Thesis (Ph. D.)--Cornell University, May, 2009. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 128-147).

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-02-09T15:57:35Z No. of bitstreams: 1 PGCA16MA198.pdf: 1520008 bytes, checksum: fd1d41fa0d4c2a913a8dc6becde2a619 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-09T15:57:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA16MA198.pdf: 1520008 bytes, checksum: fd1d41fa0d4c2a913a8dc6becde2a619 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Capes / Neotropical deer are poorly studied species, particularly those belonging to the genus Mazama because of the access difficulty to these animals. The conservation status of Mazama nana is not well known and their main threats are poaching, habitat destruction and exposure to domestic animal diseases. Among the important diseases in cervids, haemorrhagic syndromes are very common and lead to a high rate of morbidity and mortality. Diseases leading to signs of widespread bleeding are known as haemorrhagic diseases and in deer, there are three causative viral agents currently recognized: an adenovirus (Adenoviral haemorrhagic disease virus) and two orbiviruses (Bluetongue disease virus, BTV, and Epizootic haemorrhagic disease virus, EHDV). The Bela Vista Biological Refuge of Itaipu Binacional has been successfully reproducing the species Mazama nana, popularly known as the brazilian dwarf brocket deer, since 1990. While the death of animals with compatible signs with bleeding disorders has been occurring ever since, the etiological agent has not yet been identified. Thus, this project aimed to identify the viral agent that has been causing haemorrhagic disease in the herd of Brazilian dwarf brocket deer from the Bela Vista Biological Refuge. Therefore, we evaluated autopsy samples, including liver, heart, lymph nodes and esophagus as well blood from 32 live animals in the search for viral genetic material, using namely the RT-PCR test for BTV, semi-nested RT-PCR for EHDV and the conventional PCR for adenovirus. In addition, we applied the Agar Gel Immunodiffusion technique (AGID) for detecting antibodies against BTV. Four samples, belonging from animals that died with haemorrhagic disease signs, were positive for RT-PCR test against BTV, and from this material, it was possible to isolate and serotype the virus. At the end of the study, we identified three serotypes thus far unknown in Brazil, the 14 BTV3, BTV14 and BTV18 plus a serotype not yet identified. The prevalence of seropositive animals to BTV was 3.12%. All semi-nested RT-PCR tests for EHDV and conventional PCR for AHDV had negative results. Therefore, we concluded that the BTV is the causative agent of the haemorrhagic disease of the brazilian dwarf brocket deers from the Bela Vista Biological Refuge and at least three serotypes are involved in the epidemiology of the disease / Os cervídeos neotropicais são pouco estudados, particularmente as espécies pertencentes ao gênero Mazama, em razão da dificuldade de acesso aos animais silvestres e suas amostras. O status de conservação da espécie Mazama nana não está bem definido. As principais ameaças a esses animais são a caça ilegal, a destruição de seu habitat e a proximidade a animais domésticos, que podem introduzir doenças comuns em populações de ruminantes silvestres. Dentre as doenças importantes em cervídeos, as síndromes hemorrágicas são muito frequentes e levam a um alto índice de morbidade e mortalidade. As doenças que provocam sinais e quadro de hemorragia generalizada em cervídeos são conhecidas pelo nome genérico de doenças hemorrágicas, e são três os agentes virais reconhecidos atualmente: um adenovírus (vírus da doença hemorrágica por adenovírus) e dois orbivirus, (o vírus da língua azul BTV e o vírus da doença epizoótica hemorrágica EHDV). O Refúgio Biológico Bela Vista da Itaipu Binacional vem reproduzindo com sucesso a espécie Mazama nana desde 1990, conhecida popularmente como veado-bororó-do-sul, porém, fazendo uma revisão histórica, percebe-se que desde que a criação foi iniciada, ocorreram mortes de cervídeos com sinais compatíveis com as doenças hemorrágicas. Entretanto, o agente etiológico nunca foi identificado. O presente projeto teve por objetivo identificar o agente viral que tem causado a doença hemorrágica no plantel de veados-bororó-do-sul do Refúgio Biológico Bela Vista, situado no município de Foz do Iguaçu, Paraná. Foram avaliadas amostras obtidas por meio de 12 necropsia, incluindo fragmentos de fígado, coração, linfonodos e esôfago, além de amostras de sangue de 32 animais vivos para a pesquisa de material genético viral pelo teste de RT-PCR em tempo real para o vírus da língua azul e semi-nested RT-PCR para o vírus da doença epizoótica hemorrágica, além de PCR convencional para o adenovírus de cervídeos. A técnica de IDGA foi utilizada para a pesquisa de anticorpos contra o vírus da língua azul. Quatro amostras, provenientes de animais que vieram a óbito com sinais de doença hemorrágica, foram positivas para o teste de RTq-PCR contra língua azul (BTV), e a partir desse material foi possível isolar e sorotipificar o vírus. Ao final do estudo, foram identificados três sorotipos até então desconhecidos em território brasileiro, o BTV3, BTV14 e BTV18. A prevalência de animais soropositivos para BTV foi de 3,12%. Todos os testes de semi-nested RT-PCR para o vírus da doença epizoótica hemorrágica (EHDV) e de PCR convencional para adenovírus tiveram resultados negativos. Com este estudo foi possível determinar que o BTV é o agente causador da doença hemorrágica no plantel de veados-bororós-do-sul do Refúgio Biológico Bela Vista e que pelo menos três sorotipos estão envolvidos na epidemiologia da doença

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T15:09:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 274094.pdf: 2621155 bytes, checksum: ed1393da62ea71d2d47ccd38ff064440 (MD5) / Os vírus entéricos humanos são importantes causas de enfermidades veiculadas através da água. Atualmente, em termos de legislação brasileira, apenas a contagem do número de coliformes é utilizada para determinar a segurança microbiológica de águas tratadas e não tratadas. Os vírus presentes no meio ambiente são, na sua maioria, não adaptados ao cultivo in vitro, tornando-se necessário o desenvolvimento e implementação de métodos que possibilitem a adoção de medidas preventivas para controle de contaminação viral. Assim sendo, os objetivos do presente trabalho foram (I) padronizar e estabelecer metodologias de concentração, detecção, quantificação e viabilidade viral no ambiente aquático; (II) realizar a pesquisa de adenovírus humanos (HAdV), norovírus (NoV) genogrupos GI e GII, rotavírus humanos genogrupo A (RV-A) e vírus da hepatite A (HAV) em águas ambientais e ostras de cultivo durante o período de um ano e (III) avaliar por ensaio de placa de lise a sobrevivência de HAdV infecciosos sorotipos 2 e 41 em águas de superfície e subterrâneas. No estudo de padronização dos métodos foram utilizados como modelos os HAdV e HAV inoculados em águas: destilada, de esgoto tratado, do mar e da lagoa. A melhor eficiência de recuperação viral (100%) foi obtida quando as matrizes de água destilada e de esgoto tratado foram utilizadas. A menor eficiência (10%) foi encontrada para a água do mar. No estudo de campo, águas foram coletadas de 8 locais de Florianópolis, Santa Catarina e ostras (Crassostrea gigas) de duas fazendas de cultivo (norte e sul da Ilha) foram também avaliadas no mesmo período. Os resultados de detecção de genomas virais foram HAdV: 75% (esgoto tratado); 64,2% (águas ambientais); 87,5% (ostras); RV-A: 41,6% (esgoto tratado); 19% (águas ambientais); 8,3% (ostras); HAV: 25% (esgoto tratado); 8,3% (águas ambientais); ausência nas ostras; NoV: 50% (esgoto tratado); 19% (águas ambientais); ausência nas ostras. No estudo de viabilidade viral por PCR integrado a cultura celular (ICC-PCR), confirmou-se positividade de HAdV em: 66,6% (esgoto tratado); 83,8% (águas ambientais); de RV-A: ausência em esgoto tratado e 12,5% (águas ambientais); de HAV: 66,6% (esgoto tratado) e ausência nas águas ambientais. Por PCR quantitativo o número de genomas (gc) de NoV nas águas foram médias de 1,8 x 102 (GI) e 1,0 x 103 gc/L (GII) em esgoto tratado e de 1,1 x 102 (GI) e 8,1 x 103 gc/L (GII) nas águas ambientais. Para HAdV obteve-se médias de: 9,8 x 104 (esgoto tratado); 9,8 x 106 gc/L (águas ambientais) e de 9,1 x 104 (ostras sul da ilha) e 1,5 x 105 gc/g (ostras norte da ilha). Os resultados obtidos indicam uma maior prevalência de HAdV no ambiente aquático, seguido de NoV, RV-A e HAV. No estudo de decaimento de infectividade de HAdV em amostras de água houve uma significativa inativação viral somente ao final das 23 semanas a 19°C para os dois sorotipos de adenovírus testados. Estes resultados demonstram a longa taxa de sobrevivência destes vírus em águas ambientais. / Enteric viruses are important cause of gastroenteritis outbreaks transmitted through contaminated water sources. Nowadays, the Brazilian legislation only requires the coliforms counting to determine the microbiologic safety in treated and non treated water. Most viruses present in the aquatic environment are not adaptable to in vitro cultures, becoming necessary to develop and implement methods that could be used in the monitoring and prevention of viral contamination. Therefore, the objectives of this thesis were (I) to standardize and establish methodologies of concentration, detection, quantification and viral viability in the aquatic environment; (II) to access the contamination of human adenovirus (HAdV), norovirus (NoV) genogrups GI e GII, human rotavirus genogrup A (RV-A) and Hepatitis Virus A (HAV) in environmental waters and oysters during one year; (III) to study the survival of infectious HAdV type 2 and 41 in surface and ground waters measured by plaque assay. In the standardization study, HAdV and HAV were used as models and were inoculated in distilled water, treated wastewater, seawater and lagoon water, showing better virus recovery (100%) in distilled water and treated wastewater, and lower recovery (10%) in seawater. In the field study, water samples were collected from 8 sites in Florianopolis, Santa Catarina and oyster samples (Crassostrea gigas) from two oysters' farms (north and south of the Island) were also collected in the same period. The detection results of virus genomes were HAdV: 75% (treated wastewater); 64.2% (environmental waters); 87.5% (oysters); RV-A: 41.6% (treated wastewater); 19% (environmental waters); 8.3% (oysters); HAV: 25% (treated wastewater); 8.3% (environmental waters); absence in oysters; NoV: 50% (treated wastewater); 19% (environmental waters); absence in oysters. In the viability study by integrated cell culture PCR (ICC-PCR), the results confirmed viable HAdV: 66.6% (treated wastewater); 83.3% (environmental waters); RV-A: absence in treated wastewater and 12.5% (environmental waters); HAV: 66.6% (treated wastewater) and absence in environmental waters. By quantitative PCR assays the number of genomes (g.c.) for NoV in waters were averages of 1.8 x 102 (GI) and 1.0 x 103 gc/L (GII) in treated wastewater and 1.1 x 102 (GI) and 8.1 x 103 gc/L (GII) in environmental waters. For HAdV the averages were: 9.8 x 104 (treated wastewater); 9.8 x 106 gc/L (environmental waters) and 9.1 x 104 (oyster farm South) e 1.5 x 105 gc/g (oyster farm North). The surveillance results have shown a higher prevalence of HAdV in the aquatic environment, followed by NoV, RV-A and HAV. In the study of HAdV infectivity decay in water under different temperatures, results showed a significant inactivation only after 23 weeks at 19°C for both HAdV tested. These results have shown a long-term survival of adenoviruses in environmental waters.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T08:15:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 286371.pdf: 1947104 bytes, checksum: 68df212a986afad58f62e633e601bcc8 (MD5) / Patógenos virais humanos têm sido associados a muitos episódios de gastrenterites, bem como a doenças relacionadas ao consumo de moluscos contaminados. O risco pode ser reduzido por um tratamento destes moluscos visando sua auto-limpeza previamente a sua comercialização. A depuração de moluscos reduz os níveis de microrganismos presentes na carne, diminuindo a chance de uma potencial infecção associada ao seu consumo in natura. Em um sistema de depuração, a água do mar pode ser recirculada pelo menos por 24 horas e, durante este ciclo, a água é tratada química ou fisicamente para eliminar a contaminação por microrganismos. Neste trabalho, um sistema fechado de depuração de moluscos foi testado para eliminar os patógenos virais em ostras. Além disso, a capacidade do cloro livre em inativar esses vírus, bem como a estabilidade viral em água do mar, com e sem radiação U.V. foram investigadas. Para os ensaios de depuração, ostras (Crassostrea gigas) foram artificialmente contaminadas em aquários, contendo água do mar semeada com Vírus da Hepatite A (HAV) e Adenovírus Humano (HAdV5). Em seguida, as ostras foram colocadas no tanque de depuração, e foram analisadas após 48h, 72h e 96h. Em cada amostragem, o trato gastrointestinal das ostras foi homogeneizado e processado visando a eluição das partículas virais. Para os estudos de desinfecção pelo uso do cloro, água do mar natural e artificial foram semeadas com Norovírus Murino 1 (MNV-1), HAdV2 e Poliomavírus JC (JCPyV) e tratadas com uma concentração inicial de cloro livre de 2,5 mg/l, por 60min. Para os ensaios de estabilidade viral em água do mar e desinfecção viral por luz U.V., 300L de água do mar foram semeadas com o HAV, MNV-1 e HAdV2 e tratados com U.V. (36W), em um mini-tanque de depuração, com recirculação por 120h. Um litro de água do mar foi coletado a cada 24h em até 120h e as amostras de água foram tratadas pelo método de floculação com leite acidificado para adsorção e concentração das partículas virais. O monitoramento viral nos tecidos das ostras e água do mar foi avaliado por métodos moleculares (PCR e q(RT)-PCR), e por métodos de cultura celular associados a métodos moleculares ou imunológicos (ICC-PCR, RT-PCR ICC, IFA, Citometria de Fluxo e Ensaio de Placas de Lise). A detecção por PCR, em amostras de ostras, mostrou que o genoma de HAdV5 foi detectado em todos os períodos de amostragem, e o genoma do HAV foi detectado até 72 h. Os testes envolvendo viabilidade viral por ICC-PCR, demonstraram uma inativação viral progressiva, nas ostras, ao longo das 96h de recirculação de água do mar tratada com luz U.V. Nos ensaios de desinfecção por cloro, após 30 minutos de tratamento de água do mar, foi observada uma redução de ~2log10 e ~3log10 para MNV-1 e HAdV2, respectivamente, com base nos resultados q(RT) PCR. Quando a infecciosidade viral foi analisada, uma redução de mais de 4log10 foi observada para MNV-1, enquanto HAdV2 apresentou uma redução de ~ 2.3log10, mantendo-se infeccioso após 60 minutos. JCPyV apresentou em média uma redução de 1,6 log10, quando avaliado por qPCR. Não houve diferenças na cinética de desinfecção viral observadas em água do mar natural e artificial. Para os ensaios de estabilidade viral em água do mar tratada ou não com luz U.V., com base nos resultados q(RT)-PCR, foram observadas cinéticas diferentes para cada vírus em 120 horas de contato. Reduções de ~ 5log10 e 3log10, em 120h, para HAdV2 e HAV, respectivamente; para MNV-1, foi observada uma redução de ~4,5 log10 em 72h sob tratamento com luz U.V. Apesar da detecção do genoma, HAdV2 foi capaz de permanecer infeccioso até 72h, de acordo com resultados de ICC-RT-PCR. Ensaios envolvendo estabilidade viral sem radiação U.V. demonstraram uma redução progressiva da carga viral ao longo das 120h de recirculação de água do mar para os três vírus (~ 2log10 para HAdV2; ~ 2,5 log10 para HAV e ~ 3log10 para MNV-1). Esta cinética diferente provavelmente está associada às espécies de cloro presentes, ao tempo de contato com a radiação U.V. e a características estruturais peculiares de cada um dos vírus. A diminuição natural da carga viral pode ser devido à existência de fatores ambientais, tais como força iônica e compostos encontrados naturalmente na água do mar. Este trabalho confirmou que HAdV é um patógeno viral particularmente resistente e exige mais tempo para inativação. Estes dados serão úteis para a otimização de desinfecção da água nos tanques de depuração de moluscos. / Viruses have been linked to nearly all episodes of gastroenteritis as well as outbreaks of illnesses related to consumption of contaminated shellfish. The risk may be reduced by appropriate treatment following harvesting as well as by depuration, which is a method that reduces the levels of microorganisms present in mollusk meat, decreasing the potential for infections associated with mollusk consumption in natura. In a depuration system, seawater may be recirculated for at least 24h, and during this cycle, the water must be chemically or physically treated to eliminate microbial contamination. In this work, a shellfish depuration closed system was tested to eliminate viral pathogens from oysters. Moreover, the chlorine capability to inactivate these viruses, as well as the viral stability and disinfection in seawater with and without U.V. irradiation were investigated. For depuration assays, oysters (Crassostrea gigas) were first artificially contaminated in aquariums containing seawater seeded with Hepatitis A virus (HAV) and Human Adenovirus (HAdV5). Then, the oysters were placed into the depuration tank, and were harvested after 48h, 72h and 96h. After each sampling, the gastrointestinal tracts were homogenized and the viral particles were eluted. To chorine disinfection assays, natural and artificial seawater were seeded with selected viruses (Murine Norovirus 1, MNV-1; HAdV2; JC Polyomavirus, JCPyV) and treated by adding initial free chlorine concentration of 2.5mg/l for up to 60min. For the stability assays, 300L of natural seawater were seeded with HAV, MNV-1 and HAdV2, and treated by 36W U.V. lamp, into the mini depuration tank, with recirculation, for up to 120h. One liter of viral seeded seawater was harvested every 24h and viral particles were concentrated by flocculation method using skimmed milk. The kinetics of viral decay in oysters and seawater was evaluated by molecular techniques (PCR and q(RT)-PCR), and by cell culture associated with molecular and immunological methods to access the viral infectivity (ICC-PCR, ICC RT-PCR, IFA, Flow Cytometry and Plaque Assay). The molecular detection by PCR for both viruses showed that the presence of HAdV5 genome was positive in all of the sampling periods, and the HAV genome was detected until 72 h. The tests involving viral viability by ICC-PCR, demonstrated a progressive viral inactivation along the 96h of seawater recirculation under U.V. light irradiation. After 30 minutes of treatment of natural seawater a ~2log10 and ~3log10 reduction where observed for MNV-1 and HAdV2, respectively, based on q(RT)PCR results. When viral infectivity was analyzed, a reduction of more than 4log10 was observed for infectious MNV-1, while HAdV2 presented ~2.3log10 reduction, remaining infective viruses present after 60 minutes. JCPyV presented a average reduction of 1,6 log10, analysed by qPCR. No differences in the disinfection kinetics have been observed between natural and artificial seawater. Based on qPCR results, the kinetics observed were different for each virus, reaching, at 120h of contact time, ~5log10 and ~3log10 reduction for HAdV2 and HAV, respectively; for MNV-1, was observed a ~4,5log10 reduction at 72h under U.V. treatment. Despite the genome detection, HAdV2 was able to remain infectious only up to 72h, according ICC-RT-PCR results. Assays involving viral stability without U.V. irradiation, demonstrated a progressive reduction of viral load along the 120h of seawater recirculation for three viruses (~2log10 for HAdV2; ~2,5log10 for HAV and ~3log10 for MNV). This different kinetics is probably associated to the chlorine species present, the contact time with the U.V. radiation and structural characteristic of each virus. The natural decreasing of viral load can be due to the existence of environmental factors, such as ionic strength and compounds naturally found in seawater. This work confirmed that HAdV is a particularly a resistant viral pathogen and requires longer periods for inactivation. These data will be subsequently useful to plan water disinfection in shellfish depuration tanks.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-31Bitstream added on 2014-06-13T19:15:43Z : No. of bitstreams: 1 kawanami_ae_me_jabo.pdf: 824530 bytes, checksum: e2cb2bd3bc907bc0688a009fdfc6fefd (MD5) / Os cervídeos têm sido acometidos por doenças hemorrágicas virais, tais como, doença epizoótica hemorrágica (DEH), língua azul (LA) e doença hemorrágica por adenovírus (DHA). Como as lesões macroscópicas, entre elas, enterite hemorrágica, edema pulmonar, petéquias e sufusões em diversos órgãos, são observadas nas três doenças, há necessidade de técnicas acuradas para realizar o diagnóstico definitivo. A partir do material de arquivo (blocos de parafina) existente no Departamento de Patologia Veterinária da FCAV – Unesp, 42 cervídeos brasileiros, tanto de vida livre como de cativeiro, foram selecionados, por apresentarem sinais clínicos e/ou lesões macroscópicas sugestivas de doenças virais hemorrágicas. Das amostras analisadas, utilizando técnica de imunoistoquímica, todas apresentaram resultado negativo para adenovírus. Utilizando técnica de RT-PCR em tempo real para vírus da doença epizoótica hemorrágica, os resultados foram também negativos. A mesma técnica aplicada para vírus da língua azul revelou sete animais positivos (16,66%) confirmados com eletroforese em gel de agarose 4% e sequenciamento. Todos os casos positivos foram de animais provenientes de cativeiro, sendo três fêmeas (duas jovens, uma adulta) e quatro machos jovens. As principais alterações macroscópicas observadas nesses animais foram conteúdo intestinal hemorrágico, mucosas avermelhadas do trato gastrointestinal, úlceras em língua e petéquias em diversos órgãos. Na histologia observou-se principalmente infiltrado inflamatório, hemorragia e congestão em diversos órgãos. Os vírus da DHA e DEH não estão envolvidos nos óbitos dos cervídeos estudados. A relevância deste trabalho está no fato de ser a primeira descrição de material genético do vírus da LA em cervídeos brasileiros / Cervids have been affected by viral hemorrhagic diseases, such as Epizootic hemorrhagic disease (EHD), Bluetongue (BT), and Adenoviral hemorrhagic disease (AHD). Once that gross lesions, among them, hemorrhagic enteritis, pulmonary edema, petechiae and suffusions in several organs, are similar, it is necessary to use accurate techniques to the definitive diagnosis. From the archival material (paraffin blocks) available in the Department of Veterinary Pathology of FCAV – Unesp, 42 Brazilian deer, both free living and captive, were selected because they had lesions suggestive of hemorrhagic viral disease. The samples analyzed, using Immunohistochemistry, were all negative for adenovirus. Using real time RT-PCR for EHD, the results were also negative. The same technique applied to BT virus revealed seven positive animals (16,66%) confirmed after agarose 4% gel electrophoresis and gene sequencing. The main macroscopic changes observed in these animals were hemorrhagic intestinal contents, reddish mucous membrane of the gastrointestinal tract, ulcers on tongue and petechiae in various organs. Mostly histological changes observed were inflammatory infiltrate, hemorrhage, and congestion in various organs. All positive cases were from captive animals, three females (two young and one adult), and four young males. The AHD and EHD virus are not involved in the deaths of the deers studied in this research. The significance of this study is due to the fact that it was the first time the genome of BT virus was identified in Brazilian cervids

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndrewDMoura_DISSERT.pdf: 2171367 bytes, checksum: f41e94b4a019b04f63123834b3af9d4c (MD5) Previous issue date: 2013-04-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Toxoplasmosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by the protozoan Toxoplasma gondii, triggering dangerous complications in immunocompromised patients and pregnant women, as well as having great economic impact for the livestock. So far the control of toxoplasmosis is made primarily by chemotherapy. However, most drugs used routinely have some limitations. In order to control this disease, several research groups, including ours, has been working to develop a medical-veterinary vaccine based on parasite antigens, vectors and protocols of immunization. In this study were implemented and standardized methodologies for amplification and cloning of recombinant immunogens in the system for the development of a prototype vaccine, based on the surface antigens of T. gondii and recombinant adenovirus encoding these antigens. Genes encoding BAG1, GRA2 and SAG1 proteins were amplified. We established a strategy for cloning SAG1, SAG2, SAG3 and TgAMA1- genes in recombinant system. The genes encoding SAG1 and SAG2 were cloned and their sequences showed high similarity with sequences from GenBank. The virtual translation of these proteins showed polymorphisms in the amino acid sequence, which can be correlated with levels of antigenicity. Simultaneously, the adenovirus encoding the SAGs (HAdSAGs) were expanded, purificated and characterizated. Immunization of C57bl/6 mice, using viral supernatant was not enought to elicit immune responses at high levels, being required HAdSAGs titration for future immunizations. Therefore, this study allowed the cloning of the two genes important for the development of a prototype vaccine. Besides, implementations methodologies that permit advancements in the development of a vaccine against toxoplasmosis using adenovirus to express proteins of the parasite / A toxoplasmose ? uma zoonose de distribui??o mundial causada pelo protozo?rio Toxoplasma gondi podendo desencadear graves complica??es em pacientes imunossuprimidos e gestantes; bem como acarretando grande impacto econ?mico para a pecu?ria. At? o momento o controle da toxoplasmose ? feito basicamente pela quimioterapia. Contudo, a maioria das drogas utilizadas na rotina apresentam alguma limita??o. No intuito do controle dessa parasitose, diversos grupos de pesquisas, inclusive o nosso, v?m trabalhando para o desenvolvimento de uma vacina m?dico-veterin?ria com base em ant?genos do parasito, vetores e protocolos para imuniza??o. Nesse estudo foram implantadas e padronizadas metodologias para amplifica??o e clonagem de imun?genos em sistema recombinante visando o desenvolvimento de um prot?tipo vacinal, tendo como base os ant?genos de superf?cie de T. gondii e adenov?rus recombinante codificando esses ant?genos. Os genes que codificam as prote?nas BAG1, GRA2 e SAG1 foram amplificados. Foi estabelecida uma estrat?gia de clonagem dos genes SAG1, SAG2, SAG3 e TgAMA-1 em sistema recombinante. Os genes que codificam SAG1 e SAG2 foram clonados e suas sequ?ncias apresentaram grande similaridade com sequ?ncias depositadas no GenBank. A tradu??o virtual dessas prote?nas apresentou polimorfismos no n?vel de amino?cidos, que poder?o ser correlacionadas com n?veis de antigenicidade. Paralelamente, foi realizada a expans?o, purifica??o e caracteriza??o dos adenov?rus que codificam as SAGs (HAdSAGs). A imuniza??o de camundongos C57BL/6, utilizando o sobrenadante viral, n?o foi suficiente para desencadear respostas imunol?gicas em altos n?veis, sendo necess?ria a titula??o dos HAdSAGs para futuras imuniza??es. Portanto, esse estudo permitiu a clonagem de dois genes importantes para o desenvolvimento de um prot?tipo vacinal, al?m de implementa??es de metodologias que permitir?o avan?os para o desenvolvimento de uma vacina contra a toxoplasmose usando adenov?rus que expressem prote?nas do parasito

Orientador: Maria Silvia Viccari Gatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T22:09:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_SandraSoares_M.pdf: 1140484 bytes, checksum: de8846c9246eef9258a4b0d3953a88b6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O tratamento de esgoto sanitário em lagoa de decantação anaeróbia e disposição controlada de água residuária no solo é uma alternativa de baixo custo para o reuso de águas residuárias na agricultura. Nele, o esgoto sanitário é depositado em uma lagoa de decantação anaeróbia com retenção hidráulica de sete dias, após o que a água residuária é conduzida para rampa de solo franco argilo-arenoso, com cobertura vegetal de gramínia Cynodon sp, para disposição por escoamento superficial, seguindo-se sua infiltração e percolação. O objetivo desse trabalho foi verificar a eficiência desse sistema na eliminação e/ou inativação de adenovírus humanos (HAdV) e rotavírus (RV). Amostras de 1L de água residuária foram obtidas em quatro coletas, em intervalos de sete dias, na entrada do esgoto bruto (EB), no ponto de aplicação na rampa (0m) e nos pontos da sua superfície após 10, 20, 30, 35m e 40m. Sob a rampa, a 1m de profundidade e distantes 30m (30-1) e 35m (35 -1), dois pontos foram amostrados. Antes do ponto 0m, pontos de testemunha a 1m de profundidade e distantes 2m (T1) e 0,5m (T2) da rampa, e um ponto do lençol freático (LF) a 3m de profundidade, também foram coletados.As água residuárias foram concentradas de 1.000 a 5.000 vezes por filtração e eluição em membrana eletropositiva e ultracentrifugação. Nos eluatos obtidos, após extração de DNA, a presença de HAdV foi pesquisada por PCR e nested-PCR. Para a detecção de RV usou-se RT-PCR e duplo-semi- nested-PCR. Eluatos HAdV positivos foram inoculados em células HEp-2 e após até cinco passagens a presença de HAdV foi confirmada por PCR.. HAdV foram detectados em 29 das 35 amostras analisadas, sendo positivos todos os pontos de EB e da superfície da rampa. Em profundidade, sob a rampa, quatro amostras foram positivas, além de outras duas em T2 e uma em LF, o que demonstra a percolação desses vírus no solo com contaminação do LF. Quando testadas em células HEp-2, nas amostras do EB e dos pontos 0, 30, 35 e 40m a presença de vírions foi determinada, enquanto nos pontos 30-1m e LF os HAdV não foram infectivos. Esses resultados permitem concluir que o sistema não foi eficiente para remover e/ou inativar HAdV. Por outro lado, pode-se afirmar que os HAdV são indicadores virais adequados para esse sistema, desde que mantida a metodologia aqui empregada. Uma amostra de EB foi positiva para RV (genotipos G1 e G2), resultado esse que não permite qualquer conclusão. Para o reuso da água residuária advinda desse sistema impõe-se a associação de processos de desinfecção para a eliminação de HAdV / Abstract: Urban sewage treatment by an anaerobic process with overland flow system is a cheap alternative to reuse domestic effluents in agriculture. In this procedure, wastewater remains in an anaerobic pond for seven days, and then it is spilled from the top of a 40-meter extension slope covered with Tifton 85 (Cynodon sp) grass in order to surface flow and percolate until it reaches groundwater. The objective of this work is to determine if this procedure could be effective in removing and/or inactivating human adenoviruses (HAdV) and rotaviruses (RV) in a test unit in Limeira - SP, Brazil. Samples were collected every seven days from different spots in four sampling events totalizing one liter of wastewater. Sampling points were chosen at the raw sewage (EB), on the surface of the slope at 0, 10, 20, 30, 35 and 40 meters, and down one meter from the surface of the slope at the 30- and 35-meter points (30-1 and 35-1). Other points upslope were used at a distance of 2 meters (T1) and 0.5 meters (T2), beyond a 3-meter depth and 1-meter distant spot (LF). All samples were concentrated from a 1000 to 5000 times by filtration through electropositive microporous membrane followed by ultracentrifugation. HAdV detection was performed by both PCR and nested PCR. RV detection was accomplished by both RT-PCR and duplex semi-nested PCR. The positive samples for HAdV were inoculated in HEp-2 cells, and confirmation of the virions was performed by PCR. HAdV were detected in 29 of the 35 samples tested including in all samples both from the EB and from the surface of the slope. HAdV tested positive in the two T2, in one LF, and in the four samples underneath the slope. In HEp-2 cells HAdV virions were detected at the EB and at 0, 30, 35, and 40 meters on the surface of the slope. Spots 30-1 and LF were tested in HEp-2 cells, resulting negative to the presence of infective viral particles, although they tested HAdV positive. These results attest to the inefficiency of the proposed system of sewage treatment in removing and/or inactivating HAdV; however, maintaining the methodology used in this research, HAdV proves to be the appropriate viral indicator in this system. In relation to RV, no conclusions can be extracted since just one sample from the EB was RV-positive (G1 and G2 mixture). Finally, before reuse in agriculture, the effluents from the anaerobic pond should be disinfected to eliminate these viruses / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-07-03T12:16:28Z No. of bitstreams: 2 Tese - Ana Carla Peixoto Guissoni - 2015.pdf: 3062686 bytes, checksum: d470d2e61cd6d74d52b862bd1e76f0c9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-10T11:37:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Ana Carla Peixoto Guissoni - 2015.pdf: 3062686 bytes, checksum: d470d2e61cd6d74d52b862bd1e76f0c9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T11:37:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Ana Carla Peixoto Guissoni - 2015.pdf: 3062686 bytes, checksum: d470d2e61cd6d74d52b862bd1e76f0c9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-08-06 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Human adenovirus (HAdVs) are causative agents of different clinical syndromes such as gastroenteritis, respiratory diseases, eye diseases and cystitis. Adenovirus infection can modify the cellular homeostasis through the interaction with the host cell by inducing proteins of several metabolic pathways. The resulting knowledge of this virus-cell interaction may aid the elucidation of the pathogenic mechanisms caused by adenovirus and the host response against viral infection. To study this interaction, a methodology that has been widely used is proteomics, a tool used in this study, which aimed to identify induced proteins due to viral infection. In this context, we used cells A-549 infected with human adenovirus of type F, serotype 40 (HAdV-40). Infected cells and non-infected cells were used for the osmotic lysis, which were quantified by the Bradford method and then digested with trypsin. Peptides were separated on the LC system in two dimensions. The ionization of the peptides was performed by nano-eletronspray source and through analysis of ToF-MSE system aiming the protein identification. A sum of 336 proteins were identified, 206 of them induced and 130 suppressed by the infection with HAdV-40. The main pathways affected by viral infection were: energy, cellular organization, stress response and apoptosis. It was observed alteration of cell metabolism with increase of the glycolytic pathway, β-oxidation and respiratory chain. Also, the results suggest cytoskeleton reorganization and apoptosis induction. The data can to contribute knowledge about adenovirus pathogenesis considering the proteins related to distinct metabolic pathways induced by viral infection. / Adenovírus humano (HAdVs) são agentes causadores de diversas síndromes clínicas como gastroenterite, doenças respiratórias, oculares e cistite. A infecção por adenovírus pode levar a alterações na homeostase celular a partir da interação com a célula hospedeira pela indução de proteínas de diversas vias metabólicas. O conhecimento resultante desta interação vírus-célula pode auxiliar na elucidação da patogenia destes vírus e na resposta do hospedeiro contra a infecção viral. Para o estudo desta interação, uma metodologia que tem sido bastante utilizada é a proteômica, ferramenta esta usada no presente estudo, que tem como finalidade a identificação de proteínas induzidas a partir da infecção viral. Foram utilizadas células A-549 infectadas por adenovírus humano da espécie F, sorotipo 40 (HAdV-40). Para o procedimento, a partir de células infectadas e controles, procedeu-se à extração de proteínas por lise osmótica, as quais foram quantificadas pelo método de Bradford e a seguir digeridas com tripsina. Os peptídeos foram separados em sistema de cromatografia líquida em duas dimensões. A ionização dos peptídeos foi realizada em fonte nano-eletronspray e a análise destes através do sistema ToF-MSE, possibilitanto a identificação das proteínas. Foram identificadas 336 proteínas, sendo 206 induzidas pela infecção por HAdV-40 e 130 reprimidas. As principais vias afetadas pela infecção viral foram: energia, organização celular, resposta ao estresse e apoptose. Observou-se alteração do metabolismo da célula com o aumento da via glicolítica, β-oxidação e da cadeia respiratória. Além disso, os resultados sugerem reorganização do citoesqueleto e indução de apoptose. Esses dados podem contribuir para o conhecimento da patogenia dos adenovírus considerando as proteínas relacionadas com vias metabólicas distintas induzidas pela infecção viral.

Os vírus entéricos humanos são encontrados no esgoto e em subprodutos dos processos de tratamento. Recentemente vem sendo recomendados como indicadores de qualidade microbiológica em normas da legislação brasileira e também nas de outros países, mas ainda com parâmetros a definir. O objetivo do estudo é a avaliação e a comparação entre métodos clássicos e moleculares aplicados à detecção de vírus entéricos em amostras de água de reúso e de lodo, visando subsidiar a legislação brasileira. Ensaios de semeadura experimental de protótipos de rotavírus e de adenovírus foram realizados nas matrizes ambientais e os vírus detectados por métodos clássicos (cultivo celular e reação de imunoperoxidase) e moleculares (PCR/nested-PCR, RT-PCR e ICC-PCR), determinando-se os limites de detecção de cada método para cada matriz. A pesquisa de rotavírus e adenovírus presentes naturalmente em 25 amostras de água de reúso e em 25 de lodo possibilitou a comparação dos métodos propostos. O ICC-PCR mostrou ser o método mais factível a ser aplicado na área de saneamento. / Human enteric viruses are common contaminants of raw sewage and subproducts of sewage treatment processes. In recent years, those viruses were recommend as new microbiological indicators in different matrices in Brazilian legislation and others countries, although some questions should be elucidated. At present, the aim was to evaluate and compare the efficiencies of standard and molecular virological methods for detection of human enteric viruses in sludge and reclaimed water samples. Rotavirus and adenovirus were experimentally spiked in the proposed matrices and virus recovery and detection limits established for each method and matrice. Viruses naturally presented in 25 samples of sludge and 25 samples of reclaimed water were assayed by all methods and results evaluated and compared for statistical significance. From all methods evaluated, ICC-PCR showed to be the most suitable for virus surveillance in sludge and reclaimed water.

A glicoproteína gp120 do HIV apresenta domínios conservados, dentre os quais está o C4. Este domínio está envolvido no reconhecimento da molécula CD4 na superfície das células alvo, e anticorpos dirigidos contra ele neutralizam o vírus. Em trabalho anterior, este domínio foi introduzido dentro da região globular da proteína fibra do adenovírus. Como a fibra adenoviral é estimulante do sistema imune, decidimos testar a capacidade de indução de anticorpos anti-C4 por essa proteína modificada. Assim, foram construídos vetores plasmídicos e adenovirais portando o gene da região globular da fibra adenoviral contendo o domínio C4, que usados na imunização de camundongos induziram anticorpos capazes de reconhecer a proteína gp120. Também construímos um vetor baculoviral expressando essa proteína híbrida, que purificada por HPLC, foi utilizada para imunizar camundongos que também produziram anticorpos capazes de reconhecer a proteína gp120. Nossos dados sugerem que a região globular da fibra adenoviral é uma boa plataforma para a exposição de epítopos de imunização. / HIV glycoprotein gp120 has conserved domains, one of them being the C4 domain. This region is involved in the recognition of the CD4 marker in target cells and antibodies that recognize this domain can block HIV infection. Previously, the C4 domain was introduced in the adenovirus fiber knob. As the adenovirus fiber stimulates de immune system, we decided to test the production of anti-C4 antibodies by this hybrid protein. We constructed plasmid and adenovirus vectors carrying the fiber knob modified with the C4 domain. Immunization of mice with these vectors showed the production of specific antibodies that recognized de gp120 glycoprotein. Also, we constructed a baculovirus vector expressing the hybrid protein, which was purified by HPLC. Mice immunized with this protein also produced antibodies capable of recognizing gp120. Our data suggest that the fiber knob is a good carrier protein for epitope immunization.