Le virus de l’hépatite B (VHB) utilise la machinerie transcriptionnelle nucléaire pour sa réplication. Le génome viral est transporté de la périphérie cellulaire à l’enveloppe nucléaire. Généralement, ce transport intracytoplasmique rétrograde est facilité par le réseau de Mt via l’utilisation du complexe moteur de la dynéine. Nous avons montré que le transport des capsides du VHB dépend des Mt, ce qui permet l’adressage des capsides aux complexes du pore nucléaire (NPC) ; lequel est requis pour l’étape de libération du génome de la capside dans le noyau.Dans cette étude, nous avons utilisé des capsides provenant de virus récupérés dans du surnageant de HepG2.2.15, qui contiennent le génome mature partiellement double brin (capsides matures), et des capsides exprimées chez E.coli. Ces dernières sont utilisées telles quelles, capsides E.coli contenant de l’ARN, ou bien sont utilisées pour préparer des capsides vides. Après microinjection dans des ovocytes de Xenopus laevis, nous avons observé que les capsides vides et les capsides matures sont transloquées aux NPC avec une cinétique similaire. Les capsides contenant de l’ARN ne sont pas identifiées aux NPCs ce qui implique que le transport des deux autres types de capsides est actif. Cela a été confirmé par la pré-injection d’anticorps anti tubuline qui neutralisent le transport assuré par les Mt.L’attachement spécifique des capsides matures et vides aux Mt a été confirmé en utilisant des Mt polymérisés in vitro, nous avons montré que cette interaction nécessitait des protéines cytosoliques. En utilisant des expériences de coïmmunoprécipitation et de cosédimentation nous avons identifié une chaîne légère de la dynéine (DynLL1 membre de la famille Lc8) comme partenaire des capsides. Dans les expériences de microinjection, la comicroinjection d’un excès de DynLL1 avec les capsides inhibe leur transport vers les NPCs, indiquant que DynLL1 est impliquée dans le transport actif des capsides.DynLL2 qui n’interagit pas avec les capsides diffère de DynLL1 de seulement six acides aminés. Par mutagénèse dirigée de DynLL1, nous avons montré l’implication de deux acides aminés dans l’interaction directe avec les capsides. Ces deux acides aminés sont présents à la surface du dimère de DynLL1 et absents dans le sillon résultant de la dimérisation de DynLL1, sillon impliqué dans l’interaction avec la DynIC. Nous avons partiellement reconstitué le complexe DynIC, DynLL1 et capsides vides qui doit en partie refléter la situation in vivo. / Hepatitis B virus (HBV) needs the nuclear transcription machinery for replication. The virus thus depends on the transport of its genome from the cell periphery to the nuclear envelope. In general this retrograde intracytoplasmic trafficking is facilitated along Mt (MT) using motor protein complexes of the dynein family. As we showed earlier HBV capsid transport also depends upon intact MT in order to allow their arrival at the nuclear pores, which in turn is required for genome liberation from the capsid.In the analysis we used virus-derived HBV capsids obtained from the supernatant of HepG2.2.15, which contain the mature partially double-stranded DNA genome (mature capsids) and capsids expressed in E. coli. The latter were applied in two forms: as unspecific E. coli RNA- containing capsids and as empty capsids. Upon microinjection into Xenopus laevis oocytes we observed that mature and empty capsids were translocated to the nuclear pores with a similar kinetic. RNA-containing capsids failed to arrive at the pores implying that transport of the two other capsid types was active. Active translocation was confirmed by pre-injecting anti tubulin antibodies which interfere with MT-mediated translocation.In vitro reconstitution assays confirmed the specific attachment of mature and empty capsids to MTs and showed the need of further cytosolic proteins. Using pull-down and co-sedimentation experiments we identified one dynein light chain (DYNLL1, member of the Lc8 family) as interaction partner of the capsids. Injecting an excess of recombinant DYNLL1 with empty capsids into Xenopus laevis oocytes inhibited capsid transport to the nuclear pores indicating that DYNLL1 was only functional interaction partner implied in active transport.DNYLL2 did not interact with the capsids although differing from DYNLL1 by just six amino acids. Site directed mutagenesis of DYNLL1 revealed that two amino acids were critical for a direct interaction with the capsids. Both localized at the exterior of the DYNLL1 dimer and not in the groove of DYNLL1, which interacts with the dynein intermediate chain. Accordingly we could reconstitute a complex consisting of empty capsids, DYNLL1 and dynein intermediate chain as it should be in the in vivo situation.

Ce travail porte sur la mise au point des nanocochléates intégrant à la fois l’amphotéricine B (AmB) et la miltéfosine (hexadécylphosphocholine, HePC) dotés de propriétés adéquates pour une administration par voie orale pour le traitement de la leishmaniose viscérale. Notre premier axe de recherche a été l’étude des interactions de l’AmB et de l’HePC avec les monocouches de lipides de DOPS (dioleoyl phosphatidylsérine) et de Cho (cholestérol) dans le développement de nanocochléates chargés avec ces deux principes actifs. Les résultats expérimentaux nous ont permis de déterminer le rapport drogue/lipides optimal pour la formulation des nanocochléates : 9DOPS/1Cho/0,5AmB/0,5HePC et de confirmer que dans la formulation de nanocochléates, l’AmB et l’HePC sont incorporés de façon stable et se situent au sein des bicouches lipidiques entre des lipides, plutôt que dans la phase aqueuse entre les bicouches.Notre second axe de recherche a porté sur la formulation et la caractérisation des nanocochléates chargés en AmB et en HePC. Ces nanocochléates ont été formulés à partir des liposomes unilamellaires encapsulant ces deux principes actifs. Les paramètres expérimentaux majeurs (taille de liposomes, proportion DOPS/1Cho) ont été optimisés. Les propriétés physico-chimiques des nanocochléates, telles que la taille, la charge de surface, la morphologie, le rendement d'encapsulation, l’organisation des principes actifs et la stabilité pendant le stockage au cours de temps ont été étudiées. En vue d'une formulation orale, la libération des principes actifs in vitro ainsi que la stabilité des nanocochléates in vitro dans les milieux gastro-intestinaux ont également été étudiés d’après la Pharmacopée des Etats-Unis. Enfin, une étude in vivo préliminaire chez le rat portant sur la pharmacocinétique plasmatique d'AmB après administration orale de nanocochléates chargés en AmB avec ou sans HePC en comparaison avec l’Ambisome® et la Fungizone® a été entamée. Les résultats préliminaires ont démontré une absorption significative par voie orale de l’AmB.Ce travail a permis de développer des nanocochléates avec des propriétés appropriées pour une formulation contenant à la fois l’AmB et l’HePC administrable par voie orale. Néanmoins, des optimisations restent à réaliser avant d’envisager une application clinique. / The aim of this work was to formulate nanocochleates containing both Amphotericin B (AmB) and miltefosine (hexadecylphosphocholine, HePC) with properties suitable for administration by the oral route for the treatment of visceral leishmaniasis. The first part of this work was a fundamental study of the interactions between AmB and HePC and monolayers of dioleylphosphatidylserine (DOPS) with or without cholesterol (Cho), to provide a basis for the formulation of nanocochleates containing the two active molecules. The results allowed us to define the optimal proportions for the formulation of nanocochleates: 9DOPS/1Cho/0.5AmB/0.5HePC and to predict that AmB and HePC would be incorporated stably into the formulation and would be located between the lipids in the bilayers rather than in the aqueous phase between the bilayers. The second part of the work was the formulation and characterization of nanococheates containing both AmB and HePC. These were derived from unilamellar liposomes containing the two active molecules. The crucial experimental parameters (size of the liposomes, ratio of DOPS to Cho) were optimized. The physico-chemical properties of the nanocochleates, such as the size, surface charge, morphology, encapsulation yield, the organization of the active molecules and the stability during long-term storage were studied. Since the formulation was destined for the oral route, in-vitro drug release and the stability of the nanocochleates in simulated gastro-intestinal media were studied according to the recommendations of the US Pharmacopeia. Finally, a preliminary in-vivo study of the plasma pharmacokinetics of AmB after oral gavage to rats of nanocochleates contained AmB with or without HePC, in comparison with AmBisome and Fungizone, was carried out. A significant oral absorption of AmB was observed. This work has led to the formulation of nanocochleates containing AmB and HePC with appropriate properties for oral administration. However, further optimization is necessary before such particles will be suitable for clinical use.

Background: In 2019, hepatitis is seen as one of the deadliest virus infections in the world and is seen as a global health problem. Hepatitis is a DNA-virus that can lead to chronic hepatitis and liver cirrhosis. Both hepatitis B and C are blood infections which means that they are transmitted through contact with damaged skin, mucus membrane or the eyes. Aim: The aim of this study was to describe how patients with hepatitis B and C experience the treatment from healthcare professionals. Method: The method used in this study was a review of literature research. The study was conducted through examination of 10 research articles. The chosen articles were found on the databases PubMed and CINAHL. The differences and the similarities were noted to create a larger understanding of the results. Results: The results consist of four categories which shows how patients with hepatitis B and C experience the treatment from healthcare professionals. The four categories are, a lack of information, faulty information, withholding of the diagnosis hepatitis and dismissive treatment. Patients were in need of support in the form of information and understanding. The negative experience received from healthcare professionals could be derived from lack of information. Conclusion: The conclusion of this study is that patients with hepatitis B and C experience negative treatment from healthcare professionals. The negative treatment is often connected to information and lack thereof. This study may have significance for future treatment of patients with hepatitis by highlighting the existing response. / Bakgrund: År 2019 anses hepatit vara den näst dödligaste virusinfektionen i världen. Det är ett globalt folkhälsoproblem. Hepatit är ett DNA-virus som kan leda till kronisk hepatit och levercirros. Både hepatit B och C är blodsmittor vilket innebär att de smittar genom att blod kommer i kontakt med skadad hud, slemhinna eller öga. Syfte: Syftet med studien var att beskriva hur patienter med hepatit B och C upplever bemötandet från omvårdnadspersonal. Metod: Studien är en litteraturöversikt med beskrivande design. Studien har genomförts genom granskning av 10 vetenskapliga artiklar. Valda artiklar har hittats genom sökningar på PubMed och CINAHL. Skillnader och likheter har noterats för att skapa större förståelse för resultatet. Resultat: Resultatet består av fyra kategorier som påvisar hur patienter med hepatit B och C upplever bemötandet från omvårdnadspersonal. De fyra kategorierna är otillräcklig- och felaktig information, undanhållande av diagnosen hepatit och avvisande bemötande från omvårdnadspersonalen. Patienterna hade ett stort behov av stöd i form av information och förståelse. Det negativa bemötandet från omvårdnadspersonalen kunde ofta härledas till okunskap. Slutsats: Slutsatsen av denna studie är att patienter med hepatit B och C upplever negativt bemötande från omvårdnadspersonal. Det negativa bemötandet är ofta kopplat till information och brist på sådan. Det finns en kunskapslucka hos omvårdnadspersonal när det gäller hepatit vilket får konsekvenser för patientens behandling och hälsa. Denna studie kan komma att få betydelse för den framtida vården för patienter med hepatit genom att konsekvenser av det befintliga bemötandet belyses.

Lamivudin war der erste Inhibitor der Hepatitis-B-Virus(HBV)-Polymerase, der für die Therapie der chronischen HBV-Infektion in Deutschland zugelassen wurde und seitdem zu einer signifikanten Senkung der HBV-assoziierten Letalität beigetragen hat. Aufgrund des hohen Resistenzrisikos unter Lamivudin wird der Einsatz der Substanz jedoch in den aktuellen HBV-Leitlinien nicht mehr empfohlen. Stattdessen sollen hochpotente Nukleos(t)id-Analoga wie Entecavir oder Tenofovir angewendet werden, die jedoch gerade in den ärmeren Endemiegebieten nur selten verfügbar sind. Zudem gibt es auch in den westlichen Industrieländern Patienten, die seit Jahren resistenzfrei mit Lamivudin behandelt wurden. Ob diese von einer prophylaktischen Therapieumstellung profitieren, ist bislang unklar. Ziel dieser Studie war es, die Langzeiteffektivität der Lamivudin-Therapie sowie die Häufigkeit und die prädiktiven Faktoren der Lamivudin-Resistenz zu ermitteln. In einer retrospektiven Untersuchung wurden hierzu die Verläufe von 147 HBeAg-positiven und 80 HBeAg-negativen Patienten aus 3 hepatologischen Zentren in Deutschland analysiert. Zur Sicherung der Lamivudin-Resistenz erfolgte eine genetische Resistenztestung. Zusätzlich wurde der klinische Nutzen einer hoch-sensitiven Real-Time-PCR zur Bestimmung der HBV-DNA evaluiert. Im Langzeitverlauf zeigte sich bei einer bestimmten Subgruppe von Patienten ein gutes virologisches, serologisches und biochemisches Ansprechen. Die vorliegende Studie bestätigte jedoch auch das hohe Resistenzrisiko unter einer Langzeittherapie mit Lamivudin, welches nach 7 Jahren 55% erreichte. Maßgeblicher prädiktiver Faktor für eine spätere Resistenzentwicklung war das virologische Ansprechen im Therapieverlauf. Entgegen den Ergebnissen früherer Studien stellte die Höhe der HBV-DNA zum Zeitpunkt des Therapiebeginns keinen prädiktiven Faktor der Resistenzentwicklung dar, sondern beeinflusste die Wahrscheinlichkeit des virologischen Ansprechens. Der Einsatz hoch-sensitiver Verfahren zur Bestimmung der HBV-DNA zur Therapiekontrolle oder Prädiktion der Lamivudin-Resistenz ist unseren Beobachtungen nach nicht erforderlich. Bei HBeAg-positiven Patienten hatte zudem ein HBeAg-Verlust einen günstigen Einfluss auf die Resistenzwahrscheinlichkeit. Auffällig war außerdem, dass HBeAg-positive Patienten nach einem virologischen Ansprechen nur noch ein sehr geringes Resistenzrisiko aufwiesen, während bei HBeAg-negativen Patienten trotz eines virologischen Ansprechens im gesamten Therapiezeitraum neue Fälle von Lamivudin-Resistenz beobachtet wurden. Auch durch die Kombination verschiedener Merkmale, die die Resistenzwahrscheinlichkeit nachweislich beeinflussten, konnte letztlich keine Subgruppe identifiziert werden, die im Verlauf resistenzfrei blieb oder nur ein sehr geringes Resistenzrisiko aufwies. Zusätzlich wurden diverse weitere Wirts-, virale und therapieassoziierte Charakteristika untersucht, die jedoch keinen prädiktiven Wert in Hinblick auf eine Resistenzentwicklung aufwiesen. Insbesondere natürlich vorkommende HBV-Mutationen, die mit einer Lamivudin-Resistenz assoziiert sind, wurden bei 9% der unvorbehandelten Patienten nachgewiesen, ohne dass dieser Befund einen signifikanten Einfluss auf das virologische Ansprechen oder die Resistenzwahrscheinlichkeit zeigte. Zusammenfassend ist festzustellen, dass wir in unserer Studie Parameter definieren konnten, die mit einem Langzeitansprechen assoziiert sind und damit die Grundlage einer individualisierten Therapie darstellen könnten. Die Ergebnisse sind vor allem für Länder mit eingeschränkten Therapiemöglichkeiten von Relevanz. Sofern höher potentere Nukleos(t)idanaloga zur Verfügung stehen, sollte in Anbetracht des hohen Resistenzrisikos allerdings von einer Therapie mit Lamivudin abgesehen werden. Liegt bereits eine langjährige Lamivudin-Therapie ohne Zeichen einer Resistenzentwicklung vor, so erscheint die Fortsetzung jedoch gerechtfertigt. Dennoch sind regelmäßige Kontrollen erforderlich, da Lamivudin-Resistenzen auch nach mehr als 10 Jahren auftreten können.

Markéta Sypecká CRISPR/Cas9 editing of leukemic B-cells: searching for microRNA-155 targets involved in the process of leukemogenesis Introduction: Chronic lymphocytic leukemia (chronic lymphoid leukemia, CLL) is a monoclonal disorder characterized by a progressive accumulation of functionally incompetent lymphocytes. CLL is the most common form of leukemia found in adults in Western countries. Course of the disease can differ: some patients die rapidly, within 2-3 years of diagnosis, because of complications from CLL, but most patients live 5-10 years. However, every stage of this disease has significantly higher level of miR-155, which is known as oncomiR. Micro RNAs represent negative regulators of gene expression. MiR-155 affects genes, which are involved in leukemogenesis and cell cycle. And it is known, that miR-155 suppresses its targets. We hypothesized that by gene editing of CLL B - cells we unblock miR-155 targets and find out correlation between these targets (known and unknown) with CLL leukemogenesis. Method we use for gene editing is CRISPR/Cas9, which enables to delete sequence of mature miR-155 in genome of leukemic B-cells. Methods: CRISPR/Cas9, nucleofection, qRT-PCR, FACS Results:We achieved to isolate clone that bears one allelic deletion (miR-155-/+) in sequence for mature...

The thesis is dealing with spectral analysis of the B[e] star FS CMa, a prototype of FS CMa stars group. These objects are characterized by huge amount of matter in sourrounding shell which origin is not explained for many years. However, solving this issue could enrich stellar astrophysics by enhanced stellar evolution models. The goal of this thesis is to improve our understanding of FS CMa. We described spectral variability on various time scales and simulated spectra for different forms of the system in HDUST code. On the basis of new obtained spectra we confirmed long-term changes in variability of some spectral features and rapid variability of some spectral lines. We gained an estimate of the gas density. The simulations showed that spectral type of FS CMa is not certain and that the star could be surrounded by extended disk, many stellar radii wide. 1

Our aim was to aid the viscoelasticity into the model for thermal convection by developing our own code in Fortran 90 and to study the role of viscoelasticity in this model. We should have included the viscoelasticity by Maxwell model; however, due to numerical instability we changed it for Oldroyd-B model. We were adding the terms of objective derivative into our code step by step and we were observing how they influence the behaviour of thermal convection. Partial time derivative and advective terms were included in whole complexity, the corrotational terms need more numerical testing. Our work suggest that the influence of viscoelasticity on thermal convection is noticeable. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Study program: Pharmacy Author: Marianna Šamajová Supervisor: RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Consultant: plk. gšt. doc. RNDr. Zuzana Kročová, Ph.D. Title of diploma thesis: Entry of bacteria Mycobacterium bovis BCG into B lymphocytes Background: The objective of this work was to evaluate the entry of bacterium Mycobacterium bovis BCG into B lymphocytes and the role of selected receptors in this process. Methods: Peritoneal cell suspensions with unblocked and/or blocked receptors on BALB/c mouse B lymphocytes we infected by bacterium M. bovis BCG-GFP unopsonized and/or opsonized by fresh murine serum ("complement") or immune serum ("antibodies"). Using flow cytometry we evaluated the entry of bacterium M. bovis BCG-GFP into B lymphocytes and their subpopulations B1a, B1b and B2. Results: M. bovis BCG-GFP actively enters into B lymphocytes. Depending on the subpopulation, it most infects B1a, less B1b and at least B2 lymphocytes. Only the subpopulation B2 responds significantly to the opsonization by complement. Opsonization by antibodies had no significant effect on the infection. Entry into CD19+ cells is mediated through the BCR receptor, especially in subpopulations B1a and B1b. Under the opsonized conditions, the CR1/2 complement receptor is...

Nela Dvořáková 19.7.2019 1 Abstract We study a representative of a diverse group of stars exhibiting the B[e] phe- nomenon, designated MWC 939. This object might be an important link be- tween the stage of the asymptotic giant branch and planetary nebula stage as it is one of a few such objects observed. Our focus is aimed at spectral analysis of the circumstellar matter around the central star. We assemble a line list for MWC 939 and observe variations of its spectrum. Electron density and temper- ature are estimated using nebular diagnostics of ratios of [S II] λλ 6716, 6731 ˚A and [O I] λλ 6300, 6364 ˚A and 5577 ˚A. These estimates are then used for detailed calculations of the structure of circumstellar envelope. 1

Leukemia is the most common cancer of children, moreover it is also not uncommon of elderly patients. Research has focused on the development of specific antileukemic drugs in recent years. Abnormalities in tumor cell metabolism that can be targeted during treatment appear to be the key. Natural 1,4-naphthoquinones, including quambalarin B produced as a secondary metabolite by the basidiomycetes of Quambalaria cyanescens, are known for their therapeutic effects. Not surprisingly, Quambalarine B has also been shown to inhibit cell proliferation in some leukemic cell lines and subsequently caused cell death. In the present thesis, I tried to observe changes in amino acid metabolism by monitoring amino acid levels in the intracellular and extracellular environment of leukemic cells after treatment with Quambalarine B using amino acid analysis with fluorescence detection. The observation was performed in Jurkat, Ramos and THP-1 cell lines, each of these lines represents another type of leukemic disease. [IN CZECH] Key words Amino acid analysis, amino acid metabolism, Quambalarine B, leukemia