Récemment, des analyses dans divers organismes eucaryotes ont révélé que l'ensemble du génome est transcrit et produit en plus des ARNs messagers, une grande variété d’ARNs non codants de différentes longueurs. Les ARNs non codants de plus de 200 nucleotides, classés comme longs ARNs non codants (LARNnc), représentent la classe la plus abondante de transcripts non codants. Les études des fonctions des LARNnc suggèrent que beaucoup d'entre eux seraient impliqués dans la régulation de la transcription. L'objectif de ma thèse de doctorat était d'élucider les mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par des LARNnc dans différents systèmes eucaryotes. Dans mon premier projet, j'ai étudié le rôle d'un long ARN non codant antisens dans la régulation transcriptionnelle du gène PHO84, codant un transporteur de phosphate à haute affinité, chez S. cerevisiae. Des études antérieures ont montré que la suppression d’une proteine de l’exosome Rrp6 entraîne une augmentation de l'expression antisens et la répression de PHO84. Il a été suggéré que la perte de Rrp6 entraîne une stabilisation antisens au locus PHO84, entraînant le recrutement de l'histone de-acétylase Hda1 et la répression de PHO84. Cependant, le mécanisme par lequel Rrp6p régule la transcription de PHO84 n’était pas connu. En combinant des méthodes à l’échelle de cellule unique, des approches biochimiques et génétiques, nous avons montré que les niveaux d'ARN antisens sont régulés principalement lors de l'élongation par le complexe Nrd1-Nab3-Sen1, qui nécessite Rrp6 pour un recrutement efficace à l`extrémité 3`de PHO84. De plus, nous révélons l'expression anticorrelé du sens et de l'antisens, En résumé, nos données suggèrent que la transcription antisens régule le seuil d'activation du promoteur PHO84. Dans mon second projet, j'ai étudié les rôles des ARNs dérivés des amplificateurs (ARNa) dans la regulation de la transcription. En utilisant les cellules de cancer du sein MCF7 comme système modèle, nous avons cherché à déterminer comment les ARNa induits par l'oestrogène (E2) participent à la régulation de la transcription médiée par le recepteur d’oestrogène (ERα) au niveau de l'allèle unique. À l'aide de l’hybridation fluorescente à l’échelle de molécule unique (smFISH), nous avons révélé qu`après induction d'E2, les ARNa sont induits avec une cinétique similaire à celle des ARNm cibles, sont localisés exclusivement dans le noyau, principalement associés à la chromatine, et sont moins abondants que les ARNm. De manière surprenante, nous avons constaté que les ARNa sont rarement co-transcrits avec leurs loci cibles, indiquant que la transcription active des gènes ne nécessite pas la synthèse continue ou l'accumulation d'ARNa sur l'amplificateur. En outre, en utilisant des mesures de la distance à sous-diffraction, nous avons démontré que la cotranscription des ARNa et des ARNm se produit rarement dans une boucle amplificateurpromoteur. De plus, nous avons révélé que la transcription basale d'ARNa n'exige pas ERα ou l'histone méthyltransférase MLL1 qui active l'amplificateur par la mono-méthylation H3K4. Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que les ARNa peuvent jouer un rôle lors de l'activation du promoteur, mais ne sont pas nécessaires pour maintenir la transcription de l'ARNm ou pour stabiliser les interactions amplificateur-promoteur. / Transcription is the initial step in gene expression and is subject to extensive regulation. Recently, analyses in diverse eukaryotes have revealed that in addition to protein coding genes, transcription occurs throughout the noncoding genome, producing non-coding RNAs of various lengths. Non-coding RNAs longer than 200 nucleotides, classified as long non-coding RNAs (lncRNAs), represent the most abundant class of non-coding transcripts, whose functions however are poorly understood. Recent studies suggest that many lncRNAs might have roles in transcription regulation. The goal of my PhD thesis was to elucidate the mechanisms of lncRNA mediated transcription regulation in different eukaryotic systems. For my first project, I investigated the role of an antisense long noncoding RNA in transcription regulation of the high-affinity phosphate transporter gene PHO84 in the unicellular eukaryote S. cerevisiae. Previous studies showed that deletion of the nuclear exosome component Rrp6 results in increased antisense expression and repression of PHO84. It was suggested that the loss of Rrp6 results in antisense stabilization at the PHO84 locus, leading to recruitment of the histone de-acetylase Hda1 and repression of PHO84. However, most of the mechanistic details of how Rrp6p functions in regulating PHO84 transcription were not understood. Combining single cell methods with biochemical and genetic approaches, we showed that antisense RNA levels are regulated primarily during transcriptional elongation by the Nrd1-Nab3-Sen1 complex, which requires Rrp6 for efficient recruitment to the 3’end of PHO84. Furthermore, we reveal anti-correlated expression of sense and antisense, which have distinct modes of transcription. In summary, our data suggest a model whereby antisense transcriptional read-through into the PHO84 promoter regulates the activation threshold of the gene. For my second project, I investigated the roles of enhancer derived RNAs (eRNAs). eRNAs are lncRNAs transcribed from enhancers that have been suggested to regulate transcription through different mechanisms, including enhancer-promoter looping, RNA polymerase elongation, and chromatin remodeling. However, no coherent model of eRNA function has yet emerged. Using MCF7 breast cancer cells as a model system, we sought to determine how estrogen (E2) induced eRNAs participate in estrogen receptor alpha (ERα) mediated transcription regulation at the single allele level. Using single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH), we revealed that upon E2 induction eRNAs are induced with similar kinetics as target mRNAs, but are localized exclusively in the nucleus, mostly chromatin associated, and are less abundant than mRNAs. Surprisingly, we found that eRNAs are rarely co-transcribed with their target loci, indicating that active gene transcription does not require the continuous synthesis or accumulation of eRNAs at the enhancer. Furthermore, using sub-diffraction-limit distance measurements, we demonstrated that co-transcription of eRNAs and mRNAs rarely occurs within a closed enhancer-promoter loop. Moreover, we revealed that basal eRNA transcription does not require ERα or the histone methyltransferase MLL1, which activates the enhancer through H3K4 mono-methylation. Altogether, our findings showed that eRNAs may play a role during promoter activation, but are not required to sustain mRNA transcription or stabilize enhancer-promoter looping interactions.

L'adaptation est un phénomène capital pour la croissance optimale et la survie des bactéries dans un environnement qui est constamment soumis à des changements physico-chimiques. Pour y parvenir, les bactéries doivent contrôler l'expression génétique de façon efficace, c'est-à-dire en ayant le moins de perte énergétique possible et ce, dans un laps de temps très court suite à la détection du stress. Chez les procaryotes, on dénombre plusieurs mécanismes différents pour réguler l'expression des gènes. Par exemple, la transcription de certains gènes peut être inhibée ou activée par des facteurs protéiques. Dans certains cas, c'est plutôt la stabilité de l'ARNm ou encore le niveau traduction du gène qui est affecté, on parle alors de régulation post-transcriptionnelle. Chez les bactéries, les petits ARN régulateurs, exprimés selon différentes conditions de stress, contrôlent majoritairement l'expression de leurs gènes cibles de manière post-transcriptionelle. En plus de ces régulations en trans , il a récemment été découvert que certaines structures conservées de l'ARN pouvaient également contrôler l'expression de gènes en cis lors de la liaison spécifique d'un ligand. Ces structures, aujourd'hui connues sous le nom de riborégulateur, sont divisées en plusieurs classes dépendamment du type de ligand qui est lié. Chez Escherichia coli , il y a six riborégulateurs dont trois riborégulateurs TPP (thiMD, thiCEFSGH et thiBPQ ), un riborégulateur lysine (lysC ), un riborégulateur FMN (ribB ) et un riborégulateur AdoCbl (btuB ). Les résultats, présentés dans ce mémoire, portent sur la caractérisation du mode de régulation du riborégulateur lysine chez E. coli . Ainsi, pour la première fois dans le domaine des riborégulateurs, nous avons démontré que le riborégulateur lysine contrôle l'expression du gène lysC par deux mécanismes distincts, soit au niveau de la traduction du gène et de la stabilité de l'ARNm. Également, nous avons mis en évidence que par un changement de structure, le riborégulateur lysine peut contrôler l'accessibilité du site de clivage à la RNase E et par le fait même, la stabilité de l'ARNm. Ce nouveau mode de régulation ne semble pas être unique au riborégulateur lysine puisqu'il semble, selon les résultats préliminaires, que le riborégulateur thiC régulerait l'expression de l'opéron thiCEFSGH par les mêmes mécanismes de régulation.

DsrA est un petit ARN régulateur que l'on retrouve chez plusieurs espèces bactériennes, notamment Escherichia coli non-pathogène et pathogène. DsrA est exprimé principalement lorsque la bactérie est dans un environnement température suboptimale (<37 [degrés Celsius]). En conditions d'expression de DsrA, on retrouve une forme pleine longueur de 85 nucléotides et une forme tronquée de 60 nucléotides. Il a été montré que DsrA, dans sa forme pleine longueur ou tronquée, peut diminuer l'initiation de la traduction de l'ARNm hns , codant pour la protéine H-NS, un régulateur majeur de la transcription qui module près de 5% des gènes chez E. coli . Toutefois, les mécanismes impliqués dans la répression traductionnelle d'hns par DsrA n'ont pas été caractérisés. Les travaux présentés dans ce mémoire démontrent que DsrA bloque l'initiation de la traduction d'hns en s'appariant immédiatement en aval du codon d'initiation de la traduction. De plus, DsrA provoque la dégradation de l'ARNm hns en recrutant le complexe dégradosome ARN. La RNase E, qui fait partie de ce complexe, va cliver l'ARNm au nucléotide 131 dans la région codante du gène, soit 80 nucléotides en aval de l'appariement entre hns et DsrA. Ce clivage va provoquer la dégradation rapide de l'ARNm hns par les exoribonucléases de E. coli . Mes travaux de maîtrise ont abouti à un modèle d'action de DsrA sur hns qui pourrait inclure les autres cibles négatives de DsrA. De plus, ils suggèrent que les sRNA semblent partager le même mécanisme général de dégradation des ARNm. Ces travaux démontrent également que l'extrémité 5' de DsrA tronqué est monophosphate ce qui suggère un clivage par une ribonucléase. Toutefois aucune ribonucléase connue d' E. coli ne semble produire la forme tronquée de DsrA, bien que l'exoribonucléase PNPase semble influencer sa dégradation. Ces travaux démontrent également l'impact des protéines RppH et CsdA dans la dégradation de l'ARNm hns à 25 [degrés Celsius], c'est-à-dire lorsque DsrA est naturellement exprimé. Ces protéines sont importantes pour la stabilité de hns et pour sa dégradation en présence de DsrA. Toutefois, le mécanisme d'action de ces protéines n'a pas été déterminé.

Vers la fin des années 1990 et au début des années 2000, l’idée que l’ARN puisse interagir directement avec de petits métabolites pour contrôler l’expression de certains gènes devient de plus en plus acceptée. Des recherches menées à cette époque ont permis la découverte de plusieurs structures d’ARN hautement conservées nommées riborégulateurs. La structure de ces ARN leur permet de reconnaître spécifiquement un ligand. La reconnaissance du ligand entraîne ensuite un changement de conformation dans l’ARN responsable du contrôle de l’expression génétique. Le but de cette thèse est d’étudier la structure et les changements de conformation du riborégulateur associé au gène add liant l’adénine chez Vibrio vulnificus. Ce riborégulateur étant relativement simple, les informations recueillies lors de cette étude pourront servir à comprendre le fonctionnement de riborégulateurs plus complexes. Dans l’introduction, la découverte des riborégulateurs sera décrite en plus des caractéristiques particulières et de l’importance de ces ARN. Par la suite, quelques exemples démontrant l’importance des structures d’ARN seront abordés. Ensuite, les techniques de fluorescence utilisées pour étudier les structures d’ARN au cours de cette thèse seront présentées. Enfin, les recherches effectuées sur les riborégulateurs adénine seront détaillées afin d’aider le lecteur à bien comprendre le type de riborégulateur au centre de cette thèse. Le chapitre 1 traite du repliement de l’aptamère suite à la liaison avec l’adénine. Dans ce chapitre, il est démontré que l’aptamère peut adopter trois conformations. Une modification de la séquence de l’aptamère de type sauvage a permis d’isoler ces trois conformations. Il a ensuite été possible d’identifier les caractéristiques propres à chacun des états. Le chapitre 2 s’intéresse à une région précise du riborégulateur adénine. Dans ce chapitre, la conformation du cœur de l’aptamère est étudiée plus en profondeur. Il y est possible de constater que le repliement du cœur de l’aptamère influence l’interaction boucle-boucle en présence de magnésium et de ligand. De plus, la présence de ligand, en concentration suffisante, permet le repliement du cœur et favorise le rapprochement des tiges P2 et P3 dans un aptamère muté pour empêcher la formation de l’interaction boucle-boucle. Il semble donc que le repliement du cœur de l’aptamère influence la structure globale de l’aptamère. Finalement, les travaux présentés dans les chapitres 1 et 2 seront mis en contexte avec la littérature scientifique disponible. Cette discussion tentera de réconcilier certaines observations contradictoires. Il sera ensuite question de l’impact que les travaux présentés dans cette thèse peuvent avoir dans le domaine de l’ARN. Enfin, quelques études à réaliser en continuité avec ces travaux seront proposées.

Dans les cellules eucaryotes, l’expression d’un gène peut être régulée à de nombreux niveaux. Les études réalisées sur le contrôle de l’expression génique se sont généralement intéressées aux mécanismes de contrôle transcriptionnel. Cependant de nombreux exemples mettent de plus en plus en évidence l’importance des mécanismes post-transcriptionnels dans cette régulation. Les contrôles post-transcriptionnels de l’expression génique reposent essentiellement sur des interactions spécifiques entre les régions 5’ et 3’ non traduites de l’ARNm et des protéines agissant en trans qui contrôlent spécifiquement la maturation des ARNs messagers (ARNms), leur localisation cytoplasmique, leur stabilité et/ou leur traduction. Les éléments riches en adénine et en uridine (ARE), localisés dans la région 3’ non traduite de nombreux ARNms, font partie des séquences régulatrices les plus étudiées. Elles sont notamment présentes dans les ARNms codant pour des cytokines et des proto-oncogènes. Les protéines de liaison à l’ARN jouent donc un rôle central dans la régulation de l’expression des gènes. Les protéines TIA-1 et TIAR appartiennent à la famille des protéines qui fixent l’ARN et qui contiennent des domaines RRM (RNA Recognition Motif). Elles sont impliquées dans des mécanismes permettant la régulation de l’expression génique tels que l’épissage alternatif et la traduction. En particulier, elles participent à l’arrêt général de la traduction qui accompagne un stress environnemental en séquestrant les ARNms poly(A)+ non traduits dans des foci cytoplasmiques appelés granules de stress (SGs). Elles sont également impliquées dans la répression traductionnelle d’ARNms spécifiques en liant les ARE présents dans les extrémités 3’ non traduites de certains ARNms, et notamment des ARNs messagers codant pour le TNF-α et la cyclooxygénase-2 (Cox-2). L’invalidation des gènes tia-1 et tiar chez la souris conduit à une létalité embryonnaire élevée suggérant que ces protéines jouent également un rôle important au cours de l’embryogenèse. Afin de comprendre les mécanismes par lesquels les protéines TIA-1 et TIAR remplissent leurs différentes fonctions, nous avons réalisé un criblage par la technique du double hybride en levure afin d'identifier des partenaires d’interaction de ces deux protéines. Les protéines TIA-1 et TIAR interagissent avec les protéines FBPs (Fuse Binding Proteins). Celles-ci participent notamment à la maturation et à la dégradation des ARNs. Nous avons montré que les protéines FBPs co-localisent parfaitement avec TIA-1 dans le noyau et migrent dans les granules de stress en réponse à un stress oxydatif. De plus, des expériences de retard de migration sur gel réalisées à partir d’extrait cytosolique de macrophages ont montré que les protéines FBPs sont présentes dans le même complexe liant l’ARE du TNF-α que TIA-1. Enfin, la surexpression du domaine de liaison à l’ARN KH3 de FBP2 en fusion à l’EGFP induit la séquestration spécifique des protéines TIA-1 et TIAR dans des foci cytoplasmiques, empêchant ainsi leur accumulation nucléaire. Nos résultats indiquent que les protéines TIA-1/R et FBPs pourraient être fonctionnellement impliquées dans des étapes communes du métabolisme de l’ARN dans le noyau et/ou le cytoplasme.

La TriméthylGuanosine Synthase 1 de levure (Tgs1) à été identifiée à la suite d’un criblage double hybride en utilisant l’extrémité basique carboxy-terminale de la protéine SmB, cœur des snRNP, comme appât. Il a été également montré que Tgs1 interagit spécifiquement avec le domaine carboxyl-terminal basique KKD/E des protéines Nop58p et Cbf5p, deux composants protéiques du coeur des snoRNP. Le gène TGS1 n’est pas essentiel mais sa délétion confère un phénotype de cryo-sensibilité associé à un léger défaut d’épissage à basse température, associé à la rétention de U1 dans le nucléole. La recherche de substrats pour cette protéine a montré que Tgs1p est capable de méthyler la coiffe monométhylée des snARN et des snoARN transcrits par l’ARN polymérase II. La grande majorité des snoARN joue un rôle dans la sélection des sites de modifications de plusieurs classes d’ARN. Certains, par contre, sont impliqués dans la voie de synthèse des ribosomes, un processus comprenant de multiples étapes de clivages endo- et exoribonucléotidiques et ayant lieu dans le nucléole où les facteurs impliqués dans ces réactions se concentrent en plusieurs domaines distincts. Le point de départ de ce travail de thèse a été de tester un possible rôle de Tgs1p et/ou de la triméthylation dans la biosynthèse du ribosome. Dans un premier temps, l’analyse du processing des ARN ribosomiques dans la souche délétée pour TGS1 nous a permis de mettre en évidence l’implication de Tgs1 dans la formation de l’ARNr de la petite sous-unité, l’ARNr 18S. Des mutants catalytiques de Tgs1, incapables de reconnaître et de modifier les coiffes m7G, ont été crées. L’analyse de la voie de biogenèse des ribosomes dans ces souches ne présente pas les défauts constatés dans la souche délétée, révélant que c’est la protéine et non sa fonction catalytique qui est requise. De plus, ces mutants sont autant défectueux dans l’épissage des ARN messagers, excluant toute implication du défaut d’épissage dans le ralentissement de la voie de biogenèse des ribosomes observé dans la souche délétée. L’ultrastructure des souches délétées pour TGS1 observée en microscopie électronique nous a permis de mettre en évidence un effet de l’absence de Tgs1 sur la morphologie nucléolaire. En effet, le nucléole dans ces souches ne présente plus de nucléole structuré, bi-compartimenté. Les analyses en microscopie à fluorescence ont confirmé la disparition de la ségrégation des deux compartiments nucléolaires, suggérant que le défaut dans la biogenèse des ribosomes puisse être une conséquence de la perte de cohérence du nucléole. La caractérisation de l’environnement physique et fonctionnel de Tgs1 a été entreprise afin de mettre à jour des fonctions additionnelles de la protéine. Diverses approches ont été envisagées: la recherche de partenaires physiques par l’emploi d’un allèle de TGS1 étiquetté TAP permettant la purification puis l’analyse de partenaires physiques ainsi que la recherche de partenaires fonctionnels par la méthode du crible synthétique létal. La recherche de partenaires physiques a permis de révéler l’existence d’un grand nombre d’ARN non codants coprécipités avec Tgs1. Certains sont des substrats connus de la protéine mais un grand nombre d’ARN ne possédant pas de coiffes monométhylées. La recherche de partenaires fonctionnels a permis la découverte de candidats synthétiques létaux appartenant à deux groupes, un groupe lié à l’épissage des ARN messagers et un autre groupe constitué de membres du complexe SWR1, complexe impliqué dans la régulation transcriptionnelle par modification de la chromatine. Lors de ce crible de candidats synthétiques létaux, il est apparu que la délétion de TGS1 restaure partiellement le défaut de croissance à chaud induit par la délétion du gène RRP47, dont le produit est impliqué dans la maturation de l’extrémité 3’ de plusieurs types d’ARN non codants. Les travaux préliminaires effectués ne permettent pas encore d’expliquer un tel phénotype. Au cours de ce travail de thèse, nous avons pu répondre à un certain nombre de questions sur la fonction et le rôle de Tgs1 dans la cellule. La fonction catalytique de Tgs1 dans la méthylation des coiffes m7G est clairement nécessaire à l’efficacité de l’épissage des ARN messagers mais le rôle de la triméthylation de la coiffe des snoARN n’est pas élucidé à ce jour. Le fait que la fonction catalytique de Tgs1 n’est pas impliquée dans le défaut dans la biogenèse des ribosomes et la découverte du rôle de la protéine dans la morphologie nucléolaire, laisse entrevoir l’existence de fonctions additionnelles de Tgs1 dans la cellule. La caractérisation de son environnement physique et fonctionnel abonde justement dans ce sens, mettant à jour plusieurs interactions probablement liées à sa fonction catalytique, notamment dans l’épissage des ARN messagers mais également un grand nombre d’interactions impliquant la participation de Tgs1 dans d’autres voies métaboliques.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / El objetivo de este estudio es desarrollar un método computacional capaz de predecir con alta especificidad y sensibilidad los genes pequeños de ARN no codificante en genomas bacterianos, identificando las variables involucradas de mayor importancia que deben ser consideradas para su correcta clasificación. El trabajo aquí presentado consistió en investigar y analizar el estado del arte en métodos de predicción computacional de genes pequeños de ARN no codificante en bacterias, recopilar un listado de las variables involucradas y determinar estadísticamente aquellas que diferencian con mayor precisión los genes pequeños de ARN no codificante de secuencias genéticas al azar, comparar distintos métodos de predicción e identificar el que otorgue mejores resultados. Finalmente, se compararon los resultados del método con otros preexistentes y se aplicó el método al genoma completo de Escherichia coli. Los principales resultados obtenidos en este estudio son la identificación de 4 variables que influyen significativamente en la detección correcta de genes pequeños de ARN no codificante. Estas son: Valor z, Valor de partición, EMPI y Porcentaje de bultos, las cuales corresponden al subconjunto de variables con mayor capacidad discriminatoria. Por este motivo se recomienda que futuros métodos predictivos consideren la inclusión de estas 4 variables. Las variables seleccionadas muestran que existe una presión selectiva en la evolución de los genes pequeños de ARN no codificante, la que apunta a aumentar la estabilidad de la molécula al modificar su estructura para disminuir la energía de plegamiento y eliminar subestructuras desestabilizantes no funcionales. El mejor método de clasificación corresponde al Perceptrón Multicapa basado en redes neuronales, con una alta sensibilidad (88,8%) y alta especificidad (85,5%), teniendo una tasa de falsos positivos relativamente baja (14,5%). Con este subconjunto de variables y el método de clasificación, se realizó una predicción sobre el genoma de la bacteria Escherichia coli, generando 1192 predicciones, con un valor de sensibilidad de 30,5% y un valor predictivo positivo de 1,51 % respecto a los genes pequeños de ARN no codificante conocidos. Seleccionando las predicciones cercanas a promotores σ70 o terminadores intrínsecos (independientes del factor ρ), se obtiene un desempeño predictivo similar al logrado por otros autores en la literatura, con el beneficio adicional de requerir la medición de sólo 4 variables y sin la necesidad de información sobre genes homólogos en organismos cercanos filogenéticamente. La contribución de este trabajo consiste en profundizar el conocimiento acerca de las características de los genes de ARN no codificante, al haber estudiado las variables utilizadas previamente en la literatura y definir las 4 más relevantes, las cuales se relacionan directamente con la estructura secundaria y su energía mínima de plegamiento. En segundo lugar se propone un listado de 1192 secuencias del genoma de Escherichia coli y un listado más corto con las 5 más probables de ser genes sARN, estas secuencias pueden ser comprobadas experimentalmente. Estos resultados inciden positivamente en mejorar la calidad de las anotaciones de estos genes en genomas bacterianos, permitiendo mayores avances en estudios de genómica funcional y regulación en redes metabólicas.

Les viroïdes sont de petites molécules d'ARN simple-brins circulaires qui infectent les plantes et induisent une variété de symptômes.Les viroïdes ne codent pour aucune protéine, mais possèdent une structure secondaire complexe qui leur permet d'accomplir différentes fonctions et d'interagir avec diverses composantes de leur hôte. Pour compléter leur cycle de réplication, les viroïdes doivent nécessairement interagir avec des protéines de leur hôte. Quelques protéines ont déjà été identifiées pour se lier à certains viroïdes. Toutefois, avant le début de mes études aucune protéine n'était connue pour interagir avec le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Notre laboratoire s'intéresse justement au PLMVd, un viroïde de la famille des Avsunviroidae qui se répliquent à l'intérieur des chloroplastes des plantes de pêcher infectés. Ce viroïde se réplique plus précisément par un mécanisme en cercle-roulant symétrique, ce qui implique que ses deux polarités utilisent exactement le même mécanisme et possèdent donc plusieurs caractéristiques similaires. Toutefois, quelques légères différences biochimiques avaient été recensées entre les deux polarités. Par le passé, l'équipe de notre laboratoire a déterminé la structure secondaire de la polarité positive à l'aide de différentes techniques. Afin de comparer les deux polarités, il devenait important de procéder à l'analyse de la structure secondaire de la polarité négative. Grâce à cette étude, des similitudes et des différences entre les deux ont pu être localisées. Ces résultats seront essentiels pour la poursuite de plusieurs études sur PLMVd. Par exemple, cette structure sera certainement utile pour étudier la liaison de différents partenaires protéiques ainsi que pour l'analyse des petits ARN interférents provenant de PLMVd. Une analyse plus approfondie de la structure secondaire et tertaire des deux polarités de PLMVd a été amorcée par la méthode d'acylation sélective de l'hydroxyle de l'ARN analysée par extension d'amorce (SHAPE). Cette étude a permis de comparer la structure de deux variants et a permis d'identifier de nouveaux motifs, tel qu'un cruciforme à l'intérieur de la tige P11 et un pseudonoeud entre les boucles L1 et L11. Une analyse informatique de toutes les séquences connues de PLMVd a été réalisée et a permis de vérifier le potentiel de ce pseudonoeud pour tous les variants de PLMVd. Par la suite, une étude sur des interactions possibles entre PLMVd et des protéines provenant de feuilles de pêcher a été entreprise. Lors de cette recherche, différentes méthodes de détection des interactions ARN-protéine ont été utilisées, certaines sans succès. L'approche faisant appel à des hybridations de type northwestern fut profitable et permis d'identifier quelques protéines cellulaires capables d'interagir avec PLMVd. La caractérisation de certaines interactions a par la suite été réalisée pour permettre de mieux définir la liaison du facteur d'élongation 1-alpha (eEF1A) sur PLMVd. Finalement, différents projets satellites ont été initiés et concernent l'implication de certains éléments de structure de PLMVd in vivo. Ils seront décrits au dernier chapitre. Ces travaux ont été réalisés en collaboration avec un groupe de recherche de Belgique et ont mené à l'inoculation de plusieurs mutants de PLMVd.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les mécanismes régissant le trafic et la localisation des ARN à l'intérieur du noyau sont encore mal compris. La protéine PHAX (Phosphorylated adaptator for RNA export) est un facteur nécessaire à l'export nucléaire des précurseurs des snARN, ainsi qu'à l'adressage des précurseur des snoRNA coiffés vers les corps de Cajal (Ohno et al., 2000 ; Boulon et al., 2004 ). De manière remarquable, la liaison de PHAX à ces ARN est strictement dépendante de leur taille, et celle-ci est perdue au-delà d'une certaine longueur d'ARN (Ohno et al., 2002). Cependant, in vitro, PHAX est capable de s'associer aux ARN, mais il le fait sans spécificité de séquence ni de taille. L'étude des mécanismes impliqués dans la distinction des petits ARN non-codants des grands ARN comme les ARN messagers, est malgré tout essentielle car elle dirige ces ARN vers des voies de maturation différentes. Lors de ma thèse j'ai mis en place un projet qui aborde deux questions : (i) déterminer comment le facteur PHAX sélectionne les petits ARN, (ii) caractériser l'ensemble des ARN liés à PHAX dans le but de découvrir de nouveaux petits ARN non-codants. J'ai observé que PHAX forme un complexe avec le CBC, comme attendu, et avec une protéine non caractérisée à l'époque, et que nous avons nommée PBP1 (PHAX binding protein 1). J'ai pu déterminer que ces quatre protéines, CBC20-CBC80-PHAX-PBP1 forment un complexe, que j'ai appelé complexe CBCAP. In vivo, ce complexe est bien associé avec les précurseurs de snARN et snoARN. De façon très intéressante, le complexe CBCAP est aussi associé à de nombreux ARNs messagers de petite taille (inferieurs à 1500pb). De manière intéressante, les ARN liés par le CBCAP sont également parmi les plus abondants dans la cellule. L'expression de ces ARN est de plus affectée suite à la déplétion des protéines PHAX ou PBP1, et, de manière surprenante, ces protéines ont souvent des effets opposés sur la stabilité de ces ARN. PHAX est préférentiellement requis pour la production des snRNA, tandis que PBP1 est plutôt nécessaire à la production des snoRNA coiffés et des ARN messagers. Le complexe CBCAP pourrait donc sélectionner les ARN selon leur taille et il distinguerait plusieurs types d'ARN (codants ou non-codants; exportés ou retenus), af in qu'ils soient orientés vers la voie de maturation adéquate. De manière remarquable, la production de PBP1 est elle-même contrôlée par des signaux de croissance cellulaire. Ainsi, PBP1 permettrait de réguler l'expression des ARN les plus abondants dans la cellule, et jouerait ainsi un rôle clef dans le contrôle de la croissance cellulaire. Au cours de ma thèse, j'ai aussi observé par analyse tilling array, la co-précipitation avec PBP1 et de PHAX avec des petits ARN non annotés. J'initie la caractérisation de ces nouveaux ARN. / RNA localisation determines the fate of RNA. However inherent transport mechanisms still remain unclear. The protein PHAX is required for snRNA and snoRNA maturation as it both exports precursors of snRNA to the cytoplasm via the recruitment of the CRM1 export machinery, and transports precursors of capped snoRNA to the cajal bodies. Interestingly, PHAX associates with and transports mainly small RNA through a mechanism that is not specific of the RNA sequence. To determine how PHAX recognises specifically small RNA, we characterised the PHAX native complex. We purified a complex that we called CBCAP, which contains the CBC (cap binding complex), the protein that we called PBP1 (PHAX binding protein 1) and the transporter PHAX. As expected, this complex is associated with precursors of snRNA and snoRNA. Interestingly, we also co-purified with CBCAP small coding RNA (under 1500bp). Furthermore, expression of these RNA is affected by PBP1 and PHA X depletion. Surprisingly, these two proteins have an opposite effect on RNA stability. PHAX is required for snRNA expression, whereas PBP1 seems to control capped snoRNA and small mRNA expression. The complex CBCAP might thus be involved in the distinction of RNA size and seems to discriminate coding from non-coding RNA in order to address them to the appropriate processing pathway.