Mecanismos que regem o desenvolvimento do olho composto e lóbulo óptico tem sido amplamente estudados em Drosophila melanogaster onde a retina é formada a partir de um disco imaginal anexado com o cérebro e os lóbulos opticos a partir do primórdio óptico externo. Através de histologia comparativa e análise de expressão gênica no desenvolvimento do sistema visual em Apis mellifera nós procuramos elucidar questões sobre plasticidade do desenvolvimento subjacente a fortes diferenças sexo- e casta-específico no olho assim como contribuir com aspectos evo-devo. O desenvolvimento dos lóbulos ópticos ocorre por dobramento neuroepitelial a partir de um centro de diferenciação no cérebro larval. Deste centro, a medula, lamina e lóbula surgem ao mesmo tempo em operárias e zangões. Dois passos marcam a diferenciação da lâmina (i) sua origem a partir da diferenciação de neuroblastos da camada mais externa da medula, isso coincidindo com o primeiro pico de expressão de roughest, e (ii) 24 horas mais tarde o aparecimento dos omatideos hexagonais coincidindo com o segundo pico de expressão de roughest. Com a inclusão de genes candidatos relacionados com o desenvolvimento do olho e lóbulos ópticos em insetos [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) e epidermal growth factor receptor (egfr)] nós encontramos distintos picos de expressão para sol, eya, mnb e so em níveis de transcritos e tempo de aparição do pico diferindo entre operárias e zangões. Enquanto estes quatro genes mostraram relativa sincronia durante o desenvolvimento em zangões, o mesmo não ocorreu em operárias. Além disso, em operárias sol é muito mais expresso na pré-pupa do que em zangões. Ambos os sexo mostraram padrões muito similares de expressão de elav, exceto por um atraso em zangões. Em contraste, a expressão de egfr ocorre antes em zangões. Durante a phase chave no desenvolvimento do sistema visual, uma análise global do transcriptoma, por meio de micro-arranjos mostrou vários genes relacionados com ciclo celular entre os diferencialmente expressos. Em conclusão, a relação entre tempo e eventos morfológicos com os padrões de expressão gênica revelou diferenças possivelmente relacionadas com mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema visual altamente dimorfico de Apis mellifera. / Developmental mechanisms governing compound eye development in insects have been broadly studied in Drosophila melanogaster, where the retina is formed from an imaginal disc attached to the larval brain. However little is known about eye development in other insects, most of which do not have such imaginal eye discs. Through a comparative histological and gene expression analysis of eye development in the honey bee, Apis mellifera, we intended to elucidate questions about developmental plasticity underlying the marked sex and castespecific differences in eye size, as well as to contribute to evo-devo aspects. Optic lobe development occurs by neuroepithelial folding initiating from a differentiation center in the larval brain. From this center, the medula, lamina and lobula arise at the same time in drones and workers. Two steps mark the differentiation of the lamina (i) its origin from neuroblasts differentiating in the outer layer of the medula, this coinciding with the first peak of roughest expression during the feeding stage of the fifth larval instar, and (ii) 24 hours later, the appearance of hexagonal ommatidia, coinciding with a second peak in roughest expression. Upon including further candidate genes related to insect eye development [small optic lobe (sol), eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision (elav) and epidermal growth factor receptor (egfr)] we found distinct expression peaks for sol, eya, mnb and so, with timing and relative transcript levels differing between drones and workers. Whereas these four genes showed a relatively synchronous pattern of expression in drones in the fifth larval instar, this was not so in workers. Furthermore, in prepupae sol was higher expressed in workers than the other three genes, and also in comparison to drones. Both sexes showed a strikingly similar expression pattern for elav, except for some delay in drones. In contrast, egfr expression was found to occur earlier in drones. Through a global transcriptom analysis, done at a key step of larval development, several genes were reveled as diffetentially expressed, many of these regulating cell cycle steps. In conclusion, the relationship in the timing of morphological events with gene expression patterns revealed differences possibly related to mechanisms underlying development of the highly dimorphic compound eye in the honey bee.

O comportamento higiênico (CH) é uma característica muito utilizada para seleção em programas de melhoramento genético de abelhas Apis mellifera , em especial para o controle de doenças sem a necessidade de tratamentos químicos. Entretanto, o controle de qualquer comportamento é extremamente difícil sem que se conheçam os mecanismos que os determinam e quais os fatores ambientais que os influenciam. Os objetivos deste trabalho se constituíram em verificar se as abelhas forrageiras podem realizar o comportamento higiênico durante a noite, período no qual existe pouca ou nenhuma coleta de recursos e verificar o efeito das variáveis climáticas: temperatura, umidade relativa e em especial das precipitações pluviométricas no comportamento higiênico das abelhas africanizadas. Os experimentos foram realizados no Apiário Experimental do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão PretoUSP. Foram utilizadas seis colônias de abelhas africanizadas escolhidas aleatoriamente, colméias de observação e o sistema de monitoramento de uma Câmara Climática dotada de sensores de temperatura, umidade e registradores automáticos de atividades de vôo dotados de foto-células (Apidômetros) instalados no alvado das colônias. Próximo ao laboratório foi montada uma Estação Climatológica Modelo Vantage Pro-2 acoplada ao computador (com recepção wireless) para registro dos dados climáticos. Para o processamento estatístico dos dados dos experimentos utilizamos os testes One Way Repeated Measures (RM) ANOVA, RM ANOVA on Ranks, Paired t-test e o teste de Correlação de Spearman, levando-se em consideração a normalidade das amostras. Para avaliarmos a possível influência das abelhas forrageiras no CH realizamos três experimentos. No primeiro verificamos que as forrageiras realizam o CH na ausência de abelhas mais jovens. O segundo experimento foi realizado com quadros-testes de CH introduzidos nas colméias em horários distintos, sendo três repetições realizadas das 12h às 22h (6 horas durante o dia e 4 horas durante a noite) e das 24h às 10h (6 horas durante a noite e 4 horas durante o dia). As médias de células vazias foram respectivamente de 10,82% e 14,17%. Estes dados apresentaram diferença estatisticamente significante, sendo que o CH foi mais eficiente quando o quadro-teste permaneceu a maior parte do tempo (6 horas) na colméia durante a noite. As mesmas colônias foram utilizadas em mais três repetições realizadas das 18h às 4h (10 horas durante a noite) e das 6h às 16h (10 horas durante o dia). As médias de células vazias foram de 28,56% durante a noite e 23,90% durante o dia. Neste caso, embora não haja diferença estatística significante foi possível observar uma tendência do CH ser mais eficiente no período noturno. Contudo, como neste experimento não foi possível observar nenhuma abelha forrageira realizando o CH, um novo experimento foi realizado com uma colméia de observação para filmagens de abelhas de idade controlada e marcadas com etiquetas coloridas e numeradas. No entanto, nenhuma abelha observada forrageando anteriormente foi vista realizando o CH durante a noite. Constatamos que colônias constituídas por abelhas jovens apresentam melhor desempenho no CH do que colônias constituídas por abelhas de todas as idades. Quanto a influência das condições climáticas, realizamos testes de CH dois dias antes da chuva, durante a chuva e dois dias depois da chuva. Os testes de CH foram estatisticamente mais eficientes em dias chuvosos do que antes e depois da chuva quando realizados na primavera e no verão. Porém, durante o outono e o inverno os testes de CH não apresentaram nenhuma diferença estatísticamente significante. Mesmo não tendo sido observadas abelhas forrageiras realizando o CH não podemos descartar a possibilidade destas abelhas auxiliarem no CH em dias chuvosos e durante a noite quando a maior parte das campeiras estão no interior da colméia. Também podemos atribuir os resultados obtidos ao possível desvio de função de outras abelhas responsáveis pela recepção, evaporação e armazenamento de néctar e empacotamento de pólen, já que durante a noite e a chuva a coleta de recursos é extremamente reduzida ou não existe. A variável climática umidade relativa do ambiente comportou-se como um fator inversamente proporcional em relação ao CH, enquanto que a temperatura não apresentou nenhuma diferença estatísticamente significante em nenhum dos tratamentos. No entanto, como não foi possível obter dados de temperaturas mais extremas durante o período dos experimentos esta variável deve ser melhor pesquisada para se verificar o efeito dela no CH das abelhas africanizadas. / Hygienic behavior (HB) of honey bees (Apis mellifera ) is a useful and selectable characteristic for resistance to diseases. However, in order to efficiently evaluate and select for this behavior we need to understand the mechanisms involved and how environmental factors influence HB. We examined how time of the day, bee age and behavioral ontogeny, and climatic variables, including temperature, relative humidity and rainfall affect the HB of Africanized bees. We used six colonies of Africanized bees, observation hives and a hive temperature control chamber (colonies had free access to the outside), with temperature and relative humidity sensors and automatic flight activity recorders at the hive entrances. A climatic station placed near the hives was used to record the weather data. The data was analyzed with one way repeated measures ANOVA, ANOVA on ranks, paired t-tests and Spearman\'s correlation tests. We found that foraging bees can perform HB when the younger bees are removed from the colonies. When the HB tests were run from 12h to 22h (six hours during the day and four hours during the night), 10.8% of the brood was removed; when it was run from 24h to 10h (six hours during the night and four hours during the day, 14.2% of the brood was removed. These percentages were significantly different (three repetitions). The same tests were run from 18h to 4h (10 hours during the night; 28.6% removal) and 6h to 16h (10 hours during the day; 23.9% removal). In this case, there was no significant difference, though there appeared to be a tendency towards greater efficiency at night, similar to what was seen in the experiments with six versus four hours of night-time activity. We hypothesized that unoccupied forager bees may contribute at night; however, when we filmed the behavior of marked bees, those that were seen to make foraging trips did not perform HB at night. We also found that colonies formed only by young bees had more efficient HB than colonies formed by bees of all ages. To determine the influence of climatic conditions, we tested HB two days before rainy days, during rainy days and two days after rainy days; HB was significantly more efficient on rainy days than before and after during spring and summer (when most rain falls). However, during autumn and winter (normally dry seasons) there were no significant differences between days with and without rainfall. The variable relative humidity was inversely correlated with HB, while temperature was not significantly correlated with HB, though we did not test extreme temperatures.

Introdução: Hexamerinas são proteínas de estocagem sintetizadas pelo corpo gorduroso de larvas de insetos e secretadas na hemolinfa, onde se acumulam. A função canônica das hexamerinas consiste em servir de reserva de aminoácidos e energia para a reconstrução de tecidos e órgãos durante a metamorfose. Este trabalho teve como objetivo a busca por evidências de funções alternativas das hexamerinas durante o ciclo de vida de abelhas A. mellifera. Resultados: Os perfis temporais de expressão das quatro hexamerinas (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c e HEX 110), verificados por meio de SDS-PAGE e western blot, corroboram sua função canônica na metamorfose. Consistente com esta função, as quatro hexamerinas foram localizadas no citoplasma das células do corpo gorduroso utilizando-se anticorpos específicos e microscopia confocal. No entanto, funções adicionais puderam ser inferidas com base nos seguintes resultados: (1) Foci das quatro hexamerinas foram localizados nos núcleos de algumas células do corpo gorduroso em metamorfose, levando à hipótese de que têm função anti-apoptótica durante este período crítico do desenvolvimento; (2) Além disso, HEX 70a e HEX 110 foram localizadas no citoplasma e núcleo de células ovarianas e testiculares, indicando função no desenvolvimento e maturação das gônadas; (3) A co-localização de um análogo de timidina (EdU) e HEX 70a nos núcleos das células dos ovaríolos, sugeriu fortemente uma função na proliferação celular. O knockdown de HEX 70a in vivo por meio de injeção de anticorpo específico prejudicou o crescimento dos ovaríolos de rainhas, reforçando a hipótese de função na proliferação celular, (4) interferiu na esclerotização da cutícula de operárias, indicando função na formação do exoesqueleto e (5) provocou a antecipação da ecdise adulta, provavelmente em resposta à ausência (ou diminuição) dos aminoácidos derivados das hexamerinas. Foram investigados também aspectos da regulação dos genes de hexamerinas. A manipulação experimental da dieta alimentar e dos títulos do hormônio juvenil (HJ) interferiram claramente na expressão dos genes de hexamerinas. A potencial ação reguladora do HJ foi reforçada pelos resultados de análises por bioinformática da região 5 UTR de cada gene de hexamerina (Martins et al., 2010) que revelaram potencial motivo de ligação à proteína Ultraspiracle (Usp), um membro do complexo receptor do HJ no DNA. Procedimentos para expressar as hexamerinas in vitro em sistema de bactérias e purificá-las estão em progresso visando a caracterização da estrutura e de interações entre as subunidades. Conclusão: Estes resultados ressaltam que as hexamerinas têm outras funções no ciclo de vida de A. mellifera, além da função já bem estabelecida de reserva de aminoácidos para a metamorfose. / Background: Insect hexamerins are storage proteins synthesized by the larval fat body and secreted into the hemolymph, where they accumulate. The canonical function of hexamerins is to provide amino acids and energy for the reconstruction of tissues and organs during pupal-to-adult development. The aim of the current study was to search for evidence of alternative roles for the hexamerins in the life cycle of the honey bee, A. mellifera. Results: The canonical role of insect hexamerins received support from our data on the temporal expression profiles of the four honey bee hexamerin subunits (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c and HEX 110), as verified by SDS-PAGE and western blot using hemolymph and fat body samples. Consistent with the canonical function, the four hexamerins were localized in the cytoplasm of fat body cells, during metamorphosis, by using specific antibodies and confocal laser-scanning microscopy. However, additional functions could be inferred by the following findings: (1) The four hexamerins were also localized in the nuclei of some fat body cells, thus tentatively suggesting an anti-apoptotic role during metamorphosis; (2) Furthermore, HEX 70a and HEX 110 were localized in the cytoplasm and nucleus of ovarian and testicular cells, pointing to a role in gonad development and maturation. Co-labeling of the thymidine analog EdU and HEX 70a in the ovariole cell nuclei, strongly suggested a role in cell proliferation; HEX 70a depletion via injection of the specific antibody in queen pupae impaired ovariole growth, thus strengthening our hypothesis on a role in cell proliferation, (3) HEX 70a depletion also impaired cuticle sclerotization, indicating a function in exoskeleton formation, and (4) led to a precocious adult ecdysis, perhaps in response to the lack (or decrease) in hexamerin-derived amino acids. We also investigated aspects of the regulation of hexamerin genes. The experimental manipulation of diet consumption and juvenile hormone (JH) titer clearly interfered in the expression of hexamerin genes. Regulation by JH was also supported by a previous bioinformatics analysis of the 5 UTR region of each hexamerin gene (Martins et al., 2010), which revealed a potential binding site for Ultraspiracle (Usp), a member of the JH receptor complex in the DNA. Experiments are in progress for in vitro expression and purification of the four hexamerins aiming to further characterize their structures and interactions. Conclusion: Taken together, these results imply in novel roles for hexamerins in the life cycle of A. mellifera in addition to their well-established role as amino acids sources for metamorphosis.

O ciclo circadiano é um sistema adaptativo e vantajoso que permite a antecipação dos organismos e sincronização de suas atividades fisiológicas frente às variações ambientais que ocorrem ao longo do dia. Seu funcionamento molecular acontece pela geração dos ritmos circadianos, os quais surgem a partir da expressão cíclica dos genes do relógio em um feedback autoregulatório. Em insetos, os ritmos circadianos apresentam função importante em coordenar o timing do desenvolvimento e o comportamento. Nos últimos anos, estudos desvendaram que o relógio molecular de insetos sociais apresenta um funcionamento mais similar ao relógio de mamíferos do que com outros insetos como Drosophila melanogaster. Em especial, abelhas sociais têm sido ótimos modelos para investigar como os ritmos circadianos são modulados de acordo com as interações sociais entre os indivíduos, a plasticidade comportamental e a divisão social do trabalho entre as operárias. Operárias jovens (nutrizes) cuidam da cria no interior da colônia e geralmente apresentam uma atividade arrítimica ao longo de 24 horas, enquanto as abelhas mais velhas (forrageiras) são rítmicas e desenvolvem atividades complexas no ambiente externo. Nesse trabalho, nós caracterizamos os perfis de expressão dos genes do relógio period (per), cryptochrome mammalian-like (cry-m), clock (clk), cycle (cyc), timeout 2 (tim2), par domain protein 1 (pdp1), vrille (vri) e clockwork orange (cwo) durante todo o desenvolvimento de abelhas operárias de Apis mellifera. Verificamos que os genes do relógio são expressos antes mesmo da formação do sistema nervoso central no embrião e que seus transcritos podem ser herdados maternalmente. No desenvolvimento de larvas e pupas, revelamos que estes genes são diferencialmente expressos entre as fases investigadas e, com exceção dos genes cwo e tim2, todos respondem ao tratamento com o Hormônio Juvenil (HJ) na fase de pupa de olho branco. A resposta positiva dos genes clk, cyc e pdp1 frente ao tratamento hormonal pode estar relacionada com o envolvimento destes nas vias que respondem à sinalização do HJ, interagindo com os genes Kruppel (Kr-h1) e Methoprene-tolerant (MET). No desenvolvimento adulto, vimos que os genes per e cry-m são potenciais marcadores da plasticidade comportamental e divisão social do trabalho. Em um experimento usando single-cohort colony, estes genes apresentam níveis transcricionais que não oscilam em cabeças de operárias jovens (3 e 7 dias) ao longo de 24 horas, comparado aos níveis de expressão que oscilam de forma robusta em abelhas mais velhas (15 e 25 dias). Ainda, reconstruímos redes de interação proteína-proteína e miRNA-mRNA onde foram identificadas potenciais moléculas que atuam modulando os genes do relógio em nível póstranscricional e traducional. Dentre elas, validamos as interações entre os miRNA-34 e seus sítios de ligação que estão presentes nas 3`UTRS dos genes cyc e cwo, através do ensaio por luciferase, revelando que este miRNA é um regulador negativo da expressão desses genes. Pela primeira vez, realizamos uma análise ampla dos genes do relógio em um inseto social, além de identificar novas moléculas que podem atuar modulando os ritmos circadianos. Nosso trabalho demonstra a importâcia das abelhas sociais como modelos ideais para desvendar os mecanismos moleculares que regem os ritmos circadianos não só em abelhas, como também em outros organismos, inclusive mamíferos. / The circadian clock is an advantageous adaptive system that enables organisms to anticipate and syncronize their biological activities during the daily environmental changes. The circadian clock acts through the ontogeny of circadian rhythms, which are generated by the cyclic expression of the clock genes in an autregulatory feedback loop. In insects, the circadian rhythms have important roles in the coordination of the developmental timing and behavior, interacting with the endocrine system. In the last years, researchers revealed that the molecular clock of social insects is more similar to mammals than to insects. In particular, the social honeybee is an excellent model to investigate how the circadian rhythms are modulated accordingly to the social context, behavioral plasticity, and taskrelated activities. While young bees (nurses) work arrhythmically around the clock inside the colony in brood-care activities, old bees (foragers) need to be strongly rhythmic to develop complex tasks. In this work, we characterized the expression patterns of the clock genes period (per), cryptochrome mammalian-like (cry-m), clock (clk), cycle (cyc), timeout 2 (tim2), par domain protein 1 (pdp1), vrille (vri) e clockwork orange (cwo) in the entire development of Apis mellifera. Our results revealed that the clock genes are expressed before the formation of the central nervous system in embryos and that their transcripts might be inherited maternally. The clock genes are diferentially modulated during the larval and pupal development and, except for tim2 and cwo, all of them respond to the treatment with Juvenile Hormone (JH) in white-eyed pupae. The positive response to JH by clk, cyc and pdp1 might be related to the involvement of these genes on the pathways of the JH signaling, interacting with Kruppel (Kr-h1) and Methoprene-tolerant (MET) genes. In the adult development, the clock genes per and cry-m are potential molecular markers of the behavioral plasticity and division of labor in a single-cohort colony, once they did not exhibit transcriptional oscillations in heads of young bees (3 and 7 days-old) during 24h, compared to the robust transcriptional oscillation in old bees (15 and 25 days-old). Additionally, we reconstructed protein-protein and miRNA-mRNA interaction networks and identified putative molecules involved in the post-transcriptional and translational regulation of the clock genes. Among those molecules, we validated interactions between the miR-34 and its binding sites in the 3`UTR of cyc and cwo by luciferase assay, showing that this miRNA is a negative regulator of both clock genes. We showed for the first time a broad analysis of the circadian clock elements in a social insect, and also identified news molecules with potential to act as modulators of the circadian rhythms. This work expands the knowledge about the biological roles of the circadian clock in honeybees. Our work also contributes to highlight the importance of honeybees as an ideal model to uncover the molecular mechanisms that govern the circadian rhythms, not only in bees, but in other organisms, including mammals.

A relação entre nutrição e fenótipo é uma questão especialmente desafiadora em casos de polifenismo facultativo, como no caso das castas de insetos sociais, por exemplo, a abelha melífera Apis mellifera. Após estudos de vias de sensoriamento de nutrientes, modificações inesperadas nestas vias de sinalização revelaram a resposta à hipóxia como um possível mecanismo subjacente à regulação do tamanho corporal e crescimento de órgãos. Uma vez que essa resposta está intimamente ligada a condições metabólicas das células, o presente estudo foi concebido para investigar possíveis alterações no metabolismo mitocondrial e oxidativo no processo de diferenciação de castas em A. melífera na fase larval, com foco no corpo gorduroso, que é o centro metabólico dos insetos. Partindo da hipótese de que rainhas e operárias são criadas em células de cria abertas sob condições iguais de disponibilidade de oxigênio, nós investigamos o número e a distribuição mitocondrial, bem como as taxas de consumo de oxigênio em mitocondrias de células de corpo gorduroso durante estágios larvais críticos. Por meio de análises de imunofluorescência e microscopia eletrônica encontramos maior densidade de mitocôndrias no corpo gorduroso larval da rainha, dado corroborado pela quantificação de unidades funcionais mitocondriais por ensaio de citrato sintase. Medições de consumo de oxigênio por respirometria de alta resolução revelaram que as larvas de rainha têm capacidades máximas mais altas de produção de ATP, com menor demanda fisiológica, mas com mesma eficiência mitocondrial que operárias. A análise da expressão de fatores relacionados à mitogênese mostrou que os homólogos dos genes codificadores dos fatores de transcrição TFB1 e TFB2 e de um regulador nutricional, ERR, estão mais expressos em larvas de rainha. Apesar das diferenças encontradas na respiração mitocondrial entre as duas castas, as mesmas apresentaram níveis similares de produção de lactato e peróxido de hidrogênio, sem grandes alterações referentes à condições de estresse oxidativo e ao estado redox das célula. Encontramos altos níveis de expressão de genes codificadores das enzimas do sistema antioxidante MnSOD e catalase em células do corpo gorduroso larval de rainha, que garantem a redução de eventuais danos oxidativos. Estes resultados são fortes evidências de que a nutrição diferencial das larvas pelas operárias adultas, como estímulo externo da indução do desenvolvimento das castas, diferencialmente afeta a dinâmica e funcionalidade mitocondrial como elemento intrínseca da plasticidade fenotípica neste inseto social. / The connection between nutrition and phenotype is a particularly challenging issue in cases of facultative polyphenism, as for instance in the honeybee Apis mellifera. After studies on nutrient sensing pathways found unexpected modifications in these signaling pathways, a response to hypoxia was revealed as a possible mechanism underlying regulation of body size and organ growth. Since this response is closely linked to the metabolic conditions of the cells, the present study was designed to investigate the role of the mitochondrial and oxidative metabolism in the fat body of honeybee larvae, which is the metabolic center in insects, in the context of the caste differentiation process in A. mellifera. Based on the fact that honey bee larvae are reared in open brood cells, the queen and worker larvae should be exposed to equal oxygen diffusion conditions, and hence we investigated mitochondrial number and intracellular distribution, as well as rates of mitochondrial oxygen consumption in fat body cells during the larval stages critical for caste differentiation. By means of immunofluorescence and electron microscopy we found a higher density of mitochondria in the fat body of queen larvae. This result was corroborated by the quantification of mitochondrial functional units using a citrate synthase assay. Measurements of oxygen consumption obtained by high resolution respirometry revealed that queen larvae have higher maximum capacities of ATP production, with less physiological demand and higher mitochondrial efficiency than workers. Analysis of the expression of genes related to mitogenesis showed that Apis homologs of the transcription factors TFB1 and TFB2 and of the nutritional regulator, ERR are higher expressed in queen larvae. Despite differences in mitochondrial respiration, the two castes presented similar levels of lactate and hydrogen peroxide production, and without major chang in oxidative stress and cellular redox status. The high transcriptional levels of genes encoding enzymes of the antioxidant system, MnSOD and catalase observed in fat body cells of queen larvae guarantee that oxidative damage is reduced during larval development. These results are strong evidence that the differential nutrition of honey bee larvae by the adult worker, as the external stimulus for caste induction, differentially affects mitochondrial dynamics and functionality as an intrinsic element of phenotypic plasticity in this social insect.

Desde o início do processo de africanização das abelhas Apis mellifera nas Américas em 1957, as abelhas africanizadas têm sido alvo de muitos estudos, sendo a variabilidade populacional um destes focos. Neste trabalho, populações Neotropicais de Apis mellifera do Brasil e do Panamá foram avaliadas quanto a sua variabilidade morfológica por morfometria tradicional, morfometria geométrica e pelo software de identificação automática de abelhas ABIS (Automatic Bee Identification System). Foram ainda avaliadas quanto à origem do DNA mitocondrial encontrado atualmente nas populações, bem como mudanças temporais nos perfis morfométricos e de DNA mitocondrial nas populações de Ribeirão Preto e do Panamá. Os resultados mostram que as populações brasileiras amostradas apresentam um gradiente de variação de tamanho, sendo que as abelhas do sul são significantemente maiores que as do norte do país, assim como as abelhas do princípio do processo de africanização em Ribeirão Preto e no Panamá são maiores que as populações atuais. Essas diferenças de tamanho podem refletir diferentes graus de mistura das populações ancestrais e também fatores ecológicos e ambientais. Entretanto, nenhuma correlação significante foi encontrada entre as medidas de tamanho de asa e altitude da localidade amostrada, fato este que nos indica que em nossas amostras, a variável altitude não interferiu no tamanho das asas das abelhas. No que diz respeito à variabilidade do formato das nervuras das asas das abelhas africanizadas, esta se mostra pequena e, apesar de distinto do formato de Apis mellifera scutellata, o formato das nervuras das abelhas africanizadas é mais parecido com o destas abelhas do que das demais subespécies formadoras do híbrido. O DNA mitocondrial das populações brasileiras de abelhas africanizadas apresentou-se quase que totalmente como sendo de origem africana à exceção de três colônias que apresentaram DNA mitocondrial como sendo de origem de subespécies do leste europeu. Quando a morfometria geométrica e o ABIS foram testado no quesito identificação populacional, ambos mostraram um desempenho muito fraco em identificar as populações de abelhas africanizadas, provavelmente devido ao alto fluxo gênico entre os grupos. Entretanto, quando tratamos de grupos mais distantes, como subespécies e populações isoladas, como é o caso da população de abelhas italianas (A. m. ligustica) de Fernando de Noronha, os dois métodos morfométricos se mostraram muito eficientes, com as taxas de acerto girando entre 85% e 100% na identificação de colônias de diferentes subespécies e da população de Fernando de Noronha. A população de Fernando de Noronha apresentou ainda um perfil morfométrico completamente diferenciado de Apis mellifera ligustica, subespécie que foi introduzida na ilha em 1984, podendo estas diferenças serem resultado de inbreeding, adaptação ambiental ou mesmo efeito gargalo das matrizes introduzidas. Desta maneira, as novas metodologias morfométricas utilizadas neste trabalho, embora não sejam precisas ou as mais apropriadas para identificar o grau de africanização das populações de abelhas africanizadas, se mostram muito promissoras no estudo da identificação das subespécies de Apis mellifera e mesmo de outras espécies de abelhas. / Since the release of the African bee Apis mellifera scutellata in Brazil in 1957, Africanized honey bees have been widely studied, though there are still unresolved questions about population variability. We examined the temporal and spatial variability of Apis mellifera populations from Brazil and Panama, using mitochondrial DNA, traditional morphometrics, geometric morphometrics and an Automatic Bee Identification System (ABIS). The populations from Ribeirão Preto, Brazil and Panamá were examined for temporal changes in their morphometric profiles and in mitochondrial DNA patterns. Bees from south Brazil were found to be significantly larger than those from the north and northeast. Bees collected at the beginning of the Africanization process were also found to be bigger than those collected recently. These differences in size may reflect different degrees of admixture of the founder subspecies and also environmental and ecological factors. No significant correlation was observed between the size of the wings and the altitude where the bees were sampled. When the patterns of wing venation were compared among the Africanized populations, we found little variation; though Africanized bees were found to be distinct from (African) A. m. scutellata, this group was most similar to the African pattern. The mtDNA of the Africanized populations was found to be almost completely of African origin, except for three of 394 colonies, which had the east European pattern. This nearly complete displacement may have been caused by nest usurpation by Africanized bees or due to a competitive disadvantage of hybrids with European maternity. We did not get good discrimination or identifications of the populations with ABIS and geometric morphometrics, probably due to the high rates of gene flow among the groups. However, when tested in more distinct groups, for example, subspecies and isolated populations, such as the Italian bees on Fernando de Noronha island, these two methods were very efficient, with identification rates of around 85% and 100%, respectively. The population of Italian bees (A.m. ligustica) on Fernando de Noronha presented a morphometric profile very different from that of A. m. ligustica, the subspecies introduced to the island in 1984. These differences could be a result of inbreeding, environmental adaptations or bottleneck effects. The two new morphometric methodologies, though they did not provide good discrimination of the Africanized populations, are very promising for studies of Apis mellifera subspecies and for identification of other bee species.

A alimentação diferencial durante o desenvolvimento das abelhas Apis mellifera desencadeia respostas endógenas em vias de sinalização e sistema endócrino, que promovem o desenvolvimento de fenótipos alternativos nas castas femininas. Rainhas e operárias diferem em sua fisiologia, morfologia, longevidade, função na colônia, comportamento, e principalmente, na ativação do sistema reprodutivo. Em relação aos ovários, resultados prévios baseados em ensaios de microarranjos revelaram um conjunto de genes como diferencialmente expressos (DEGs) em larvas de rainhas e operárias. Esse trabalho teve como objetivo analisar os padrões de expressão desses DEGs em mais detalhe em ovários larvais de rainhas e operárias. Com esse objetivo, foram selecionados 18 DEGs para validação por RTqPCR. Estas análises foram realizadas em ovários dissecados de rainhas e operárias em quatro estágios larvais que representam fases críticas no desenvolvimento ovariano (L4, L5F1, L5F2 e L5F3). Dentre os 18 DEGs candidatos, 11 foram confirmados como de fato diferencialmente expressos. Entre esses, quatro genes que codificam enzimas: short chain dehydrogenase reductase (GB54419), 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), SCPEP1-like gene (GB11273) e glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902), exibiram um pico de expressão em L5F1 em ovários de operárias. Dentre os dois genes relacionados à estocagem ou transporte de proteínas, o gene apolipoprotein III (GB20117) encontrou-se mais expresso em operárias enquanto que hexamerin 70b (GB10869) se mostrou superexpresso em ovários de rainhas. Os genes relacionados à tradução de mRNA e vias de sinalização: elongation factor 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) e mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) estavam significativamente superexpressos em ovários de rainhas. O gene OCLP-1 (GB19297), que possui uma função hipotética como inibidor de cistina foi encontrado como superexpresso em ovários de operárias. A fim de avaliar a modulação desses genes por hormônio juvenil, foi realizado o tratamento in vivo de larvas de operárias com aplicação tópica do hormônio. Após seis horas de tratamento, os ovários foram dissecados e as amostras analisadas por RT-qPCR. Dos onze DEGs testados para resposta a HJ, seis se mostraram significativamente modulados pelo hormônio Dois genes, short chain dehydrogenase reductase e heat shock protein 90, que também respondem a ecdisona, são up-regulados por HJ, enquanto os genes OCLP-1, hexamerin 70b, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase e apolipoprotein III eram downregulados. A expressão diferencial desses genes que codificam enzimas, proteínas de transporte/estocagem e fatores de vias de sinalização, indica que estes genes são importantes no desenvolvimento casta-especifíco dos ovários, uma vez que sua expressão está fortemente modulada durante os estágios em que ocorre a morte celular programada em ovários de operárias. / Differential feeding during larval development of the honey bee (Apis mellifera) triggers endogenous responses in signaling pathways and the endocrine system which promote the development of alternative phenotypes in the female castes. Queens and workers differ in physiology, morphology, longevity, function in the colony, behavior, and, especially so, the activation of the reproductive system. Concerning the ovaries, previous results based on microarray assays revealed a set of differentially expressed genes (DEGs) in queen and worker larvae.This project now aimed to further analyze the expression patterns of DEGs in the ovaries of larval workers and queens. From the microarray assays we selected a set of 18 DEGs for validation by qPCR. These analyses were performed on ovaries dissected from queens and workers of four larval stages representing critical phases of ovary development (L4, L5F1, L5F2, L5F3). Among the 18 DEG candidates, 11 were confirmed as differentially expressed. Four genes that code for enzymes: a short chain dehydrogenase reductase (GB54419), a 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), an SCPEP1-like gene (GB11273) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902) exhibited an expression peak at L5F1 in worker ovaries. Among the two genes encoding storage or transport proteins, apolipoprotein III (GB20117) was more expressed in workers and hexamerin 70b (GB10869) was overexpressed in queen ovaries. Among the genes related to mRNA translation and signaling pathways: elongation fator 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) and a mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) were found significantly overexpressed in queen ovaries. The gene OCLP-1 (GB19297), which has a hypothetical function as an inhibitor cystine knot peptide, was found higher expressed in worker ovaries. So as to evaluate the modulation of these genes by juvenile hormone, an in vivo treatment of workers larvae was performed with cuticular application of the hormone. After six hours of treatment, the ovaries were dissected and the samples analyzed by RTqPCR. Of the eleven DEGs tested for response to JH, six were significantly modulated by the hormone. Two genes, short chain dehydrogenase reductase and heat shock protein 90, which also respond to ecdysone, were up-regulated by JH, while OCLP-1 hexamerin 70b, 15- hydroxyprostaglandin dehydrogenase and apolipoprotein III were down-regulated.The differential expression of these genes encoding enzymes, storage/transport and signaling pathway proteins indicates that they are important in caste-specific ovary development, as their expression is strongly modulated during stages when programmed cell death takes place.

Os insetos desenvolveram um sistema imune eficiente contra parasitas e patógenos, que compreende a resposta celular e a humoral. Os mecanismos celulares envolvem a fagocitose e a encapsulação pelos hemócitos, enquanto que as respostas humorais incluem a ativação da Profenoloxidase, e a síntese pelo corpo gorduroso dos peptídeos antimicrobianos, que são liberados na hemolinfa. Duas vias de sinalização intracelular, Toll e Imd, controlam a expressão dos genes codificadores dos peptídeos antimicrobianos. A análise do Genoma da abelha Apis mellifera permitiu a identificação dos genes dessas vias. No entanto, pouco se conhece do mecanismo de resposta imune nessas abelhas. Desta maneira, nos propusemos analisar a transcrição de genes efetores da resposta imune (abaecina, hymenoptaecina, defensina, transferrina, profenoloxidase), assim como os genes integrantes das vias de sinalização, tais como os genes de reconhecimento de microorganismos (PGRP, GNBP) e ainda, os de sinalização (cactus, relish, dorsal 1-B). Avaliamos também possíveis proteínas implicadas na resposta imune, como as proteínas de estocagem Vitelogenina, Hexamerina 70a, Lipoforina I/II e Lipoforina III. Finalmente, analisamos o efeito da nutrição e do envelhecimento sobre a imunidade em abelhas. Para análise da expressão dos genes das vias de sinalização, as abelhas foram infectadas com bactérias Serratia marcescens ou Micrococcus luteus por injeção ou via alimentação. A infecção com esses microorganismos provocou a transcrição de peptídeos antimicrobianos e de transferrina em altas quantidades após 3 e 12 horas de tratamento, além da alteração na quantidade de transcritos de outros genes. O papel dos genes profenoloxidase e dorsal na imunidade, descritos como codificadores de importantes proteínas em outros insetos, foi avaliado através da metodologia de silenciamento gênico por RNA de interferência. Observamos a diminuição da transcrição do gene alvo, mostrando a eficiência da metodologia. No entanto, a simples injeção de um RNA de fita dupla foi capaz de ativar o sistema imune de abelhas. Este efeito contribuiu para a dificuldade de atribuição do papel da Profenoloxidase na imunidade de abelhas. Contudo, os resultados de silenciamento de dorsal e suas isoformas, nos levaram a considerar que dorsal 1-A ou dorsal 2 participam da via de sinalização intracelular para produção de peptídeos antimicrobianos, principalmente de defensina. Em relação às proteínas de estocagem, tanto a quantidade de transcritos quanto de proteínas diminui após infecção com bactérias, indicando que estas proteínas estão envolvidas de alguma forma no processo de imunidade em abelhas. Além disso, consumo de alimentos ricos em proteína aumentou os níveis de transcritos das proteínas de estocagem, o que muito provavelmente favorece a manutenção da capacidade de resposta imune de abelhas. O efeito do envelhecimento no declínio da imunidade foi analisado em abelhas nutridoras (novas) e forrageiras (velhas) de uma colônia típica. Além disso, foram utilizadas abelhas de uma colônia single-cohort, que eram de uma mesma idade, mas algumas eram nutridoras, enquanto outras eram forrageiras. Todas as abelhas, independentemente da idade ou comportamento, foram capazes de ativar o sistema imune após infecção pela bactéria S. marcescens. No entanto, as abelhas com o comportamento de forrageira, independentemente da idade, sempre foram mais susceptíveis a infecções que as nutridoras. Este fato se deve, muito provavelmente, às diferenças fisiológicas entre essas abelhas, que proporciona às nutridoras maior competência à sobrevivência. / Insects have developed an efficient immune system against parasites and pathogens, which is comprised of both cellular and humoral responses. The cellular mechanisms involve phagocytosis and encapsulation by hemocytes, whereas the humoral responses include activation of prophenoloxidase and synthesis of antimicrobial peptides by the fat body, which are released into the hemolymph. Two signaling pathways, Toll and Imd, control the expression of genes encoding antimicrobial peptides. Genome-wide analyses of the honey bee, Apis mellifera, have identified predicted genes for these signaling pathways. However, immune response mechanisms in honey bees were not yet in depth studied. We analyzed the transcription of effector genes (abaecin, hymenoptaecin, defensin, transferin, prophenoloxidase), as well as other immune genes, such as pathogen recognition genes (PGRP, GNBP) and signaling genes (cactus, relish, dorsal 1- B). We also investigated the role of the storage proteins Vitellogenin, Hexamerin 70a, Lipophorin I/II and Lipophorin III in the honey bee immunity. Finally, we analyzed the effect of nutrition and aging on honey bee immunity. Gene expression of signaling pathway components was assessed in honey bees that had been infected with the bacteria Serratia marcescens or Micrococcus luteus through injection or oral challenge. Honey bees infected with these microorganisms had strong up-regulation of antimicrobial peptide genes and of transferin, and also other changes in transcript abundance after 3 and 12 hours of challenge. The roles of prophenoloxidase and dorsal in the immune response, described as genes encoding important proteins in other insects, were also investigated. In this case we used RNA interference (RNAi) to silence the expression of these genes. RNAi efficiently silenced the target genes. However, injection of doublestranded RNA in honey bees induced a reaction by the immune system. This made it difficult to determine the role of prophenoloxidase in honey bee immunity. Yet, silencing of dorsal and its isoforms led us to consider dorsal 1-A or dorsal 2 as members of the signaling pathways that produce antimicrobial peptides, especially defensin. The abundance of storage proteins transcripts and proteins was lower in infected bees than in controls, giving evidence that these proteins participate in the immune process in honey bees. Moreover, protein consumption caused up-regulation of genes encoding storage proteins, which may favor the maintenace of the immune response capacity. The effect of aging on decline in immunity was analyzed in (young) nurse bees and (old) foragers from normal free-flying colony. We also examined bees from a single-cohort colony, in which all individuals were at the same age; but some were nursing, while others were foraging. All the bees, independent of age or behavior, were able to activate the immune system after infection with S. marcescens. However, foragers, independent of age, were always more susceptible to infections than were nurse bees. This is probably due to physiological differences between bees, which confers to the nurses more competence to survivorship.

Le parasite microsporidien Nosema ceranae est un pathogène émergent de l’abeille européenne (Apis mellifera). Il provoque une maladie appelée nosémose qui peut induire de fortes mortalités dans les colonies. La présence de N. ceranae dans les ruches n’est pas toutefois pas systématiquement associée à des symptômes ou à une dépopulation, ce qui suggère une variabilité de sa virulence. Une hypothèse proposée pour expliquer cette variation repose sur l'existence potentielle de variants parasitaires de niveaux de virulence différents. Ce travail a eu pour objectif d’évaluer le polymorphisme de N. ceranae par une approche multilocus, dans le but de savoir s’il est possible de différencier des isolats parasitaires. La diversité nucléotidique de dix marqueurs génétiques a été évaluée dans des abeilles géographiquement éloignées. L’analyse du polymorphisme de ces gènes a révélé un fort contenu allélique au sein même d'un individu hôte mais une absence de divergence entre les populations parasitaires issues d'hôtes distincts. Ces données montrent que cette approche multilocus ne permet de pas de différencier des isolats de N. ceranae, mais que des populations parasitaires similaires infectent des abeilles géographiquement distantes. Ces données sont en accord avec l'hypothèse d'une colonisation récente d'A. mellifera par N. ceranae mais posent de nombreuses questions quand à l'origine de la diversité parasitaire au sein d'un seul individu. Le second volet de cette thèse a eu pour objectif de rechercher dans le génome de N. ceranae des gènes codant de potentiels facteurs de virulence puis de produire des protéines recombinantes et des anticorps dirigés contre ces facteurs. Ces anticorps devaient permettre de localiser ces protéines d'intérêt au niveau subcellulaire dans des tissus infectés. / The microsporidian parasite Nosema ceranae is an emergent pathogen of the Western honeybee (Apis mellifera). It is associated to a disease called nosemosis that can lead to high mortality of honybees in colonies. Its presence in hives has not been systematically linked to symptoms or depopulation, suggesting a variation in its virulence. Thus, the existence of several N. ceranae variants with different virulence levels has been proposed. In this work aimed to assess N. ceranae polymorphism through a multilocus approach to test whether is it possible to discriminate between parasite taxa. Thus the nucleotide diversity of ten marker genes has been measured in parasite populations isolated from single A. mellifera individuals in distant locations. While high nucleotide diversity and allele content have been observed for all genes in single individuals, the absence of isolate differentiation precluded any taxa discrimination. These data support the hypothesis of a recent host-jump to A. mellifera and suggest that similar populations of parasites infect honeybees in distant locations. However they question the origin of such polymorphism within one host. In the second part of this work genes encoding putative virulence factors have been searched within N. ceranae genome, in order to produce recombinant proteins and then specific antibodies. Such antibodies would allow the subcellular localization of those proteins in infected tissues.

<p>Dokazivanje virusnih infekcija pĉela od velikog je interesa za pravilnu procjenu odnosa izmeĊu domaćina i potencijalnog patogena. Do izrade ove doktorske teze, na teritoriji Bosne i Hercegovine nije bilo prouĉavanja koja bi dokaz virusnih infekcija pĉela dovela do mogućnosti kliniĉke procjene patolo&scaron;kog odnosa za eko-genotip prilagoĊene pĉelinje zajednice. Evolucijski adaptirani virusi medonosne pĉele Apis mellifera carnica, sa stanovi&scaron;ta veterinarske entomologije, veterinarske virusologije i infektivnih bolesti, te saznanja veterinarskog servisa uop&scaron;te, nisu bili dovoljno prepoznati. Pojava i dostupnost molekularnih dijagnostiĉkih metoda omogućile su senzitivno i specifiĉno dokazivanje dijela genoma virusa koji inficiraju pĉelinje zajednice. Iz ekstrahovanih uzoraka templata razliĉitih uzoraka homogenizata sluĉajno uzorkovanih pĉela, RNK, sa jednim parom prajmera za svaki virus, pojedinaĉno, redoslijedom: BQCV, DWV, SBV, ABPV, KBV, CBPV uraĊeni su amplifikacijski protokoli i dobijeni rezultati za klasiĉan, end point, RT-PCR. Ovom doktorskom disertacijom dobijeni su prvi rezultati koji se odnose na utvrĊivanje prisustva i ra&scaron;irenosti virusnih infekcija kod vrste Apis mellifera u pĉelinjacima Bosne i Hercegovine. Od oko dvadeset virusa koji inficiraju pĉele i pĉelinje zajednice, metodama primjenjive molekularne dijagnostike u ovoj doktorskoj tezi dokazivali smo prisustvo virusnih infekcija za &scaron;est najvi&scaron;e prouĉavanih virusa pĉela. Dobijeni rezultati dokazali su prisustvo pet od &scaron;est traţenih virusa sa razliĉitim kombinacijama koinfekcija te raznolikom prostornom distribucijom virusa. Poznavanje sloţenih mehanizama virusnih infekcija pĉelinjih zajednica neophodnost je koja sa novim saznanjima progla&scaron;ava neke od virusa emergentnim patogenima, koji bitno naru&scaron;avaju opstanak pĉelinje zajednice. U patolo&scaron;ko-sinergistiĉkom odnosu sa nametnikom pĉelinje zajednice Varroa destructor neki pĉelinji virusi uzroci su globalno registrovanih gubitaka. Dio istraţivanja u radu odnosio se na terensko prouĉavanje dinamike prisustva grinje Varroa destructor u pĉelinjim zajednicama. Za pravilno dono&scaron;enje suda o uzroku ugibanja pĉelinjih zajednica, pored postojećih zahtjeva kontrole patogena pĉela definisanih procedurama dijagnostiĉkog manuala i Koda OIE-a, bilo bi potrebno imati i rezultate kojim bi se dokazalo kvalitativno i kvantitativno prisustvo virusa kod vrste Apis mellifera. UvoĊenje i standardizacija molekularno-biolo&scaron;kih metoda u rutinskoj dijagnostici virusnih bolesti pĉela je opravdano. Samo je pitanje vremena kada će virusne infekcije pĉela biti predmet rutinske dijagnostike kojim se kontroli&scaron;ezdravstveni status pĉelinje zajednice.</p> / <p>Evidence of viral infection of bees is of great interest for the proper assessment of the relationship between host and pathogen potential. By making this doctoral thesis on the territory of Bosnia and Herzegovina, where before was no present study of evidence of viral infections, lead to ability on clinical evaluation of pathological relations for eco-genotype adapted colonies. Evolutionarily adapted viruses honeybee Apis mellifera, from the veterinary entomology, veterinary virology and infectious diseases, and knowledge of the veterinary services in general, have not been recognized enough. The appearance and availability of molecular diagnostic methods have allowed sensitive and specific detection part of the genome of the virus that infects the colonies. Templates were extracted from samples of different patterns, homogenisate, randomly sampled bees, RNA, with a pair of primers for each virus, respectively, in the order: BQCV, DWV, SBV, ABPV, KBV, CBPV amplification protocols were done and the results obtained by conventional, end point, RT -PCR. This doctoral dissertation obtained the first results concerning the determination of the presence and spread of viral infections in the species Apis mellifera in Bosnia and Herzegovina. From about twenty viruses that can infect bees and hives using diagnostic methods applicable in this doctoral thesis we demonstrate the presence of viral infections of six most studied viruses of bees. The obtained results showed the presence five of the six essential viruses in forms of co-infection with different combinations and varied virus spatial distribution. Awareness of the complex mechanisms of viral infections in colonies is that the new knowledge proclaimed a virus as &quot;emergent pathogen&quot; that significantly impairs the survival of honeybee colonies. The pathogenic synergistic relationship with the parasite Varroa destructor causes that bee viruses are globally listed as reasons for losses. Part of the research work was related to the field study of the dynamics of the presence of Varroa destructor mites in honey bee colonies. For a accurate judgment of the deaths of bee colonies, in addition to existing requirements bee pathogen control procedures defined by diagnostic Manuals and Code of the OIE, it would be necessary to have the results to prove the qualitative and quantitative presence of the virus in the species Apis mellifera. The introduction and standardization of molecular biological methods in routine diagnosis of viral diseases of bees is justified. It is only a matter of time before the virus infections of bees will be subject to routine diagnostics which controls the health of bee colonies</p>