Le détournement de la machinerie cellulaire basé sur la dégradation par la voie du protéasome est une stratégie fréquemment retrouvée chez les virus afin d’optimiser leur réplication. Ainsi, le VIH-1 a développé toute une série de contremesures via ses protéines accessoires, vif et vpu notamment, afin de cibler les facteurs de restriction vers la voie du protéasome. La protéine accessoire Vpr est également associée à un complexe Cul4 E3 ubiquitin ligase mais est toujoursorphelin de sa cible. Nos travaux ont montré que la protéine CTIP2 est un acteur majeur impliqué dans la restriction de la réplication du VIH-1. Nous proposons de défendre la thèse selon laquelle la protéine CTIP2 est dégradée par la voie du protéasome en présence de la protéine vpr. Nous avons ainsi montré que l’expression de la protéine CTIP2 est plus forte en absence qu’en présence de la protéine vpr. Des expériences utilisant des inhibiteurs de la voie du protéasome sont en faveur d’une régulation de type post traductionnel. Par immunoprécipitation, nous avons montré que CTIP2 fait partie d’un complexe comprenant DDB1 et DCAF1 en présence et en absence de Vpr. Sa dégradation est prévenue en présence du mutant vpr (Q65R) qui n’interagit plus avec DCAF, et en présence d’un Knock Down de DCAF1par ailleurs, DCAF1 est associé avec CTIP2 inclus dans le complexe impliqué dans l’établissement de la latence du VIH-1 comprenant notamment HDAC1. Enfin, les protéines CTIP2, Vpr et DCAF colocalisent dans les noyaux des cellules microgliales. Nos résultats suggèrent fortement que la protéine Vpr favorise la dégradation du facteur CTIP2, qui est décrit comme un facteur restreignant l’infection par le VIH-1 dans les cellules microgliales, et ainsi favorise sa réplication. / Usurping the host ubiquitination proteasome system (UPS) to inactivate the undesirable host protein is a common viral strategy. HIV-1 proteins inactivate the detrimental host proteins by this system. In Microglial cells, CTIP2 represses both initial phase and late phase of HIV-1 gene transcription. As HIV-1 can still replicate in the presence of CTIP2, we postulated that it might inactivate CTIP2 by using Cul4 E3 ubiquitin ligase complex to resume its replication. We observed higher CTIP2 expressions in the absence of Vpr, with no effect on CTIP2 mRNA and proteasome inhibitor can block this degradation. Co-immunoprecipitation assays showed that CTIP2 is associated with DCAF1 and DDB1 in the absence and presence of Vpr. We showed that this degradation is prevented by the using Vpr mutant (Q65R) and by knock down of DCAF1. Finally, we observed the co-localization of CTIP2 with Cul4A-DCAF1-DDB1 complex even in the absence of Vpr, in microglial cells. Additionally, DCAF1 interacts with CTIP2-associated heterochromatin enzymes complex. Our results suggest that Vpr expression increases the turnover of CTIP2 in HIV-1 productively infected cells. By degrading CTIP2, HIV-1 counteracts CTIP2-mediated silencing of its expression and favors its replication.

Vif (Viral Infectivity Factor) est une protéine auxiliaire qui augmente le «fitness» viral dans l’hôte infecté. Vif est essentielle à la formation de particules virales infectieuses dans les cellules dites «non-permissives», alors que des virus ΔVif se répliquent efficacement dans des lignées cellulaires T dites « permissives ». Les cellules non-permissives expriment les facteurs de restriction APOBEC3G (APOlipoprotein B mRNA-Editing enzyme Catalytic polypeptide 3G ou A3G) et A3F, deux cytidine désaminases dont l’action hypermutatrice est létale pour le virus. Vif réduit de façon considérable le taux d’expression des protéines A3G/3F par deux mécanismes principaux : (1) en recrutant une E3 ubiquitine ligase, Vif induit la dégradation d’A3G par le protéasome et (2) en se fixant sur l’ARNm, Vif régulant négativement la traduction d’A3G par un mécanisme dépendent de la région 5'-UTR. L'objectif de mon projet a été de déterminer le rôle et le mécanisme de la régulation traductionnelle du facteur de restriction A3G par la protéine Vif du VIH-1 ex vivo. En parallèle, nous nous sommes intéressés à déterminer les domaines de la protéine Vif impliqués dans l’activité chaperonne d'ARN. Par l’analyse des « westerns blots » issus de co-transfections de différents vecteurs d’expression d’A3G en présence ou absence de Vif et d’un dominant négative de la Cullin 5, nous avons démontré ex vivo que Vif requiert les tiges boucles 2 et 3 de la région 5’UTR (de façon simultanée) pour inhiber la traduction d’A3G. La régulation traductionnelle d’A3G par Vif cause 50% de la réduction total d’A3G en présence de Vif. Ensuite, nous avons observé qu’une une petite uORF (Upstream Open Reading Frame), contenue entre ces deux tiges-boucles est nécessaire pour l’inhibition d’A3G par Vif. Les uORFs, présents dans 50 % des gènes eucaryotes, interviennent principalement dans des mécanismes de régulation traductionnelle. Ainsi, nous avons observé in vitro et ex vivo que l’uORF régule négativement la traduction de l’ORF majeure d’A3G. Par l’analyse de l’expression de différents mutants de l’uORF, nous avons démontré ex vivo que 60% des complexes d’initiation de la traduction synthétisent A3G par « leaky scanning » et 40 % sont recrutés dans la traduction de l’uORF, en inhibant ainsi l’expression d’A3G. A partir de ces résultats nous proposons un modèle de l’inhibition d’A3G par Vif. Dans ce modèle, Vif pourrais inhiber l’étape de terminaison de la traduction de l’uORF en causant un « stalling » des ribosomes en empêchant ainsi à des nouveaux complexes d’initiation d’attendre l’ORF majeur. Nous avons aussi déterminé l’impact de la régulation traductionnelle d’A3G par Vif sur l’incorporation d’A3G dans les particules virales et sur l’infectivité virale. Nous avons alors observé que l’inhibition traductionnel d’A3G par Vif réduit l’incorporation d’A3G dans les particules virales avec un profil de diminution d’A3G similaire à celui observé dans les cellules. En utilisant des cellules indicatrices TZM-bl, nous avons ensuite observé que l’inhibition traductionnelle d’A3G par Vif augmente l’infectivité virale de 50%. Finalement, nous avons déterminé les domaines de la protéine Vif impliqués dans l’activité chaperonnes d'ARN. En utilisant des essaies de dimérisation des fragments d’ARN du VIH-1, nous avons pu mettre en évidence que le domaine C-terminal de la protéine Vif était impliqué dans cette activité. Ces résultats nous ont permis de mieux comprendre ce phénomène de restriction cellulaire et pourraient être importants dans le développement de nouvelles stratégies d’inhibition de la réplication virale qui ciblerait spécifiquement l’interaction de Vif avec l’ARNm d’A3G. / The HIV-1 viral infectivity factor (Vif) is a small basic protein essential for viral fitness and pathogenicity. Vif allows productive infection of non-permissive cells (including most natural HIV-1 targets) by counteracting cellular cytosine deaminases APOBEC3G (A3G) and A3F by different mechanisms and thus preventing its incorporation into viral particles. The Vif-induced degradation of A3G through the proteasome pathway has been extensively studied, but little is known about the translational repression of A3G mRNA by Vif. After cellular co-transfection of A3G mRNA constructs mutated in their untranslated regions (UTRs) in presence or absence of Vif, and in conditions where the proteasome-induced degradation of A3G was inhibited, we show that the 5’-UTR of A3G mRNA is crucial for the translational inhibition by Vif. The core binding factor, CBF-, required to stabilize the Vif/A3G complex is dispensable for this specific repression. According to our previous secondary structural model of the 5’-UTR, the two distal stem-loop structures are sufficient for a complete translational inhibition of A3G. We show that residue K26 of Vif is critical for A3G neutralization, both for its proteasome-induced degradation and translation inhibition of itsmRNA. Interestingly, we observe a strict correlation between the cellular reduction of A3G through translation inhibition and the quantity of A3G incorporated into viral particles. Both mechanisms account for about 50% decrease of A3G in cell. Thus, we showed for the first time that A3G mRNA translational inhibition by Vif is a 5’-UTR mRNA-dependent mechanism, and that any of these two mechanisms, degradation or translation, is sufficient to restore viral infectivity. Regulating the translation of A3G could thus be considered as a new target to restore a functional expression of A3G and viral restriction.

Une des caractéristiques du Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) est sa diversification génétique extensive, qui lui permet d’échapper au système immunitaire. Néanmoins, il est nécessaire que le taux de mutation requis pour à cette évolution rapide ne compromette pas la fonctionnalité de ses protéines. Les travaux présentés ici ont eu pour objectif l’étude des réseaux de coévolution qui composent les glycoprotéines d’enveloppe (Env) afin de comprendre les règles qui sous-tendent leur évolution. Il a été mis en évidence que les régions variables de ces protéines, grâce à leur flexibilité structurelle, peuvent aussi servir à faciliter l’incorporation de mutations touchant les régions plus constantes. De plus, un réseau de coévolution impliqué dans les changements de conformations nécessaires à l’activité de Env a été identifié, soutenant le fait que ces régions variables ont un rôle central dans ces changements. Ces études démontrent le rôle crucial joué par les régions variables en dévoilant un nouvel aspect de leur contribution à l’évolution du VIH-1. / The Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) is characterized by an extensive genetic diversification of its strains that allows the virus to escape the immune system. However, the mutation rate needed for this rapid evolution must not compromise the functionality of the viral proteins. The aim of the work presented here has been to study the coevolution networks that constitute the envelope glycoproteins (Env) in order to understand the rules driving their evolution. The results have highlighted that variable regions, thanks to their structural freedom, can facilitate the incorporation of mutations in more constant regions. Moreover, a coevolution network involved in the conformational changes required for the activity of Env has been identified, underlining the central role played by variable regions in these processes. Besides underscoring the crucial role played by variable regions in the functionality of Env, these studies unveil a new aspect of their contribution to HIV-1 evolution.

Le VIH, grâce à sa variabilité génétique, présente une grande capacité à échapper au système immunitaire et s’adapter à l’environnement. La recombinaison, source importante de cette variabilité, est illustrée par le grand nombre de formes recombinantes observées dans l’épidémie. Le laboratoire s’est intéressé à l’étude de ce mécanisme et des lois qui gouvernent l’apparition de ces formes et ce en se focalisant sur la recombinaison inter sous-types d’isolats primaires le long du gène de l’enveloppe. En plus de mettre en évidence les paramètres impliqués dans la génération et la sélection de ces formes dans la nature, le laboratoire a pu déterminer qu’une majorité des recombinants dans la région C2 du gène de l’enveloppe présente des défauts majeurs de fonctionnalité. Ces défauts étaient sans doute dus à une incompatibilité entre les deux portions de sous-types différents réassociées par la recombinaison. Afin d’identifier les régions impliquées dans cette perte de fonctionnalité, des chimères entre différents sous-types ont été construites et testées en entrée virale. Ces chimères présentent la région C2, V1V2 et V3 de sous-types différents du reste de la protéine. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence que les régions V1V2 et C2 sont importantes pour le maintien de la fonctionnalité des protéines et que V1V2 est essentielle au maintien de l’interaction entre les sous-unités de l’enveloppe, la gp120 et la gp41. Cette étude a donc permis de déterminer que V1V2 et C2 font partie d’un réseau de coévolution important impliquant des interactions indispensables au maintien de la fonctionnalité de la protéine. / HIV presents a high genetic variability that is necessary for the virus to escape to the host immune response and to adapt to the environment. Recombination is an important source of this variability and contributes to the generation of recombinant forms in the epidemic. Using inter subtypes from primary isolates, the laboratory focused on the study of recombination along the envelope gene and the determination of the parameters involved in the generation and selection of these recombinant forms. Previous works in the laboratory showed that a majority of recombinants in C2 region of the envelope gene displayed an important loss of function. This loss was probably due to an incompatibility of the parts associated by recombination and that come from different origins. To identify the regions involved in the loss of functionality of these recombinants, chimeras where C2 and surrounding regions (V1V2 and V3) from a different subtype than the rest of the gene, were created and tested for their ability to mediate viral entry. The functionality tests showed that V1V2 and C2 are important to maintain the functionality of the protein. Indeed, V1V2 seem to be involved in the stability of the Env trimer by maintaining the interaction between the two subunits of the protein, gp120/gp41. This work shows that V1V2 and C2 regions are involved in a coevolution network and their interactions with other portions are essential to maintain the functionality of the protein.

The HIV-1 reservoir is the major barrier to eradication and cure of HIV-1 infection. The aim of this thesis was to characterise the HIV-1 reservoir in PHI and to investigate two potential reservoir clearance strategies. Sensitive Q-PCR assays that quantify HIV-1 DNA reservoir level were developed and applied to characterise the HIV-1 reservoir in acutely infected patients enrolled in the SPARTAC trial. HIV-1 DNA levels were found to be a useful biomarker for predicting clinical progression and the time of viral remission in patients, after HAART interruption. Since low HIV-1 DNA reservoir levels were clinically beneficial, potential therapies aimed at decreasing the reservoir burden were investigated. Thermotherapy was employed as a possible method for increasing CTL killing ability of HIV-1-infected cells. This may increase the likelihood of virological control and functional cure. SPION uptake impacted negatively on the natural killing ability of CTL that expressed the high affinity 868-TCR. However, localised thermotherapeutic heat generation was insufficient to cause direct thermal ablation of bound target cells or to enhance the natural killing ability of CTL. 868-TCR transduced CTL were employed directly as a means to target the latent viral reservoir by the ‘kick and kill’ hypothesis. Latent HIV-1 was reactivated in a variety of latent cell line models, but inconclusively in a primary model. 868-TCR transduced CTL killing of latently infected cells was observed. However, reactivation of latent virus did not necessarily relate to increased antigenicity of latent cells, perhaps in part due to anti-latency drug-induced alterations in MHC class I expression. Despite recent and sustained interest in HIV-1 cure strategies, the prospect still remains elusive. Only through the development of sensitive assays that measure the HIV-1 reservoir and their application to novel and innovative cure strategies will HIV-1 ever be functionally cured or eradicated in patients on a large scale.

This study is a contribution to Chinese-Western dialogue of bioethics but perhaps the first one of its kind. From a Chinese-Western comparative ethical perspective, this work brings Chinese ethical theories, especially Confucian ethics, into a contemporary context of the epidemic of HIV/AIDS, and to see how the deeply-rooted thoughts of Confucius interact, compete, or integrate with concepts from Western ethical traditions. An underlying belief is that some ideas in Confucian ethics are important and insightful beyond their cultural and historical origins in China and other Confucianism influenced societies.Methodologically, this thesis employs two approaches, conceptual normative analysis combined with critical interpretation. The ‘interpretive’ approach I employ, as an important methodology supplementing my normative analysis, not only deals with Chinese ancient texts, but also explains specific beliefs and practices in China.With a critical eye, this thesis carefully examines a number of key topics in the ethics of AIDS in China from a cross-cultural perspective. Topics including: views on personhood and the vulnerability of People Living with HIV/AIDS; prioritising and balancing the role of ‘harm reduction’ and the role of ‘eradication of deviant behaviour’ in AIDS policy in China; rights-based opt-out approach and duty-based family-centred approach in HIV testing and Biobanking; blood donation; moral responsibility and personal responsibility for health; and the popular rhetoric of ‘innocent infection’ versus ‘guilty infection’ in AIDS. My overall aim in this work is to present a cross-cultural bioethics study through the investigation of some ethical issues in AIDS in China from a Chinese-Western comparative perspective and also attempt to suggest a humane and effective policy for HIV/AIDS which I believe is appropriate to both traditions. I believe this work has contributed to our knowledge in three related but independent areas: the control of the epidemic of HIV/AIDS in China; medical ethics in China; and to both the methods and the utility of cross-cultural study of bioethics between China and the West.

Young women are particularly vulnerable to HIV. Despite the successful HIV prevention efforts in Thailand in the past, young Thai women are at increased HIV risk and in urgent need of effective HIV interventions. Numerous studies have emphasised the importance of family in determining young people’s sexual behaviour. This thesis explores the roles of family in shaping young people’s sexual decisions and examines the potential of family-involved HIV interventions (FIHIs) for young Thai women. The thesis systematically examines studies across settings to determine whether involving family in HIV interventions could influence young people’s sexual behaviour. The findings suggest that FIHIs have a potential in shaping young people’s condom use practices. It identifies several key characteristics of effective FIHIs that can potentially be valuable for future HIV development in other contexts. Qualitative data collected from focus groups of young Thai women in Bangkok are analysed using the framework developed from the systematic review of qualitative studies. The findings highlight several challenges for future FIHIs for young Thai women. These are barriers to parent-child communication, a tension of coexistence of two divergent sexual norms - traditional/Thai versus modern/globalised, alternative sources of sexual health and HIV knowledge, the importance of family relationships, and the different circumstances and needs of young Thai women from different backgrounds. Future FIHIs for young Thai women should consider a comprehensive, structural and eco-developmental approach, simultaneously targeting both individuals and the wider environment. This thesis offers a new contribution to the HIV prevention and sexual health education literature and identifies the potential effectiveness of FIHIs tailored to young Thai women,constituting an important step in addressing the public health problems of HIV/AIDS infections in Thailand.

Les cellules dendritiques (CD) jouent un rôle majeur dans l'initiation, la régulation et le maintien des réponses immunes contre les pathogènes. Le ciblage d'antigènes (Ag) liés à des anticorps monoclonaux (AcM) dirigés contre des récepteurs spécifiques de CD est une approche vaccinale prometteuse induisant une réponse immunitaire chez l'animal. Cependant, certaines protéines de fusion AcM-Ag ne peuvent pas être produites. J'ai donc développé des AcM fusionnés à un domaine dockérine et des Ag fusionnés à un domaine cohésine, permettant ainsi l'assemblage non-covalent de complexes AcM-Ag. Ainsi, des complexes non-covalents anti-CD40-Ag ou anti-Langerine-Ag du virus influenza ont induit l'expansion in vitro de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques, et la production d'anticorps chez la souris. De même, le ciblage de ces Ag via DCIR, récepteur exprimé sur différentes populations de CD humaines, ont induit l'expansion de lymphocytes T CD8+ mémoires in vitro. Enfin, j'ai montré que l'addition de peptides glycosylés flexibles facilite la production d'AcM anti-CD40 fusionnés à 5 peptides du VIH. Ces peptides conservés et immunogènes sont dérivés des protéines Gag, Nef et Pol. Ce prototype vaccinal, testé in vitro, sur des cellules de patients séropositifs, induit l'expansion d'un vaste répertoire de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques et multifonctionnels. Ces cellules T CD8+ cytotoxiques sont capables de supprimer la réplication du VIH in vitro. En conclusion, ce travail a permis de développer plusieurs prototypes de vaccins ciblant les CD et a démontré leur potentiel à induire des réponses immunes efficaces, justifiant leur application à visée préventive et thérapeutique. / Dendritic cells (DCs), as the most potent antigen-presenting cells, have a pivotal role in the initiation, regulation and maintenance of immune responses against cancers and pathogens. Targeting antigens (Ag) directly to DCs via anti-DC receptor monoclonal antibody-antigen (mAb-Ag) fusion proteins is a promising approach to vaccine development and has been shown to induce potent immunity in animal models. Thus, I developed mAbs fused to a dockerin domain and antigens fused to a cohesin domain, enabling non-covalent assembly of mAb-Ag complexes particularly when direct mAb-Ag fusions could not be produced. Delivery of influenza Ags to CD40 and Langerin via these non-covalent complexes, respectively expanded Ag-specific CD4+ and CD8+ T cells in vitro and elicited Ag-specific antibody responses in mice. Similarly, targeting influenza Ags in vitro with such complexes to DCIR on various human DC subsets expanded Ag-specific memory CD8+ T cells. Finally, I found that flexible glycosylated peptide linkers enabled production of an anti-CD40 mAb fused to a string of 5 conserved T cell epitope- rich regions of HIV Gag, Nef and Pol. In vitro, this prototype vaccine expanded a broad repertoire of Ag- specific and multifunctional CD4+ and CD8+ T cells from HIV-infected patients. These cytotoxic expanded CD8+ T cells were effective in suppressing in vitro HIV replication. In conclusion, our work facilitated the development of prototype DC-targeting vaccines and demonstrated their potential to induce effective immune responses, supporting their use for preventive and therapeutic applications.

Le but de notre travail était d'étudier des nouveaux aspects de la physiopathologie et de la thérapeutique du choc anaphylactique chez le rat Brown Norway. La première partie de notre thèse étudie la physiopathologie systémique et régionale du choc anaphylactique. Le choc anaphylactique s'accompagne d'une diminution rapide du débit cardiaque, d'une altération brutale de l'autorégulation du débit sanguin cérébral et d'une atteinte respiratoire associant un oedème des voies respiratoires et un bronchospasme. La deuxième partie de notre travail s'intéresse à la prise en charge thérapeutique du choc anaphylactique. L'adrénaline s'avère supérieure à la vasopressine, pour inhiber le bronchospasme et diminuer la perméabilité microvasculaire, permettant une meilleure préservation de l'oxygénation cérébrale, en particulier dans la région de l'hippocampe, mais aussi une correction du bronchospsme et une diminution de l'hyperperméabilté bronchique à la phase précoce du choc anaphylactique. Nous avons également comparé les effets de trois types de solutés de remplissage administrés en association avec l'adrénaline au cours du choc anaphylactique, démontrant la supériorité de l'administration de soluté macromoléculaires tels que l'HES et l'échec des solutés salés hypertoniques. Enfin nous avons pu mettre en évidence l'intérêt de l'administration de bleu de méthylène (3mg/kg) en démontrant l'existence d'un effet synergique avec l'adrénaline au cours du choc anaphylactique / The aim of our work was to study new aspects of the pathophysiology and treatment of anaphylactic shock in the Brown Norway rat. The first part of this thesis focuses on the systemic and regional pathophysiology of anaphylactic shock which is accompanied by a rapid decrease in cardiac output, a sudden alteration of autoregulation of cerebral blood flow and a respiratory dysfunction involving swelling of the airways and bronchospasm. The second part of our work focuses on the therapeutic management of anaphylactic shock. Epinephrine was found to be superior to vasopressin, to inhibit bronchospasm and decrease microvascular permeability, allowing a better preservation of the cerebral oxygenation, in particular in the region of the hippocampus. Furthermore, it provided also an alleviation of bronchospasm and of bronchial hyperperméabilté in the early phase of anaphylactic shock. We also compared the effects of three types of fluid therapy administered in combination with adrenaline during anaphylactic shock, demonstrating the superiority of the administration of a macromolecular solution such as HES compared to hypertonic saline fluids. Finally we were able to highlight the usefulness of the administration of methylene blue (3mg/kg) demonstrating the existence of a synergistic effect with adrenaline during anaphylactic shock

Le système du complément est une cascade de défense immunitaire complexe et étroitement régulée, conduisant à des dommages tissulaires lorsqu’il est suractivé. L’hème, un motif moléculaire de danger dérivant de l’hémolyse, est capable d’activer le complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales (CE) in vitro, suggérant un rationel pour examiner l’impact de l’activation du complément dans les maladies hémolytiques. L’objectif de ce projet était d’étudier si et comment l’hémolyse intravasculaire active le complément in vivo, et de comprendre les mécanismes sous-jacent conduisant à l’acquisition d’un phénotype activateur du complément par les CE afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons détecté des dépôts de complément, de C3 et de C5b-9, dans des reins de patients souffrants de nephropathie drépanocytaire ainsi que dans un modèle murin de drépanocytose. Nous avons mis en place un modèle murin d’hémolyse intravasculaire massive, déclenchée par la phénylhydrazine (PHZ), et caractérisé l’atteinte rénale. Nous avons détecté des dépôts de C3 au niveau des reins de ces souris. Cet effet a été inhibé par l’administration préventive du scavenger naturel de l’hème, l’hémopexine (Hx), et reproduit par des injections d’hème libre, démontrant une activation hème-dépendante in vivo. Les microvésicules d’érythrocytes (MVs) drépanocytaires représentent une source naturelle d’hème, de par leur concentration en hème trois fois supérieure à celle observée chez les donneurs sains. Nous avons démontré que les MVs drépanocytaires activent le complément dans le sérum et sur les CE, de manière en partie hème-dépendante. Ces résultats révèlent le rôle activateur de l’hème sur le complément dans les maladies hémolytiques. De plus, nous avons démontré que l’interaction de l’hème avec TLR4 peut en partie expliquer les dépôts de C3 sur l’endothélium in vivo et les CE in vitro. L’utilisation d’un inhibiteur de TLR4, le TAK-242, a réduit de 50% les dépôts de complément sur les CE, confirmé par une réduction des dépôts sur l’endothélium vasculaire chez des souris TLR4-/- traitées par PHZ ou hème. De plus, nous avons montré que ces dépôts hème/TLR4 dépendants sont liés à l’expression rapide de P-sélectine, qui recrute C3b et C3(H2O) à la membrane des CE, révélé par l’analyse des interactions protéiques en temps réel et l’utilisation d’un anticorps bloquant anti-P-sélectine. Ensemble, ce projet démontre que l’hème et les MVs sont les produits dérivés de l’hémolyse responsables de l’activation du complément. Au niveau cellulaire, l’induction par l’hème d’un phénotype activateur du complément des CE dépend de l’axe TLR4/P-sélectine, induisant des dépôts de C3 à la surface cellulaire. Ainsi, ces études soulignent les bénéfices potentiels de l’Hx et du TAK-242 contre l’activation du complément dans des pathologies associées à une hémolyse. / Complement system is a complex and tightly regulated innate immune defensive cascade, which can promote tissue damage, when overactivated. Hemolysis-derived danger associated molecular pattern heme is able to activate complement in serum and on endothelial cells (EC) in vitro, providing a rational for scrutinizing the impact of complement activation in hemolytic diseases. The objectives of this work were to study whether and how intravascular hemolysis induces complement activation in vivo, and to understand the underlying mechanism that leads to the acquisition of a complement activating phenotype of the endothelium in order to identify novel therapeutic strategies. We found complement deposits, including C3 activation fragments and C5b-9, within kidneys of patients with sickle cell disease (SCD) nephropathy (a prototypical hemolytic disease) as well as in a mouse model of SCD. We set up and characterized the renal injury of a mouse model of massive intravascular hemolysis, triggered by injection of phenylhydrazine (PHZ). We revealed C3 deposition within kidneys of the PHZ-treated animals. It was prevented by heme scavenging with hemopexin (Hx) and reproduced by injections of free heme, thus demonstrating the importance of heme for the complement activation in vivo. SCD erythrocytes microvesicles (MVs), are a pathologically relevant source of labile heme, since they carry three times more heme on their surface compare to MVs from healthy donors. We demonstrated that MVs, generated from SCD erythrocytes, activate complement in human serum and on EC surface, in part on a heme-dependent manner. These data highlight the importance of heme as a complement activator in hemolytic diseases. Further, we found that the C3 activation fragments deposits on endothelium in vivo and on EC in vitro can be in part explained by interaction of heme with TLR4. Indeed, the use of a specific inhibitor of TLR4, TAK-242, reduced about 50% the complement deposits on EC surface and such deposits on vascular endothelium in PHZ- or heme-injected mice were attenuated TLR4-/- mice. Moreover, we found that heme/TLR4-dependent complement deposition was mediated by the rapid expression of P-selectin, which in turn, recruited C3b and C3(H2O) on the EC surface, as evidenced by real time protein interaction analyses and using of blocking antibodies. Together our results demonstrated that heme and erythrocytes MVs are the hemolysis-derived products which promoted complement activation. At cellular level, heme induced complement-activating phenotype of EC by triggering TLR4/P-selectin axis and resulting in C3 activation fragments on cell surface. Together, these studies underline the potential benefits of Hx and TAK-242 against complement activation in pathologies related to hemolysis.