Le "coût de la reproduction" est un concept qui définit qu'un investissement à la reproduction élevé a un prix qui se paye ultérieurement par une accélération de la sénescence. Cela peut notamment traduire des compromis entre la reproduction et d'autres fonctions physiologiques comme la défense antioxydante. Chez l'huître creuse Crassostrea gigas, la reproduction représente une fonction physiologique majeure. Dans le cadre des études effectuées pour comprendre les mortalités estivales affectant cette espèce, une corrélation négative entre effort reproducteur et survie a été observée. D'autre part, des gènes antioxydants ont été mis en évidence comme différentiellement exprimés entre les lignées d'huîtres sélectionnées pour leur résistance ou leur sensibilité aux mortalités estivales. Certaines études proposent que la susceptibilité au stress oxydant puisse représenter un coût de la reproduction participant au processus de sénescence. Dans ce contexte, nous avons analysé la capacité antioxydante des huîtres en fonction de leur investissement reproducteur. Pour cela, la technique d'ARN interférence a été utilisée pour manipuler l'effort reproducteur des huîtres. L'expression des principales enzymes antioxydantes (taux de transcrits et activités enzymatiques) et le dosage de dommages oxydatifs ont ensuite été mesurés dans différents tissus et cellules de l'organisme (branchies, gonade, hémocytes et gamètes). Les résultats obtenus dans le cadre de cette thèse suggèrent que la capacité antioxydante de C. gigas est particulièrement efficace et que la reproduction seule n'est pas suffisante pour induire un stress oxydant. Cette capacité antioxydante apparaît comme tissu-spécifique voire cellule-spécifique et le métabolisme du glutathion semble jouer un rôle majeur dans cette protection. Cette grande résistance au stress oxydant contribuerait à faire de C. gigas une espèce particulièrement adaptée à la vie dans des environnements stressants.

Le blé tendre, Triticum aestivum, est une des céréales les plus cultivées au monde et est d'une importance considérable pour l'alimentation humaine, fournissant environ un cinquième des calories consommées par l'Homme. Le rendement en grain chez les céréales dépend majoritairement du nombre et de la taille des grains. Chez le riz (Oryza sativa), le gène GW2 a été isolé dans un locus à effet quantitatif majeur pour la taille et le poids du grain. Ce gène code pour une enzyme E3 ligase de type RING, qui régule négativement la taille et le poids du grain de riz. L'homologue de GW2 chez le blé tendre, le gène TaGW2, est exprimé par trois copies TaGW2-A,TaGW2-B et TaGW2-D, portées par chacun des génomes homéologues A, B et D. Les trois copies présentent des profils d'expression distincts au cours du développement du grain. TaGW2-A a été cartographié dans une région de QTLs pour le rendement, sur le chromosome 6AS ; et du polymorphisme dans sa séquence promotrice et intronique a été retrouvé associé au poids de 1000-grains dans une core collection mondiale de blé tendre. Afin de rechercher la fonction de TaGW2, l'extinction stable des trois copies TaGW2 a été entreprise par ARN interférence. De manière surprenante, les plantes transgéniques montrent des réductions significatives des dimensions et du poids du grain de blé (- 22,5 et - 30% du volume et de la masse du grain, respectivement), ainsi que du nombre de cellules de l'albumen (- 25%), comparé aux plantes témoins dans nos conditions ; suggérant que TaGW2 est un régulateur positif de la taille finale du grain chez le blé tendre. La protéine TaGW2-A a été caractérisée aux niveaux moléculaire et biochimique : elle est une E3 ubiquitine ligase fonctionnelle in vitro, et s'accumule dans la cellule au niveau du nucléole, du nucléoplasme et du cytoplasme. Sa fonction E3 ligase semble notamment influencer sa localisation subcellulaire. Afin de déterminer la ou les voie(s) de signalisation dans la(es)quelle(s) intervient TaGW2, une banque ADNc de grains de blé a été construite et criblée par double-hybride avec 320 acides aminés de la protéine TaGW2-A. Les premiers interacteurs potentiels identifiés suggèrent d'une part un rôle de TaGW2 dans la régulation de la division cellulaire, et d'autre part une fonction E3 Nedd8 ligase, en plus de son activité E3 ligase.

Chez la femme, le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué. Différents traitements sont disponibles selon le sous-type tumoral. Cependant, certaines patientes sont réfractaires à ces thérapies et restent vulnérables lors de récidives. Le cancer a longtemps été défini par une division aberrante des cellules, mais aujourd'hui, il est évident que la résistance à la mort cellulaire programmée est un paramètre majeur dans l'étiologie de la maladie.Les cyclines de type D régulent le cycle cellulaire en permettant la transition de la phase G1 à la phase S. Pour cela, elles activent les kinases dépendantes des cyclines 4/6 (CDK4/6) qui phosphorylent les protéines du rétinoblastome ce qui libère le facteur de transcription E2F. La Cycline D1 (CycD1) nucléaire est donc centrale dans le contrôle du cycle. Son gène est amplifié dans les cancers humains et la moitié des patientes atteintes d'un cancer du sein ont une surexpression de CycD1. Par l’activation de CDK4, CycD1 est essentielle à l'apparition et à la progression tumorale. Ainsi, des inhibiteurs spécifiques de CDK4/6 ont été développés contre le cancer du sein. Malheureusement, certaines patientes restent insensibles à ce traitement. À ce titre, le ciblage spécifique de CycD1 pourrait représenter une alternative clinique. En effet, en plus de la régulation du cycle, CycD1 est également impliquée, indépendamment de CDK4, dans la survie des cellules cancéreuses. Cependant, aucun mécanisme de l'impact de CycD1 dans le maintien tumoral n'a été établi pour démontrer ce potentiel thérapeutique. En outre, CycD1 a été décrite dans les organes à l’âge adulte pour réguler le métabolisme du glucose et l'hématopoïèse. Par conséquent, pour éviter tout effet secondaire indésirable, nous avons décidé d’évaluer l’implication potentielle de CycD1 dans les organes adultes. Grâce au Tandem-HTRF, basé sur le transfert d'énergie entre deux anticorps, nous avons révélé la dynamique inattendue de CycD1 dans chaque organe adulte. De plus, nous avons montré que l’altération de l'expression de CycD1 conduit à une diminution des capacités de survie des cellules saines post-mitotiques.Au vu de ces limitations, nous avons développé une nouvelle approche d'ARN interférence spécifique des cellules cancéreuses appelée TAG-RNAi. Cette technologie permet de cibler CycD1 uniquement dans la tumeur afin d'épargner les cellules saines. Cette approche innovante consiste à cibler un tag présent uniquement sur l’ARNm de CycD1 des cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons découvert que le ciblage spécifique de CycD1 induit une régression rapide et spontanée des tumeurs dépendantes des oncogènes RAS ou ERBB2. Par protéomique in vivo, j'ai découvert que lors de stress pro-apoptotiques, CycD1 cytoplasmique interagit avec la procaspase-3 et bloque son activation pour empêcher l'apoptose des cellules. Ces travaux démontrent la valeur clinique du ciblage spécifique de CycD1 dans les cancers afin d'améliorer l'efficacité des chimiothérapies.Par conséquent, il restait à déterminer comment appliquer le TAG-RNAi contre CycD1 uniquement dans les cellules cancéreuses des patientes. Puisque le tag exotique présent sur le gène Ccnd1 chez la souris nous a permis de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses, nous avons pensé que des mutations retrouvées dans les cancers humains représentaient une option de ciblage. Ainsi, nous avons étendu le concept TAG-RNAi aux mutations somatiques caractéristiques des cancers pour cibler avec succès l'expression des mutants KRAS-G12V ou BRAF-V600E comme exemples. L'idée est donc d'identifier les mutations de Ccnd1 chez les patientes afin d'appliquer le TAG-RNAi comme une thérapie personnalisée afin d’éviter les effets secondaires. Enfin, l'expression de CycD1 représente un nouveau biomarqueur pour le cancer et les troubles liés à l'âge: de faibles taux prédisposent aux maladies dégénératives tandis que des taux élevés indiquent une susceptibilité accrue au cancer. / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women. This cancer is the leading cause of death in women aged from 35 to 65 years old. Different treatments are now available depending on tumor subtypes. However, some patients are still refractory to these therapies and are at risk of disease relapse. Cancer research has long focused on aberrant cancer cell division but today it is evident that the resistance to programmed cell death is also a major characteristic of the disease.D-type cyclins regulate cell cycle by allowing the transition from the G1-phase to the S-phase. These regulatory subunits activate the Cyclin-Dependent Kinases 4/6 (CDK4/6) that phosphorylate the retinoblastoma proteins which then release the E2F transcription factors. Nuclear Cyclin D1 (CycD1) is therefore central in the control of division. The Ccnd1 gene is amplified in human cancers and half of breast cancer patients bare an overexpression of CycD1. CycD1 is required for mammary carcinoma onset and progression in a CDK4 kinase-dependent manner. Hence, specific CDK4/6 inhibitors have been developed and authorized in the clinics against breast cancer. Unfortunately, some patients remain insensitive to this treatment. In this frame, the specific targeting of CycD1 could represent a strategic alternative in clinics to overcome these pitfalls. Indeed, in addition to cell cycle regulation with CDK4, CycD1 is also involved in CDK4-independent features of cancer cells like cell survival. However, to date, no clear mechanism for the impact of CycD1 in tumor maintenance is established to demonstrate the therapeutic value of its targeting.Moreover, recent studies have demonstrated the participation of CycD1 in adult organs to regulate glucose metabolism and hematopoiesis. As a consequence, to avoid any undesirable side effects, we decided to gauge the potential CycD1 implication in post-mitotic organs body-wide. We set up a new hypersensitive technology named Tandem-HTRF based on the energy transfer between two antibodies to reveal the unexpected dynamics of CycD1 expression in adult organ. Then, we discovered that alterations of CycD1 expression induced dramatic functional consequences on the survival capacities of healthy adult post-mitotic cells.Based on these limitations, we developed a novel RNAi approach specific to cancer cells named TAG-RNAi. This technology allows the silencing of CycD1 in cancer cells only to spare healthy cells. This innovative approach consists in the targeting of a mRNA tag only present on CycD1 from cancer cells. Using this technique, we found that the specific silencing of CycD1 induces a rapid and spontaneous regression of tumors driven by the RAS or ERBB2 oncogenes. Then, thanks to a proteomics screening in vivo, I discovered that under pro-apoptotic stresses the cytoplasmic CycD1 interacts with the procaspase-3 protein and blocks its activation to prevent cancer cell apoptosis. Altogether, my work demonstrates the clinical value of the specific targeting of CycD1 in cancers to increase the efficacy of chemotherapeutic treatments.Hence, it remained to be determined how to apply in patients RNAi against CycD1 only in cancer cells. Because the exotic tagging of its gene was instrumental in mice cancer models, we reasoned that human cancer mutations could represent such a specific tag. We have extended the concept of TAG-RNAi to somatic mutations characteristic of human cancers to successfully target the expression of KRAS-G12V or BRAF-V600E mutants as examples. The idea is therefore to identify Ccnd1 mutations in cancer patients in order to apply TAG-RNAi as a custom therapeutic approach that will manage side effects. More unanticipated, CycD1 expression represents a new biomarker for both cancer and age-related disorders: low CycD1 levels predispose to degenerative complications while high CycD1 levels indicate increased susceptibility to cancer and resistance to treatment.

Les polérovirus infectent une large gamme de plantes d’intérêt économique. Ils sont transmis par un insecte vecteur, le puceron, selon le mode circulant non-multipliant. Le virus, acquis par le puceron lors de l’ingestion de sève sur une plante infectée, traverse l’épithélium des cellules intestinales puis celui des glandes salivaires par un mécanisme de transcytose impliquant des récepteurs encore inconnus. Le récepteur de l’éphrine (Eph) est une protéine membranaire dont un domaine est capable de se lier dans la levure aux protéines structurales des polérovirus. En développant des techniques basées sur l’ARN interférence, nous avons montré que l’acquisition orale d’ARN double brin ciblant Eph chez le puceron Myzus persicae permet de réduire de manière reproductible l’internalisation des polérovirus dans le corps du puceron. Les pucerons ainsi traités transmettent le virus avec une efficacité réduite. Eph pourrait donc assurer la fonction de récepteur des polérovirus chez M. persicae. / Poleroviruses infect a wide range of economically important plants. They are transmitted in a circulative and non-propagative mode by an insect vector, the aphid. The virus particles are acquired by aphids when ingesting the sap from an infected plant and cross successively the epithelia of the midgut and the salivary gland cells by a transcytosis mechanism that relies on the presence of unknown receptors.The ephrin receptor (Eph) is a membrane protein which contains a domain able to bind in yeast to the structural proteins of poleroviruses. By developing methods based on RNA interference, we have shown that oral acquisition of double-stranded RNA targeting Eph in the aphid Myzus persicae can reproducibly reduce polerovirus internalization into the aphid's body. Such treated aphids transmit the virus to plants with a lower efficiency. Eph could therefore function as a receptor for poleroviruses in M. persicae.

L'aggravation actuelle du risque lié au paludisme résulte du développement du phénomène de résistance de souches de Plasmodium falciparum aux molécules antipaludiques. Une telle situation et l’absence de vaccin efficace nécessitent le développement de nouvelles stratégies antiparasitaires. Jusqu’à présent, les mécanismes moléculaires qui contrôlent le cycle parasitaire sont méconnus. Chez la plupart des eucaryotes, les protéine kinases sont impliquées dans des fonctions cellulaires essentielleset constituent une cible privilégiée pour la conception de nouveaux médicaments. Dans cecadre, nous nous sommes intéressés à la voie de transduction de l’AMP cyclique et en particulier à la sous-unité catalytique de la protéine kinase AMPc dépendante (PfPKAc)dont le rôle essentiel reste mal défini chez P. falciparum. Deux approches complémentaires ont été choisies pour étudier cette kinase :1) au niveau biochimique par le clonage, l’expression, la purification et la caractérisation enzymatique de la PfPKAc. L’objectif était d’obtenir une enzyme active in vitro de façon à pourvoir mesurer les constantes enzymatiques de la PfPKAc et conduire les premiers essais d’inhibitions.2) au niveau cellulaire en analysant les conséquences de l’inhibition par des ARN interférents spécifiques des transcrits de la PfPKAc. Le développement parasitaire mais également le transcriptome global ont été étudiés de manière à préciser les voies métaboliques liées à cette kinase plasmodiale.L’ensemble de ces études précise la compréhension de la voie de transduction de l’AMP cyclique et de la PfPKA qui pourrait conduire au développement de nouvelles voies thérapeutiques. / Nowadays, the increase of risks associated with malaria results from the development of resistance of Plasmodium falciparum strains to antimalarial drugs. This situation and the lack of an effective vaccine require the development of new antimalarial strategies. Untilnow, molecular mechanisms controlling the life cycle of malaria parasites, are still poorly understood. In most eukaryotes, protein kinases are implicated in essential cellular functions and represent attractive targets for the development of new drugs. In this context, we focused on the signaling pathway implicating cAMP and particularly the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase (PfPKAc), whose function is still unclear in P. falciparum. Two complementary strategies were chosen to study this kinase:1) at the biochemical level by the cloning, expression, purification and enzymatic characterization of the PfPKAc. The objective was to obtain an in vitro active PfPKAc to evaluate the kinetic constants of PfPKAc and to conduct the first inhibition studies.2) at the cellular level by studying the consequences of PfPKAc transcripts inhibition byspecific interfering RNAs. The parasite growth but also the overall transcriptome werestudied to specify the metabolic pathways associated with this plasmodial protein kinase.All of these studies improve the understanding of cAMP transduction pathway and PfPKA,which could allow the development of new therapeutic approaches.

Le blé tendre, Triticum aestivum, est une des céréales les plus cultivées au monde et est d’une importance considérable pour l’alimentation humaine, fournissant environ un cinquième des calories consommées par l’Homme. Le rendement en grain chez les céréales dépend majoritairement du nombre et de la taille des grains. Chez le riz (Oryza sativa), le gène GW2 a été isolé dans un locus à effet quantitatif majeur pour la taille et le poids du grain. Ce gène code pour une enzyme E3 ligase de type RING, qui régule négativement la taille et le poids du grain de riz. L’homologue de GW2 chez le blé tendre, le gène TaGW2, est exprimé par trois copies TaGW2-A,TaGW2-B et TaGW2-D, portées par chacun des génomes homéologues A, B et D. Les trois copies présentent des profils d’expression distincts au cours du développement du grain. TaGW2-A a été cartographié dans une région de QTLs pour le rendement, sur le chromosome 6AS ; et du polymorphisme dans sa séquence promotrice et intronique a été retrouvé associé au poids de 1000-grains dans une core collection mondiale de blé tendre. Afin de rechercher la fonction de TaGW2, l’extinction stable des trois copies TaGW2 a été entreprise par ARN interférence. De manière surprenante, les plantes transgéniques montrent des réductions significatives des dimensions et du poids du grain de blé (- 22,5 et - 30% du volume et de la masse du grain, respectivement), ainsi que du nombre de cellules de l’albumen (- 25%), comparé aux plantes témoins dans nos conditions ; suggérant que TaGW2 est un régulateur positif de la taille finale du grain chez le blé tendre. La protéine TaGW2-A a été caractérisée aux niveaux moléculaire et biochimique : elle est une E3 ubiquitine ligase fonctionnelle in vitro, et s’accumule dans la cellule au niveau du nucléole, du nucléoplasme et du cytoplasme. Sa fonction E3 ligase semble notamment influencer sa localisation subcellulaire. Afin de déterminer la ou les voie(s) de signalisation dans la(es)quelle(s) intervient TaGW2, une banque ADNc de grains de blé a été construite et criblée par double-hybride avec 320 acides aminés de la protéine TaGW2-A. Les premiers interacteurs potentiels identifiés suggèrent d’une part un rôle de TaGW2 dans la régulation de la division cellulaire, et d’autre part une fonction E3 Nedd8 ligase, en plus de son activité E3 ligase. / Wheat, Triticum aestivum, is one of the world’s major cereal crops and is of considerable importance to human nutrition, supplying one-fifth of the calories consumed by humans. For important food crops such as wheat, rice and maize, grain yield mainly depends on grain number and size. In rice (Oryza sativa), GW2 was isolated from a major quantitative trait locus for grain size and weight, and encodes an E3 RING ligase that negatively regulates these yield components. Wheat has TaGW2 homologs in A, B and D genomes; and copies show distinct expression pattern during whole grain development in wheat. TaGW2-A was mapped in a genomic region on 6AS, encompassing previous reported QTLs for yield; and polymorphisms in TaGW2-A (promoter and intron 7) were associated with thousand-grain weight, in a worldwide wheat core collection. To investigate TaGW2 function, RNA interference was used to down-regulate TaGW2 transcripts levels. Surprisingly, transgenic wheat lines significantly showed decreased grain weight and size-related dimensions, and endosperm cell number compared to controls. The present study thus suggests that TaGW2 is a positive regulator of the final grain size in wheat, conversely to GW2 in rice. Biochemical and molecular analyses of the protein TaGW2-A revealed that 1) TaGW2-A is a functional E3 ubiquitine ligase in vitro, 2) TaGW2-A accumulates in the nucleolus, the nucleoplasm, and the cytosol, 3) E3 ubiquitine ligase activity seems to impact TaGW2-A subcellular localization. To investigate the TaGW2 signalling pathway(s), cDNA library from whole wheat grains was built and screened with the bait protein TaGW2(1-320). Preliminary results from the interactomic study suggest that TaGW2 may regulate cell division. Moreover, TaGW2 may also function as an E3 Nedd8 ligase, besides its E3 ubiquitin ligase function.

Le cancer du col de l’utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme, dont l’agent étiologique majeur est l’infection par les papillomavirus humain (notamment HPV-16 et 18), qui sont de petits virus infectant les épithéliums muqueux et cutanés, et pouvant induire la formation de tumeurs. L’inducteur majeur du processus oncogène est le processus d’intégration des régions codantes pour les oncoprotéines E6 et E7, au sein de la cellule hôte suite à l’infection. Elles interférent avec le cycle cellulaire et induisent notamment l’immortalisation, voire la transformation des cellules. Les fonctions les plus connue de ces deux oncoprotéines sont la dégradation des suppresseurs de tumeur p53 et pRb, respectivement. Mon travail de thèse à consisté en la mise au point des vecteurs adénoviraux exprimant des miARN dirigés contre l’oncoprotéine E6. Exprimés in vitro ils induisent l’induction de la mort cellulaire par apoptose des cellules tumorales traitées, via l’activation de la voie de caspases, et in vivo permettent le ralentissement de la croissance de tumeurs xénogreffées à des souris Nude. De plus, la stratégie thérapeutique adénovirale a montré ses extensions possibles sur d’autres types de cancers HPV-positifs, mais également via l’expression de différentes moléculaires thérapeutiques, visant à empêcher l’interaction des oncoprotéines telles qu’E6 avec leurs partenaires cellulaires et ainsi les empêcher d’exercer les activités biologiques impliquées dans le développement de cancers. Pour finir, les adénovirus peuvent également être vu comme des outils d’extinction fonctionnels d’E6 et permettant d’étudier les répercutions sur d’autres processus cellulaires. / Cervical cancer is the third most common female cancer. Infection by human papillomavirus (mainly HPV-16 and 18), with tropisms for mucosal or cutaneous squamous surfaces, is the major etiological agent implicated in cancer and tumor development. After infection, the oncogenic process is triggered by integration of oncoproteins E6 and E7 coding regions into the host cell genome. After integration, these oncoproteins interfere with the cell cycle and induce immortalization and cellular transformation of normal cells. The best known function of these two oncoproteins is the degradation of tumors suppressors p53 and pRb respectively. My thesis project consisted in the development of adenoviral vectors expressing miRNA directed against E6 oncoprotein. Their in vitro expression resulted in cellular death by apoptosis of the treated tumor cells, and allowed reduction of tumor growth in vivo in nude mice xenografts. In addition, the adenoviral therapeutical strategy showed its possible extensions on other types of HPV-positive cancers, but also through the possible expression of different therapeutic molecules aimed at preventing the interaction of viral oncoproteins, such as E6, with their cellular partners. These abolished interactions prevent oncoproteins from exercising their biological activities implicated in the development of cancers. In conclusion, we can say that adenoviruses can also be seen as functional tools suppressing E6 and enabling to highlight the repercussions of its suppression on other cellular processes.

L'objectif de cette thèse repose sur le développement de micelles de polymères polyioniques, vecteurs de molécules thérapeutiques en immunothérapie avec des cellules dendritiques (DCs). Elles sont préparées à partir d'un copolymère à blocs double-hydrophiles, l'acide polyméthacrylique-b-polyoxyde d'éthylène (PMAA-b-POE) et d'un contre ion de charge opposée. De taille nanométrique, elles sont capables d'encapsuler des molécules thérapeutiques selon une association tripartite originale et de se désassembler à pH acide pour permettre leur libération dans le milieu endosomal.Le premier axe de travail a porté sur l'évaluation de la propriété des copolymères à induire un échappement endosomal en fonction de leur masse molaire en utilisant deux modèles membranaires (liposomes et globules rouges). La complexation des copolymères de masses molaires différentes avec la poly-L-lysine comme contre-ion a permis l'obtention de micelles avec des propriétés d'échappement endosomal variables. Cette propriété est intéressante car en fonction de la stratégie thérapeutique adoptée, elle orientera le choix de la masse molaire du copolymère pour la formulation des micelles.Le second axe a consisté en l'application de ces micelles pour la vectorisation d'un peptide modèle (peptide OVA) dans les DCs. La capacité des micelles à encapsuler le peptide et à le libérer au niveau des compartiments endosomaux a été évaluée par des techniques de spectrofluorimétrie et de microscopie confocale. Enfin, l'efficacité de présentation du peptide formulé dans les différentes micelles a été mise en évidence et a montré l'amélioration de la présentation par les DCs du peptide formulé dans les micelles comparé au peptide non formulé. Cette présentation est nettement supérieure en utilisant les micelles composées de copolymères de masse molaire élevée qui n'entraînent pas d'échappement endosomal.Le troisième axe de recherche a reposé sur la transfection des DCs avec des micelles de siRNA dirigés contre la protéine de surface CD86. Seules les micelles composées de copolymères de faible masse molaire ont permis l'encapsulation du siRNA et la baisse de l'expression de la protéine CD86 à la surface des DCs. Afin d'optimiser la capacité des micelles à encapsuler et transfecter les DCs, la formulation des micelles a été optimisée en remplaçant la PLL par un autre polycation la polyethylene imine PEI. Ces micelles polyioniques à base de copolymère PMAA-b-POE apparaissent donc comme des vecteurs de molécules d'intérêt thérapeutique prometteurs pour les cellules dendritiques en immunothérapie ou en thérapie génique. / The aim of the thesis work is based on the development of polymeric micelles vectors of therapeutic molecules in immunotherapy with dendritic cells (DCs). They are composed of a double hydrophilic blocks copolymers, poly(methacrylic acid)-b-poly(ethylene oxide) (PMAA-b-PEO) and an oppositely charged polyion. They are caracterized by a nanometric size, a capacity to encapsulate therapeutic molecules according to a tripartite association and are able to disassemble at acidic pH allowing the release of their cargo.The first part of this work has focused on the evaluation of the endosomal escape property of copolymers based on their molecular weight by using two membrane models (liposomes and red blood cells). Complexation of different molecular weight copolymers with poly- L- lysine as counter ion allowed the formation of micelles with variable endosomal escape properties. This property is interesting because according to the adopted therapeutic strategy, it will guide the choice of the copolymer micelles for formulation.The second part consisted of the application of these micelles for the vectorization of a model peptide (OVA peptide) in DCs. The ability of micelles to encapsulate and release this peptide in the endosomal compartments was assessed by fluorescence spectroscopy and confocal microscopy techniques. Finally, the effectiveness of the OVA presentation formulated in the different type of micelles has been demonstrated and shown that the peptide presentation by DCs was improved when it was formulated in micelles compared to unformulated peptide. This presentation was much higher using micelles composed of high molecular weight copolymers that do not involve endosomal escape.The third part of the research was based on the transfection of DCs with siRNA directed against CD86 protein surface. Only micelles composed of low molecular weight copolymers allowed the encapsulation of siRNA molecules and decreased the expression of CD86 protein on DCs surface. To increase the ability of micelles to encapsulate and transfect DCs, the micelle formulation was optimized by changing the PLL with another polycation PEI.These polyion micelles based PMAA-b-PEO copolymers appear as vectors of therapeutic molecules for promising strategies with dendritic cells such as vaccination and gene therapy.

L’établissement et le maintien du patron d’expression génique sont d’une importance critique pour l’identité cellulaire. Les protéines du groupe Polycomb (PcG) agissent sur la chromatine afin de maintenir la répression génique de ses gènes cibles à travers les cycles cellulaires de façon épigénétique. Toutefois, durant la mitose, la structure de la chromatine est grandement altérée par la répression de la transcription, la condensation de la chromatine et le relâchement de nombreux facteurs de transcription. Une question se pose alors : comment les protéines PcG peuvent-elles maintenir leur fonction à travers la mitose ? En interphase, les protéines PcG sont liées à leurs cibles sur la chromatine. Durant la mitose, la majorité des protéines PcG se libèrent de la chromatine mais une petite fraction persiste. Selon l’hypothèse du mitotic bookmarking, cette fraction agirait comme un ensemble de marqueurs guidant le recrutement des protéines PcG en fin de mitose pour maintenir le profil d’expression génique de la cellule. Cependant, nous ne savons pas comment ce recrutement à lieu, ni comment une fraction de protéines PcG est retenue à la chromatine. Afin de répondre à ces questions, un crible à ARN interférent a été établi pour identifier des facteurs contrôlant la liaison des protéines PcG à la chromatine à travers le cycle cellulaire. Quoiqu’une confirmation soit nécessaire, les facteurs spécifiques à l’interphase sont enrichis en protéines co-purifiant avec la protéine PcG testée et en hélicases alors que ceux spécifiques à la mitose sont enrichis en candidats liés aux protéines du groupe Trithorax (TrxG). / A critical part of cell identity is the establishment and maintenance of gene expression patterns. Polycomb group proteins (PcG) act on chromatin to maintain gene repression through cell cycles (epigenetically). However, during mitosis, chromatin structure is greatly altered by transcription repression, chromatin condensation, and the release of many transcription factors. A question then arises: how can PcG proteins maintain their function through mitosis? During interphase, PcG proteins are bound to their chromatin targets. During mitosis, most PcG proteins are released from chromatin, but a small fraction remains bound to chromatin. According to the mitotic bookmarking hypothesis, this fraction acts as a set of markers to guide the recruitment of PcG proteins at the end of mitosis to maintain the gene expression profile. However, we do not know how this recruitment takes place, nor do we know how a fraction of PcG proteins is retained on chromatin. To address these questions, an RNAi screen was established to identify factors that control the binding of PcG proteins to chromatin across the cell cycle. Although a confirmation is necessary, factors identified from interphase cells were enriched in proteins co-purifying with the tested PcG protein and in helicases while mitosis specific factors were enriched in Trithorax group (TrxG) protein related candidates.

La différenciation sexuelle des Isopodes dépend d'une hormone sexuelle protéique, l'hormone androgène (HA), caractéristique des Malacostracés. Cet Insulin-Like Peptide suffit à induire par sa présence la différenciation mâle de ces Crustacés. Nous avons identifié in silico le transporteur circulant de l'HA, l'IGFBP-rP1, chez de nombreuses espèces d'Isopodes ainsi qu'à l'échelle des Crustacés. De la même façon, nous avons identifié deux récepteurs transmembranaires, l'IR1 et l'IR2, issus d'une duplication de gène spécifique des Malacostracés. Les patrons d'expression de ces gènes ont été étudiés sur notre espèce modèle, Armadillidium vulgare. Av-IGFBP-rP1 et Av-IR1 sont exprimés de manière ubiquiste et tout au long du développement. Av-IR2 est aussi exprimé à chaque stade de la différenciation mais ce transcrit est quasi-spécifique des glandes androgènes et ovaires. Une approche par ARNi a confirmé l'implication de ces trois protéines dans la voie de signalisation de l'HA. En effet, l'inhibition de l'HA, Av-IGFBP-rP1 et Av-IR1 provoquent l'hypertrophie des glandes androgènes, suggérant leur implication dans une boucle de rétro-contrôle de l'HA. L'inhibition de Av-IR2 semble seulement provoquer la différenciation d'ouvertures génitales femelles. Ces phénotypes sont comparables à ceux des intersexués mâles induits par la bactérie féminisante endogène Wolbachia. Nous montrons cependant que la bactérie altère seulement l'expression de l'HA et pas celle des récepteurs. Enfin, nous avons testé l'effet du bisphénol A mais nous n'observons pas d'altération de la différenciation sexuelle des larves lors d'expositions à ce perturbateur endocrinien exogène. / Sexual differentiation in Isopods relies on a proteinaceous sex hormone called androgenic hormone (AH), specific to Malacostracans. This Insulin-Like Peptide induces male differentiation by its mere presence in these Crustaceans. We identified in silico the circulating carrier of the AH, called IGFBP-rP1, in many Isopod species, but also on the crustacean scale. Similarly, we identified two transmembrane receptors, IR1 and IR2, coming from a gene duplication specific to Malacostracans. The expression patterns of these genes were investigated in our model species, Armadillidium vulgare. Av-IGFBP-rP1 and Av-IR1 are broadly expressed in the animal and throughout development. Av-IR2 is also expressed at each developmental stage but this transcript is almost specific to androgenic glands and ovaries. An RNAi approach has confirmed the implication of these three proteins in the AH signalling pathway. Indeed, the inhibition of AH, Av-IGFBP-rP1 and Av-IR1 induces androgenic gland hypertrophy, suggesting their implication in an AH feedback loop. Av-IR2 inhibition seems to provoke the differentiation of female genital apertures only. These phenotypes are similar to those of male intersexes induced by the endogenous feminizing bacterium Wolbachia. Yet, we show that the bacterium alters the expression of the AH only and not the one of its receptors. Finally, we have tested the effect of bisphenol A but we observe no alteration of the sexual differentiation in larvae upon exposition to this exogenous endocrine disruptor.