Evalúa in silico y serológicamente el potencial antigénico del dominio extracelular recombinante de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D (LptD) de Bartonella bacilliformis. Por medio del análisis in silico se escogió a la proteína LptD por estar localizado en la membrana externa, poseer una alta probabilidad de ser antigénica, no presentar similitud con proteínas humanas, de ratón o de cerdo, ser una proteína de mediano peso molecular (86.80 kDa), presentar epítopes con alta afinidad a HLA clase I y II, los cuales, presentaron un alto índice de cobertura poblacional (Perú 100%, Sudamérica 93.8% y a nivel Mundial 99.28%). Mediante el uso de la tecnología de ADN recombinante se clonó en Escherichia coli TOP10 el gen del dominio extracelular de LptD fusionada a una cola de seis histidinas y se expresó en E. coli BL21 (DE3) pLysS. Las condiciones para inducción de la proteína recombinante fueron 0.5 mM IPTG, 16 horas, medio TB etanol al 3% (v/v), 28 0C, OD600: 1-1.5 y 200 r.p.m. La purificación se realizó en condiciones denaturantes con resina Ni-IDA (His60 Ni Superflow) a pequeña escala y se obtuvo 2.6 μg de LptD recombinante parcialmente purificada por cada 1 mL de cultivo bacteriano inducido (OD600: 1 - 1.5). El resultado positivo del ensayo de Western Blot permitió evidenciar la antigenicidad de la proteína LptD recombinante ante sueros de pacientes que sufrieron la enfermedad de Carrión. En conclusión, la proteína LptD recombinante muestra antigenicidad tanto in silico y serológicamente, estos resultados son base para posteriores estudios de la proteína LptD en la línea de investigación de candidatos vacunales contra la enfermedad de Carrión. / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú). Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

Memoria (licenciado en ciencias jurídicas y sociales) / La presente memoria tiene por objeto analizar la protección de los datos genéticos existente en nuestra legislación, en base a la comparación de ésta con la normativa internacional y el derecho comparado, para así determinar si nuestro país se ha adecuado a las nuevas tecnologías en materia genética, y si entrega una respuesta apropiada y suficiente a las problemáticas que se presentan hoy en día en este campo y que seguirán manifestándose con aun mayor frecuencia en el futuro. En particular analizar si existe una respuesta adecuada por parte del derecho penal frente a aquellas conductas que vulneran los principios involucrados en el genoma humano.

La synthèse de caténanes et rotaxanes remonte aux années 60. Aujourd'hui la plupart de ces molécules enchevêtrées, synthétisées comportent jusqu'à 4 éléments et ce nombre continu de croître. Toutefois, ces molécules restent relativement petites, comparées `a celles trouvées dans la nature tels que les caténanes présents dans l'ADN. Les caténanes et rotaxanes sont des molécules mécaniquement assemblées, composées de pièces mobiles, liées, ou non (ou plus d'elles), pouvant se mouvoir et/ou se déplacer par rapport aux autres. Cette architecture unique les rend très intéressants et fait d'eux des candidats potentiels pour les machines moléculaires, ainsi que pour des applications dans le domaine de l'optique non linéaire, en particulier dans la photonique, l'optoélectronique et le stockage de données optique. Dans ce travail, nous exposons les résultats de nos recherches portant sur les propriétés optiques non-linéaires de quelques caténanes et rotaxanes. Ces propriétés non-linéaires ont été abordées par différentes techniques. Les résultats montrent une importante contribution électronique dans la susceptibilité non-linéaire de troisième ordre confirmée par des calculs théoriques au niveau moléculaire. Nous exposons également les résultats des propriétés optiques non linéaires de l'ADN fonctionnalisé. Ces résultats montrent une recrudescence des non linéarités quand l'ADN modifiée est utilisé. Par ailleurs, on a observé les meilleurs résultats dans des expériences d'holographie quand l'ADN-CTMA est utilisé comme matrice pour le dopage du disperse red 1.

.

Les recherches décrites dans cette thèse ont pour but le développement de systèmes modèles pour 'réparer' des sites abasiques dans des doubles hélices d'ADN. Nous ne pensons pas rétablir la base naturelle manquante, mais introduirons une modification chimique du site abasique pour restaurer la stabilité du duplex. La base opposée au site abasique sera utilisée pour sélectionner un "réactif de réparation" complémentaire au sens de l'appariement de type Watson-Crick, parmi plusieurs réactifs possibles. Cette étape de sélection devrait donc constituer une sorte de "transfert d'information" ou de "réplication" de la base opposée vers le site abasique, et elle devrait être intéressante a ce titre. Nous voudrions que notre système de réparation de sites abasiques utilise des réactions qui soient réversibles à l'échelle de l'expérience. Cela devrait permettre une correction in situ des erreurs commises par le système. Nous voudrions également que les unités de réparation réagissent avec le squelette de l'ADN, mais sans le couper. Nous pensons qu'éviter la coupure du brin rendra notre système beaucoup plus fiable. Nous avons choisi la réaction entre des aldéhydes et des dérivés d'amines pour former des dérivés d'imines. Ces réactifs peuvent réagir de manière réversible dans l'eau à pH 7. Cette thèse est divisée en trois chapitres principaux; dans le chapitre deux une étude bibliographique de la littérature sur laquelle nos travaux sont basés est présentée. Le chapitre trois contient les travaux sur la réparation des sites abasiques naturels. Le chapitre quatre concerne les travaux sur la réparation des sites abasiques artificiels.

En phase somatique, plusieurs mécanismes de réparations de l'ADNinterviennent pour réparer les cassures double brin (CDB) de l'ADN. Enphase méiotique, les CDB de l'ADN engendrées de façon programmées parSpo11 sont réparées par la recombinaison homologue (RH) dont les acteursprincipaux sont Rad51 et Dmc1 aidés de Brca2. Chez Arabidopsis, en absencede Brca2, le déroulement méiotique est perturbé, les chromosomes nes'associent pas en bivalents, ils apparaissent emmêlés. Ainsi, en absencede Brca2, la recombinaison homologue pourrait ne plus être fonctionnelleet les anomalies chromosomiques observées pourraient être le résultat deréparations aberrantes des CDB de l'ADN effectuée par d'autres mécanismesde réparation de l'ADN. Nous avons montrés, chez Arabidopsis, que le Nonhomologous End Joining (NHEJ) et/ou le Single Strand Annealing (SSA),mécanismes de réparation des CDB de l'ADN en phase somatique,n'intervenaient pas en phase méiotique dans la formation des anomaliesobservées en absence de Brca2. Toujours dans l'hypothèse où ces figuresméiotiques soient le résultat de liaisons covalentes, nous avons regardési les ADN-ligases ne pourraient pas être impliquées. Ainsi, nous avons pumontrer que la Ligase 6, ADN-ligase spécifique des plantes, n'avait pas derôle dans les anomalies chromosomiques observées en méiose en absence deBrca2. D'ailleurs la Ligase 6 ne semble pas non plus intervenir dans lesfigures chromosomiques observées chez les mutants rad51 et mnd1. Le rôlede la Ligase 6 n'ayant pas été déterminé lorsque nous avons démarré cetravail, nous avons voulu identifier son le rôle en étudiant le mutantcorrespondant. Le mutant ligase 6 ne présente pas de sensibilité auxstress génotoxiques utilisés ce qui indique que la Ligase 6 ne semble pasintervenir dans la réparation de l'ADN. La mutation dans le gène LIGASE Iest létal à l'état homozygote, de plus nous avons pu observer uneségrégation anormale chez l'hétérozygote mutant pour le gène LIGASE I. Lalétalité du mutant ligase I a été contournée par l'utilisation d'unsystème ARNi pour éteindre l'expression du gène LIGASE I uniquement enméiose. Cependant, l'implication de la Ligase I, dans les anomaliesméiotiques observées en absence de Brca2 n'a pas pu être déterminée.Enfin, nous avons confirmé que, chez Arabidopsis, Xrcc4 avait un rôle dansle NHEJ via son interaction avec la Ligase IV et via la sensibilité dumutant xrcc4 à différents stress génotoxiques. En revanche, Xrcc4-like nesemble pas interagir avec les acteurs du complexe de ligation du NHEJ etle mutant ne présente pas de sensibilité aux stress génotoxique, indiquantque cette protéine n'est pas impliquée dans le NHEJ et plus généralementdans les mécanismes de réparation de l'ADN.

Cette thèse a pour objectif de montrer de nouvelles possibilités de contrôle lumineux sur des systèmes biochimiques et physico-chimiques à l'aide de tensioactifs cationiques photosensibles. Leur groupement diazobenzène peut subir une photoisomérisation trans-cis réversible qui est à l'origine d'une modi cation de polarité, exploitée en particulier pour l'une de ces molécules appelée AzoTAB. La mise en présence d'ADN, d'AzoTAB et d'un milieu d'expression génétique in vitro a d'abord permis de montrer que le niveau de production d'une protéine pouvait être accru après illumination UV. Le changement de polarité photoinduit provoque ici une modifi cation de la conformation de l'ADN et l'ARN et ce qui change les vitesses des réactions de transcription et translation. A travers la synthèse de deux nouveaux analogues de l'AzoTAB comportant une queue plus hydrophobe, c'est aussi une amélioration de la concentration de molécules nécessaires à la transition de conformation de l'ADN qui a été évaluée. Ensuite, la déformation et la rupture photoinduite de vésicules géantes unilamellaires (GUV) dans un bain d'AzoTAB a été étudiée suivant leur composition. La formation de GUV relativement monodisperses a aussi été effectuée, grâce au dépôt contrôlé d'une multicouche de phospholipides sur du silicium plan microstructuré. La polarité photodépendante de ce tensioactif a enfi n été exploitée pour modi fier localement l'énergie d'une interface. D'une part à travers la photomanipulation d'une goutte d'huile millimétrique fl ottant sur un bain d'AzoTAB. D'autre part dans un dispositif microfl uidique, où la fragmentation par la lumière d'un écoulement biphasique laminaire en microgouttes a été montrée, avec une sélectivité spatiale.

Notre travail concerne la transfection génique. Celle-ci nécessite l'envoi au noyau cellulaire d'ADN exogène, c’est-à-dire, d'une grosse molécule hydrophile, qui, normalement ne peut pénétrer dans la cellule que par endocytose. Or, un tel processus conduit habituellement à une dégradation de la molécule, en grande partie dans les lysosomes. Dans notre introduction, après un bref rappel sur l'endocytose, nous présenterons les moyens qui permettent à l'ADN exogène d'échapper à une hydrolyse intracellulaire et d'atteindre le noyau sous une forme fonctionnelle. Les résultats que nous avons présentés nous apportent des informations sur l’influence de l’injection hydrodynamique sur l’endocytose par le foie. Rappelons que notre travail avait deux buts principaux : contribuer à l’élucidation du mécanisme de la transfection hydrodynamique et rechercher si l’injection hydrodynamique pouvait présenter des avantages pour introduire des protéines dans les cellules hépatiques.

L'estudi realitzat ha estat la identificació i caracterització de proteïnes de la matriu nuclear, concretament d'una proteïna de 55 KD (p55) associada a la fase replicativa de l'ADN durant la proliferació cel.lular.La matriu nuclear és una estructura obtinguda després d'una extracció de cromatina i components solubles de nuclis amats. Durant els últims anys s'ha implicat a la matriu nuclear en importants funcions com són: l'organització i replicació de l'ADN, la transcripció i l'acció hormonal (1, 2, 3, 4, 5, 6). Nombroses evidències desvetllen la importància dels components de la matriu nuclear en la regulació de la síntesi de l'ADN i la proliferació cel.lular, com l'increment d'expressió de molts oncogens, que codifiquen proteïnes nuclears les quals s'associen a l'activació proliferativa de diversos tipus cel.lulars normals (7, 8, 9, 10). També s'ha descrit l'increment de moltes altres proteïnes, incloent la calmodulina, proteïnes acceptores de calmodulina (11) i distins enzims replicatius com l'ADN polimerasa a, l'ADN primasa, la 3'-5'-exonucleasa, l'ARNasa H i l'ADN metilasa, les quals s'associen a la matriu nuclear dels hepatòcits durant la fase replicativa de la regeneració (12).Totes aquestes dades suggereixen que la síntesi de certes proteïnes i la seva associació amb la matriu nuclear pot ésser un procés important per a la regulació de la replicació de l'ADN i la proliferació cel.lular en general.El treball desenvolupat s'ha centrat en la identificació d'una proteïna de 55 KDa (p55) associada a la matriu nuclear, que incrementa paral.lelament a l'inici de la síntesi d'ADN durant la regeneració hepàtica després d'una hepatectomia parcial (13). L'hepatectomia parcial ha estat el model emprat per l'estudi dels canvis proteics associats a la matriu nuclear dependents de les distintes fases dels cicle ceLlular.El fet de que la p55 incrementes paral.lelament a la síntesi d'ADN suggería que fos una proteïna relacionada directament amb la replicació de l'ADN.A causa de l'interès que representa l'estudi dels processos i factors que intervenen en el desenvolupament de la síntesi d'ADN i posterior divisió cel.lular, i atès que es desconeixen les proteïnes que forment part o intervenen en l'estructura interna de la matriu nuclear, l'objectiu d'aquest estudi ha estat la caracterització de la p55. Per tal propòsit s'ha purificat i s'han produït anticossos policlonals contra la p55, amb els quals s'han realitzat estudis immunocitoquímics que han desvetllat la localització nuclear d'aquesta proteïna en el teixit hepàtic regenerant.A partir de la seqüència parcial d'aminoàcids, s'ha obtingut que la p55 presenta una granhomologia amb les queratines, concretament amb la queratina núm. 8.Atès que les queratines són proteïnes de la família de filaments intermedis, descrits comconstituents dels citoesquelet cel.lular i per tant la seva localització és citoplasmàtica i no nuclear, com en el cas de la p55, es plantejaren estudis paral.lels emprant anticossos contra la p55 i contra les queratines.Els estudis realitzats a nivell bioquímic, en teixit hepàtic, semblen indicar que la p55 detectada en la matriu nuclear es tracta de la queratina 8. Ja que el patró de les dues proteïnes és el mateix tant a nivell d'electroforesi bidimensional, com a nivell de fosforil.laciò in vitro i mitjançant immunotransferències emprant els anticossos esmentats anteriorment.Com a conclusió d'aquests resultats es podria afirmar, tal com hem indicat, que les duesproteïnes són la mateixa, si no fos pels resultats obtinguts en els estudis immunocitoquímics emprant l'anticossos anti-p55 i anti-queratines, en els quals s'ha comprovat que la queratina presenta distribució citoplasmàtica i la p55 nuclear.Posteriorment, s'inicià l'estudi de la p55 en distintes línies cel.lulars en cultiu, per poder generalitzar i comprovar els resultats obtinguts en el teixit hepàtic regenerant.S'ha utilitzat la línia cel.lular NRK 44F (cèl.lules normals no epitelials de ronyó de rata).Aquestes cèl.lules resultaven un model d'estudi interessant i comparable amb el de la regeneració hepàtica post-hepatectomia parcial, ja que presenten la capacitat d'ésser activades i sincronitzades en les distintes fases del cicle cel.lular.S'ha analitzat, mitjançant tècniques immunocitoquímiques, la presència de la p55 en aquestes cèl.lules en diferents fases del cicle cel.lular i s'ha observat que, al igual que en el fetge, la p55 es detecta exclusivament en el nucli de les cèl.lules NRK en fase S. L'ànalisi bioquímica ens indica que el patró electroforètic bidimensional de la proteïna detectada en les cèl.lules NRK, és similar al de la p55 de les cèl.lules hepàtiques. Presenta una forma majoritària i distintes isoformes d'igual pes molecular, degudes a diferents graus de fosforil.lació. En canvi, el pes molecular de la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55 en aquestes cèl.lules no és de 55 KOa, si no de 62 KOa.Pel que fa a la correlació que hi ha entre la p55 i la citoqueratina 8 en les cèl.lules hepàtiques, és interessant indicar que les cèl.lules NRK 44F no són cèl.lules d'origen epitelial (tipus cel.lular que presenta típicament queratines com a components dels filaments intermedis), són fibroblasts, i aquests presenten vimentina com a component dels filaments intermedis.S'ha comprovat, mitjançant estudis immunocitoquímics i per immunotransferència la composició dels filaments intermedis de les cèl.lules NRK, emprant els anticossos antiqueratina i anti-vimentina. Ja que és conegut que alguns tipus cel.lulars que contenen un únic tipus de filament intermedi, a l'adaptar-se a les condicions de cultiu o degut a factors tumorals (en el cas de línies tumorals), expressen nous tipus de filaments intermedis que coexisteixen amb els originals.Els resultats obtinguts han estat els esperats. Les cèl.lules NRK no presenten queratines, únicament presenten vimentina.També s'ha caracteritzat la p55 en altres tipus cel.lulars com són: les cèl.lules HeLa (cèl.lules d'adenocarcinoma humà), MOCK (cèl.lules epitelials de ronyó de gos), BRL (cèl.lules d'hepatocarcinoma de rata) i cèl.lules 3T3 NIH (fibroblasts de ratolí). En totes aquestes cèl.lules, l'anticòs anti-p55 presenta localització exclusivament nuclear. En canvi s'han observat diferències respecte a la proteïna detectada. En les cèl.lules HeLa i MDCK l'anticòs anti-p55 detecta específicament una proteïna de 55 KOa, igual que en les cèl.lules hepàtiques. Una altra característica comú entre aquestes cèl.lules i les del fetge és que presenten queratines i concretament la queratina 8, com component dels filaments intermedis.En les cèl.lules 3T3 NIH, l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de 60-62 KOa. Aquest resultat coincideix amb l'obtingut en les cèl.lules NRK. Cal destacar que ambdós tipus de cèl.lules són fibroblasts i presenten vimentina com component dels filaments intermedis.Així doncs podem indicar que l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de localització nuclear independentment del tipus cel.lular que es tracti. En canvi en les cèl.lules d'origen epitelial o que contenen queratina 8, la proteïna detectada per l'anticòs presenta 55 KOa de pes molecular i en els fibroblasts o cèl.lules que no contenen queratina la proteïna detectada presenta entre 60-62 KOa.S'ha intentat esbrinar si la proteïna de 62 KOa detectada en els fibroblasts presenta alguna correlació amb la vimentina, com és el cas de la p55 i la queratina 8 en el fetge. Però, a més de presentar distint pes molecular, ja que la vimentina té un pes molecular de 57 KOa, presenten diferent patró electroforètic, així com tampoc s'ha observat que l'anticòs antivimentina reconegui la p55, ni l'anticòs anti-p55 la vimentina, contràriament al que s'observava amb la p55 i la queratina 8 en el fetge.CONCLUSIONS:Com a conclusió final podem dir que la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55, encara que no presenti sempre una correlació amb el tipus de filament intermedi típic del tipus cel.lular en estudi, té relació amb els filaments intermedis degut a la seqüència d'aminoàcids que presenta. La proteïna identificada es pot considerar una proteïna estructural de la matriu nuclear implicada en la segregació dels cromosomes durant la divisió cel.lular, ja que els estudis immunocitoquímics realitzats en cèl.lules en mitosi, emprant l'anticòs anti-p55, ens mostren una reacció associada als cromosomes i a vegades seguint el mateix patró que el fus mitòtic.BIBLIOGRAFIA:1- Nelson, W.G.; K.J. Barrack and O.S. Cotfey. 1986. Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 457475.2- Pardoll, O.M.; B. Volgestein and O.S. Coffey. 1980. Cell 19: 527-536.3- Smith, H.C. and R. Berezney. 1982. Biochemestry 21: 6751-6761.4- Smith, H.C. and R. Berezney. 1983. Biochemestry 22: 3042-3046.5- Jackson, O.A. and P.R. Cook. 1986. EMBO J. 5: 1403-1410.6- Berezney, R. and O.S. Cotfey. 1975. Science 189: 291-293.7- Kelly, K.; B.H. Cochram, Ch.O. Stiles and P.Leder. 1983. Cell 35: 603-610.8- Thompson, C.B.; P.B. Challoner, P.E. Neiman and M. Groudine. 1986. Nature 319: 374380.9- Greenberg, M.E. and E.B. Ziff. 1984. Nature 311: 433-438.10- Thompson, N.L.; J.E. Mead, lo Braun. M. Goyette, P.R. Shank and N. Fausto. 1986.Caneer. Res. 46: 3111-3117.11- Serratosa, J.; M.J. Pujol, O. Baehs and E. Carafoli. 1988. 8ioehem. 8iophys. Res.Commun. 150: 1162-1169.12- Tubo, R.A. and R. Berezney. 1987. J. 8iol. Chem. 262: 1148-1154.13- Higgins, G.M. and R.M. Anderson. 1931. Mreh. Pathol. 12: 186-202. / We have identified a protein (p55) with a molecular weight of 55 KDa and pI of 6.2, which was strongly increased in the nuclear matrix of rat liver cells during proliferative activation. This protein is highly insoluble since it could not be solubilized either by detergents or by alkaline extraction. We have obtained three partial amino acid sequences which revealed that p55 has a high homology with cytoqueratins. Polyclonal antibodies raised against p55 were used to carry out Western blot and immunocytochemical studies which indicated that p55 was localized only in the nuclei, specifically in the nuclear matrix. Autoradiographic experiments revealed that not all the cells presenting an increase in p55 incorporated (3H)thymidine, indicating that this protein is not related to DNA replication. Immunocytochemical studies also revealed that during mitosis p55 is localized surrounding the chromosomes and associated with the mitotic apparatus, suggesting that p55 is involved in the separation of chromosomes during cell division.In order to identify the presence of p55 in different cells types, we have also analyzed the antibody against the p55 in NRK (normal rat kidney) cells.Immunocytochemical studies in synchronic NRK cells revealed that the antibody is located specifically in the nuclei of replicative NRK cells. Western blot analysis of NRK cells showed that the protein detected in NRK cells has 62 KDa and 5.2-5.4 pi value. By western blot studies, we have also found that the protein (p62) is present at the same level in different phases of cell cycle, suggesting that the specific reaction detected by imunocytochemistry in replicative cells is due to increase of antigen accessibility or a change of protein conformation.Immunocytochemical studies in others culture cells, HeLa (human cervical adenocarcinome), NIH 3T3 fibroblasts, MDCK (Madin-Darby canine kidney) cells and BRL (rat hepatocarcinome), confirm the nuclear reaction of the antibody.We also show that the protein detected by the antibody from nuclear matrix liver cells is located in the nuclear matrix in all tested cells after extraction of "in vitro" nuclear matrix fraction.Thus, the NRK cells are fibroblasts and their do not have cytokeratins, we can conclude that the antibody against the nuclear matrix from rat liver cells detect a specific protein of nuclear matrix and from all the results we can also suggest that the protein detected would be related with intermediate filaments proteins.

The goal of this thesis has been to design, characterise and optimise an electrochemical DNA sensor array. In order to investigate the oligonucleotide probe immobilisation and the hybridisation detection, preliminary experiments with an easy system were performed. This system demonstrated the suitability of oligonucleotide self-assembled monolayers (SAMs) on gold surfaces as immobilisation method. Due to the rapid DNA sensor development towards DNA arrays, a modified strategy was proposed. This strategy was based on the site-directed electrodeposition of biorecognition nanomodules on electrodes of photolithographic resolution. These biorecognition nanomodules, oligonucleotide-modified colloidal gold nanoparticles, were rationally synthesised previously studying the conditions under which colloidal gold suspensions were stable. Fluorescence and colourimetric techniques proved the effectiveness of the conjugation, the functionality of the conjugated probes, and the thermal stability of the modification, which made the biorecognition nanomodules suitable for hybridisation detection. After their characterisation, the biorecognition nanomodules were electrodeposited on different electrode surfaces and the site-directed immobilisation was clearly demonstrated by several techniques, such as light and electron microscopy, and colourimetric, piezoelectric and electrochemical techniques. Additionally, the site-directed deposited biorecognition nanomodules were functional and able to differentiate 4-point mutations in 19-mer oligonucleotides. Despite the promising results, which demonstrated the viability of the directed electrodeposition as arraying technique, the necessity for the electrochemical signal amplification was observed, as system values were very close to blank values. Following two parallel objectives for the electrochemical signal amplification (to intrinsically increase kinetic rates between enzymes and electrodes, and to optimise electrochemical recycling systems), osmium complexes were rationally designed and the kinetics of electron transfer with redox enzymes was evaluated. These kinetic studies showed that more positively charged mediators and with higher redox potentials yielded higher rates, also favoured at high pH and low ionic strength, demonstrating the possibility to amplify electrochemical signals.The thesis is structured in seven chapters. Chapter I is an introduction that establishes the basis of DNA sensors and arrays, explains the behaviour and stability of the colloidal gold suspensions, conjugations and deposition, and presents the theoretical basis for the evaluation of electron transfer rate constants between redox enzymes and mediators. The objective of the thesis, the state-of-the-art, the hypothesis, the methodology, the most important conclusions and the limitations and future work are also presented in this chapter. Chapter II describes the preliminary system for the immobilisation characterisation and hybridisation detection. Chapter III elaborates on the study of colloidal gold suspension stability and the subsequent synthesis of the functional biorecognition nanomodules. Moreover, in this chapter the thermal stability and the functionality of the nanomodules are characterised by various techniques. In Chapter IV, the site-directed electrodeposition of these nanomodules is presented, as well as the characterisation techniques applied for its evaluation. Chapter V covers the rational study of the experimental parameters that affect the electron transfer kinetics between Glucose Oxidase (GOx) and osmium complexes, developed for application in electrochemical signal amplification. Finally, Chapters VI and VII summarise the conclusions,the limitations of the thesis work and proposals for future study. / El objetivo de esta tesis ha sido diseñar, caracterizar y optimizar un array de sensores de ADN electroquímico. Para el estudio de la inmovilización de las sondas de oligonucleótidos y la detección de la hibridación se realizaron experimentos preliminares con un sistema simplificado. Dicho sistema demostró que las monocapas auto-ensambladas (SAMs) en superficies de oro eran apropiadas como método de inmovilización. Debido al rápido desarrollo de los sensores de ADN hacia los arrays de ADN, se modificó la estrategia. La nueva estrategia se basó en la electrodeposición dirigida de nanomódulos de bioreconocimiento en electrodos de resolución fotolitográfica. Dichos nanomódulos, nanopartículas de oro coloidal modificadas con oligonucleótidos, se sintetizaron racionalmente después de haber estudiado las condiciones bajo las cuales las suspensiones de oro coloidal eran estables. Mediante técnicas de fluorescencia y colorimetría se caracterizó la eficacia de las conjugaciones, la funcionalidad de los oligonucleótidos conjugados y la estabilidad térmica de la modificación, experimentos que demostraron que los conjugados eran aptos para la detección de la hibridación. Después de su caracterización, los nanomódulos de bioreconocimiento fueron electrodepositados en distintas superficies electródicas y se demostró la inmovilización dirigida mediante varias técnicas, como la microscopía óptica y electrónica, y técnicas colorimétricas, piezoeléctricas y electroquímicas. Además, los nanomódulos de bioreconocimiento depositados eran funcionales y capaces de diferenciar 4 mutaciones en oligonucleótidos de 19 bases. A pesar de los prometedores resultados, los cuales demostraron la viabilidad de utilizar la electrodeposición dirigida como técnica de arraying, se observó la necesidad de amplificar la señal electroquímica, puesto que los valores obtenidos del sistema eran muy parecidos a los valores obtenidos de los blancos. Siguiendo dos objetivos paralelos para la amplificación de la señal electroquímica (aumentar intrínsecamente las constantes de transferencia de electrones entre encimas y electrodos, y optimizar los sistemas de reciclaje electroquímicos), se diseñaron racionalmente complejos de osmio y se evaluó la cinética de transferencia de electrones entre dichos complejos y encimas redox. En estos estudios cinéticos se observó que los mediadores con carga global más positiva y con potenciales redox más altos proporcionaban constantes de transferencia de electrones más altas, también favorecidas a alto pH y baja fuerza iónica, demostrando la posibilidad de amplificar las señales electroquímicas. Esta tesis está dividida en siete capítulos. El primer capítulo es una introducción que explica los principios fundamentales y el estado de la ciencia en el área de los sensores y arrays de ADN, que sienta las bases del comportamiento de las suspensiones de oro coloidal y que presenta la cinética de transferencia de electrones entre mediadores y enzimas. El segundo capítulo describe el desarrollo de un método preliminar para caracterizar la inmovilización y detectar la hibridación en sensores de ADN. En el tercer capítulo se presentan estudios de estabilidad de las suspensiones de oro coloidal, conjugaciones de oligonucleótidos a dichos coloides y la caracterización de la eficacia de dichas conjugaciones, de la estabilidad de las suspensiones de las conjugaciones, y de la funcionalidad de los conjugados. En el cuarto capítulo se demuestra la electrodeposición dirigida y selectiva en varias superficies electródicas mediante varias técnicas de caracterización. En el quinto capítulo se obtienen las constantes de transferencia de electrones entre la Glucosa Oxidasa (GOx) y distintos complejos de osmio, y se analiza el efecto de varios parámetros experimentales en dichas constantes. Finalmente, un sexto capítulo establece las conclusiones de la tesis y un séptimo capítulo propone varias líneas de investigación a desarrollar en un futuro.