molts accidents radiològics on la irradiació no és homogènia, fins el moment el seu estudi es basava en considerar que una part del cos havia estat irradiada homogèniament mentre que l’altre part no havia estat irradiada. Aquesta consideració resulta poc realista ja que a la majoria d’accidents, els individus exposats reben un gradient de dosis. Amb l’objectiu d’estudiar les exposicions heterogènies s’han fet simulacions barrejant sang irradiada d’un home i una dona a dues dosis diferents, amb aquesta metodologia s’ha pogut distingir l’origen de cadascuna de les cèl·lules analitzades. Mitjançant l’aplicació d’un model de mixtura de Poissons s’ha pogut determinar la freqüència de dicèntrics de cadascuna de les dues fraccions irradiades i estimar la dosi de radiació rebuda i la fracció inicial de cèl·lules irradiades a cada dosi. La possibilitat de poder estimar dosis altes de radiació, així com poder diferenciar millor les irradiacions no homogènies és una aportació molt important en el camp de la radioprotecció. / Biological dosimetry allow us to estimate the dose to an exposure to ionizing radiation thought the analysis of a biomarker, and is an essential element in radiation protection. Among various biomarkers that can be used, dicentric chromosomes in metaphase from peripheral blood lymphocytes are considered the most useful, because their frequency is correlated in variations of the dose. This is true for doses up to 4-5 Gy, in higher doses the numbers of cells that achieve metaphase are very few and for this reason analysis becomes increasingly difficult. To overcome this limitation, the inhibition of the G2/M checkpoint by the addition of caffeine and the optimization of the culture duration, allows the mitigation of the mitotic delay, getting enough metaphases to perform the cytogenetic analysis. Through this methodology, a dose effect curve has been established for doses up to 25 Gy, it is based in a Gompertz model (that has never been used so far in biological dosimetry). The reliability of this model has been tested for whole and partial simulations. Furthermore, in most of radiological accidents where the irradiation is not homogeneous, up to now, its study was based in considering that one part of the body had been irradiated while the other part had not. This consideration becomes unrealistic because in the majority of accidents the exposed individuals received a gradient of doses. In order to study the heterogeneous exposures simulations, mixing irradiated blood at two different doses from a male and a female, allows the differentiation of the origin of each analyzed cell. Through the application of a mixture Poisson model the dicentric frequency from each fraction has been determined as well as the received dose and the initial proportion of cells irradiated at each dose. The possibility to estimate the received dose after high doses of exposure, as well as the better differentiation for the study of non homogeneous exposures is a very important contribution to the radioprotection field.

La dosimetria biològica és un camp que s’ha desenvolupat dins la radioprotecció i permet estimar la dosi d’una exposició a radiacions ionitzants en casos en que no es coneix o no és prou fiable la dosimetria física. En dosimetria biològica, la metodologia més establerta per estimar la dosi d’una exposició a radiacions es basa en obtenir la freqüència d’una determinada alteració cromosòmica i, extrapolar‐la a una corba dosi‐efecte prèviament elaborada. Hi ha diversos factors que poden fer variar la freqüència de les alteracions cromosòmiques, entre aquests hi ha el cas de les irradiacions parcials, que es dona quan una irradiació només afecta una part del cos, i no la seva totalitat. En aquests casos si és realitza dosimetria biològica l’estimació de la dosi serà menor de la que en realitat és. Per tal de simular irradiacions parcials és va irradiar sang perifèrica a 2, 3, 4 i 5 Gy amb raigs X, i es va barrejar amb sang no irradiada per tal de tenir diferents percentatges de sang irradiada (87,5, 75, 50, 25 i 12,5%). Es va realitzar l’anàlisi mitjançant tècniques de FISH, pintant els cromosomes 1, 4 i 11 conjuntament amb tots els centròmers. Les alteracions cromosòmiques detectades es van expressar en nomenclatura PAINT, PAINT modificada i convencional. Es van utilitzar el test u i el test s (basat en el model de Poisson inflat en el zero) per avaluar la sobredispersió causada per les cèl∙lules no irradiades. Es va estimar la dosi per a cada tipus d’alteració considerada amb el mètode Dolphin i les corbes dosi‐efecte prèviament elaborades (usant les mateixes sondes cromosòmiques). Només es va detectar sobredispersió a dosis altes i a percentatges de sang irradiada baixos. Els dos mètodes usats per detectar desviacions de la distribució de Poisson van mostrar resultats molt similars. El total d’alteracions aparentment simples van ser el tipus d’alteració que l’estimació de la dosi va ser més propera a la dosi real que es va irradiar. Les tècniques de FISH utilitzades van tenir la mateixa eficiència detectant dicèntrics com translocacions. Comparant els resultats obtinguts amb tècniques de FISH amb els obtinguts analitzant dicèntrics amb tinció uniforme, amb aquest últim mètode s’obtenen millors resultats tant en la detecció de d’irradiacions parcials com en l’estimació de la dosi. Un altre factor que influeix en l’estimació d’una dosi és el temps transcorregut després d’una irradiació, ja que no totes les alteracions cromosòmiques presenten la mateixa estabilitat al llarg del temps. Per avaluar quines alteracions són més útils alhora d’estimar la dosi d’una exposició anterior (dosimetria biològica retrospectiva) es va fer un estudi utilitzant com a model la línia cel∙lular limfoblastoide Jurkat de cariotip normal i estable. Es van irradiar cèl∙lules Jurkat en G0 a dosis de 0,2, 2 i 2Gy amb raigs X, un cop irradiades es van mantenir en cultiu durant tres setmanes i es van extreure alíquotes a diferents temps. Les alteracions cromosòmiques induïdes es van analitzar mitjançant tècniques de pintat dels cromosomes 1, 4 i 11 conjuntament amb tots els centròmers per avaluar la persistència de translocacions i dicèntrics, i la tècnica d’mFISH per avaluar la freqüència, la complexitat, la participació de cada cromosoma de les alteracions radioinduïdes i les associacions cromosòmiques preferencials en les mostres inicials i finals en el cultiu control i en els irradiats a 2 i 4 Gy. En l’estudi realitzat amb pintat cromosòmic a totes les dosis la freqüència (x100) de dicèntrics i d’alteracions complexes van disminuir de forma ràpida fins arribar a valors popers a 0. La freqüència (x100) de translocacions es va mantenir força constant als cultius irradiats a 0,2 i 2 Gy mentre que als cultius irradiats a 4 Gy es va observar un descens que en les mostres inicials era pronunciat i en les finals era suau. La tècnica d’mFISH va mostrar que són les alteracions simples incompletes les que desapareixen al llarg del temps i que el grau de complexitat de les alteracions cromosòmiques augmenta amb la dosi i disminueix amb el temps post‐irradiació. No es van detectar desviacions respecte a la participació a l’atzar de cada cromosoma quan es van considerar les alteracions tipus intercanvi, però si que es van detectar quan es van considerar el total de alteracions cromosòmiques radioinduïdes. Es van detectar diferencies significatives en associacions cromosòmiques preferencials en la mostra inicial i en la final del cultiu de cèl∙lules Jurkat. / Biological dosimetry is is a field that has developed within the radioprotection to estimate the dose of ionizing radiation exposure in cases that physical dosimetry is not enough reliable or is unkown. In biological dosymetry, the more established methodology for estimating the dose of radiation exposure is based on extrapolate the frequency of a specific chromosomal alteration in a dose‐effect curve previously prepared. There are several factors that can vary the frequency of chromosome aberrations among these is the case of partial body irradiations, which occurs when radiation affects only a part of the body. In those cases the dose will be underestimated. In order to simulate partial body dose irradiations peripheral blood samples were irradiated at 2, 3, 4 and 5 Gy of X‐rays, and mixed with non‐irradiated blood to obtain the following percentages of irradiated blood: 87.5, 75, 50, 25 and 12.5. FISH painting was performed using whole chromosome painting probes for chromosomes 1, 4, and 11 in combination with a pancentromeric probe. Chromosome aberrations were recorded using the PAINT nomenclature, and later converted to the modified PAINT and conventional nomenclature. The u‐test was initially used to evaluate the expected overdispersion due to the presence of unexposed cells, but a test based on the zero‐inflated Poisson model (s‐test) is also proposed. Dose‐estimations for the different types of chromosome aberrations were calculated by Dolphin’s method and using the FISH dose‐effect curves previously obtained using the same whole‐chromosome probes. The expected overdispersion due to the presence of unirradiated cells was only detected at high doses and low percentages of irradiated blood. The two methods used to detect the deviation from the Poisson distribution showed a similar ability. Dose estimations for the irradiated fraction were closer to the real values for total apparently simple aberrations. In general, using FISH techniques similar results were obtained for dicentrics and translocations. In comparison to solid‐stain dicentric analysis, the use of FISH painting techniques is less suitable to detect partial irradiations, and for dose estimation assessment. Another factor in the estimation of a dose is the time elapsed after irradiation, as not all chromosome aberrations have the same stability over time. To evaluate which aberrations were more useful to estimate the dose for a retrospective exposure an irradiated cell line was studied. A follow‐up study on the persistence of the different types of chromosome aberrations was carried out. The lymphoblastoid cell line Jurkat was irradiated at 0.2, 2 and 4 Gy of X‐rays. After irradiation, the cultures were maintained for three weeks and samples were harvested at different times. Chromosome aberrations were detected using two FISH techniques: painting of chromosomes 1, 4 and 11, to assess the persistence of translocations and dicentrics, and mFISH to evaluate the frequency, the complexity, the chromosome involvement on the radiation‐induced chromosome aberrations and the preferential chromosome‐chromosome associations in the initial and final samples in the control and irradiated cultures at 2 and 4 Gy. In the study performed with painted technique, in all doses, the frequencies (x100) of dicentrics decreased clearly in the successive samples until values near zero. The frequencies (x100) of translocations, at 0.2 and 2Gy, were relatively constant until the last sample, whilst at 4Gy there was an initial steeped decrease in the first samples followed by a slight decrease in the last ones. The technique mFISH showed that simple incomplete aberrations disappear over time and the complexity of chromosome aberrations increases with dose and decreases with post‐irradiation time. The chromosome involvement was random for radiation‐induced exchange aberrations and non‐random for total aberrations. Preferential chromosome‐chromosome associations were observed in the initial and final samples in the Jurkat cell line.

Les interaccions antigen/anticòs són un dels tipus més interessants d’interaccions proteiques. La millor manera de prevenir les malalties causades per patògens és mitjançant l’ús de vacunes. L’aparició de la genòmica permet fer cerques a tot el genoma de nous candidats vacunals, tècnica anomenada vaccinologia inversa. L’estratègia més comuna on s’aplica la vaccinologia inversa és al disseny de vacunes de subunitats recombinants, que en general generen resposta immune humoral a causa de la presència d’epítops B en les proteïnes del patogen. Un problema important d’aquesta estratègia és la identificació de les proteïnes immunogèniques protectives del surfoma del patogen. El mimetisme epitòpic pot donar lloc a fenòmens autoimmunes relacionats amb diverses malalties humanes. El Capítol I d’aquesta tesi descriu una anàlisi computacional basat en la seqüència on, mitjançant l’aplicació de l’algorisme BLASTP, es van comparar bases de dades d’epítops B lineals coneguts i també de seqüències de proteïnes de superfície dels principals patògens bacterians respiratoris humans amb el proteoma humà. Es va trobar que cap dels 7353 epítops B lineals analitzats tenien regions d’identitat de seqüència amb proteïnes humanes capaces de generar anticossos i alhora que només l'1% de les 2175 proteïnes analitzades contenien alguna zona de seqüència compartida amb el proteoma humà. Aquestes troballes suggereixen l’existència d’un mecanisme per evitar l’autoimmunitat. També proposem una estratègia per corroborar o advertint sobre la viabilitat d’una proteïna que contingui un cert epítop B lineal de ser un bon candidat vacunal mitjançant estudis de vaccinologia inversa. En resum, els epítops sense cap tipus d’identitat de seqüència amb proteïnes humanes han de ser bons candidats vacunals, i al l’inrevés. El docking proteic és un mètode computacional per predir la millor manera en què interactuen les proteïnes, però, és possible identificar quina és la millor solució d’un programa de docking? La resposta habitual a aquesta pregunta és la solució que tingui més alta puntuació als outputs dels programes de docking, però les interaccions entre proteïnes són processos dinàmics, i moltes vegades la regió d’interacció és prou àmplia com per permetre diferents orientacions i/o energies d'interacció entre elles. En alguns casos, com en un multímer, es poden donar diverses regions d’interacció entre els monòmers. Aquests processos dinàmics impliquen interaccions, amb desplaçaments de superfície entre proteïnes, que porten a assolir la configuració funcional del complex proteic. Així doncs, en molts casos no hi ha una solució estàtica i única per a la interacció entre proteïnes, sinó que es donen diverses configuracions que també haurien de ser analitzades perquè podrien ser importants. Per extreure el conjunt de solucions més representatives dels outputs dels programes de docking, al Capítol II d’aquesta tesi es detalla el desenvolupament d’una aplicació de clústering no supervisada i automàtica, anomenada DockAnalyse. Aquesta aplicació es basa en el mètode ja existent de clústering DBscan, mitjançant el qual es busquen continuïtats entre els clústers generats per la representació de les dades dels outputs de docking. El mètode de clústering DBSCAN és molt robust i resol alguns dels problemes d’inconsistència dels mètodes clàssics de clústering com el tractament dels valors atípics i la dependència alhora de definir prèviament el nombre de clústers. Mitjançant representacions gràfiques i molt visuals, DockAnalyse fa que la interpretació de les solucions de docking sigui més fàcil permetent-nos trobar les més representatives. S’ha utilitzat aquesta nova aplicació per analitzar diverses interaccions proteiques i així poder modelar el comportament dinàmic de la interacció entre les proteïnes d’un complex. DockAnalyse també pot fer-se servir per a descriure regions d’interacció entre proteïnes i, per tant, orientar en futurs assajos de docking flexibles. L’aplicació (feta amb el paquet R) és oberta i accessible. La construcció dels Clústers Ferro-Sofre (ISC) en eucariotes implica interaccions entre diferents proteïnes, entre els quals es troba la proteïna Frataxina. Dèficits d'aquesta proteïna s'han associat amb excés de ferro dins del mitocondri i alteracions en la biogènesi dels ISC ja que es proposa que Frataxina actua com a donadora de ferro per a la construcció d'aquests ISC en aquest orgànul. Una reducció dràstica de Frataxina causa l'Atàxia de Friedreich, una malaltia neurodegenerativa hereditària humana que afecta principalment l'equilibri, la coordinació, els músculs i el cor. Aquest síndrome és l'atàxia autosòmica recessiva més comuna. Entre els mecanismes moleculars d' humans i de llevat que involucren Frataxina s'han trobat moltes similituds així que els llevats representen un bon model per a estudiar aquest procés. En llevat, el complex proteic que forma la plataforma central de muntatge dels passos inicials de la biogènesi dels ISC està composta per la Frataxina homòloga de llevat, el dímer Nfs1-Isd11 i la proteïna Isu. En general, està acceptat que la funció de les proteïnes implica interaccions amb altres proteïnes associades, però en aquest cas no se sap prou sobre l'estructura del complex de proteïnes i, per tant, com funciona exactament. En el Capítol III d'aquesta tesi es proposa un model del complex proteic necessari per a la biogènesi dels ISC amb el que es pretén aprofundir en detalls estructurals que expliquin la funció biològica. Per aconseguir aquest objectiu s'han utilitzat diverses eines de la bioinformàtiques, així com tècniques de modelització i programes de docking de proteïnes. Com a resultat, s'ha modelat l'estructura d'aquest complex proteic i també s'ha suggerit el comportament dinàmic dels seus components, juntament amb la dels àtoms de ferro i sofre necessaris per a la formació dels ISC. Aquestes hipòtesis podrien ajudar a comprendre millor la funció i les propietats moleculars de la proteïna Frataxina, així com els de les seves companyes presents al complex proteic. / Antigen/antibody interactions are one of the most interesting kinds of protein interactions. The best way to prevent diseases caused by pathogens is by the use of vaccines. The advent of genomics enables genome-wide searches of new vaccine candidates, called reverse vaccinology. The most common strategy to apply reverse vaccinology is by designing subunit recombinant vaccines, which usually generate humoral immune response due to B-cell epitopes in proteins. A major problem for this strategy is the identification of protective immunogenic proteins from the surfome of the pathogen. Epitope mimicry may lead to auto-immune condition related to several human diseases. Chapter I of this thesis describes a sequence-based computational analysis that was carried out applying the BLASTP algorithm where databases containing the known linear B-cell epitopes and the surface-protein sequences of the main human respiratory bacterial pathogens were compared to the human proteome. We found that none of the 7353 linear B-cell epitopes analyzed share any sequence identity region with human proteins capable of generating antibodies, and that only 1% of the 2175 exposed proteins analyzed contain a stretch of shared sequence with the human proteome. These findings suggest the existence of a mechanism to avoid autoimmunity. We also propose a strategy for corroborating or warning about the viability of a protein linear B-cell epitope to be a putative vaccine candidate in reverse vaccinology studies. Therefore, epitopes without any sequence identity with human proteins should be good vaccine candidates, and the other way around. Protein docking is a computational method to predict the best way by which proteins interact, but, is it possible to identify what the best solution of a docking program is? The usual answer to this question is the highest score solution, but interactions between proteins are dynamic processes, and many times the interaction regions are wide enough to permit protein-protein interactions with different orientations and/or interaction energies. In some cases, as in a multimeric protein complex, several interaction regions are possible among the monomers. These dynamic processes involve interactions with surface displacements between the proteins to finally achieve the functional configuration of the protein complex. Consequently, there is not a static and single solution for the interaction between proteins, but there are several important configurations that also have to be analyzed. To extract those representative solutions from the docking output datafile, Chapter II of this thesis details the development of an unsupervised and automatic clustering application, named DockAnalyse. This application is based on the already existing DBscan clustering method, which searches for continuities among the clusters generated by the docking output data representation. The DBscan clustering method is very robust and, moreover, solves some of the inconsistency problems of the classical clustering methods like, for example, the treatment of outliers and the dependence of the previously defined number of clusters. DockAnalyse makes the interpretation of the docking solutions through graphical and visual representations easier by guiding the user to find the representative solutions. We have applied our new approach to analyze several protein interactions and model the dynamic protein interaction behavior of a protein complex. DockAnalyse might also be used to describe interaction regions between proteins and, therefore, guide future flexible dockings. The application (implemented in the R package) is accessible. The assembly of Iron-Sulfur Clusters (ISCs) in eukaryotes involves interactions between different proteins, among which is important the protein Frataxin. Deficits in this protein have been associated with iron inside the mitochondria and impaired ISC biogenesis as it is postulated to act as the iron donor for ISCs assembly in this organelle. A pronounced lack of Frataxin causes Friedreich's Ataxia, which is a human neurodegenerative and hereditary disease mainly affecting the equilibrium, coordination, muscles and heart. Moreover, it is the most common autosomal recessive ataxia. High similarities between the human and yeast molecular mechanisms that involve Frataxin have been suggested making yeast a good model to study that process. In yeast, the protein complex that forms the central assembly platform for the initial step of ISC biogenesis is composed by yeast Frataxin homolog, Nfs1-Isd11 and Isu. In general, it is commonly accepted that protein function involves interaction with other protein partners, but in this case not enough is known about the structure of the protein complex and, therefore, how it exactly functions. In Chapter III of this thesis a model of the ISC biogenesis protein complex was proposed in order to gain insight into structural details that could end up with its biological function. To achieve this goal several bioinformatics tools, modeling techniques and protein docking programs were used. As a result, the structure of the protein complex and the dynamic behavior of its components, along with that of the iron and sulfur atoms required for the ISC assembly, were modeled. This hypothesis might help to better understand the function and molecular properties of Frataxin as well as those of its ISC assembly protein partners.

Platelets are important players in haemostasis and their activation is essential to limit post-traumatic blood loss upon vessel injury. On the other hand, pathological platelet activation may lead to thrombosis resulting in myocardial infarction and stroke. Platelet activation and subsequent thrombus formation are, therefore, tightly regulated and require a well-defined interplay of platelet surface receptors, intracellular signalling molecules, cytoskeletal rearrangements and the activation of the coagulation cascade. In vivo thrombosis and haemostasis models mimic thrombus formation at sites of vascular lesions and are frequently used to assess thrombotic and haemostatic functions of platelets. In this dissertation, different in vivo models were used in mice to address the question at what level a reduced platelet count (PC) compromises stable thrombus formation. To study this, mice were rendered thrombocytopenic by low-dose anti-GPIbα antibody treatment and subjected to a tail bleeding time assay as well as to four different in vivo thrombosis models. Haemostasis and occlusive thrombus formation in small vessels were only mildly affected even at severe reductions of the PC. In contrast, occlusive thrombus formation in larger arteries required higher PCs demonstrating that considerable differences in the sensitivity for PC reductions exist between these models. In a second part of this study, mice were rendered thrombocytopenic by injection of high-dose anti-GPIbα antibody which led to the complete loss of all platelets from the circulation for several days. During recovery from thrombocytopenia, the newly generated platelet population was characterised and revealed a defect in immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-signalling. This defect translated into impaired arterial thrombus formation. To further investigate ITAM-signalling in vivo, genetically modified mice were analysed which display a positive or negative regulation of platelet ITAM-signalling in vitro. Whereas mice lacking the adapter Grb2 in platelets showed a delayed thrombus formation in vivo after acetylsalicylic acid treatment, Clp36ΔLIM bone marrow chimeric mice and SLAP/SLAP2-deficient mice displayed pro-thrombotic properties in vivo. Finally, mice lacking the adapter protein EFhd2 were analysed in vitro and in vivo. However, EFhd2-deficient platelets showed only a minor increase in the procoagulant activity compared to control. / Thrombozyten sind wichtige Zellen für die Hämostase, die bei einer Verletzung der Gefäßwand aktiviert werden, um den Blutverlust zu begrenzen. Auf der anderen Seite kann die pathologische Aktvierung von Thrombozyten jedoch zu Thromboseereignissen und in Konsequenz zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen. Die Aktivierung von Thrombozyten und die nachfolgende Thrombusbildung sind daher streng reguliert und setzen ein enges Zusammenspiel von Thrombozytenoberflächenrezeptoren, intrazellulären Signalmolekülen, Zytoskelettumstrukturierungen und die Aktivierung der Koagulationskaskade voraus. In vivo Thrombose- und Hämostase-Modelle ahmen die Thrombusbildung in Gefäßen nach und werden häufig benutzt um die hämostatische und thrombotische Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In dieser Dissertation wurden verschiedene in vivo Modelle in Mäusen genutzt, um zu klären, ab welcher Thrombozytenzahl eine stabile Thrombusbildung beeinträchtigt ist. Für diese Untersuchung wurden Mäuse mit geringen Dosen anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einer Reduktion der Thrombozytenzahl führen. Anschließend wurden die Mäuse in einem Blutungszeitmodel und vier verschiedenen thrombotischen Modellen untersucht. Hämostase oder okklusive Thrombusbildung in kleinen Gefäßen waren auch bei einer sehr starken Reduktion der Thrombozytenzahl kaum beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu war für eine normale Thrombusbildung in größeren Gefäßen eine höhere Thrombozytenzahl nötig. Verschiedene in vivo Modelle zeigen daher eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber einer Reduktion der Thrombozytenzahl. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer hohen Dosis anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einem völligen, mehrtägigen Verlust aller Thrombozyten im Blutkreislauf führte. Während sich die Thrombozytenzahl erholte, wurden neu generierte Thrombozyten charakterisiert, die einen deutlichen Defekt im ITAM-Signalweg zeigten. Dieser Defekt führte zu einer verminderten arteriellen Thrombusbildung. Um Auswirkungen eines Defektes im ITAM-Signalweg detaillierter in vivo zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse, die in vitro eine reduzierte oder verstärkte ITAM-Signaltransduktion in Thrombozyten zeigen, untersucht. Während Mäuse, die in Thrombozyten kein Grb2 exprimieren nach Acetylsalicylsäurebehandlung in vivo eine verlangsamte Thrombusbildung zeigten, war die Thrombusbildung in Clp36ΔLIM Knochenmarkchimären und SLAP/SLAP2-defizienten Mäusen beschleunigt. Darüber hinaus wurden EFhd2-defiziente Mäuse in vitro und in vivo analysiert. EFhd2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch nur eine geringe Steigerung in der prokoagulatorischen Aktivität im Vergleich zu Kontrolltieren.

The evolutionary success of insects is believed to be at least partially facilitated by symbioses between insects and prokaryotes. Bacterial endosymbionts confer various fitness advantages to their hosts, for example by providing nutrients lacking from the insects’ diet thereby enabling the inhabitation of new ecological niches. The Florida carpenter ant Camponotus floridanus harbours endosymbiotic bacteria of the genus Blochmannia. These primary endosymbionts mainly reside in the cytoplasm of bacteriocytes, specialised cells interspersed into the midgut tissue, but they were also found in oocytes which allows their vertical transmission. The social lifestyle of C. floridanus may facilitate the rapid spread of infections amongst genetically closely related animals living in huge colonies. Therefore, the ants require an immune system to efficiently combat infections while maintaining a “chronic” infection with their endosymbionts. In order to investigate the immune repertoire of the ants, the Illumina sequencing method was used. The previously published genome sequence of C. floridanus was functionally re-annotated and 0.53% of C. floridanus proteins were assigned to the gene ontology (GO) term subcategory “immune system process”. Based on homology analyses, genes encoding 510 proteins with possible immune function were identified. These genes are involved in microbial recognition and immune signalling pathways but also in cellular defence mechanisms, such as phagocytosis and melanisation. The components of the major signalling pathways appear to be highly conserved and the analysis revealed an overall broad immune repertoire of the ants though the number of identified genes encoding pattern recognition receptors (PRRs) and antimicrobial peptides (AMPs) is comparatively low. Besides three genes coding for homologs of thioester-containing proteins (TEPs), which have been shown to act as opsonins promoting phagocytosis in other insects, six genes encoding the AMPs defesin-1 and defensin-2, hymenoptaecin, two tachystatin-like peptides and one crustin-like peptide are present in the ant genome. Although the low number of known AMPs in comparison to 13 AMPs in the honey bee Apis mellifera and 46 AMPs in the wasp Nasonia vitripennis may indicate a less potent immune system, measures summarised as external or social immunity may enhance the immune repertoire of C. floridanus, as it was discussed for other social insects. Also, the hymenoptaecin multipeptide precursor protein may be processed to yield seven possibly bioactive peptides. In this work, two hymenoptaecin derived peptides were heterologously expressed and purified. The preliminary antimicrobial activity assays indicate varying bacteriostatic effects of different hymenoptaecin derived peptides against Escherichia coli D31 and Staphylococcus aureus which suggests a functional amplification of the immune response further increasing the antimicrobial potency of the ants. Furthermore, 257 genes were differentially expressed upon immune challenge of C. floridanus and most of the immune genes showing differential expression are involved in recognition of microbes or encode immune effectors rather than signalling components. Additionally, genes coding for proteins involved in storage and metabolism were downregulated upon immune challenge suggesting a trade-off between two energy-intensive processes in order to enhance effectiveness of the immune response. The analysis of gene expression via qRT-PCR was used for validation of the transcriptome data and revealed stage-specific immune gene regulation. Though the same tendencies of regulation were observed in larvae and adults, expression of several immune-related genes was generally more strongly induced in larvae. Immune gene expression levels depending on the developmental stage of C. floridanus are in agreement with observations in other insects and might suggest that animals from different stages revert to individual combinations of external and internal immunity upon infection. The haemolymph proteome of immune-challenged ants further established the immune-relevance of several proteins involved in classical immune signalling pathways, e.g. PRRs, extracellularly active proteases of the Toll signalling pathway and effector molecules such as AMPs, lysozymes and TEPs. Additionally, non-canonical proteins with putative immune function were enriched in immune-challenged haemolymph, e.g. Vitellogenins, NPC2-like proteins and Hemocytin. As known from previous studies, septic wounding also leads to the upregulation of genes involved in stress responses. In the haemolymph, proteins implicated in protein stabilisation and in the protection against oxidative stress and insecticides were enriched upon immune challenge. In order to identify additional putative immune effectors, haemolymph peptide samples from immune-challenged larvae and adults were analysed. The analysis in this work focussed on the identification of putative peptides produced via the secretory pathway as previously described for neuropeptides of C. floridanus. 567 regulated peptides derived from 39 proteins were identified in the larval haemolymph, whereas 342 regulated peptides derived from 13 proteins were found in the adult haemolymph. Most of the peptides are derived from hymenoptaecin or from putative uncharacterised proteins. One haemolymph peptide of immune-challenged larvae comprises the complete amino acid sequence of a predicted peptide derived from a Vitellogenin. Though the identified peptide lacks similarities to any known immune-related peptide, it is a suitable candidate for further functional analysis. To establish a stable infection with the endosymbionts, the bacteria have to be transmitted to the next generation of the ants. The vertical transmission of B. floridanus is guaranteed by bacterial infestation of oocytes. This work presents the first comprehensive and detailed description of the localisation of the bacterial endosymbionts in C. floridanus ovaries during oogenesis. Whereas the most apical part of the germarium, which contains the germ-line stem cells, is not infected by the bacteria, small somatic cells in the outer layers of each ovariole were found to be infected in the lower germarium. Only with the beginning of cystocyte differentiation, endosymbionts are exclusively transported from follicle cells into the growing oocytes, while nurse cells were never infected with B. floridanus. This infestation of the oocytes by bacteria very likely involves exocytosis-endocytosis processes between follicle cells and the oocytes. A previous study suggested a down-modulation of the immune response in the midgut tissue which may promote endosymbiont tolerance. Therefore, the expression of several potentially relevant immune genes was analysed in the ovarial tissue by qRT-PCR. The relatively low expression of genes involved in Toll and IMD signalling, and the high expression of genes encoding negative immune regulators, such as PGRP-LB, PGRP-SC2, and tollip, strongly suggest that a down-modulation of the immune response may also facilitate endosymbiont tolerance in the ovaries and thereby contribute to their vertical transmission. Overall, the present thesis improves the knowledge about the immune repertoire of C. floridanus and provides new candidates for further functional analyses. Moreover, the involvement of the host immune system in maintaining a “chronic” infection with symbiotic bacteria was confirmed and extended to the ovaries. / Der evolutionäre Erfolg von Insekten wird zumindest teilweise Symbiosen zwischen Insekten und Prokaryonten zugeschrieben. Dabei übertragen bakterielle Symbionten verschiedenste Fitnessvorteile an ihre Wirte. Beispielsweise ermöglicht die Bereitstellung von Nährstoffen, welche in der Nahrung des Insekts fehlen, die Erschließung neuer ökologischer Nischen. Die Florida Rossameise Camponotus floridanus trägt endosymbiontische Bakterien der Gattung Blochmannia. Diese primären Endosymbionten kommen hauptsächlich im Zytoplasma von spezialisierten Zellen des Mitteldarms, den sogenannten Bakteriozyten, vor. Blochmannien wurden aber auch in Oozyten und Eiern gefunden, was ihre vertikale Übertragung an Individuen der nächsten Generation ermöglicht. Als soziale Insekten leben C. floridanus in großen Kolonien von nah verwandten Individuen. Ihre Lebensweise begünstigt möglicherweise die schnelle Ausbreitung von Infektionen, weshalb erwartet werden müsste, dass die Ameisen ein effizientes Immunsystem besitzen. Gleichzeitig muss jedoch die „chronische“ Infektion mit den bakteriellen Symbionten aufrechterhalten werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Immunrepertoire der Ameisen mittels Illumina Sequenzierung charakterisiert. Zunächst wurde das vor kurzem publizierte Genom von C. floridanus funktionell re-annotiert. Dabei wurden 0.53% der annotierten Proteine der GO-Unterkategorie “Prozesse des Immunsystems” zugeordnet. Basierend auf Homologieanalysen wurden Gene identifiziert, die für 510 Immunproteine kodieren. Die Genprodukte spielen eine Rolle bei der Erkennung von Mikroben und in den Signalwegen des Immunsystems, sind jedoch auch an Prozessen der zellulären Immunantwort, wie beispielsweise Phagozytose und Melanisierung, beteiligt. Dabei sind Komponenten der Hauptsignalwege hoch konserviert. Obwohl die Anzahl der identifizierten Proteine, die Fremdorganismen erkennen (PRRs), und die Anzahl an antimikrobiellen Peptiden (AMPs) vergleichsweise gering ist, verfügt C. floridanus insgesamt über ein umfangreiches Immunrepertoire. Neben drei Genen, die für Thioester-enthaltende Proteine (TEPs) kodieren und wie in anderen Insekten möglicherweise eine Rolle als Opsonine bei der Phagozytose spielen, wurden sechs AMP-Gene identifiziert. Diese kodieren für Defesin-1 und Defensin-2, Hymenoptaecin, zwei Tachystatin-ähnliche und ein Crustin-ähnliches Peptid. Die geringe Anzahl an bekannten AMPs im Vergleich zur Honigbiene Apis mellifera (13 AMPs) und Wespe Nasonia vitripennis (46 AMPs) könnte ein möglicherweise geringeres Potential des Immunsystems anzeigen. Allerdings könnten zusätzliche Maßnahmen, die unter dem Begriff „Soziale Immunität“ zusammengefasst werden, das Immunrepertoire von C. floridanus ergänzen, wie es schon für andere Insekten diskutiert wurde. Zudem könnten durch proteolytische Prozessierung des Hymenoptaecin Multipeptid Präkursormoleküls sieben mögliche antimikrobielle Peptide freigesetzt werden. Für die vorliegende Arbeit wurden zwei verschiedene dieser Hymenoptaecin Peptide heterolog exprimiert und aufgereinigt. Die vorläufige funktionelle Charakterisierung der Peptide zeigt, dass diese Peptide möglicherweise bakteriostatische Wirkung mit einem unterschiedlichen Wirkspektrum gegen Escherichia coli D31 und Staphylococcus aureus entfalten. Dies erlaubt die Annahme, dass die Expression des Hymenoptaecins zu einer funktionellen Amplifikation der Immunantwort führt und das Immunrepertoire der Ameisen erweitert. Nach Injektion von bakteriellem Material in die Ameisen wurde die Expression von 257 Genen reguliert. Viele dieser Gene kodieren für Proteine zur Erkennung von Pathogenen oder kodieren für Effektoren des Immunsystems. Komponenten der Signalwege zeigten dagegen kaum Veränderungen in ihrer Expression auf. Außerdem zeigten Gene, die für Speicherproteine oder Proteine des Metabolismus kodieren, generell eine geringere Expression nach Stimulierung des Immunsystems auf. Dies lässt einen Ausgleich zwischen zwei energieintensiven Prozessen vermuten, um eine effektive Immunantwort zu ermöglichen. Darüber hinaus zeigt die Validierung der Expressionsdaten mittels qRT-PCR eine Abhängigkeit der Expression mehrerer Gene vom Entwicklungsstadium der Ameisen auf. Generell wurden die gleichen Tendenzen in der Regulation der Expression dieser Gene nach Immunstimulierung beobachtet. Allerdings wurde die Expression mehrerer immunrelevanter Gene in Larven weit stärker induziert als in Adulten. Wie es auch schon für andere Insekten gezeigt wurde, scheinen C. floridanus Larven und Arbeiterinnen auf individuelle Kombinationen externer und interner Immunfaktoren zurückzugreifen. Die vorher beschriebenen Transkriptomdaten wurden durch die Charakterisierung des Hämolymph-Proteoms von C. floridanus nach Immunstimulation ergänzt, wodurch die Immunrelevanz vieler Faktoren auch auf Proteinebene bestätigt werden konnte. Beispielsweise wurden zahlreiche PRRs und extrazellulär aktive Proteasen des Toll-Signalwegs, aber auch Immuneffektoren wie AMPs, Lysozyme und TEPs in der Hämolymphe identifiziert. Zusätzlich führte die Immunstimulation in Larven und Adulten zur Anreicherung nicht-kanonischer Proteine mit möglicher Immunfunktion, beispielsweise Vitellogenine, NPC2-ähnliche Proteine und Hemocytin. Aus einer früheren Arbeit ist bekannt, dass septische Verwundungen zusätzlich die transkriptionelle Aktivierung von Genen der Stressantwort hervorrufen können. So wurden auch in der Hämolymphe Proteine entdeckt, die eine Rolle bei der Stabilisierung von Proteinen, und dem Schutz gegen oxidativen Stress und Insektizide spielen. Zur Identifizierung weiterer möglicher Peptideffektoren wurden Hämolymphpeptid-Proben von immunstimulierten Larven und Adulten analysiert. Der Fokus der Analyse lag dabei auf der Identifizierung von Peptiden, die auf dem sekretorischen Weg gebildet werden, wie es zuvor für Neuropeptide von C. floridanus beschrieben worden war. 567 differentiell regulierte Peptide, die von 39 Proteinen abstammen, wurden in Larvenhämolymphe identifiziert, wohingegen in der Hämolymphe von Adulttieren 342 derartige Peptide, die 13 Proteinen zugeordnet werden können, gefunden wurden. Die meisten dieser Peptide können Hymenoptaecin oder bisher noch nicht charakterisierte Proteinen zugeordnet werden. Jedoch wurde ein Peptid in larvaler Hämolymphe identifiziert, dessen Aminosäuresequenz vollständig mit der Sequenz eines vorhergesagten, von Vitellogenin stammenden Peptids übereinstimmt. Weil dieses Peptid keine Ähnlichkeiten zu anderen bereits charakterisierten antimikrobiellen Peptiden aufweist, stellt es einen geeigneten Kandidaten für weitere funktionelle Analysen dar. Die bakterielle Infektion von Oozyten ermöglicht die transovariale Übertragung von B. floridanus und ermöglicht damit die Etablierung einer stabilen Infektion in der nächsten Wirtsgeneration. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die erste umfassende und detaillierte Beschreibung der Lokalisation bakterieller Endosymbionten in Ovarien von C. floridanus. Im apikalen Germarium, in welchem sich die Keimbahn-Stammzellen befinden, liegt noch keine bakterielle Infektion des Gewebes vor. In späteren Segmenten des Germariums jedoch können Blochmannien das erste Mal in kleinen somatischen Zellen der äußeren Schicht jeder Ovariole detektiert werden. Mit beginnender Zystozytendifferenzierung werden die Endosymbionten von Follikelzellen ausschließlich in die heranwachsenden Oozyten transportiert, wobei sehr wahrscheinlich Exozytose-Endozytose-Prozesse involviert sind. Nährzellen zeigen zu keinem Zeitpunkt während der Oogenese eine bakterielle Infektion auf. Da in einer früheren Studie vorgeschlagen wurde, dass eine signifikant reduzierte Anregung der Immunantwort im Mitteldarmgewebe zur Toleranz der Endosymbionten beitragen könnte, wurde auch die Expression ausgewählter Immungene in den Ovarien durch qRT-PCR untersucht. Die relativ geringe Expression von Genen des Toll- und des IMD-Signalwegs und die zusätzlich vergleichsweise starke Genexpression negativer Regulatoren des Immunsystems, wie PGRP-LB, PGRP-SC2 und tollip, sind Indikatoren einer reduzierten Immunantwort in den Ovarien von C. floridanus. Wie schon für den Mitteldarm der Tiere vorgeschlagen, könnte dies möglicherweise sowohl zur Toleranz von Blochmannia als auch zur vertikalen Übertragung der Endosymbionten beitragen. Die vorliegende Doktorarbeit erweitert das Wissen über das Immunrepertoire von C. floridanus und es konnten vielversprechende Kandidaten für weitere funktionelle Analysen von möglichen Immunfaktoren identifiziert werden. Darüber hinaus konnten weitere Hinweise auf die Bedeutung von Immunfaktoren der Ameisen bei der Toleranz gegenüber den symbiontischen Bakterien gefunden und auf die Ovarien der Tiere ausgeweitet werden.

La neuropatía diabética (ND) es una de las complicaciones a largo plazo más comunes que presentan los pacientes con diabetes mellitus (DM). Los pacientes presentan como síntomas más significativos un deterioro de la función nerviosa con disfunción sensorial y dolor en las extremidades. Los mecanismos patológicos, que llevan al desarrollo de la complicación pueden ser múltiples y no están claros por lo que no existe un tratamiento único y satisfactorio. El descubrimiento de un tratamiento eficaz requiere una mayor comprensión de las causas que desencadenan la complicación, entre ellas qué tipo celular está primariamente afectado, lo que permitiría tratar la enfermedad en las primeras etapas de la complicación.El sistema nervioso periférico (SNP) contiene principalmente dos tipos celulares: neuronas y células de la glia, concretamente las células de Schwann (SC) que son las responsables de la producción de las proteínas de la mielina. En la primera parte de este trabajo nos centramos en la caracterización molecular de los efectos de la concentración de glucosa sobre las SC in vitro, en cultivos establecidos y primarios y también en cocultivos de SC y neuronas sensoriales primarias. Más tarde se realizaron estudios in vivo en muestras de nervios ciáticos de tres modelos animales diferentes, ratones ICR adultos y jóvenes a los que se les indujo la diabetes experimental mediante inyección de estreptozotocina (STZ) y también en ratones NOD, modelo de diabetes tipo I que desarrolla la enfermedad espontáneamente. En el estudio se analizaron tanto las proteínas de la mielina como factores de transcripción implicados en mielinización, demostrándose alteraciones en la expresión de estas proteínas. En la segunda parte de esta tesis, se estudiaron los cambios inducidos por la hiperglucemia en la expresión de NRG1typeIII, un factor esencial para la mielinización en sistema nervioso periférico. Se realizaron estudios in vitro con neuronas sensoriales primarias purificadas o en cocultivo con SC y cultivos primarios de neuronas motoras, cultivadas en diferentes concentraciones de glucosa. In vivo se analizaron muestras de ganglios de la raíz dorsal y de médula espinal de los tres modelos animales que hemos comentado anteriormente. En todos los casos se demostró una disminución de la expresión de NRG1typeIII.En la parte final de este trabajo, y como prueba de concepto, se administraron vectores virales con el factor promielinizante NRG1typeIII en un modelo de neuropatía diabética donde los estudios, tanto a nivel molecular como electrofisiológicos y morfológicos, demostraron una mejora significativa comparándolos con animales diabéticos no tratatados o tratados con vectores virales irrelevantes, por lo que parecería que el tipo celular primariamente afectado en la ND son las neuronas del SNP.Hasta la actualidad no existe un tratamiento óptimo para la neuropatía diabética. Nuestros resultados sugieren que los mecanismos moleculares que desencadenan esta complicación de la diabetes aparecen ya desde los primeros días de hiperglucemia, y que un tratamiento alternativo para esta complicación podría basarse en estrategias de terapia génica con vectores virales. / Diabetic neuropathy (DN) is one of the long-term complications most commonly presented in patients with diabetes mellitus (DM), with a estimated prevalence of 60% of patients. Patients have significant symptoms as a deterioration of nerve function with sensory dysfunction and pain in the extremities. The pathological mechanisms that lead to the development of the complication may be multiple and are unclear as there is no satisfactory treatment. The discovery of an effective treatment requires a greater understanding of the causes that lead to the complication, including which cell type is primarily affected, which would treat the disease in the early stages of the complication, unlike the current treatment that is performed when symptoms are well established. The peripheral nervous system (PNS) contains two main cell types: neurons and glia cells, particularly Schwann cells (SC) that are responsible for the production of myelin proteins in PNS. In the first part of this work we focus on the molecular characterization of the effects of glucose on the SC in vitro in established and primary cultures and in cocultures of SCs and primary sensory neurons. Later in vivo studies were conducted on samples of sciatic nerves from three different animal models, ICR mice adults and young (18 postnatal days) that were induced experimental diabetes by injection of streptozotocin (STZ) and in NOD mice, a type I diabetes model that spontaneously develops the disease. The study analyzed both the myelin proteins as key transcription factors involved in myelination, demonstrating altered expression of these proteins.In the second part of this thesis, we studied the changes induced by hyperglycemia in NRG1typeIII expression, an essential factor for myelination in PNS. Studies were conducted in vitro with purified or primary sensory neurons in coculture with SCs and primary cultures of motor neurons, grown in different concentrations of glucose. In vivo samples from dorsal root ganglia and spinal cord of three animal models that we discussed earlier. In all cases, showed a decreased expression of NRG1typeIII. In the final part of this work, and as a proof of concept, viral vectors coding for NRG1typeIII were administered in a mouse model of diabetic neuropathy where studies, both molecular and electrophysiological and morphological, showed a significant improvement compared with control diabetic animals or the same animals treated with viral vectors irrelevant, it would seem that the cell type primarily affected in the ND neurons are SNP, since the early days of hyperglycemia. To date there is no optimal treatment for diabetic neuropathy. Our results suggest that the molecular mechanisms that trigger this complication of diabetes appear since the early days of hyperglycemia, and an alternative treatment for this complication could be based on gene therapy strategies using viral vectors.

No description available.

La retinosi pigmentària (RP) és una malaltia degenerativa de la retina amb caràcter hereditari. Aquesta malaltia pot presentar diferents tipus d'herència: autosòmica dominant, autosòmica recessiva, lligada al cromosoma X i algunes formes digèniques i mitocondrials. La retinosi pigmentària autosòmica dominant (RPAD) està causada majoritàriament per mutacions en gens amb expressió específica a la retina i que codifiquen proteïnes involucrades principalment en la funció, estructura i desenvolupament de la retina. Tot i així, en els darrers anys, s'ha vist que mutacions en certs gens amb expressió ubiqua només provoquen patologia a la retina. Alguns d'aquests gens codifiquen proteïnes implicades en el processament del mRNA o "splicing". Tres d'aquests factors són les proteïnes PRPF3, PRPF8 i PRPF31. Mutacions en "trans" en aquests factors de "splicing" sembla ser que provoquen RPAD. D'altra banda, també s'ha vist que mutacions en "cis" en els senyals de "splicing" del gen de la rodopsina (RHO), associat a RP, també provoquen RPAD.En aquest treball es realitza un cribatge mutacional en els gens que codifiquen els factors PRPF3, PRPF8 i PRPF31 en pacients afectats per la RPAD. Es realitza la correlació fenotip-genotip en els pacients portadors de mutacions en aquests gens. Mitjançant microarrays de DNA s'estudia el perfil d'expressió gènica en alguns pacients portadors de mutacions en algun d'aquests gens per tal d'esbrinar el mecanisme patogènic que pot estar provocant la malaltia. Pel que fa a les mutacions en senyals de "splicing" del gen RHO, s'estudien els efectes d'aquestes mutacions sobre el processament del mRNA de RHO. / Retinitis pigmentosa (RP) is an inherited and degenerative disease of the retina. This disease presents different types of inheritance: autosomal dominant, autosomal recessive, X-linked and some digenic and mitochondrial forms. In most cases, autosomal dominant retinitis pigmentosa (ADRP) is caused by mutations in genes specifically expressed in the retina that codify proteins mainly involved in function, structure and development of the retina. However, in the last years it seems that mutations in certain genes with ubiquituous expression only cause pathology in the retina. Some of these genes codify proteins involved in the pre-mRNA splicing. Three of these factors are PRPF3, PRPF8 and PRPF31. It seems that trans-mutations in these splicing factors can cause RPAD. On the other hand, cis-mutations in splicing sites in the rhodopsin gene, associated to RP, also cause RPAD.In this work, a mutational screening in genes coding for PRPF3, PRPF8 and PRPF31 factors has been performed in patients affected of ADRP. Phenotype-genotype correlation has been done in patients carrying mutations in these genes. Through DNA microarrays, gene expression profile has been studied in some patients carrying mutation in some of these genes to ascertain the pathogenic mechanism that can cause the disease. Regarding mutations in splicing sites of the RHO gene, effects of these mutations in the splicing process are discussed.

Aquest treball s'emmarca dins d'una de les principals línees d'investigació del nostre grup, dirigida a l'avaluació d'estratègies aplicables a l'obtenció de varietats d'arròs resistents a patògens i insectes plaga mitjançant transformació genètica. L'objectiu general ha estat l'expressió simultània de gens vegetals que codifiquen proteïnes insecticides i antifúngiques en plantes d'arròs transgèniques. En primer lloc s'ha avaluat l'eficàcia de l'expressió d'un gen fusió que codifica dos inhibidors de proteases, els gens mpi de blat de moro (maize proteinase inhibitor) i pci de patata (potato carboxypeptidase inhibitor). Per a l'expressió simultània d'aquets dos gens s'han utilitzat vàries estratègies, com són, 1) l'ús d'una seqüència viral anomenada "2A" capaç de patir autoprocessament, 2) mitjançant una seqüència de processament de la protoxina Cry1B (definida com a seqüència "C") processada per enzims d'insectes o 3) mitjançant creuament de línees d'arròs pci i mpi. En segon lloc, s'ha estudiat l'ús d'un gen regulador de la resposta de defensa a Arabidopsis, el gen AtNPR1 (Non Expressor of Pathogenesis Related genes 1), com a transgen per l'expressió simultània de gens de defensa endògens de la planta d'arròs El gen fusió mpi-pci s'expressa correctament sota el seu propi promotor i terminador. Quan s'utilitza la seqüència 2A, el producte obtingut (proteïna MPI-2A-PCI) es processa parcialment a la cèl·lula d'arròs, mentre que la MPI-C-PCI s'acumula com a poliproteïna no processada. L'expressió del gen mpi-pci emprant ambdues estratègies (2A and C) confereix resistència front infestació amb larves del lepidòpter plaga (Chilo suppressalis). Bioassaigs amb plantes transgèniques d'arròs mpi-pci infestades mostren una reducció significativa del pes larval en comparació amb larves control. Tot i que tradicionalment s'ha atribuït un paper insecticida als inhibidors de proteases vegetals, hem demostrat el potencial del PCI com a agent antifúngic. Així, plantes transgèniques que expressen constitutivament el gen pci mostren resistència vers patògens de gran importància econòmica com Magnaporthe oryzae i Fusarium verticillioides. S'ha purificat una carboxipeptidasa de M. oryzae mitjançant cromatografia d'afinitat i posteriorment s'ha caracteritzat per espectrometria de masses. Aquesta proteïna fúngica resulta ser una nova carboxipeptidasa B (MoCPB) que és totalment inhibida pel PCI. En conjunt, aquests resultats indiquen que el PCI exerceix la seva activitat antifúngica mitjançant la inhibició d'aquesta carboxipeptidasa fúngica. A la segona part de la tesi, s'ha demostrat que l'expressió constitutiva en arròs del gen AtNPR1 d'Arabidopsis confereix resistència front els patògens fúngics M. oryzae i F. verticillioides, i el patogen bacterià Erwinia chrysantemi. S'ha determinat que la resistència observada vers M. grisea, està associada a un augment en la capacitat de la planta per activar els mecanismes endògens de defensa en condicions d'infecció, concretament l'expressió dels gens de defensa PR-1b, TLP (PR-5), Sci1 (PR-6), PR-10 i PBZ. Les plantes transgèniques AtNPR1 crescudes en condicions d'hivernacle presenten un tamany menor i produeixen menys llavors que les plantes no transformades. Les plantes AtNPR1 desenvolupen lesions espontànies a les fulles al ser crescudes en condicions de baixa intensitat de llum. Aquestes lesions van acompanyades d'una sèrie d'efectes citològics com són l'acumulació de l'ió superòxid i de compostos fluorescents en la paret cel·lular, fenòmens que mimetitzen la resposta hipersensible de defensa. Contràriament a la resistència observada vers patògens fúngics i bacterians, les plantes d'arròs AtNPR1 presenten una major susceptibilitat al Rice Yellow Mottle Virus (RYMV). A més, l'expressió constitutiva del gen AtNPR1 regula negativament l'expressió de gens que participen en la resposta a estrès salí i sequera, com són els gens rab21, salT i dip1, resultant en una major sensibilitat a aquests dos tipus d'estrès abiòtics. Aquestes observacions suggereixen que el gen AtNPR1 en arròs presenta tant un paper positiu com negatiu en la resposta de defensa a estressos biòtics i abiòtics. / This work is part of integrated project focused on the improvement of resistance against pests and phytopathogens in rice. The general goal has been the simultaneous expression of genes encoding insecticides and antifungal proteins in transgenic rice plants. As a first approach, the effectiveness of the expression of a fusion gene that encodes two protease inhibitors, genes mpi (maize proteinase inhibitor) and pci (potato carboxypeptidase inhibitor) has been evaluated. The proteinase inhibitors are part of the natural defence system of plants against insect predation. For the simultaneous expression of these two genes has been used several strategies, including (1) the use of a viral sequence called "2A", a self-cleaving oligopeptide, (2) through a sequence of processing the protoxina Cry1B processed by insect enzymes (defined as a sequence 'C') or (3) by crossing pci and mpi lines of rice. Secondly, a regulator gene of the defence response in Arabidopsis (gene AtNPR1; Non Expressor of Pathogenesis Related gene 1) has been used as transgen for the simultaneous expression of endogenous defence genes in rice plant.The gene fusion mpi-pci is expressed correctly under the control of the mpi wound-inducible promoter and terminator regions. Using the processing sequence 2A, the protein product (MPI-2A-PCI) is partially processed in transformed rice cell, whereas MPI-C-PCI accumulates as a non-processed polyprotein. Expression of mpi-pci gene using both strategies (2A fragment and sequence C) confers resistance against the striped stem borer (Chilo suppressalis) larvae in transgenic rice plants. Bioassays performed with transgenic rice plants expressing the mpi-pci gene and infested with Chilo larvae showed a significant reduction of the larval weight compared with the control larvae group. Although the role of plant protease inhibitors has been described exclusively in the defense against insect attack, we reported about the potential role of the PCI inhibitor involved in resistance to fungal pathogens. Rice plants expressing constitutively the pci gene exhibit resistance against the economically important pathogens Magnaporthe oryzae and Fusarium verticillioides. By affinity chromatography a carboxypeptidase of M. oryzae was purified using the PCI protein, and subsequently characterized by mass spectrometry. This fungal protein came out to be a novel carboxypeptidase B (MoCPB) which was fully inhibited by PCI. Homology-based modelling revealed structural similarities between the predicted structure of the MoCPB and the crystal structure of insect carboxypeptidases. Overall, these results indicate that PCI exerts its antifungal activity through the inhibition of this particular fungal carboxypeptidase. In the second part of this work we demonstrated that constitutive expression of the Arabidopsis AtNPR1 gene in rice confers resistance against the fungal pathogens M. oryzae and F. verticillioides, and the bacterial pathogen Erwinia chrysantemi. The protection of AtNPR1 against M. oryzae is due to the priming expression of salicylic acid-responsive endogenous genes (PR1b, PR5, HR-6, PR10 and PBZ). Transgenic AtNPR1 rice plants grown in the greenhouse showed growth retardation, reduced height and smaller seeds than wild type plants. When transferred to plant growth chambers, AtNPR1 plants developed spontaneous lesions (lesion mimic phenotype) showing typical cellular markers of lesion formation, such as accumulation of superoxide ions and autofluorescent material in the cell walls. On the other hand, AtNPR1-expressing rice plants showed a higher susceptibility to infection by the Rice Yellow Mottle Virus (RYMV). Moreover, AtNPR1 negatively regulates the expression of genes playing a role in the plant response to salt and drought stress, namely the rab21, salT and dip1 genes, resulting in a higher sensitivity to both types of abiotic stress. These observations suggest that AtNPR1 has both positive and negative regulatory roles in mediating defence responses against biotic and abiotic stresses.

Els carcinomes són tumors d'origen epitelial que constitueixen aproximadament el 90% dels tumors humans. La progressió tumoral implica diferents etapes: creixement del tumor primari, invasió local, intravasació, extravasació i proliferació de les cèl·lules tumorals en un nou òrgan on formen un tumor secundari o metàstasi. Són, precisament, les metàstasis la principal causa de mort dels malalts de càncer.La invasió local dels carcinomes requereix la pèrdua de l'expressió o de la funció de la molècula d'adhesió cadherina E, la qual és un supressor d'invasió. A més, el procés d'invasió també va acompanyat de la pèrdua d'altres marcadors epitelials, de l'adquisició de marcadors mesenquimals i de l'augment de les propietats migratòries i invasives. Aquests canvis tenen un gran paral·lelisme amb la conversió fenotípica que té lloc durant el desenvolupament embrionari i que s'anomena transició epiteli-mesènquima (TEM). El principal mecanisme que regula el silenciament de la cadherina E és la repressió transcripcional, i recentment s'han caracteritzat diversos factors de transcripció que a través de la seva interacció amb les caixes E (de seqüència CANNTG) del promotor de la cadherina E reprimeixen la seva expressió: Snail, Slug, E47, Twist, ZEB-1 i ZEB-2. L'expressió estable de Snail o E47 en les cèl·lules epitelials Madin Darby Canine Kidney (MDCK) indueix un procés de TEM complet, però no es coneix el mecanisme. Moltes de les alteracions que es donen en la TEM poden ser explicades com a conseqüència de la repressió de la cadherina E, però altres events cel·lulars, independents de la dissociació cel·lular, contribuirien també a la iniciació i completació del procés. Per aquest motiu, en aquesta Tesi s'ha realitzat l'anàlisi de l'expressió gènica diferencial mitjançant RAP-PCR i microarrays de cDNA per identificar gens implicats en el procés de TEM induït per Snail o E47. Així, s'han trobat gens que codifiquen per proteïnes relacionades amb diverses funcions cel·lulars com cicle cel·lular, apoptosi, metabolisme o senyalització, però el grup majoritari és el de gens implicats en migració i invasió (adhesió cel·lular, citoesquelet, matriu extracel·lular -MEC- i proteases de MEC). Aquest estudi mostra a més que l'expressió estable de Snail o E47 en les cèl·lules MDCK indueix programes genètics en part comuns i en part específics, suggerint el paper diferencial d'aquests dos factors de transcripció en la progressió tumoral. Per altra banda, s'ha estudiat el mecanisme que regula la sobreexpressió de la metal·loproteasa MMP-9 i del factor de transcripció Id-1 que es dóna en la TEM induïda tant per Snail com per E47. L'activació transcripcional de MMP-9 és induïda per Snail i E47 de forma indirecta i mediada per altres factors de transcripció tals com Ets-1 i Sp1 que s'uneixen a la regió proximal del promotor formant un multicomplexe, i NFkB/p65 que interacciona amb una regió més distal. En canvi, l'activació transcripcional d'Id-1 és regulada principalment a través de la segona caixa E del promotor humà que interacciona amb E47. Pel que fa a Snail, no hem pogut confirmar si s'uneix directament a aquest element o indueix l'expressió d'un altre factor de transcripció capaç d'unir-s'hi. També és important la caixa GC adjacent a la caixa E que recluta Sp1. Tant l'activació de MMP-9 com d'Id-1 és regulada per la via Erk/MAPK (activada per Snail i E47) que fosforila almenys Sp1. Aquests resultats juntament amb l'expressió coneguda de Snail i E47 en línies cel·lulars de carcinoma podrien explicar la sobreexpressió de MMP-9 i Id-1 en molts tumors. / Carcinomas are tumors of epithelial origin that comprise approximately 90% of human tumors. Tumor progression is a multistep process: growth of primary tumor, local invasion, intravasation, extravasation and proliferation of malignant cells in a new organ where they form a secondary tumor or metastasis. Metastasis are the main cause of death of cancer patients.Local invasion of carcinomas requires loss of E-cadherin expression or function, which is an adhesion molecule and a well established invasion supressor. In addition, invasion process is accompanied by loss of other epithelial molecules, acquisition of mesenquimal markers and gain of migratory and invasive properties. These changes have many parallels with the phenotypic conversion that takes place during embryonic development known as epithelial-mesenquimal transition (EMT). The main mechanism that regulates E-cahderin silence is transcripcional repression, and recently several transcription factors have been characterized as E-cadherin repressors through their interaction with the E-boxes (of sequence CANNTG) of the promoter: Snail, Slug, E47, Twist, ZEB-1 and ZEB-2.Stable expression of Snail or E47 in Madin Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells induce a complete EMT, but the mechanism that govern it is not known yet. Some of the alterations that occur during EMT can be explained as a consequence of E-cadherin repression, but other cellular events, independent from cellular dissociation, may contribute to the initiation and completion of the process. For this reason, in this Thesis we made a differential expression analysis by RAP-PCR and cDNA microarrays to identify genes implicated in Snail and E47 induced EMT. Thus we found genes related to different cellular functions such as cellular cycle, apoptosis, metabolism and signaling, but the great group was composed by genes implicated in migration and invasion (cellular adhesion, cytoskeleton, extracellular matrix -EMC- and EMC proteases). This study shows that Snail or E47 expression in MDCK cells induce common and specific genetic programs, suggesting a differential role for these transcription factors in tumor progression.On the other hand, we studied the mechanism that regulates metalloprotease MMP-9 and transcription factor Id-1 upregulation in Snail and E47 induced EMT. Snail and E47 induced activation of MMP-9 is indirect and mediated by other transcription factors such as Ets-1 and Sp1 that bind to the proximal region of promoter forming a multicomplex, and NFkB/p65 that interacts with a more distal region. On the contrary, Id-1 transcriptional activation is regulated mainly through the second E-box of human promoter that recruits E47. At the moment, we have not been able to confirm whether Snail binds directly to this element or it induces the expression of another factor that interacts with the E-box. It is also important the GC-box adjacent to this E-box that binds Sp1. Either MMP-9 or Id-1 activation are regulated by Erk/MAPK pathway(activated by Snail and E47) that phosphorilates at least Sp1. These results together with known expression of Snail and E47 in carcinoma cell lines may explain MMP-9 and Id-1 upregulation in tumors.