Existen genes que, según las variantes que se presentan en la naturaleza,pueden ser permisivos o protectores frente al alcoholismo. El gen ALDH2 eshabitualmente permisivo (alelo ALDH2*1) porque codifica la enzimadeshidrogenasa aldehídica mitocondrial la cual cataliza la oxidación delacetaldehído a acetato en la vía degradativa del etanol. Este gen tiene unsegundo alelo protector, ALDH2*2, que da origen a una enzima inactiva,impidiendo la oxidación del acetaldehído y desencadenando en los individuosportadores un aumento en los niveles plasmáticos de acetaldehído de hasta 20veces sobre lo normal. Estos individuos sienten malestares físicos comomareos, taquicardia y náuseas al consumir alcohol lo que les provoca unaaversión frente al consumo. Siendo el alelo ALDH2*2 un gen protector frente al alcoholismo, producir una disminución de la actividad enzimática es una buena estrategia terapéutica frente a la enfermedad. Un tratamiento farmacológico habitual para el alcoholismo es generar una aversión al consumo de alcohol con disulfiram. Este fármaco inactiva eficazmente la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2), pero es muy tóxico. Una alternativa terapéutica es imitar el efecto del disulfiram silenciando el mRNA de la ALDH2 con ribozimas, RNAs catalíticos pequeños capaces de disminuir la síntesis proteica por ocupación y/o degradación del mRNA. Se ensayaron ribozimas de horquilla y martillo dirigidas hacia un mismo blanco del mRNA de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo, dado que el hígado es el órgano más importante en la degradación del etanol. Se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios portadores de genes de ribozimas y se midió la actividad de la ALDH2 espectrofotométricamente en extractos celulares. Se usaron ribozimas control para determinar posibles efectos de antisentido. La ribozima de horquilla (RzCG20), clonada en el vector pAC-CMV y codificada en un gen que posee el promotor del citomegalovirus y la señal de poliadenilación del virus SV40, disminuyó en 42 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células H4-II-E-C3, siendo el 44 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. En cambio, la ribozima de horquilla clonada en el vector pAAV-CMV y codificada en un gen cuya señal de poliadenilación es la de la hormona del crecimiento humana, disminuyó en 36 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células en cultivo, siendo el 64 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. La ribozima de martillo redujo sólo en 20% la actividad de la ALDH2, efecto dado exclusivamente por bloqueo del mRNA. Efectuando correcciones con el tiempo de vida media de la enzima se estima que el porcentaje de disminución del 42 % de la actividad de la ALDH2 es de al menos 56% al usar el gen de una ribozima de horquilla anti ALDH2. No se corrigió por el porcentaje de células H4-II-E-C3 transfectadas debido a la imposibilidad de obtener una estimación razonable usando el gen de la eGFP como reportero. Sin embargo, el porcentaje mínimo (56 %) concuerda con que en células 293 derivadas de riñón de embrión humano, cuyo porcentaje de transfección es cercano al 70 %, la ribozima disminuyó en 68 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 únicamente por acción antisentido. Buscando alcanzar un 100 % de transfección se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios derivados del pCEP4 codificantes de las ribozimas de horquilla y su control. Este vector, que otorga permanencia y segregación divisional, mostró efectos tóxicos sobre las células de manera que no se pudo evaluar el efecto de la ribozima de horquilla en un cultivo celular homogéneo. Los resultados de este trabajo de tesis muestran que la ribozima de horquilla RzCG20, dirigida a los nucleótidos 1553 a 1569 del mRNA de la ALDH2 de rata, es un buen candidato para experimentos in vivo enfocados hacia el desarrollo de un fármaco génico para el alcoholismo.

En organismos eucariontes, el inicio de la síntesis de proteínas comienza con el reclutamiento de la subunidad 40S del ribosoma al mRNA. Sin embargo, dependiendo de cómo se efectúe este reclutamiento, el inicio de la traducción puede ser dependiente o independiente de la estructura 5’cap. El mecanismo cap-dependiente se basa en el reconocimiento de la estructura cap (7mGpppN), presente en el extremo 5’ de todos los mRNA, por el complejo de iniciación eIF4F. El complejo eIF4F está constituido por tres proteínas: eIF4E, la proteína de unión al cap; eIF4A, una RNA helicasa ATP dependiente y la proteína de andamiaje, eIF4G. La subunidad 40S ribosomal es reclutada al mRNA como parte de un complejo formado por eIF2-GTP/Met-tRNAi, eIF1A y eIF3. El factor de iniciación eIF4G cumple la función de proteína puente entre la subunidad 40S del ribosoma (vía eIF3) y el mRNA (vía eIF4E). Luego del reclutamiento de la subunidad 40S ribosomal en la vecindad de la estructura cap, el complejo de iniciación migra en dirección 5’ a 3’ hasta encontrar un codón de inicio de la síntesis de proteína, AUG, en un contexto óptimo. El estudio del mecanismo de traducción de los mRNA de la familia Picornaviridae, los cuales carecen de estructura 5’cap, permitió la caracterización de un mecanismo alternativo de iniciación de la síntesis de proteína. El mecanismo de inicio de la traducción en los mRNA de Picornavirus está mediado por regiones de RNA altamente estructuradas que son capaces de reclutar la subunidad 40S ribosomal de manera independiente a los extremos del mRNA. Estas estructuras de RNA se denominaron sitios internos de entrada de ribosomas, IRES (por sus siglas en inglés). Desde su caracterización inicial en los mRNA de la familia Picornaviridae, la existencia de IRES se ha extendido a otras familias virales incluyendo a la familia Retroviridae. El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) pertenece al género Lentivirus de la familia Retroviridae. El genoma de VIH-1 está constituido por dos hebras idénticas de un RNA de cadena simple de polaridad positiva, unidas entre si por enlaces no covalentes. El mRNA de VIH-1 posee cap, 3’poli(A) y dos elementos IRES, el primero, IRES-1, en su región 5’ no traducida (5’UTR) y el segundo en su región codificante para la proteína viral Gag (IRES-40K). Este trabajo se focalizó en el estudio de la función del IRES-1 de VIH-1 partiendo del postulado que a diferencia de otros mRNAs virales que poseen un elemento IRES, y sólo pueden iniciar la traducción de manera IRES dependiente, el mRNA de VIH-1 posee la capacidad de iniciar la síntesis de proteína de manera dual, es decir, de manera dependiente y/o independiente de la estructura cap. Este trabajo establece que el mRNA completo de VIH-1 puede iniciar su traducción utilizando un mecanismo tanto dependiente como independiente de su estructura 5’cap. En este contexto se establece que el mRNA de VIH-1 comparte características funcionales descritas sólo para mRNA celulares, diferenciándose de manera importante de los otros mRNA virales que poseen un elemento IRES que inician su traducción exclusivamente de manera dependiente de IRES.

À l’ère du numérique, valoriser les données en leur donnant un sens est un enjeu capital pour supporter la prise de décision stratégique et cela dans divers domaines, notamment dans le domaine du marketing numérique ou de la santé, ou encore, dans notre contexte, pour une meilleure compréhension de la biologie des structures des acides nucléiques. L’un des défis majeurs de la biologie structurale concerne l’étude des structures des acides ribonucléiques (ARN), les effets de ces structures et de leurs altérations sur leurs fonctions. Contribuer à cet enjeu important est l’objectif de cette thèse. Celle-ci s’inscrit principalement dans le développement de méthodes et d’outils pour l’exploration efficace des structures secondaires d’ARN. En effet, explorer les structures secondaires d’ARN contribue à lever le voile sur leur fonction et permet de mieux cerner leur implication spécifique au sein des processus cellulaires. Dans ce contexte nous avons développé le modèle des super-n-motifs qui contribue à une meilleure représentation de la complexité structurale des ARN et offre un moyen efficace d’évaluer la similarité des structures d’ARN en tenant compte de cette complexité. Le modèle des super-n-motifs facilite l’étude des ARN dont le rôle est inconnu. Il permet de poser des hypothèses sur la ou les fonctions des ARN lorsque ceux-ci partagent une similarité structurale sans équivoque. Nous avons aussi développé la plateforme structurexplor pour faciliter l’exploration des structures secondaires, c’est-à-dire de permettre, en quelques clics, de caractériser les populations de structures d’ARN en, par exemple, faisant ressortir les groupes d’ARN partageant des structures similaires. La mise en œuvre du modèle des super-n-motifs et de la plateforme structurexplor a contribué à une meilleure compréhension de la phylogénie structurale des viroïdes qui sont des agents pathogènes à ARN attaquant les plantes, phylogénie jusqu’alors basée que sur leurs séquences.

Nombre de programmes ont été développés pour identifier des sites de fixation de facteurs de transcription. La plupart ne sont pas capables d’inférer des motifs composés de deux mots en autorisant une variation de leur espacement, caractéristiques des sites de fixation des sous-unités s de l’ARN polymérase (SFFS). Cette thèse vise à l’élaboration d’un algorithme prenant en compte toutes les connaissances biologiques structurelles de ces sites en vue de leur prédiction fiable. Nous présentons une nouvelle approche, SIGffRid (pour SIGma Factor Finder using R’MES to select Input Data), pour l’identification des SFFS qui compare deux génomes bactériens phylogénétiquement apparentés. La méthode analyse des paires de régions promotrices de gènes orthologues. Elle utilise la sur-représentation statistiquement dans les génomes complets comme critère de sélection des boîtes -35 et -10 potentielles. Des motifs composites conservés sont alors groupés en utilisant des paires de courtes graines, en autorisant la variabilité de l’espacement qui les sépare. Les motifs sont ensuite étendus suivant des considérations statistiques. Les plus significatifs sont retenus. Cet algorithme a été applique´ avec succès à la paire de génomes bactériens apparentés de Streptomyces coelicolor A3(2) et Streptomyces avermitilis. Nous démontrons que notre approche, combinant des critères statistiques et biologiques, parvient à prédire des SFFS, et abordons les améliorations envisagées. / Many programs have been developed to identify transcription factor binding sites. Most of them are not able to infer two-word motifs with variable spacer lengths, characteristics of RNA polymerase Sigma (s) Factor Binding Sites (SFBSs). The aim of this thesis is to design an algorithm taking into account the biological structural observations about these sites, in order to their relevant prediction. We describe a new approach, SIGffRid (SIGma Factor binding sites Finder using R’MES to select Input Data), to identify SFBSs by comparing two related bacterial genomes. The method performs a simultaneous analysis of pairs of promoter regions of orthologous genes. SIGffRid uses a prior identification of over-represented patterns in whole genomes as selection criteria for potential -35 and -10 boxes. These patterns are then grouped using pairs of short seeds, allowing a variable-length spacer between them. This is followed by motif extension guided by statistical considerations. Finally, statitically feasible and relevant motifs are selected. We applied our method to the pair of related bacterial genomes of Streptomyces coelicolor A3(2) and Streptomyces avermitilis. We demonstrate that our approach combining statistical and biological criteria was successful to predict SFBSs, and envisage ameliorations.

Los virus del grupo C (GRCV) son un complejo que pertenecen al género Orthobunyavirus, de la familia Peribunyaviridae (anteriormente denominado Bunyaviridae). Estos virus están asociados con enfermedades febriles en humanos que generalmente habitan en áreas tropicales y subtropicales de América del Sur y América Central. A pesar de que muchos GRCV han sido aislados de mosquitos, animales y seres humanos, los análisis genéticos de estos virus aún son limitados. En el Perú, el centro de investigaciones de enfermedades tropicales de la marina de los Estados Unidos (NAMRU-6) viene conduciendo desde los años noventa una vigilancia pasiva de las enfermedades febriles. Durante este tiempo, se lograron recuperar e identificar mediante la prueba de inmunofluorescencia 65 aislamientos de GRCV de pacientes febriles habitantes del norte y sur de la Amazonía peruana. Para caracterizar estos aislamientos, se secuenciaron una región de 500 pb del segmento S y una región de 750 pb de los segmentos M y L. El análisis de la secuencia de los aislamientos clínicos mostró identidades de nucleótidos que oscilaban entre el 68% y el 100% y las identidades de secuencia de aminoácidos deducidas que oscilaban entre 72% y 100%. Las secuencias se compararon con las siguientes cepas referenciales: virus Caraparu (CARV), virus Murutucu (MURV), virus Oriboca (ORIV), virus Marituba (MTBV), virus Apeu (APEUV) y virus Madrid (MADV). La comparación de secuencias de los segmentos L y S de las cepas clínicas con cepas referenciales mostró dos clados; clado I formado por aislamientos con alta correlación con CARV-MADV y clado II conformado por aislamientos con alta correlación con MURV, ORIV, APEUV y MTBV. Las secuencias del segmento M contiene algunos aislamientos de GRCV diferentes filogeneticamente a los de segmento L y S y su distribución filogenética está altamente relacionada con la microneutralización serológica. Estos resultados demuestran las relaciones genéticas y serológicas de los GRCV que circula en la Amazonía peruana y la divergencia genética de los GRCV en el norte de la Amazonía. / Tesis

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Selon l’université Johns Hopkins, plus de 600 millions de cas de coronavirus 2019 (COVID - 19) infectés par le SRAS-CoV-2 ont été signalés dans le monde depuis décembre 2019. La COVID-19 a causé une catastrophe énorme dans le monde, tuant plus de six millions de personnes. Il est donc essentiel de trouver des médicaments ou des vaccins efficaces. L'ARN polymérase ARN - dépendante (RdRp) joue un rôle clé dans la réplication du virus SARS-CoV-2. Nous avons constaté que la RdRp du SRAS-CoV-2 présentait 98,1% de similitude avec la RdRp du SRAS-CoV, alors que la similitude génomique de virus n'était que de 80%. Les alignements de séquences des coronavirus ont montré une homologie plus élevée entre les RdRps (60% - 98%) et une homologie plus faible entre les protéines Spike (24% - 77%). Les structures 3D de la RdRp et de la nucléotide transférase (NiRAN) ont été rapidement déterminées par modélisation à partir des structures correspondantes du SRAS. Dans le nouveau coronavirus, trois substitutions apparaissent dans le motif RdRp, ainsi qu'une liaison hydrogène supplémentaire, mais la structure des régions des doigts et du pouce est légèrement modifiée. La structure NiRAN est très conservatrice dans le COV. Les homologies de séquence et de structure entre RdRp et NiRAN sont donc supposées être des cibles médicamenteuses potentielles pour le traitement du COV émergent. La protéase principale (Mpro), également connue sous le nom de protéase 3-chymotrypsine-like (protéase 3CL), joue un rôle important dans le clivage des polyprotéines virales pour former des complexes de réplication fonctionnelle. Mpro est donc une cible pharmaceutique prometteuse pour le traitement de la COVID-19. Grâce à la modélisation moléculaire, à l'amarrage et à la détermination de l'activité protéasique, nous avons trouvé quatre nouveaux inhibiteurs ciblant le Mpro avec une affinité de liaison révélée par la moitié de la concentration maximale inhibitrice (IC50) et des constantes de dissociation (KD). Nos nouveaux inhibiteurs CB-21, CB-25, CP-1 et LC24-20 ont des CI50s de 14,88 µM (IC à 95%: 10,35 µM à 20,48 µM), 22,74 µM (IC à 95%: 13,01 µM à 38,16 µM), 18,54 µM (IC à 95%: 6,54 µM à 36,30 µM) et 32,87 µM (IC à 95%: 18,37 µM à 54,80 µM), respectivement. L'évaluation des interactions a montré que chaque inhibiteur avait des liaisons hydrogène ou des interactions hydrophobes avec des résidus importants, y compris les résidus catalytiques les plus importants: his41 et Cys145. La dose létale à 50% (DL50) des quatre inhibiteurs est beaucoup plus élevée que celle de l'inhibiteur bien connu de la Mpro, GC376, ce qui indique une faible toxicité. Ces quatre inhibiteurs peuvent servir de médicaments potentiels pour d'autres études in vitro et in vivo contre la COVID-19. Dans l'ensemble, pour RdRp et Mpro, nos résultats fournissent des informations utiles pour la recherche et le traitement de la COVID-19. / According to the data from Johns Hopkins University, more than 600 million Coronavirus Virus Disease 2019 (COVID-19) cases infected by SARS-CoV-2 has been reported worldwide since December 2019. COVID-19 brought huge disaster to the world with more than 6 million death cases. Therefore, finding efficient drugs or vaccines is of vital importance. RNA-dependent-RNA-polymerase (RdRp) plays a key role in SARS-CoV-2 viral replication. We found that SARS-COV-2 RdRp shares 98.1% of similarity with SARS-CoV RdRp while the genome similarity is only 80%. Sequence alignment of coronaviruses demonstrated higher identity among RdRps (60% – 98%) and lower identity among Spike proteins (24% – 77%). The RdRp and nucleotide-transferase (NiRAN) 3D-structures were quickly determined by modelling starting from the SARS counterpart structures. In COVID-19, three substitutions appeared in RdRp motifs with an additional hydrogen-bonding, but slight structural change shown in the finger and thumb domains. The NiRAN structure is well conserved in CoV. The sequence and structural homology among RdRp and NiRAN thus postulate them as potential drug targets to treat emerging CoVs. Main protease (Mpro), also called 3-chymotrypsin-like protease (3CL protease), plays an essential role in cleaving virus polyproteins for the functional replication complex. Therefore, Mpro is a promising drug target for COVID-19 therapy. Through molecular modelling, docking and a protease activity assay, we found four novel inhibitors targeting Mpro with the half maximal inhibitory concentration (IC50) and their binding affinities shown by the dissociation constants (KDs). Our new inhibitors CB-21, CB-25, CP-1 and LC24-20 have IC50s at 14.88 µM (95% Confidence Interval (95% CI): 10.35 µM to 20.48 µM), 22.74 µM (95% CI: 13.01 µM to 38.16 µM), 18.54µM (95% CI: 6.54 µM to 36.30 µM) and 32.87µM (95% CI: 18.37 µM to 54.80 µM)), respectively. The evaluation of interactions suggested that each inhibitor has a hydrogen bond or hydrophobic interactions with important residues, including the most essential catalytic residues: His41 and Cys145. All the r inhibitors have a much higher 50% lethal dose (LD50) compared with the wellknown Mpro inhibitor GC376, demonstrating its low toxicity. These four inhibitors can be potential drug candidates for further in vitro and in vivo studies against COVID-19.Overall, targeting RdRp and Mpro, our findings provide useful information for the research and treatment of COVID-19.

Plusieurs types de granules ARN sont observables dans toutes les cellules. Certains correspondent à des structures où la régulation post-transcriptionnelle est effectuée; parmi ceux-ci on retrouve les granules de stress (GS) et les "processing bodies" (PB). Les GS sont des structures ribonucléoprotéiques cytoplasmiques formées suite à un stress cellulaire et dans lesquels les ARNm sont remisés pour y être transitoirement réprimés et protégés en attendant de meilleures conditions physiologiques. Les PB sont aussi des granules cytoplasmiques ribonucléoprotéiques formés entre autre des composants de la machinerie de dégradation et de la surveillance de l'ARN. De nombreuses études citent l'apparition des GS suite à l'irradiation aux UV. Cependant, cette observation n'a pas été validée. Nous avons donc cherché à caractériser les granules induits par les UV en suivant le comportement de FMRP, une protéine de liaison à l'ARN présente dans les GS. Dans cette étude, nous avons montré que les UV induisent la formation de granules cytoplasmiques qui n'ont ni la même taille, ni la même cinétique d'apparition et de disparition, ni la même composition des GS. Nous avons aussi noté l'absence des protéines de la petite sous-unité ribosomale normalement présentes dans les GS. Nous avons montré également que les cellules irradiées peuvent reprendre certaines fonctions physiologiques. Nous proposons donc l'hypothèse qu'il existerait une nouvelle classe de granules ARN induits par les UV dans lesquels seront accumulés les ARN potentiellement endommagés, ceci serait un nouveau mécanisme de régulation post-tanscriptionnelle.

L'interférence à l'ARN ou RNAi est un mécanisme d'extinction de l'expression des gènes nécessitant des molécules d'ARN double-brin. Dans le cytoplasme, une machinerie enzymatique les prend en charge afin de produire de courts ARNs simple-brin de 21 nucleotides (siARN) qui vont s'associer avec une protéine Argonaute pour former le complexe effecteur appelé le complexe RISC. Ce complexe cible un ARNm par complémentarité de bases et induit sa dégradation de façon séquence spécifique. Malgré son utilisation fréquente dans les laboratoires de recherche et son fort potentiel comme agent thérapeutique, le mécanisme moléculaire par lequel le RNAi s'opère reste encore peu compris. En utilisant le nematode Caenorhabditis elegans comme modèle animal, mon projet de recherche avait pour but de mieux comprendre le fonctionnement du RNAi en déterminant : 1) la cinétique de dégradation d'un ARNm ciblé par la voie du RNAi et; 2) les caractéristiques moléculaires de l'ARN double-brin qui sont nécessaires à l'induction et au maintien du RNAi chez l'animal. Les résultats que j'ai obtenus indiquent que le clivage spécifique de l'ARNm dans la région complémentaire au siARN mène à la stabilisation d'une partie de l'ARNm ciblé suggérant que cette stabilisation serait importante pour obtenir une réponse RNAi efficace chez le nematode. De plus, mes études ont démontré que le nombre siARN, généré par la molécule d'ARN double-brin, affecte la dégradation de l'ARNm, le maintien et la transmission du RNAi chez l'animal. En résumé, mes études ont permis de mieux caractériser l'atténuation génique médiée par le RNAi chez l'animal et la mise en évidence des paramètres moléculaires importants dans la voie du RNAi. Ces observations permettront la création d'une nouvelle génération d'approches thérapeutiques utilisant le plein potentiel du RNAi comme régulateur d'expression génique.