Ce travail porte sur l’identification, la fonction et la régulation des molécules maternelles d’ARNm qui dirigent la compétence développementale juste après la fécondation chez les bovins. Tout d’abord, en utilisant le modèle du temps écoulé jusqu’au premier clivage zygotique et à travers l’évaluation du transcriptome des embryons à 2-cellules, il fut possible de déterminer la signature moléculaire des niveaux extrêmes de compétence au développement et sélectionner des molécules candidates pour des études postérieures. Les résultats ont montré que les embryons de capacité développementale variable diffèrent dans certaines fonctions comme la réparation de l’ADN, le traitement de l’ARN, la synthèse de protéines et l'expression génique définies par des ARNm synthétisés par l’ovocyte. Pour obtenir une confirmation fonctionnelle, une paire de transcrits maternels (l’un détecté dans notre sondage précédent et l’autre étant une molécule reliée) ont été inhibés par « knock-down » dans des ovocytes. Les effets du knock-down de ces facteurs de transcription sont apparus avant la formation des blastocystes dû à une diminution de la capacité au clivage et celle à progresser après le stage de 8-cellules. L’analyse moléculaire des embryons knock-down survivants suggère qu’un de ces facteurs de transcription est un contrôleur crucial de l’activation du génome embryonnaire, qui représente une fenêtre développementale dans l’embryogenèse précoce. Dans la dernièr étude, nous avons testé si les facteurs de transcription d'intérêt sont modulés au niveau traductionnel. Des ARNm rapporteurs couplés à la GFP (Protéine fluorescente) contenant soit la version courte ou la version longue de la séquence 3’-UTR des deux molécules furent injectées dans des zygotes pour évaluer leur dynamique traductionnelle. Les résultats ont montré que les éléments cis-régulateurs localisés dans les 3’-UTRs contrôlent leur synchronisation traductionnelle et suggèrent une association entre la compétence développementale et la capacité de synthèse de ces protéines. Ceci conduit à l’idée que ces facteurs de transcription cruciaux sont aussi contrôlés au niveau traductionnel chez les embryons précoces. Les connaissances acquises ont joué un rôle essentiel pour définir le contrôle potentiel des molécules maternelles sur les embryons au début de leur développement. Cette étude nous montre aussi une utilisation potentielle de cette information ainsi que les nouveaux défis présents dans le secteur des technologies reproductives. / This work explores the identity, the function, and the regulation of maternal mRNA molecules that drive developmental competence shortly after fertilization in cattle. First of all, by using the model of the time of first zygotic cleavage and assessing the transcriptome of 2-cell embryos, it was possible to determine the molecular fingerprint of extreme levels of developmental competence and select candidate molecules for further monitoring. Data implied that early embryos of variable developmental capacity differ in functions including DNA repair, RNA processing, protein synthesis, and gene expression that are dictated by oocyte-synthesized mRNA. To obtain a functional confirmation, a pair of maternal transcripts (one detected in our previous survey and other related molecule) were knocked-down in oocytes that were further cultured. The effects of ablating these transcription factors were evident before blastocyst formation due to a decrease in cleavage capacity, as well as progression past the 8-cell stage. The molecular analysis of surviving knocked-down embryos suggested that one of these transcription factors is a pivotal orchestrator of the activation of the embryonic genome, a critical developmental window in early embryogenesis. In the last survey, we asked whether the transcription factors of interest are modulated at the translational level. Reporter mRNAs containing either short or long versions of the 3’-UTR sequences of both molecules were injected in zygotes to look at their translational dynamics. Results showed that cis-acting elements located in the 3’-UTRs govern their timely translation and suggested an association between developmental competence and protein synthesis capacity. This led to the notion that these crucial transcription factors are also controlled at the translational level in early embryos. The acquired knowledge was instrumental to define the possible control operated by maternal molecules on embryos at the onset of their development, as well as some of the challenges and potential use of this information in the field of reproductive technologies.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales 2003-2004 / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire grave qui engendre une perte d’autonomie des patients et diminue leur espérance de vie. Cette maladie est la plus fréquente des dystrophies musculaires chez l’adulte avec une incidence mondiale d’une personne atteinte sur 15 000. Au Québec, cette maladie est d’une importance particulière, car elle touche une personne sur 500 dans les régions du Saguenay et de Charlevoix. La DM1 est causée par l’expansion du triplet CTG situé dans la région 3’ non-codante de la myotonine protéine kinase (DMPK). Toutefois, il a été démontré que la grande part des symptômes de la maladie seraient liés à l’accumulation nucléaire de l’ARNm de DMPK portant l’expansion. Ces ARNm mutés se lient à des facteurs nucléaires formant des foci dans les noyaux des cellules DM1, engendrant des effets toxiques sur le métabolisme cellulaire et sur l’épissage alternatif de certains ARNm. Nos travaux avaient comme but premier d’évaluer si la destruction de l’ARNm mutant de DMPK dans des myoblastes provenant de muscle squelettique DM1 permettrait de rétablir certaines fonctions et caractéristiques normales dans ces cellules. Trois technologies à base d’ARNs: les antisens, les ribozymes et les shRNAs ont diminué avec succès ces niveaux d’ARN mutés. Les ARNs antisens et les ribozymes, contrairement aux shRNA, ont permis un ciblage préférentiel des ARNs mutés de DMPK dans le noyau de myoblastes DM1. Ceci permet donc de maintenir un niveau basal de la protéine DMPK dans les myoblastes, un détail important advenant l’utilisation de ces molécules en thérapie génique chez l’humain. En utilisant les ribozymes, nous avons diminué la quantité et l’intensité des foci ce qui a permis de libérer les facteurs cellulaires se liant aux expansions de CUG. Ceci a eu comme effet de corriger un défaut d’épissage alternatif dans le récepteur à l’insuline. En exprimant de longs antisenses à l’ARNm de DMPK par un oncorétrovirus, nous avons constaté une restauration de la fusion cellulaire, de la capture de glucose ainsi qu’une diminution de CUGBP, un facteur d’épissage alternatif. Nous avons également démontré que la surexpression de hnRNP H, un facteur d’épissage liant les expansions de CUG, permettait aussi de diminuer les niveaux de CUGBP et ainsi corriger le défaut d’épissage alternatif du récepteur à l’insuline. Ces résultats démontrent donc pour la première fois le lien direct entre la rétention des ARNs mutés, la déplétion nucléaire d’un facteur d’épissage s’y liant et l’exacerbation de certaines caractéristiques du phénotype DM1. La somme de nos observations a permis deux choses importantes: en premier lieu, d’établir un nouveau modèle détaillé expliquant la pathogenèse de la DM1. En second lieu, nos résultats ont permi de valider la pertinence de détruire spécifiquement les transcrits mutés de DMPK afin de développer une thérapie génique efficace pour la DM1. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a severe neuromuscular disease that ultimately causes loss of mobility and premature death. DM1 is the most common muscular dystrophy in adults with a world wide incidence of 1 affected individual in every 15 000. This disease is of special relevance in the Saguenay and Charlevoix regions in Quebec, where 1 in every 500 individuals is a carrier of the mutation. DM1 is caused by the expansion of an unstable CTG trinucleotide repeat located in 3’UTR of the DMPK (DM protein kinase) gene. However, it has been shown that most DM1 symptoms are related to the nuclear retention of mutant DMPK mRNA. These mutant transcripts bind to nuclear proteins and form foci in DM1 cell nuclei. This is though to be the leading cause of metabolical disruptions and defective alternative splicing of several mRNAs observed in DM1 cells. Our main project objective was to evaluate whether destruction of mutant DMPK mRNA could restore normal phenotype features in DM1 human skeletal myoblasts. The use of three RNA-based approaches: antisense RNAs, ribozymes and shRNAs, all displayed significant reductions in mutant DMPK mRNA. Antisense RNAs and ribozymes, as opposed to shRNAs, allowed specific targeting and destruction of mutant DMPK mRNAs in the nucleus of DM1 myoblasts. This feature thus allows a basal level of DMPK protein expression which is of particular relevance in the advent of developing a gene therapy for DM1. Ribozymes were effective in reducing the number and intensity of foci present in the nucleus of the myoblasts, thus allowing the release of certain CUG-binding proteins. This resulted in restoration of the defective splicing of the insulin receptor mRNA. Antisense RNAs to the DMPK mRNA expressed by an oncoretrovirus restored myoblast fusion, glucose uptake and lowered nuclear levels of CUGBP, an alternative splicing factor. Over expression of hnRNP-H, an alternative splicing factor that we showed could bind to CUG repeats, also reduces expression of CUGBP and restores defective splicing of the insulin receptor. These results reveal for the first time the intricate link between mutant DMPK mRNA nuclear retention, depletion of a CUG-binding protein that is also a splicing factor and exacerbation of related DM1 features. In conclusion, our work has allowed to better define the mechanisms involved in DM1 pathogenesis and has validated the relevance of developing a gene therapy that specifically targets mutant DMPK mRNAs.

Thèse (Ph. D.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 300-391. Publié aussi en version électronique.

Chez une multitude de métazoaires étudiés, une période de quiescence transcriptionnelle est observée chez le jeune embryon suite à la fécondation de l'ovocyte. La durée de cette période est spécifique à chaque espèce et chez le bovin, l'embryon n'active son propre génome qu'aux stades 8- à 16-cellules. Précédemment à cette activation de la transcription, l'embryon subsiste grâce à l'utilisation des ARNm et des protéines fournies par l'ovocyte. C'est également à partir de ces réserves que l'embryon doit puiser les différents facteurs impliqués dans l'activation de son génome au moment requis. Les expériences présentées dans cette thèse étaient destinées à améliorer nos connaissances de l'activation du génome embryonnaire chez le bovin. Dans un premier temps, la caractérisation de l'expression de plusieurs facteurs de transcription chez l'embryon a été effectuée et le rôle envisageable de ces facteurs dans l'activation du génome a aussi été démontré. Par la suite, nous avons établi une liste exhaustive de plus de 300 transcrits embryonnaires exprimés très tôt dès l'activation du génome. Cette étude du transcriptome a permis l'identification d'une multitude de gènes associés à la transcription et au maintient de la pluripotence que l'on retrouve chez les cellules embryonnaires. Afin de définir la fonction ou le rôle des différents joueurs identifiés lors de nos études, nous avons mis au point un procédé qui cible spécifiquement un transcrit donné et induit sa dégradation dans les ovocytes bovins sans toutefois induire des effets collatéraux dommageables sur la compétence au développement de ces ovocytes. Cette méthode utilise l'interférence ARN qui réduit à des niveaux très faibles la présence d'un transcrit ciblé, ce qui permet d'étudier les effets de sa perte de fonction. Cette méthode a permis d'établir le rôle crucial dans l'embryon d'un gène issu de nos premières études : MATRIN 3. La dégradation de l'ARN de MATRIN 3, une composante architecturale de la matrice nucléaire qui agit aussi au niveau de la transcription, s'est avérée avoir des effet néfastes sur la survie embryonnaire. Les informations fournies par la combinaison des études présentées dans cette thèse contribuent à dresser un portrait mieux défini de l'activation du génome chez le bovin.

Ce travail explore certains mécanismes moléculaires impliqués dans la genèse des dyskinésies induites par la dopa thérapie. Nos travaux ont été effectués sur des échantillons de cerveaux de singes parkinsoniens ayant développé des complications motrices suite au traitement à la Lévodopa. Nos résultats montrent l'absence de corrélation entre les niveaux striataux de l'ARNm de la préprotachykinine et la survenue des dyskinésies et l'existence d'un lien de causalité entre l'augmentation des niveaux striataux des ARNm de la préproenképhaline et de la préprodynorphine ainsi que l'augmentation de la densité des récepteurs GABA-A au niveau des noyaux gris centraux et la physiopathologie de ces dyskinésies. Les traitements adjuvants avec le Ro 61-8048 , l'acide docosahéxaénoïque et le CI-I041 en association avec la Lévodopa, permettent de corriger certains paramètres biochimiques impliqués , dans la genèse de ces complications motrices et de prévenir ces dyskinésies sur le plan comportemental contrairement au Naltrexone qui les a exacerbées.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la forme adulte la plus fréquente dans le monde occidental. Les patients atteints présentent un parcours clinique très variable. Il s’avère important d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’optimiser à la fois la prise en charge du patient et le traitement. Une étude antérieure de notre groupe révèle une surexpression en ARN du marqueur UGT2B17dans les lymphocytes d’un sous-groupe de patients LLC. Les niveaux d’expression UGT2B17 élevés sont associés à un mauvais pronostic et une réponse réduite aux traitements utilisant la fludarabine (FC/FCR). Bien que les UGT soient connus pour leur rôle important dans l’inactivation et l’élimination des médicaments, ces enzymes régulent aussi l’équilibre de molécules endogènes, notamment les hormones stéroïdiennes. L’hypothèse du projet de doctorat stipule qu’UGT2B17 module des fonctions cellulaires favorisant la progression de la LLC et la résistance aux médicaments. Ces effets peuvent être médiés via sa fonction enzymatique i) en modifiant certains substrats endogènes, entraînant un effet sur les voies cellulaires, influençant le profil oncogénique des cellules LLC et ii) en inactivant les composés pharmacologiques, entraînant ainsi une réponse réduite au traitement anti leucémique. Une première étude a permis d’établir les liens entre les niveaux d’expression d’UGT2B17, l’exposition hormonale, et la survie des patients leucémiques (n=156). Nos travaux révèlent une perturbation des niveaux hormonaux chez les patients atteints de LLC comparés aux sujets sains. De plus, les niveaux de certaines hormones stéroïdiennes sont associés à la survie des patients et ce, de manière différente selon le sexe. Cela suggère un dimorphisme sexuel quant à l’influence des voies hormonales sur la progression de la maladie. Toutefois, ces effets semblent indépendants du statut génétique et d’expression d’UGT2B17, l'UGT prédominante dans les lymphocytes B. Conformément à la signature pronostique défavorable associée à UGT2B17 in vivo, sa surexpression dans des modèles cellulaires est associée à une prolifération accrue des lymphocytes B. Les analyses transcriptomiques révèlent qu'un taux élevé d'UGT2B17 est associé à une altération de gènes liés à la prostaglandine E2 (PGE₂), à la fois dans les modèles et dans une cohorte de 448 patients LLC. Les analyses fonctionnelles montrent que le PGE₂ favorise l’apoptose des cellules leucémiques de patients et réduit la prolifération des modèles cellulaires. Son effet est partiellement aboli par l’expression élevée d’UGT2B17. Les analyses enzymatiques démontrent qu’UGT2B17 inactive PGE₂ par sa conjugaison à l’acide glucuronique (GlcA), ce qui entraîne la formation de deux glucuronides (G). Ceci est soutenu par l’inactivation efficace de PGE₂ en PGE₂-G dans les cellules de patients atteints de LLC exprimant UGT2B17. Pour cette seconde étude, nous concluons que la glucuronidation du PGE₂ par l’enzyme UGT2B17 altère les effets anti-oncogéniques de PGE2 dans les cellules leucémiques, contribuant possiblement à la progression de la maladie chez les patients atteints de LLC présentant des niveaux élevés d'UGT2B17. Nous avons par la suite étudié l’implication de l’enzyme UGT2B17 dans l'inactivation de la fludarabine et de thérapies ciblées émergentes, et si cette voie affecte la réponse au traitement. Des niveaux élevés d'UGT2B17 sont associés à une sensibilité réduite à la fludarabine, l'ibrutinib et l'idelalisib dans deux modèles cellulaires lymphoïdes. Comme chez les patients atteints de LLC traités à la fludarabine, l'exposition des modèles à la l'ibrutinib et l'idelalisib induit l'expression d’UGT2B17. Nos résultats révèlent que l'UGT2B17 affecte possiblement la signalisation de la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK) et que son expression est régulée par un promoteur alternatif. Outre la fludarabine, l'ibrutinib et l'idelalisib, nous avons démontré la formation de glucuronides par spectrométrie de masse pour un nombre important de médicaments utilisés en LLC. La majorité de ces antileucémiques sont conjugués par UGT1A4, alors que la fludarabine, le venetoclax, le cerdulatinib et le chlorambucil sont également conjugués par UGT2B17. Les glucuronides de la fludarabine et de l’ibrutinib sont détectés en circulation des patients LLC traités. Ces données supportent un mécanisme spécifique pour la modification de la réponse au médicament par UGT2B17 impliquant l’inactivation directe du médicament dans les cellules B néoplasiques, contribuant ainsi à la réponse au traitement chez les patients atteints de LLC présentant des niveaux élevés d'UGT2B17. Cependant, nos résultats suggèrent des mécanismes additionnels pour les molécules qui ne sont pas des substrats de l’enzymeUGT2B17.

Pendant l'ovogenèse, l'ovocyte synthétise et emmagasine de nombreux ARNm maternels dans un état de traduction inactive. Ils sont traduits pendant la maturation et le développement embryonnaire grâce à la polyadénylation cytoplasmique, qui est régulée par des éléments spécifiques localisés dans leur 3' UTR. Les expériences présentées dans cette thèse ont été menées chez l'ovocyte bovin afin de mieux comprendre la régulation de la traduction par la polyadénylation cytoplasmique d'ARNm maternels. En étudiant l'ARNm de la cycline Bl, nous avons démontré que la polyadénylation cytoplasmique et l'initiation de la traduction peut survenir avant la maturation in vitro de l'ovocyte. Nous avons ensuite identifié et caractérisé un nouveau gène de l'ovocyte bovin nommé OOSPI (oocyte-secreted protein 1), qui est exprimé sous deux variants d'épissage : OOSPI vl (variant 1); et OOSPI_v2 (variant 2). Les transcrits de ce gène sont présents en grande quantité dans les ovocytes immatures (GV) et sont dégradés graduellement pendant la maturation et le développement, sans être exprimés à nouveau suite à l'activation du génome embryonnaire. Nous avons démontré que le gène OOSPI est un marqueur ovocyte-spécifique et que l'ARNm OOSPI vl est un marqueur de compétence au développement. L'étude de l'état de polyadénylation de l'ARNm OOSPI vl a permis de découvrir que sa queue poly(A) est longue dans les ovocytes en GV, allongée dans le zygote et raccourcie dans l'embryon au stade 8 cellules. Ce profil de polyadénylation est similaire à celui d'autres ARNm maternels ovocytaires possédant un CPE de type embryonnaire (eCPE) dans leur 3' UTR, comme celui de l'ARNm OOSP1 vl. Nous n'avons pu étudier l'initiation de la traduction de l'ARNm OOSPI vl puisque la protéine OOSPI vl est déjà présente dans les ovocytes immatures et matures (Mil), sous trois masses moléculaires différentes. La forme protéique de faible masse moléculaire disparaît complètement en fonction du temps après 18 h de fécondation in vitro. Seule la forme protéique de masse moyenne est encore présente dans les blastocystes. Nous avons montré que l'ARNm OOSPI vl et la protéine qu'il code sont finement régulés lors de la fécondation et du développement embryonnaire. / During oogenesis, the oocyte synthesizes and stores numerous maternal mRNA in a translational inactive state. Their translation is linked to cytoplasmic polyadenylation during maturation and embryo development and is driven by specific elements in their 3' UTR. The experiments presented in this thesis were conducted in the bovine oocyte to better understand translation regulation of maternal mRNA by cytoplasmic polyadenylation. With the study of cyclin Bl mRNA, we demonstrated that cytoplasmic polyadenylation and translation initiation can occur before in vitro maturation of the oocyte. We then identified and characterized a novel bovine oocyte gene named OOSP1 (oocyte-secreted protein 1), that is expressed under two splicing variants : OOSP1 vl (variant 1); and OOSPlv2 (variant 2). These transcripts are highly present in immature (GV) oocytes and are gradually depleted during maturation and development, without being reexpressed following embryonic genome activation. We showed that the OOSP1 gene is an oocyte-specific marker and that OOSPlvJ mRNA is a marker for developmental competence. The study of OOSPlvl mRNA polyadenylation status showed that its poly(A) tail is long in GV stage oocytes, elongated in zygotes and shortened in 8-cell embryos. This polyadenylation pattern is similar to the ones of other oocyte maternal mRNA bearing an embryonic type CPE (eCPE) in their 3' UTR, as the one present in OOSPlvl mRNA. We were not able to study OOSPlvl mRNA translation initiation since OOSPljvl protein was already present, in three different molecular masses, in immature and mature (Mil) oocytes. The low molecular mass protein form disappears in a time-dependant manner after 18 h of in vitro fertilization and only the medium molecular mass protein form is still present in blastocysts. We demonstrated that OOSP1 vl mRNA and its encoded protein are finely regulated during fertilization and embryo development.

L’expression des gènes chez les organismes eucaryotes est un processus hautement régulé dans l’espace et dans le temps. Les ARN messagers, premièrement décrits comme simples intermédiaires entre l’ADN et les protéines, s’avèrent être des éléments centraux de la régulation de l’expression génique :les régulations post-transcriptionnelles vont influencer la stabilité, la traductibilité et la localisation des ARN messagers (ARNm). Le contrôle de la dégradation des ARNm est un moyen efficace d’adapter rapidement la production des protéines en fonction des besoins de la cellule. La dégradation des ARNm est un processus actif qui nécessite soit l’élimination de la coiffe en 5’ ou de la queue polyA en 3’, soit un clivage endonucléolytique. Dans la plupart des cas, le messager est premièrement déadénylé, puis décoiffé avant d’être dégradé dans le sens 5’-3’ ou dans le sens 3’-5’. De plus, les ARNm en cours de dégradation sont relocalisés dans des granules cytoplasmiques appelés Processing Bodies où les facteurs de la dégradation sont concentrés. On trouve dans les messagers codant pour des protéines dont la production doit être finement régulée, une variété importante d’éléments régulateurs (éléments cis) le plus souvent au sein de leur région 3’ non traduite. La régulation de la stabilité d’ARNm porteurs d’éléments riches en adénine et uridine (ARE) dans leur région 3’ non traduite (3’UTR) par les protéines capables de reconnaitre et lier ces éléments (ARE-BP) constitue un des exemples les plus documentés de régulations post-transcriptionnelles de l’expression des gène, mais le mécanisme moléculaire de cette régulation est encore mal compris.<p>Nous avons utilisé le messager codant pour le peptide antimicrobien CécropineA1 lié par l’ARE-BP dTIS11 comme modèle pour étudier les régulations post-transcriptionnelles dépendantes des ARE chez la drosophile. Au cours de ce travail, nous avons démontré que le messager CecA1 subit une déadénylation biphasique. En effet, une déadénylation initiale racourcie la queue polyA sans diminuer la quantité de messager, puis une seconde déadénylation, prise en charge par le complexe de déadénylation CCR-NOT nécessite la présence de la protéine dTIS11 et conduit à la dégradation totale du transcrit. L’observation des intermédiaires de la dégradation nous montre que, après sa déadénylation totale, le messager est décoiffé, puis dégradé dans les deux directions: 3’-5’ et 5’-3’. Contrairement à ce qui a été montré pour ces homologues mammifères, la protéine dTIS11 n’induit pas l’accumulation du messager CecA1 dans les Processing Bodies mais favorise la deuxième phase de déadénylation alors que le messager CecA1 est associé à la machinerie de traduction afin d’induire une dégradation rapide et efficace du transcrit.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction<p><p>Avec plus de 7000 cas diagnostiqués par an en Belgique, le cancer bronchique est l’un des cancers les plus fréquents chez l'homme. Son pronostic est très réservé, la survie à 5 ans tous stades confondus étant inférieure à 15 %. Ce faible taux de guérison s’explique en grande partie par le fait que le diagnostic se réalise généralement à un stade avancé de la maladie. Une méthode de détection précoce, l’endoscopie en autofluorescence, exploite des variations de la fluorescence bronchique sous l'effet d'un laser et permet ainsi de dévoiler des lésions précancéreuses invisibles en lumière blanche. Réalisée à l’Institut Jules Bordet depuis 1996, la photodétection nous a permis de constituer une banque de biopsies d’épithélium bronchique à tous les stades de la carcinogenèse bronchique, conservées initialement en blocs paraffinés et, depuis 2003, par congélation. <p><p>Hypothèse<p><p>Nous avons émis l’hypothèse que la compréhension de la genèse du carcinome épidermoïde bronchique par la caractérisation de l’évolution des anomalies moléculaires dans les lésions précancéreuses et cancéreuses de l'arbre bronchique nous permettrait d’identifier de nouvelles cibles de détection et éventuellement de chimioprévention pour le cancer bronchique. L'objectif de nos travaux a donc été de caractériser les modifications moléculaires successives et/ou cumulatives sous-jacentes à la transition entre les différents stades histologiques de la carcinogenèse épidermoïde bronchique (épithélium bronchique normal du fumeur, hyperplasie, métaplasie, dysplasies légère, modérée et sévère, CIS et les carcinomes invasifs). Différentes techniques complémentaires ont été successivement utilisées à cet effet :1) étude de l’expression protéique par immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF), 2) étude de l’expression des ARNs messagers par microdamiers, 3) étude de l’expression des microARNs par RT-PCR quantitative.<p><p>Travaux réalisés<p><p>Afin de sélectionner les protéines à étudier aux différents stades de la carcinogenèse épidermoïde bronchique, nous avons réalisé une étude méthodologique de la littérature chez les patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC). En effet, d’une part, la petite taille des biopsies bronchiques que nous projetions d’étudier et, d’autre part, le faible taux de découvertes de lésions de haut grade lors de la réalisation de bronchoscopies en fluorescence limitent le nombre d’analyses réalisables. Les revues systématiques de la littérature, intégrant une analyse méthodologique des études publiées et une méta-analyse de leur impact pronostique en terme de survie, ont permis de choisir une série de marqueurs sur base de leur intérêt potentiel grâce à la puissance apportée par l’agrégation de grands nombres de cas. <p><p>La mutation de KRAS identifiée par PCR constitue un facteur péjoratif pour la survie des patients atteints de CBNPC et plus spécifiquement des adénocarcinomes (ADC). Etant donné que notre projet est consacré à la genèse du carcinome épidermoïde bronchique (CEB), nous n’avons pas étudié ce facteur dans nos biopsies. <p><p>Par contre, les revues systématiques ont montré un impact en terme de survie dans les CBNPC, y compris dans les CEB, pour l’angiogenèse, des récepteurs de facteurs de croissance épithéliale (EGFR et c-erbB-2) et des marqueurs de la prolifération cellulaire (Ki-67). Nous avons donc étudié l’expression de ces protéines par IHC dans les lésions précurseurs de CEB et dans les CEB. L’expression de Ki-67 est augmentée aux stades de dysplasie sévère et de CIS par rapport à ceux de dysplasies légère et modérée. La mesure de l’expression de Ki-67 dans ces biopsies aide donc à les classifier en lésions de bas et de haut grade. L’étude de la corrélation de l’expression de plusieurs protéines (EGFR, c-erbB-2 et Ki-67) dans les mêmes lésions bronchiques a montré que la majorité des biopsies de haut grade (dysplasies sévères et CIS) expriment anormalement EGFR et/ou Ki-67. Par contre, l’homologue d’EGFR, c-erbB-2, n’apparaît que plus tardivement, dans les carcinomes invasifs. <p><p>Nous avons également caractérisé l’expression de protéines impliquées dans les voies de l'apoptose dans les lésions précurseurs de CEB. L’expression du facteur suppresseur de tumeurs p53 s’est avérée être un marqueur pronostique péjoratif important pour la survie des patients atteints de CNBPC et augmente dès les premières étapes de la tumorigenèse bronchique et même déjà dans l’épithélium morphologiquement normal du fumeur. L'altération de l'expression de p53 est donc un événement très précoce dans la genèse du CEB et la positivité de p53 augmente ensuite avec la sévérité des lésions. Dans le but de caractériser les voies de contrôle de p53 au cours de la carcinogenèse épidermoïde bronchique, nous avons analysé l'expression de 3 autres protéines, MDM2, p14arf et la nucléophosmine (NPM), dans une série de 200 biopsies. L’expression de MDM2, NPM et p14arf est respectivement altérée aux stades de dysplasie légère, modérée et sévère. Au stade de dysplasie sévère, l’expression de p14arf, inhibiteur de MDM2, peut soit disparaître, soit se concentrer dans les nucléoles. Tant la perte de p14arf que sa concentration dans les nucléoles sont associées à une augmentation de l’expression de MDM2. Nous avons également observé que la délocalisation de NPM depuis le nucléoplasme vers le nucléole est hautement corrélée à celle de p14arf. En IF, NPM et p14arf colocalisent dans le nucléoplasme dans les échantillons de bas grade ou dans les nucléoles dans les lésions de haut grade. Par contre, la protéine MDM2 n’est détectée dans les nucléoles quelles que soient les localisations de p14arf ou de NPM et quel que soit le stade. Ces données sont en faveur de l’hypothèse selon laquelle la localisation de p14arf dans les nucléoles empêcherait la formation des complexes p14arf–MDM2 et pourrait ainsi faciliter la carcinogenèse pulmonaire. Nos résultats suggèrent également que la présence de NPM dans le nucléoplasme pourrait jouer un rôle protecteur contre le dommage cellulaire et la transformation maligne tandis que sa délocalisation vers les nucléoles et ce, peut-être par la délocalisation de p14arf, favoriserait la carcinogenèse bronchique. Enfin, suite à la réalisation d’une méta-analyse montrant le rôle de la cyclooxygénase 2 (COX-2) en tant que facteur pronostique dans les CBNPC de stade précoce, l’expression de la protéine COX-2 a été analysée par IHC dans 106 biopsies. Cette étude montre que cette protéine s’accumule exclusivement à partir du stade de dysplasie sévère, permettant ainsi de séparer les lésions bronchiques de bas et de haut grade. Avec une haute valeur prédictive positive (100 %) et une bonne valeur prédictive négative (82,35 %), COX-2 apparaît donc comme un marqueur précoce potentiel à tester pour le dépistage du cancer bronchique.<p><p>En parallèle à ces travaux, nous avons collecté des biopsies fraîchement congelées aux différents stades de la carcinogenèse épidermoïde pour une analyse du transcriptome. La première étape a consisté à définir le profil d’expression génique par la technique des microdamiers. Après son extraction et sa rétrotranscription, l’ARN a été marqué et hybridé sur des lames commercialisées par Agilent Technologies. Au total, 122 échantillons, dont minimum 12 de chaque catégorie, ont été hybridés avec un contrôle commun (issu d’un mélange de biopsies bronchiques normales de non-fumeurs). Une analyse en composante principale a montré que la hiérarchie de la classification histologique était bien représentée par les profils d’expression génique des biospies aux différents stades. Quelle que soit la liste de gènes de départ sélectionnée pour réaliser le regroupement hiérarchisé, nous avons observé, de manière constante et robuste, une différence majeure de profil d’expression génique entre, d’une part, les tissus bronchiques les plus « normaux » (normal normofluorescent, histologiquement normal mais hypofluorescent et hyperplasie) et, d’autre part, toutes les autres catégories histologiques dites « anormales ou modifiées » à partir de la métaplasie jusqu’au carcinome invasif. Parmi les épithéliums bronchiques « modifiés », deux grands groupes se distinguent :d’un côté, les métaplasies et dysplasies légères, qui sont très souvent bénignes et réversibles pour la plupart, et de l’autre côté, les dysplasies sévères, les CIS et les carcinomes invasifs, lésions à risque beaucoup plus élevé d’évoluer vers un cancer ou déjà malignes. Les échantillons au stade de dysplasie modérée se classent tantôt dans le deuxième groupe avec les dysplasies légères tantôt dans le troisième avec les dysplasies sévères. Il semble donc que le stade histologique de la dysplasie modérée soit un groupe hétérogène n’ayant pas de réalité biologique et qu’il serait plus adéquat de les reclasser dans un des 2 autres groupes sur base des arguments moléculaires. Nous avons obtenu les listes de gènes dont l’expression varie de manière statistiquement significative entre les différentes étapes de la carcinogenèse épidermoïde bronchique. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence un profil d’expression génique permettant de discriminer les lésions bronchiques de mauvais pronostic (dysplasies sévères ou plus) de celles de meilleur pronostic (tissu normal et anomalies morphologiques de bas grade). Les gènes qui constituent ce profil permettant d’identifier les lésions de mauvais pronostic sont des candidats pour la détection précoce du cancer bronchique. De plus, nos données de génomique confirment la surexpression de certains ARNs messagers correspondant à des protéines dont la surexpression a été rapportée dans les études d’IHC comme COX-2, MDM2, Ki-67, les cytokératines, les métallopeptidases, les cyclines. Par ailleurs, certaines protéines dont le rôle dans les cancers pulmonaires invasifs a déjà été décrit mais pas aux stades pré-invasifs, parmi lesquelles la protéine PTH-like, des protéines liées à TNF ou d’autres liées à IGF, E2F ou à Wnt, semblent impliquées aux stades précoces de la carcinogenèse épidermoïde bronchique. Enfin, de nouveaux acteurs possibles de ce processus ont été mis en évidence.<p><p>Nous avons également étudié l’évolution de l’expression des microARNs au cours de la carcinogenèse bronchique par des RT-PCR quantitatives (LDA) sur 60 des biopsies dont nous avons étudié le transcriptome (6 par catégorie) et en utilisant la classification en 3 groupes issue des analyses des microdamiers d’expression génique. Cette étude montre que plusieurs miARNs sont différentiellement exprimés durant la carcinogenèse bronchique. De plus, deux étapes successives et distinctes ont été mises en évidence pour l’évolution de l’expression des miARNs au cours de la carcinogenèse bronchique. Aux stades les plus précoces, correspondant à la progression de l’épithélium normal du non-fumeur vers l’épithélium histologiquement normal du fumeur et l’hyperplasie jusqu’au groupe des anomalies morphologiques relativement bénignes (métaplasie, dysplasies légère et modérée), on observe une réduction significative de l’expression de la grande majorité des miARNs. Aux stades plus tardifs de la carcinogenèse (dysplasie sévère, CIS et CEB), même si 74 % des miARNs altérés restent encore régulés négativement par rapport à leur niveau d’expression dans l’épithélium normal du non-fumeur, la proportion de miARNs dont l’expression est augmentée (43 %) s’accroît par rapport à leur niveau d’expression dans les stades qui les précèdent (métaplasie, dysplasies légère et modérée). En outre, lorsque l’on compare ce dernier groupe à celui des lésions plus sévères (dysplasie sévère et CIS), qui progressent fréquemment vers des carcinomes invasifs, 80 % des miARNs augmentent leur niveau d’expression. Par ailleurs, l’expression de certains microARNs évolue de manière linéaire. En particulier, l’expression de miR 34c, cible transcriptionnelle de p53, et celle de miR 15a, inhibiteur de Bcl2, diminuent progressivement entre les différents stades à partir du tissu bronchique normal du non-fumeur jusqu’au CEB. Enfin, les profils d’expression des miARNs permettent de prédire avec précision la classification histologique non seulement entre les lésions de bas grade (métaplasie, dysplasies légère et modérée) et de haut grade (dysplasie sévère et CIS) mais également entre les CIS et les carcinomes invasifs. Les miARNs qui constituent ces signatures sont donc des candidats potentiels pour la détection précoce du cancer bronchique.<p><p>Conclusions<p><p>Nos travaux montrent que les anomalies moléculaires apparaissent aux stades les plus précoces de la transformation maligne de l’épithélium bronchique. L’expression protéique des marqueurs étudiés -p53, MDM2, p14arf, NPM, Ki-67, COX-2, c-erbB-2, et EGFR- permet d’affiner la classification des lésions bronchiques précancéreuses et de mieux comprendre les voies de la carcinogenèse précoce. Les profils d'expression des gènes et des microARNs apportent une approche originale des étapes successives du processus de carcinogenèse épidermoïde bronchique et ont mis en évidence des signatures permettant de discriminer les lésions qui sont à très haut risque de progression vers un cancer invasif ou qui sont déjà néoplasiques de celles de meilleur pronostic. Les marqueurs qui constituent ces profils sont des candidats potentiels pour la détection précoce du cancer bronchique.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The export of mRNAs from the nucleus to the cytoplasm is one of many steps along the gene expression pathway and is fundamental for mRNAs to meet with ribosomes for translation in the cytoplasm. Exchanges between nucleus and cytoplasm occur through the nuclear pore complex (NPC), which is a large multi-protein complex embedded in the nuclear membrane and assembled by 30 different proteins the nucleoporins. The nucleoplasmic side of the pore is believed to orchestrate many fundamental nuclear processes. Indeed, a growing body of evidence suggests that the nuclear pore is involved in a broad range of activities including modulation of DNA topology, DNA repair, epigenetic regulation of gene expression, and selective access to exporting molecules. The structural component required for orchestrating those nucleoplasmic functions is the basket, a ∼60- to 80-nm-long structure protruding into the nucleoplasm. The consensus view depicts the basket as a structure assembled by filamentous proteins, TPR (Translocated Promoter Region protein) in humans and by its two paralogues Mlp1 and Mlp2 (myosin-like proteins) in yeast, converging into a distal ring. In the first part of this thesis, we characterized the motion of specific mRNAs at the vicinity of the nuclear periphery. We observed that transcripts scan along the nuclear envelope, likely to find a nuclear pore to be exported. We also showed the scanning behavior was affected upon Mlp1 deletion or truncation as well as upon mutation of the nuclear poly(A) binding protein Nab2. These observations indicated that Mlp1 and hence baskets, as well as specific RNA binding proteins, facilitate the interaction of mRNA with the nuclear periphery. While the canonical structure of the NPC is well established, our understanding of the conditions and factors contributing to the assembly of a basket, as well as the stoichiometry of its components, remains incomplete. Although basket proteins have been implicated in the regulation of gene expression through gene anchoring to the nuclear periphery and in mRNA scanning before export, how this is mediated by Mlp1/2 is poorly understood. Moreover, the dynamics of basket proteins in yeast seem to obey different rules than those of other nucleoporins as their turnover at the pore is faster than any other NPC components. Furthermore, it has been observed that during heat shock Mlp1 and Mlp2 dissociate from nuclear pores and form intra-nuclear granules, sequestering mRNAs and RNA export factors. Yet the mechanism for the formation of these granules or their role during heat shock is poorly understood. In yeast, the nuclear baskets are not associated with all NPCs, as no baskets assemble on the pores adjacent to the nucleolus. Yet, how cells establish these basket-less pores and whether they represent specialized nuclear pores with different functions from basket-containing pores is still unknown. To understand the dynamics of basket assembly and the biological relevance of establishing distinct sets of pores, we dissected the biological processes leading to the formation of baskets. In addition, to highlight potential functional differences between the two types of pores, we identified the interactors of nuclear basket-containing and nucleolar basket-less pores. We showed that assembling a basket is not a default mode for a pore in the nucleoplasm and that active mRNA processing is required to maintain baskets integrity. While mRNA can be found associated with both types of pores, our results suggest that export kinetics may be different on basket-containing and basket-less pores. The eukaryotes organize their nucleus in discrete functional regions and the nuclear envelope has been envisioned as an organelle by and of itself. Our analyzes indicate that mRNAs and Mlp1 participate in an additional degree of nuclear compartmentalization by enabling the formation of a dynamic structure: the basket. Overall my project sheds new light on the nuclear organization and highlights the surprising entanglement between mRNA export and NPC plasticity. / L'exportation des ARN messagers du noyau vers le cytoplasme est l'une des nombreuses étapes de la voie d'expression des gènes et est fondamentale pour que les ARNm rencontrent les ribosomes pour être traduits dans le cytoplasme. Les échanges entre le noyau et le cytoplasme se font par l'intermédiaire du complexe du pore nucléaire, qui est un grand complexe multiprotéique enchâssé dans la membrane nucléaire et assemblé par 30 protéines différentes, les nucléoporines. Le versant nucléoplasmique du pore orchestre de nombreux processus nucléaires fondamentaux. En effet, un nombre croissant d’études suggère que le pore nucléaire est impliqué dans un large éventail d'activités, notamment la modulation de la topologie de l'ADN, la réparation de l'ADN, la régulation épigénétique de l'expression des gènes et l'accès sélectif aux molécules candidates à l’export. Le composant structurel nécessaire pour orchestrer ces fonctions nucléoplasmiques est appelé le panier une structure de ∼60 à 80 nm de long faisant saillie dans le nucléoplasme. Une vision consensuelle dépeint le panier comme une structure assemblée par des protéines filamenteuses convergeant en un anneau distal, TPR (Translocated Promoter Region protein) chez l'homme et par ses deux paralogues Mlp1 et Mlp2 (myosin-like proteins) chez la levure. Dans la première partie de cette thèse, nous avons caractérisé le mouvement d'ARNm spécifiques au voisinage de la périphérie nucléaire. Nous avons observé que les transcrits scannent l'enveloppe nucléaire, probablement pour trouver un pore nucléaire afin d'être exportés. Nous avons également montré que ce comportement était affecté par la délétion ou la troncation de Mlp1 ainsi que par la mutation de la protéine de liaison aux queues poly(A) Nab2. Ces observations indiquent que Mlp1 et donc les paniers, ainsi que des protéines liant l’ARN, facilitent l'interaction des ARNm avec la périphérie nucléaire. Alors que la structure canonique du pore nucléaire est bien établie, notre compréhension des conditions et des facteurs contribuant à l'assemblage du panier, ainsi que de la stoechiométrie de ses composants, reste incomplète. Bien que les protéines du panier soient impliquées dans la régulation de l'expression des gènes par l'ancrage des gènes à la périphérie nucléaire et dans le recrutement des ARNm avant leur export, la manière dont le panier intervient dans ce processus est mal comprise. De plus, la dynamique des protéines du panier chez la levure semble obéir à des 6 règles différentes de celles des autres nucléoporines, car leur renouvellement (turn over) au niveau du pore est plus rapide que celui des autres composants du NPC. De plus, il a été observé que lors d'un choc thermique, Mlp1 et Mlp2 se dissocient des pores nucléaires et forment des granules intra-nucléaires, séquestrant les ARNm et les facteurs d'exportation d'ARN. Pourtant, le mécanisme de formation de ces granules ou leur rôle pendant le choc thermique est mal compris. Chez la levure, le panier nucléaire n'est pas associé à tous les pores nucléaires, et les paniers sont absents des pores adjacents au nucléole. La manière dont les cellules établissent ces pores sans paniers et s'ils représentent des pores nucléaires spécialisés ayant des fonctions différentes des pores contenant des corbeilles n’est pas connue. Pour comprendre la dynamique de l'assemblage des paniers et la pertinence biologique de former de deux types de pores distincts, nous avons disséqué les processus biologiques menant à la formation des paniers. De plus, afin de mettre en évidence les différences fonctionnelles potentielles entre les deux types de pores nous avons étudié les protéines associées aux pores contenant un panier nucléaire et des pores sans panier. Nous avons montré que l'assemblage d'un panier n'est pas un mode par défaut pour un pore dans le nucléoplasme et que la formation et la maturation des ARNm est nécessaire pour maintenir l'intégrité des paniers. Alors que l'ARNm peut être trouvé associé aux deux types de pores, nos résultats suggèrent que la cinétique d’export peut être différente sur les pores avec et sans panier. Les eucaryotes organisent leur noyau en régions fonctionnelles discrètes et l'enveloppe nucléaire a été envisagée comme pouvant être une organelle à part entière. Nos analyses indiquent que les ARNm et Mlp1 participent à un degré supplémentaire de compartimentation nucléaire en permettant la formation d'une structure dynamique : le panier. Mon projet apporte un nouvel éclairage sur l'organisation des compartiments nucléaire et met en évidence l'intrication surprenante entre l'export des ARNm et la plasticité des pores nucléaires.