Orientadores: Aline Carvalho da Costa, Rubens Maciel Filho, Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:59:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_RafaelRamosde_D.pdf: 13239438 bytes, checksum: 3878b0150588cf72948be14b3f7dec47 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O objetivo deste trabalho é modelar um processo de produção de etanol a partir da fermentação de hidrolisado enzimático de bagaço concentrado com melaço de cana-de-açúcar. Para este propósito, foram realizadas 23 fermentações em batelada com e sem reciclo de células em várias temperaturas: 30, 32, 34, 36 e 38 °C. O reciclo visa avaliar a influência da exposição da levedura S. cerevisiae ao hidrolisado contendo inibidores (especialmente ácido acético) por longos períodos de tempo, e com altas concentrações celulares. Para cada temperatura a primeira fermentação foi realizada com inóculo fresco e realizaram-se no mínimo 4 reciclos. Inicialmente avaliou-se um modelo desenvolvido em trabalho anterior (ANDRADE, 2007) para fermentação de melaço de cana. Este modelo não foi capaz de descrever novas fermentações na presença de alterações da matéria-prima, nem mesmo quando o substrato era melaço de uma safra diferente. Devido ao grande número de parâmetros (11) no modelo, desenvolveu-se uma metodologia de re-estimação, na qual os parâmetros mais sensíveis eram reajustados, e os menos sensíveis mantidos fixos, tornando a re-estimação mais simples. Para isso fez-se uma análise de sensibilidade paramétrica através de planejamentos de Plackett-Burman usando o software STATISTICA, variando os parâmetros cinéticos e calculando seus efeitos nos perfis de concentração de células, substrato e etanol. Os parâmetros mais relevantes nos perfis foram ?máx, Pmáx, Yx e Yp/x, os quais foram escolhidos para serem reajustados quando se alterava o substrato. Com o reajuste desses 4 parâmetros, foi possível descrever os dados experimentais da fermentação de melaço de nova safra com precisão. O mesmo algoritmo de re-estimação foi utilizado para ajuste dos parâmetros do modelo de fermentações de caldo hidrolisado concentrado com melaço. Além dos 4 parâmetros definidos como mais importantes (?máx, Pmáx, Yx ,Yp/x), re-estimou-se também o parâmetro Xmáx, já que no desenvolvimento do modelo original não foi considerado reciclo de células, havendo baixa concentração de biomassa. Acrescentou-se, ainda, ao modelo original, um termo para levar em conta a inibição por ácido acético, logo estimaram-se também os parâmetros relacionados. Após re-estimação dos parâmetros usando um algoritmo de otimização quasi-Newton desenvolvido em COMPAQ VISUAL FORTRAN, realizou-se nova análise de sensibilidade para verificar se os parâmetros mais sensíveis continuavam sendo os mesmos. Neste caso, o ?máx deixou de ser xviii relevante se a análise fosse feita no tempo final de fermentação, porém realizando análise de sensibilidade em diferentes tempos, mostra-se que ?máx tem efeito nos perfis do modelo no início da fermentação. Foi possível desenvolver um modelo preciso que descreveu as fermentações em batelada com e sem reciclo de células em função da temperatura mantendo 11 dos 13 parâmetros (ajustados a partir de dados de fermentação de hidrolisado concentrado com melaço) fixos. Apenas os parâmetros Yx e Yp/x tiveram valores diferentes para as fermentações com reciclo / Abstract: The objective of this paper is to model a process of ethanol production from sugarcane bagasse hydrolysate concentrated with molasses. For this purpose, experimental data were obtained from 23 batch fermentations with and without cells recycle in different temperatures: 30, 32, 34, 36 e 38 °C. The recycle aims to evaluate the influence of exposing the yeast S. cerevisiae to the hydrolysate inhibitors (specifically acetic acid) for long time periods, and under high cell concentrations. For each temperature the first fermentation was performed with fresh inoculum and at least 4 recycles were carried out. Initially a model developed in a previous work (ANDRADE, 2007) for sugarcane molasses fermentation was evaluated. This model was not able to describe new fermentations in the presence of changes of raw material, not even when the substrate was molasses from a different harvest. Due to the large number of parameters (11) in the model, a re-estimation methodology was proposed, in which the most sensitive parameters were adjusted and the less sensitive were kept fixed, making the re-estimation easier. A parametric sensitivity analysis through Plackett-Burman designs was performed, using the software STATISTICA, by varying the kinetic parameters and calculating their influence on the profiles of cell, substrate and ethanol concentrations. The most relevant parameters in the profiles were ?max, Pmax, Yx and Yp/x, which were chosen to be re-estimated when there was change in the substrate. With the re-estimation of these four parameters, it was possible to describe the experimental data from fermentation of molasses from a new harvest accurately. The same re-estimation algorithm was used to adjust the parameters of the fermentation of hydrolysate concentrated with sugarcane molasses. In addition to the 4 parameters defined as most important (?max, Pmax, Yx, Yp/x), Xmax was also re-estimated, since the development of the original model did not consider recycling of cells, which resulted in a low biomass concentration. A term to account for the inhibition by acetic acid was added to the original model, so the related parameters were also estimated. After the parameters re-estimation using a quasi-Newton optimization algorithm developed in COMPAQ VISUAL FORTRAN, a new sensitivity analysis was carried out to verify if the most sensitive parameters remained the same. In this case, ?max had no influence if xx the analysis was performed at the end of the fermentation, but by performing the sensitivity analysis at different times, ?max was shown to influence the model profiles at the beginning of fermentation. It was possible to develop an accurate model that described the batch fermentations with and without cells recycle as a function of temperature keeping 11 of the 13 parameters (adjusted from data of fermentation of hydrolyzate concentrated with molasses) fixed. Only the parameters Yx and Yp/x had different values for the fermentation with recycle / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Silvio Roberto Andrietta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_Erica_M.pdf: 2525603 bytes, checksum: f97ccddcfb17fb8f1171b0c8fafecb97 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Este trabalho teve por objetivo estudar o processo de fermentação alcoólica operando em batelada-alimentada, analisando o efeito da forma de alimentação do reator, da temperatura e da concentração de inóculo sobre o rendimento fermentativo, a produtividade e a cinética do sistema, encontrando a forma mais adequada de operação das unidades que trabalham com esse tipo de processo. Os ensaios foram realizados em reator de bancada utilizando meio sintético a base de sacarose e extrato de levedura. O microrganismo utilizado foi a cepa de levedura Y904 (Saccharomyces cerevisae). As concentrações de substrato e etanol foram determinadas pelo método colorimétrico em espectrofotômetro, e as concentrações de células foram determinadas pelo método gravimétrico. Para avaliação cinética, utilizou-se um modelo proposto por LEE et. al. 1983 modificado e os parâmentros cinéticos foram ajustados por um programa computacional desenvolvido em Delphi. Através de uma análise estatística realizada no Software Statistica 5.0 foi possível determinar quais parâmetros cinéticos apresentaram variação significativa em relação às variáveis estudadas. Como resultado, observou-se que nas condições estudadas, o rendimento em etanol obteve significância com a temperatura e a concentração de inoculo, sendo que valores elevados foram obtidos em temperaturas extremas e altas concentrações de inoculo. O rendimento em células foi afetado pela temperatura, obtendo valores elevados a baixa temperatura... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Many fermentative processes industrial are realized in the fed-batch way, where the feeding containing substract and/or nutrients are fed the bioreactor. This work has as objective to study the process of alcoholic fermentation operating in fed-batch, analyzing the effect of feeding way the bioreactor, temperature and concentration of yeast about the fermentative yield, the productivity and the kinetic of the system, finding the more appropriate way of operating the units that work with this kind of process. The essays were realized in the bench bioreactor using synthetic substract with sucrose and yeast extract. The microorganism used is the strain of yeast Y904 (Saccharomyces cerevisae). The concentration of substract and ethanol were determined by metric color method in espectrofotometer, and the concentrations of biomass were determined by gravity methody. For the kinetic evaluation was used the proposed model by LEE et. al. 1983 modified and kinetics parameters were adjusted by a software developed in Delphi. Through a statistica analyse in the Software Statistica 5.0 it was possible to determine the kinetic parameters that presented significant variation regarding the variables studied. As a result, it was notice that in the conditions studied, the yield of ethanol obtained significant with the temperature and concentration of yeast, considering that high values were obtained in extreme temperature and high concentration of yeast... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Engenharia Química / Mestre em Engenharia Química

Il existe une forte demande de l'industrie pour des technologies permettant de réduire la teneur en alcool des vins. Bien que des levures à faible rendement alcool aient été développées par ingénierie génétique, les approches non-OGM sont aujourd'hui largement privilégiées. Nous avons mis en œuvre et comparé différentes stratégies d'évolution adaptative, à partir d'une souche œnologique commerciale, afin de réorienter le flux carboné vers la formation de glycérol aux dépens de l'éthanol. Après 200 générations en conditions de stress salin, nous avons obtenu des souches évoluées présentant une augmentation de la production de glycérol de 50 à 70 %, capables de diminuer de 0,45 à 0,80 % (v/v) la teneur en alcool de vins naturels ou synthétiques. Cette réorientation s'accompagne d'une accumulation de succinate et de 2,3-butanediol et d'une réduction de la vitesse fermentaire. Les mutants ont une survie accrue en conditions de stress salin et carence en glucose. Afin d'identifier les mécanismes sous-jacents, nous avons réalisé des analyses du transcriptome, du métabolome (exo- et endo-) et du génome des souches évoluées. Nous avons montré que le phénotype des mutants n'est pas dû à une dérégulation ou à des mutations des gènes de la voie de synthèse du glycérol mais à de larges modifications du métabolisme carboné, énergétique et redox. Le génome des souches évoluées présente des pertes d'hétérozygotie qui pourraient contribuer au phénotype observé. L'étude génétique d'une souche évoluée montre une origine multigénique des traits métaboliques. Une analyse de cartographie de QTL en utilisant une approche « bulk sequencing » a été initiée pour identifier les mutations impliquées dans le caractère fort glycérol/faible éthanol. Ces travaux ont ainsi permis de développer et caractériser des souches œnologiques faibles productrices d'alcool et de fournir un cadre pour l'identification des bases moléculaires impliquées.Mots-clefs : S. cerevisiae, fermentation œnologique, évolution adaptative, éthanol, glycérol, transcriptome, métabolome, génome. / There is a strong demand from the industry for technologies to reduce the alcohol content of wine. Although low-alcohol yield yeasts have been developed by genetic engineering, GMO-free approaches are now widely preferred. We have implemented and compared different strategies for adaptive evolution to redirect the carbon flux towards glycerol formation at the expense of ethanol. After 200 generations salt stress conditions, we obtained evolved strains with glycerol production increased by 50 to 70%, able to decrease from 0.45 to 0.80% (v/v) the alcohol content of natural or synthetic wines. This shift is accompanied by an accumulation of succinate and 2,3-butanediol and a reduced fermentation rate. Mutants also exhibit a better survival under salt stress and glucose restriction conditions. To identify the underlying mechanisms, we analysed the transcriptome, metabolome (endo- and exo-) and genome of the evolved strains. We showed that the evolved phenotype is not due to deregulation or mutations of genes of involved in the glycerol synthesis pathway but to major changes in carbon, energy and redox metabolism. The genome of the evolved strains revealed loss of heterozygosity which could contribute to the observed phenotype. The genetic study of an evolved strain shows that the metabolic traits are under multigenic control. A QTL mapping analysis using a "bulk sequencing" approach was initiated to identify mutations involved in the high glycerol/low ethanol trait. This work has enabled the development and characterization of low alcohol wine yeast strains and has provided a framework for the identification of the underlying molecular bases.Key-words: S. cerevisiae, wine fermentation, adaptative evolution, ethanol, glycerol, transcriptome, metabolome, genome.

Atualmente, as cepas de S. cerevisiae utilizadas na produção industrial de álcool combustível no Brasil são leveduras diplóides que metabolizam a sacarose através da sua hidrolise extracelular pela invertase periplasmática, seguida pelo transporte para o interior da célula das moléculas de glicose e frutose formadas, e posterior metabolização pela glicólise. Neste trabalho, utilizando técnicas de engenharia genética e posteriores cruzamentos, foram desenvolvidas cepas diplóides de S. cerevisiae capazes de consumir este açúcar por meio da sua captação direta pelo transportador codificado pelo gene AGT1, e hidrólise intracelular pela invertase citoplasmática codificada por uma versão modificada do gene SUC2. Estas modificações permitiram alcançar um rendimento 10% maior na produção de etanol, além de aumentar a velocidade de consumo da sacarose e diminuir a quantidade de açúcares residuais ao final do processo. Estes resultados abrem novos horizontes para tornar a produção de etanol no Brasil mais eficiente. / Currently, the S. cerevisiae strains used in industrial production of fuel alcohol in Brazil are diploid yeasts that of metabolize sucrose through its extracellular hydrolysis by the periplasmic invertase, followed by the transport of the formed glucose and fructose into the cells, and further metabolism through glycolysis. In this study, utilizing genetic engineering techniques and further crosses, diploid strains of S. cerevisiae were developed that are able to consume this sugar through its direct uptake by the transporter encoded by the AGT1 gene, and intracellular hydrolysis by the cytoplasmic invertase encoded by a modified version of the SUC2 gene. These modifications allowed achieving a 10% higher yield in the production of ethanol, besides increasing the sucrose consumption rate and decreasing the amount of residual sugars at the end of the process. These results open new horizons to turn ethanol production in Brazil more efficient.

Durante o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae em meios contendo sacarose, a enzima invertase hidrolisa a sacarose no ambiente extracelular em glicose e frutose, as quais são posteriormente captadas pelas células por difusão facilitada. Num trabalho prévio, a localização da enzima invertase foi modificada nesta levedura, eliminando-se a forma extracelular e superexpressando-se a forma intracelular da enzima (Stambuk et al., 2009). Como resultado, a captação de sacarose por esta linhagem modificada (iSUC2) é realizada pelo co-transporte ativo com íons H+, implicando no gasto de 1 mol de ATP para cada mol de H+ extrudado pelas células para manutenção do pH intracelular. Como forma de compensar este gasto energético, espera-se que a linhagem iSUC2 desvie uma maior parte do fluxo de carbono para a geração de energia e, consequentemente, para a formação de etanol, em relação a uma linhagem selvagem. No presente trabalho, uma avaliação fisiológica quantitativa de uma linhagem com esta modificação genética foi realizada tanto em quimiostatos limitados por sacarose, como em cultivos descontínuos com sacarose como única fonte de carbono. Os dados obtidos em quimiostatos anaeróbios demonstram que na linhagem iSUC2 a enzima invertase ficou retida no ambiente intracelular e apresentou atividade absoluta total cerca de duas vezes maior que na linhagem-referência (SUC2). Além disto, verificou-se um aumento de 4% no fator de conversão de sacarose a etanol (Y ETH/S), em relação à linhagem SUC2. No entanto, como foi observado que cerca de 8 % da sacarose não foi consumida pelas células da linhagem iSUC2 durante o estado-estacionário dos quimiostatos anaeróbios, decidiu-se melhorar a capacidade do transporte ativo deste dissacarídeo nesta linhagem através de uma estratégia de engenharia evolutiva caracterizada pelo cultivo destas células em quimiostatos longos limitados por sacarose, em anaerobiose. Obteve-se assim, após cerca de 60 gerações, uma linhagem mutante (iSUC2 evoluída) com atividade de transporte de sacarose 20 vezes superior à linhagem iSUC2, sendo capaz de consumir toda a sacarose do meio de cultivo. Esta linhagem apresentou um aumento de 11% no YETH/S e uma diminuição de 27% no fator de conversão de sacarose a células (YX/S), quando comparada à linhagem-referência. A análise do transcriptoma revelou o aumento da expressão de vários genes codificadores de transportadores de hexoses, bem como genes relacionados ao metabolismo de maltose, incluindo o gene do transportador de alta-afinidade para alfa-glicosídeos AGT1, quando a linhagem iSUC2 evoluída foi comparada à linhagem iSUC2. Detectou-se que a evolução em quimiostato resultou na duplicação do gene AGT1, sem que houvesse mutação neste gene. Através da superexpressão do gene AGT1 na linhagem iSUC2, conseguiu-se gerar uma linhagem que apresentou YETH/S muito próximo ao da linhagem iSUC2 evoluída. No entanto, outros parâmetros fisiológicos, foram diferentes nestas duas linhagens, indicando que a duplicação do gene AGT1 não foi a única mutação que ocorreu durante o processo de evolução em quimiostato. Este trabalho ilustra o potencial da combinação entre engenharia metabólica e engenharia evolutiva para a obtenção de linhagens de levedura melhoradas, para aplicação na produção industrial de etanol combustível a partir de meios contendo sacarose. / When growing on sucrose-containing substrates, Saccharomyces cerevisiae secretes invertase that hydrolyses sucrose into glucose and fructose, which are subsequently assimilated by facilitated diffusion. In a previous work, the cellular location of invertase in yeast was modified, by eliminating the extracellular form of the enzyme and over-expressing the intracellular one (Stambuk et al., 2009). As a result, sucrose uptake by this modified strain (iSUC2) occurs by an active H+-sucrose symport system, in which 1 ATP needs to be used by the cells to extrude the proton co-transported. In order to compensate for this, it is expected that these cells will deviate a higher proportion of the carbon flow towards energy generation, and consequently to ethanol formation, in comparison with the wild-type phenotype (SUC2). In the present work, a quantitative physiological evaluation of the iSUC2 strain was performed in both batch and chemostat cultures. Cells from the iSUC2 strain harvested from steady-state anaerobic sucrose-limited chemostats retained all invertase intracellularly and showed a 2-fold higher total invertase activity, when compared to the SUC2 strain grown under identical conditions. Besides this, the ethanol yield on sucrose in the former cells was 4% higher than in the latter case. However, due to the high levels of residual sucrose during these cultivations with the iSUC2 strain, we attempted to improve the transport capacity in the iSUC2 strain by evolutionary engineering. After 60 generations of cultivation in an anaerobic sucrose-limited chemostat, an evolved strain was selected, which presented a 20-fold increase in the sucrose transport capacity, when compared with the parental strain (iSUC2), leading to almost no residual sucrose. During growth of this evolved strain in anaerobic sucrose-limited chemostats, the ethanol yield on sucrose was 11% higher and the biomass yield on sucrose was 27% lower, when compared with the SUC2 strain. Transcriptome analysis revealed an increase in the expression level of several hexose transporters, as well as many MAL-related genes, including the gene for the high-affinity permease AGT1. Indeed, it was verified that this gene was duplicated during the evolution experiment, but no point mutation was detected. By over-expressing the AGT1 gene in the iSUC2 strain, it was possible to attain a similar ethanol yield on sucrose, when compared to the evolved iSUC2 strain. However, several other physiological parameters were different in both strains, indicating that the AGT1 gene duplication was not the only mutation that occurred during evolution in the chemostat. To conclude, this work illustrates that the combination of metabolic and evolutionary engineering is a powerful strategy to obtain improved sucrose-fermenting yeast strains.

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência de bactérias dos gêneros Bacillus e Lactobacillus, bem como de seus produtos metabólicos, na redução da viabilidade celular Saccharomyces cerevisiae, quando em cultura mista de levedura e bactérias ativas e tratadas. Também foi avaliado um meio alternativo de cultivo de bactérias e leveduras, constituído de caldo de cana diluído a 5o brix e suplementado com extrato de levedura e peptona. As bactérias Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum foram cultivadas em associação com Saccharomyces cerevisiae (cepa Y-904) por 72 h a 32oC, sob agitação. A viabilidade celular, a taxa de brotamento e a população de células da levedura, a acidez total, a acidez volátil e o pH do meio foram determinados às 0, 24, 48 e 72 h do cultivo misto. Também foi determinada a população inicial e final dos microrganismos através de plaqueamento em profundidade, em meio de cultivo tradicional (PCA para os Bacillus, MRS-agar para os Lactobacillus e YEPD-agar para S. cerevisiae) e no meio constituído de caldo de cana. As culturas de bactéria foram tratadas através do calor (esterilização em autoclave a 120oC por 20 minutos), de agente antimicrobiano (Kamoran HJ na concentração de 3,0 ppm) ou da irradiação (radiação gama, com doses de 5,0 kGy para os Lactobacillus e 15,0 kGy para os Bacillus). Os resultados mostraram que apenas os meios de cultivo mais acidificados (com maiores concentrações de acidez total e volátil, e menores valores de pH), contaminados com as bactérias ativas L. fermentum e B. subtilis, provocaram diminuição da viabilidade celular da levedura. Excetuando a bactéria B. subtilis inativada por radiação, as demais bactérias tratadas pelos diferentes processos (calor, radiação e antimicrobiano) não causaram diminuição da viabilidade celular e da população das leveduras, indicando que a presença isolada dos metabólitos celulares dessas bactérias não foi suficiente para reduzir a porcentagem de células vivas e a densidade populacional da levedura. Para todos os microrganismos, as contagens obtidas com o cultivo em meio à base de caldo de cana foram semelhantes às obtidas nos meios tradicionais, provavelmente porque o meio alternativo simula a composição do mosto de caldo de cana-de-açúcar, do qual as bactérias foram isoladas do processo industrial de produção de etanol. Sendo assim, o meio de cultivo à base de caldo de cana-de-açúcar pôde substituir os meios tradicionais de cultivo da levedura e das bactérias testadas neste trabalho. / The aim of this work was to study the influence of the bacteria Bacillus and Lactobacillus, as well as their metabolic products, in reduction of cellular viability of Saccharomyces cerevisiae, when in mixed culture of yeast and active and treated bacteria. Also was to evaluated an alternative medium (MCC) for the cultivation of bacteria and yeast, constituted of sugarcane juice diluted to 5o Brix and supplemented with yeast extract and peptone. The bacteria Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum were cultivated in association with yeast Saccharomyces cerevisiae (strain Y-904) for 72 h on 32oC, under agitation. The cellular viability, budding rate and population of S. cerevisiae, the total acidity, volatile acidity and pH of culture were determined from 0, 24, 48 e 72 h of mixed culture. Also were determined the initial and final of microorganism population across the pour plate method, in traditional culture medium (PCA for Bacillus, MRS-agar for Lactobacillus and YEPD-agar for yeast S. cerevisiae) and in medium constituted of sugarcane juice. The bacteria cultures were treated by heat sterilization (120oC for 20 minutes), antibacterial agent (Kamoran HJ in concentration 3,0 ppm) or irradiation (radiation gama, with doses of 5,0 kGy for Lactobacillus and 15,0 kGy for Bacillus). The results of the present research showed that just the culture mediums more acids (with higher concentrations of total and volatile acidity, and smaller values of pH), contaminated with active bacteria L. fermentum and B. subtilis, caused reduction on yeast cellular viability. Except the bacteria B. subtilis treated with radiation, the others bacteria treated by different procedures (heat, radiation e antibacterial) did not cause reduction on yeast cellular viability and population, indicating that the isolated presence of the cellular metabolic of theses bacteria was not enough to reduce the percentage of the yeast live cells and a density population. For all microorganisms, the counts obtained with the cultivation medium constituted of sugarcane juice were similar obtained in traditional mediums, probably because the alternative medium simulate the composition of sugarcane must, that the bacteria were isolated in industrial process of ethanol yield. However, the culture medium constituted of sugarcane juice could be replacing traditional culture mediums of yeast and bacteria tested in this work.

Historicamente o Brasil tem marcado importante presença no setor sucroalcoleiro devido a fatos como o Programa Nacional do Álcool (Pró-álcool) e mais recentemente a tecnologia dos carros flex. Esses fatos somados aos problemas da utilização de uma matriz energética não renovável, cara e muito poluente como o petróleo, trazem a importância de aperfeiçoar a atividade no país. No entanto, diversos fatores afetam a fermentação e reduzem o rendimento fermentativo, como a entrada de contaminantes no processo e a pemanência deles, através de problemas como a qualidade da matéria prima e práticas como o processo de \"Melle-Boinot, respectivamente. Estudos anteriores revelam que grande parte desses contaminantes são do grupo chamado de bactérias láticas e que essas apresentam duas maneiras distintas de metabolizar os açúcares (homofermentativas e heterofermentativa), sendo que o tipo presente influencia em outros fatores importantes como a produção de glicerol por parte das leveduras. Além disso, acredita-se que as heterofermentativas sejam favorecidas pelas condições impostas na dorna fermentativa. Nesse contexto, o presente trabalho objetiva fazer um levantamento do tipo metabólico predominante das bactérias láticas contaminantes de destilarias brasileiras, além de entender melhor as relações existentes entre esses microrganismos e as leveduras. Para isso, foram isoladas 221 bactérias de destilarias e testadas quanto ao tipo metabólico. Adicionalmente, 2 bactérias foram escolhidas (I8 e I9), identificadas e testadas em ensaios de fermentação em conjunto com as leveduras PE-2 e Mauri, sob condições que simulam o processo industrial. Foram testados cinco tratamentos (PE-2; PE-2+I8; PE-2+I9; Mauri; Mauri+I8 e Mauri+I9), com 3 repetições cada e um total de 5 reciclos fermentativos. Ao final de cada reciclo fermentativo, amostras foram retiradas para análises químicas e microbiológicas. Os resultados revelam que, embora as hetero sejam mais agressivas e predominem em relação às homo quando simulamos o processo industrial dentro do laboratório, diferentemente do que se pensava, não ocorre essa predominância dentro da destilaria, já que 51,3% dos isolados eram homo e 48,69% eram hetero. Além disso os resultados também mostraram que todas as bactérias homo identificadas pertenciam à espécie Lactobacillus plantarum, enquanto as hetero à espécie L. fermentum, o que de acordo com dados anteriores da literatura sugerem que possa haver uma divisão de tipos metabólicos por espécie. Ao analisarmos os metabólitos de ambos os microrganismos vemos que houve menor produção de glicerol por parte das leveduras quando elas estavam em cultivo conjunto com as bactérias homofermentativas, mesmo em comparação com o controle (sem contaminação) o que pode ser explicado pelo fato de ter havido produção de succinato exclusivamente nos tratamentos com a I8 (homo). Ou seja, como as bactérias homo produzem quantidades muito superiores de ácido lático se compararmos com as heterofermentativas, as leveduras foram estimuladas a excretarem mais ácido succínico, desviando o metabolismo da produção massiva de glicerol. / Brazil has been historically very present in ethanol industry because some facts as National Alcohol Program (\"Pro-Alcohol\") and more recently the flex fuel car technology. These facts, added to the problems of using petroleum that is a non-renewable energy source, very expensive and polluting, bring the importance of improving brazilian activity. However, several factors affect the fermentation and reduce alcoholic yields, as the entry of contaminants into the process and their permanency because, for example, the quality of raw materials and everyday practices as \"Melle-Boinot\" process, respectively. Previous studies have shown that many of these contaminants are called lactic acid bacteria, which have two distinct ways to metabolize sugars (homofermentative and heterofermentative), and the type present could influence important factors such as glycerol production by yeasts. Additionally, it is believed that the hetero bacteria are favored by the fermentative industrial conditions. In this context, this work aims to survey the predominant metabolic type of lactic acid bacteria contaminants in brazilian distilleries, and understand the relationship between this microorganisms and yeasts. For that, we isolated 221 bacteria from distilleries and tested their metabolic type. In addition, two strains were chosen (I8 and I9), identified and tested with PE- 2 and Mauri yeasts under industrial process simulating conditions. By this mean, we have 6 treatments (PE-2; PE-2+I8; PE-2+I9; Mauri; Mauri+I8 and Mauri+I9) with 3 replicates each one and a total of 5 cell recycling fermentation. At the end of each recycle, samples were taken for chemical and microbiological analysis. The results showed that, although the heterofermentative are more aggressive and dominant in relation to homo when we simulate the industrial process in the laboratory, unlike previously thought, we can not find this predominance in distilleries, since 51,3% of the isolates were homo and 48,69% were hetero. In addition, the results also showed that all the homo bacteria identify was a Lactobacillus plantarum, while all the hetero identify was a L. fermentum, which according to previous literature, suggests that should exist a division of metabolic types by species. When analyzing the metabolites of both microorganisms we see that there was less glycerol production by the yeast when they were growing together with homofermentative bacteria, even in comparison with the control (without contamination) which might be explained by the fact that there was only succinate production in treatments with homo (I8). In other words, homofermentative bacteria produce much higher amounts of lactic acid when compared with hetero, so yeast cells were stimulated to excrete more succinic acid and take the metabolism away from glycerol mass production.

Dentre as leveduras selvagens mais comumente encontradas na fermentação alcoólica, destaca-se o gênero Saccharomyces apresentando colônias rugosas com células dispostas em cachos (pseudohifas). Este biótipo de levedura tem sempre sido associado com problemas na indústria, ocasionando queda no rendimento fermentativo. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo realizar a caracterização genética, morfo-fisiológica e da resistência ao estresse de linhagens de Saccharomyces cerevisiae que apresentam colônias rugosas e mucosas, buscando alternativas que possam contribuir para o manejo dessas leveduras selvagens (rugosas) na fermentação alcoólica. Foram realizados testes de caracterização para crescimento invasivo, atividade killer, temperatura, pH, concentração de etanol e açúcar, presença de actidione, floculação e capacidade fermentativa, utilizando-se 22 linhagens de leveduras (11 rugosas e 11 mucosas) selecionadas previamente por seqüenciamento da região ITS do DNA ribossomal. O efeito do tratamento ácido em diferentes valores de pH sobre o crescimento de duas linhagens (52 rugosa e PE-02 mucosa) foi também avaliado, seguido do monitoramento do crescimento em meio de caldo de cana após tratamento ácido. Em seguida, testes fermentativos em meio de caldo de cana foram conduzidos em culturas puras e mista dessas linhagens. Os testes de caracterização morfofisiológica mostraram que a invasividade em meio YEPD Agar ocorreu em baixa freqüência dentre as 22 leveduras testadas; dez dentre onze leveduras rugosas apresentaram taxa de floculação expressiva, e entre as mucosas a floculação foi praticamente inexistente; nenhuma das linhagens apresentou produção de toxina killer; as linhagens com colônias rugosas apresentaram capacidade fermentativa significativamente inferior às linhagens com colônias mucosas, em sistema de batelada com ciclo único de 48 horas em meio de caldo de cana, demonstrando velocidade mais lenta de fermentação. Quanto à resistência ao estresse por temperatura, pH, etanol e concentração de açúcar, as linhagens mucosas tiveram maior resistência à acidez do meio, enquanto as linhagens rugosas foram mais resistentes às concentrações elevadas de etanol e açúcar. Nenhuma levedura foi resistente ao actidione. A análise genética, através dos loci microssatélites, revelou a presença de dois grupos principais relacionados geneticamente, sendo o primeiro ramo constituído principalmente de colônias rugosas (67%), contendo, no entanto, a linhagem PE-02, apresentando linhagens com alta taxa de floculação e tolerância às altas concentrações de açúcar e etanol; o outro grupo (com três subgrupos) compreendeu principalmente colônias mucosas, apresentando pouca resistência às situações estressantes aqui estudadas. A levedura com colônia rugosa (linhagem 52) foi bastante afetada pelo tratamento ácido em valores de pH 1,0 e 1,5, ao contrário da levedura com colônia mucosa (PE-02). A fermentação em sistema de batelada com reciclo celular e tratamento ácido conduzido em pH 1,5 teve efeito sobre o crescimento da levedura rugosa quando em cultura mista com a levedura mucosa, não resultando em prejuízo à eficiência fermentativa, quando comparada com a cultura pura da PE-02. Em cultura pura da levedura rugosa, constatou-se eficiência fermentativa por volta de 60%, confirmando o baixo desempenho destas leveduras. O conhecimento das respostas das leveduras rugosas 12 às situações estressantes pode ajudar a manejar a fermentação alcoólica para minimizar o efeito da levedura contaminante. / Among the wild yeasts more commonly found in the alcoholic fermentation, wrinkled colonies with pseudohyphal morphology belonging to Saccharomyces genus are highlighted. This yeast biotype has been associated with industrial problems, resulting in the decrease of the fermentative yield. In this context, this work aimed to perform the genetic, morphological/physiological characterization and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae strains which exhibited wrinkled and mucous colonies, searching for alternatives that could contribute to the management of these wild yeasts (wrinkled colonies) in the alcoholic fermentation. Characterization tests for invasiveness in Agar medium, killer activity, temperature, pH, ethanol and sugar concentration, actidione, flocculation and fermentative capacity were carried out with 22 strains (11 wrinkled and 11 mucous colonies), which were screened previously by the sequencing of the ITS region of the ribosomal DNA. The effect of the acid treatment using different pH values over the growth of two strains (52 wrinked and PE-02 mucous) was also evaluated, following the growth monitoring in sugar cane juice after acid treatment. Fermentative tests in sugar cane juice were carried out with pure and mixed cultures of these strains. The morphological/physiological tests showed that the invasiveness in YEPD Agar medium occurred in low frequency among the 22 strains tested; ten out of eleven wrinked yeasts exhibited expressive flocculation, and among the mucous, the flocculation was near zero; none of the strains showed killer activity; the wrinkled colonies presented lower fermentative capacity comparing to mucous colonies, in a 48- hour cycle in batch system using sugar cane juice, with slower fermentation rate. Concerning the resistance to temperature, pH, ethanol and sugar concentration, the mucous colonies were more resistant to low pH, while the wrinkled colonies were more resistant to the elevated ethanol and sugar concentrations. None of the yeasts were resistant to actidione. The genetic analysis by microsatellite loci revealed the presence of two main genetic related groups, the first branch comprised mainly of wrinkled colonies (67%), containing however the PE-02 strain, showing strains with high flocculation rate and tolerance to high concentration of sugar and ethanol; the other group (with three subgroups) comprised mainly mucous colonies, showing lower resistance to the stressing conditions here studied. The yeast with wrinkled colony (strain 52) was severely affected by the acid treatment in pH values of 1.0 and 1.5, but the same did not occur with the mucous colony (PE-02). The batch fermentation with cell recycle and acid treatment in pH 1.5 had effect over the wrinkled yeast growth when in mixed culture with the mucous yeast, and did not impair the fermentative efficiency comparing to the pure culture of PE-02. In pure culture with the wrinkled colony, a fermentative efficiency as low as 60% was observed, confirming the low performance of these yeasts. The knowledge of the response to stressful conditions exhibited by the yeasts with wrinkled colonies can help to manage the alcoholic fermentation in order to minimize the effect of the contaminant yeast.

As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial. São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho, pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar, identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em níveis de contaminação variando de 101 a 103 células/mL, em meio de caldo de cana, em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas) para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (101 a 103 células/mL), impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação. Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação. / Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination levels varying from 101 to 103 cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production. Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis (CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of the initial inoculum size ((101 to 103 cells/mL), impairing the bioethanol fermentation, causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters, which would not be produced, depending on the contamination level.

Tesis por compendio / [ES] Saccharomyces cerevisiae, además de ser un importante organismo modelo en biología, es indiscutiblemente la especie de levadura más utilizada en procesos fermentativos industriales, incluyendo el sector enológico. Su capacidad de fermentar en concentraciones elevadas de azúcares, tolerar concentraciones altas de etanol y soportar la adición de sulfitos, son algunos de los factores que explican su éxito en fermentaciones vínicas. El metabolismo fermentativo de S. cerevisiae en condiciones enológicas se conoce bien gracias a una amplia bibliografía científica. En cambio, aún se sabe poco sobre el metabolismo de las especies de Saccharomyces criotolerantes, S. uvarum y S. kudriavzevii, quienes han suscitado recientemente el interés del sector vitivinícola por sus buenas propiedades fermentativas a bajas temperaturas, tales como la producción de vinos con mayor contenido en glicerol y alta complejidad aromática, llegando a veces a reducir su contenido en etanol. En este contexto, esta tesis pretende ampliar nuestros conocimientos sobre el metabolismo fermentativo de S. uvarum y S. kudriavzevii en condiciones enológicas, profundizando en el entendimiento de las diferencias existentes con el de S. cerevisiae, así como entre cepas de S. cerevisiae de distintos orígenes. Para ello, hemos utilizado varias técnicas ómicas para analizar la dinámica de los metabolomas (intra- y extracelulares) y/o transcriptomas de cepas representativas de S. cerevisiae, S. uvarum y S. kudriavzevii a alta (25 °C) y baja (12 °C) temperatura de fermentación. También, hemos desarrollado un modelo metabólico a escala de genoma que, junto a un análisis de balance de flujos, es capaz de cuantificar los flujos a través del metabolismo del carbono y del nitrógeno de levaduras en cultivo de tipo batch. Así, el conjunto de estos trabajos nos ha permitido identificar rasgos metabólicos y/o transcriptómicos relevantes para el sector enológico en estas especies. También se aporta nueva información sobre las especificidades de redistribución de flujos en la red metabólica de levaduras del género Saccharomyces acorde a la especie y las fluctuaciones ambientales que ocurren durante una fermentación vínica. / [CAT] Saccharomyces cerevisiae, a més de ser un important organisme model en biologia, és indiscutiblement l'espècie de llevat més utilitzat en processos fermentatius industrials, incloent el sector enològic. La seua capacitat de fermentar grans concentracions de sucres, tolerar concentracions altes d'etanol i suportar l'addició de sulfits, són alguns dels factors que expliquen el seu èxit en fermentacions víniques. D'aquesta manera, el metabolisme fermentatiu de S. cerevisiae en condicions enològiques està ben descrit i es beneficia d'una àmplia bibliografia científica. En canvi, poc se sap encara sobre el metabolisme de les espècies de Saccharomyces criotolerants, S. uvarum i S. kudriavzevii, els qui han recentment suscitat l'interés del sector vitivinícola per les seues bones propietats fermentatives a baixes temperatures, com ara la producció de vins amb major contingut en glicerol, alta complexitat aromàtica i arribant a vegades a reduir el seu contingut en etanol. En aquest context, aquesta tesi pretén ampliar els nostres coneixements sobre el metabolisme fermentatiu de S. uvarum i S. kudriavzevii en condicions enològiques, aprofundint en l'enteniment de les diferències existents amb el de S. cerevisiae, així també com entre ceps de S. cerevisiae de diferents orígens. Per a això, hem utilitzat diverses tècniques omiques per a analitzar la dinàmica dels metabolomes (intra- i extracelul·lars) i/o transcriptomes de ceps representatius de S. cerevisiae, S. uvarum i S. kudriavzevii a alta (25 °C) i baixa (12 °C) temperatures de fermentació. També, hem desenvolupat un model metabòlic a escala del genoma que, al costat d'una anàlisi de balanç de fluxos, és capaç de quantificar els fluxos a través del metabolisme carbonat i nitrogenat de llevats en cultius de tipus batch. Així, el conjunt d'aquests treballs ens ha permés identificar trets metabòlics i/o transcriptómics rellevants per al sector enològic en aquestes espècies. També aporta nova informació sobre les especificitats de redistribució de fluxos en la xarxa metabòlica de llevats del gènere Saccharomyces concorde a l'espècie i les fluctuacions ambientals ocorrent durant una fermentació vínica. / [EN] Saccharomyces cerevisiae, besides being an important model organism in biology, is undoubtedly the most widely used yeast species in industrial fermentation processes, including the winemaking sector. Its ability to ferment at high levels of sugars, tolerate high ethanol concentrations and withstand the addition of sulfites are some of the factors explaining its success in wine fermentation. Accordingly, the fermentative metabolism of S. cerevisiae under oenological conditions is well described and benefits from a large scientific literature. In contrast, little is known about the metabolism of the cryotolerant Saccharomyces species, S. uvarum and S. kudriavzevii, which have recently attracted the interest of the wine industry for their good fermentative properties at low temperatures, such as the production of wines with higher glycerol content, high aromatic complexity and sometimes even reduced ethanol content. In this context, this thesis aims to expand our knowledge on the fermentative metabolism of S. uvarum and S. kudriavzevii under oenological conditions, deepening our understanding of the existing differences with that of S. cerevisiae, as well as between S. cerevisiae strains of different origins. For this purpose, we have used several omics techniques to analyze the dynamics of the (intra- and extracellular) metabolomes and/or transcriptomes of representative strains of S. cerevisiae, S. uvarum and S. kudriavzevii at high (25 °C) and low (12 °C) fermentation temperatures. Also, we have developed a genome-scale metabolic model that, together with a flux balance analysis, is able to quantify fluxes through carbon and nitrogen metabolism of yeast in batch culture. Taken together, this work has allowed us to identify metabolic and/or transcriptomic traits relevant to the oenological sector in these species. It also provides new information on the specificities of flux redistribution in the metabolic network of Saccharomyces yeasts according to the species and environmental fluctuations occurring during wine fermentation. / The present work has been carried out at the Department of Food Biotechnology of the IATA (CSIC). Romain Minebois was funded by a FPI grant (REF: BES-2016-078202) and supported by projects AGL2015-67504-C3-1R and RTI2018-093744-BC31 of the Ministerio de Ciencia e Inovación awarded to Amparo Querol. / Minebois, RCM. (2021). Study of the differences in the fermentative metabolism of S. cerevisiae, S. uvarum and S. kudriavzevii species [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176018 / Compendio