Lithium ist noch immer der Goldstandard in der Behandlung der bipolaren Störung und kommt auch in der Behandlung der unipolaren Depression zur Anwendung. Die therapeutische Breite von Lithium ist jedoch gering. Bei zu hohen Spiegeln kann es zu schweren Nebenwirkungen bis hin zu Intoxikationen mit letalem Verlauf kommen. Mit zunehmendem Lebensalter nimmt die renale Lithiumclearance ab. Hinzu kommen somatische Komorbiditäten, welche die renale Lithiumcelarance ebenfalls beeinträchtigen können. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Arzneimitteln, welche ebenfalls Einfluss auf den Lithiumspiegel nehmen können. Zu diesen zählen Diuretika, ACE-Hemmer und AT1-Rezeptor-Antagonisten sowie nicht-steroidale Antirheumatika, welche den am häufigsten rezeptierten Medikamente gehören. In einer retrospektiven naturalistischen Studie wurde der Einfluss einer Komedikation aus einem Schleifen- (Furosemid/Torasemid), Thiazid- (HCT) oder kaliumsparenden Diuretikum (Amilorid, Spironolacton, Triamteren), einem ACE-Inhibitor (Captopril, Enalapril, Lisinopril, Ramipril) oder AT1-Rezeptor-Antagonisten (Candesartan, Losartan, Irbesartan, Olmesartan, Valsartan) oder einem nicht-steroidalen Antirheumatikum (Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Ibuprofen) auf den dosisbezogenen Lithiumspiegel untersucht. Als Stichprobe dienten 501 Lithiumpatienten, welche stationär im Zentrum für Psychische Gesundheit der Universitätsklinik Würzburg behandelt worden waren (01/2008 – 12/2015). 92 Patienten (18,4 %) nahmen nur eines der aufgeführten Medikamente ein, während 76 (15,1 %) eine Kombination von bis zu 5 Medikamenten erhielten – somit beinhaltete die Komedikation von 33,5 % der Patienten mindestens eines der aufgeführten Medikamente. Als Kontrollgruppe diente eine Stichprobe von 333 Lithiumpatienten ohne entsprechende Komedikation. Altersintrinsische Faktoren (p < 0,001; R2=0,289), die GFR (p < 0,001; R2=0,377) sowie das Geschlecht (p < 0,001; R2=0,406) scheinen den größten Einfluss auf den Lithiumspiegel zu nehmen (ca. 41 %), während für die Komedikation ein geringerer Effekt anzunehmen ist (ca. 4%). Die Ergebnisse sprechen für ein signifikantes Interaktionspotential von Diclofenac und Ibuprofen (p = 0,001). Es ergeben sich auch Hinweise auf ein relevantes Interaktionspotential von Hydrochlorothiazid (p = 0,020). Patienten, welche Acetylsalicylsäure (p < 0,001) oder Allopurinol (p = 0,003) erhalten, scheinen ein Risikokollektiv für erhöhte Lithiumspiegel darzustellen. Die dosisbezogenen Lithiumspiegel der Stichproben mit Einnahme eines ACE-Hemmers/AT1-Rezeptor-Antagonisten und eines Schleifendiuretikums unterschieden sich dagegen nicht signifikant von denen der Kontrollstichprobe ohne Komedikation. Es ist zudem davon auszugehen, dass eine Kombination mehrerer Pharmaka mit Interaktionspotential (p < 0,001) ein höheres Risiko für erhöhte dosisbezogene Lithiumspiegel birgt als eine Monotherapie (p = 0,026) und die Indikation einer solchen sollte daher kritisch geprüft werden. Eine zusätzliche Analyse von 32 Fällen von supratherapeutischen Lithiumserumkonzentrationen von ≥ 1,3 mmol/l (1,3–4,1mmol/l) legt nahe, dass sich ein Großteil von Lithiumintoxikationen durch regelmäßige Spiegelkontrollen und Dosisanpassungen unter Berücksichtigung von Komedikation, Alter und Komorbiditäten sowie Psychoedukation der Patienten vermeiden ließen. / Lithium is still the gold standard in treating bipolar disorder and is indicated in the treatment of unipolar depression as well. Lithium has a narrow therapeutic range. Elevated lithium levels can lead to severe adverse effects and lethal intoxications. With increasing age, lithium clearance decreases. Somatic comorbidities can decrease lithium clearance as well. Moreover, there is a large number of drugs, which can affect lithium clearance. Among those are diuretics, ACE-inhibitors/AT1-receptor-antagonists and non-steroidal anti-inflammatory drugs. All of them belong to the most frequently prescribed drug. Retrospective data of lithium serum levels was analysed in 501 inpatients, who had been treated in the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy of the University Hospital of Würzburg (01/2008–12/2015). We wanted to investigate whether comedication of loop diuretics (Furosemide/Torasemide), thiaziddiuretics (Hydrochlorothizide) or potassium-sparing diuretics (Amiloride, Spironolactone, Triamterene), ACE-inhibitor (Captopril, Enalapril, Lisinopril, Ramipril) or AT1-receptor-antagonists (Candesartan, Losartan, Irbesartan, Olmesartan, Valsartan) or non-steroidal anti-inflammatory drugs (Acetylsalicylic acid, Diclofenac, Ibuprofen)affect the serum concentration of lithium. 92 inpatients (18.4 %) received one of the mentioned drugs, whereas 76 inpatients (15.1 %) received a combination of up to 5 drugs – thus a total of 33.5 % of the patients were treated with at least one potentially interacting drug. The control sample consisted of 333 inpatients whithout comedication of any interacting drug. Age intrinsic factors (p < 0.001; R2=0,289), gfr (p < 0.001; R2=0,377), and sex (p < 0.001; R2=0,406) had the greatest impact on serum lithium concentration (41%) whereas the effect of comedication was lower (4%). There is evidence that Diclofenac and Ibuprofen have a significant effect on dose related lithium concentration (p = 0.001). Possibly hydrochlorothiazide does so, too (p = 0.020). Moreover patients receiving Acetylsalicylic acid (p < 0.001) and Allopurinol (p = 0.003) are at higher risk for elevates lithium concentrations. Dose related lithium levels of the samples receiving an ACE-inhibitor/AT1-receptor-antagonist or loop diuretic did not significantly differ from the control sample without interacting comedication. A combination of potentially interacting drugs (p < 0.001) seems to be more critical than taking only one of the investigated drugs (p = 0.026) and thus the indication should be critically considered. An additional analysis of 32 cases with elevated lithium concentrations ≥ 1.3 mmol/l (1.3–4.1mmol/l) indicates, that most lithium intoxications could be avoided by regular measurements of lithium serum concentration and adaption of lithium dosage in regard of comedication, age and comorbidity if indicated and by patients´ psychoeducation.

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A ação aguda direta da Ang-(1-7) sobre o fluxo reabsortivo de bicarbonato (JHCO3-) foi avaliada por microperfusão estacionária in vivo em túbulos proximais de ratos utilizando microelétrodo sensível a H+. Em ratos WKY, a Ang-(1-7) tem efeito bifásico sobre o NHE3: em baixas concentrações causa queda do JHCO3-, enquanto que em altas concentrações estimula o JHCO3-. Em ratos SHR, a Ang-(1-7) demonstrou efeitos opostos aos dos ratos WKY; a Ang-(1-7; 10-9 M) aumentou o JHCO3-, enquanto a Ang (1-7; 10-6 M) causou significante queda do JHCO3-. Em adição, monitoramos fluorimétricamente a concentração de cálcio citosólico ([Ca2+]i) em túbulos proximais isolados, por meio do probe sensivél a cálcio FURA-2-AM. Nossos dados indicam que a [Ca2+]i em ratos WKY no controle é 99,7 ± 2,28 nM; a Ang-(1-7) aumenta esse valor. Em animais SHR o controle é 94,3 ± 1,66 nM; a Ang-(1-7) aumenta esse valor. Em conclusão, nossos dados indicam que a interação dos efeitos opostos dose dependente da Ang-(1-7) e Ang II sobre JHCO3- e a [Ca2+]i representa importante mecanismo de regulação fisiológica do volume e do pH intra-extracelular. / Direct acute effects of Ang-(1-7) on the resorptive bicarbonate flow (JHCO3-) was evaluated by stationary microperfusion in vivo in proximal tubules using microelectrode sensitive to H+. In WKY control rats, Ang-(1-7) has biphasic effects on Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3): at low dose inhibits and at higher one stimulates the NHE3. In SHR rats, Ang-(1-7) displayed opposite effects on SHR when compared to WKY rats: Ang- (1-7) at low dose increases JHCO3- whereas Ang (1-7) at higher dose reduces JHCO3-. In addition, we have fluorimetrically monitored cytosolic calcium ([Ca2+]i) in isolated proximal tubule through FURA-2-AM. Our data show that [Ca2+]i in the WKY control group is 99.7 ± 2.28 nM. Ang-(1-7) at 10-9 or 10-6 M increases [Ca2+]i. In SHR control rats [Ca2+]i is 94.3 ± 1.66 nM; Ang-(1-7) increase [Ca2+]i. Thus, our data are indicating that the interaction of the opposing dose-dependent effects of Ang-(1-7) and Ang II on JHCO3- and [Ca2+]i may represent an important physiological mechanism for regulating the intra and extracellular volume and pH in normotensive and hypertensive individuals.

Résumé : La signalisation biaisée représente la capacité des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) d'engager des voies de signalisation distinctes avec des efficacités variables selon le ligand utilisé ou la mutation dans le récepteur. Un meilleur contrôle des voies activées ou inhibées par des médicaments pourrait permettre de réduire leurs effets indésirables. Malheureusement, les mécanismes structuraux impliqués dans la transmission du signal à travers la membrane plasmique par l'entremise des RCPG sont peu connus, ce qui limite le développement rationnel de nouvelles molécules ciblant des voies de signalisation particulières. Le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT[indice inférieur 1]), un RCPG de classe A prototypique, peut activer différents effecteurs suite à sa stimulation par le ligand endogène angiotensine II (AngII), incluant la protéine G[indice inférieur q/11] et les β-arrestines. Il est suggéré que l'activation de ces deux voies de signalisation peut être associée à des conformations différentes du récepteur AT[indice inférieur 1]. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé des simulations de dynamique moléculaire afin d'explorer les interactions et les mouvements qui définissent le paysage conformationnel du récepteur AT[indice inférieur 1]. De plus, nous avons vérifié comment était modifié le paysage conformationnel par des mutations (N111G, N111W et D74N) et des ligands (AngII et [Sar[indice supérieur 1], Ile[indice supérieur 8]]AngII) ayant des profils signalétiques différents pour la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] et la voie des β-arrestines. Les résultats obtenus nous éclairent sur le rôle d'un réseau de ponts hydrogène entre des résidus polaires conservés au coeur du récepteur dont font partie les résidus N111[indice supérieur 3.35] et D74[indice supérieur 2.50]. Les résultats révèlent la présence d'un groupe de résidus hydrophobes juste au-dessus du réseau de ponts hydrogène et adjacent à la pochette de liaison du récepteur qui semble important pour la stabilisation de l'état inactif du récepteur ainsi que pour son activation par un ligand. Dans l'ensemble, les résultats suggèrent que l'activation de la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] est associée avec une transition conformationnelle spécifique stabilisée par l'agoniste alors que l'activation de la voie des β-arrestines est associée à une stabilisation de l'état de repos du récepteur. / Abstract: Biased signaling represents the ability of G protein-coupled receptors to engage distinct pathways with various efficacies depending on the ligand used or on mutations in the receptor. Having better control over the signaling pathways activated or inhibited by drugs could lead to fewer undesirable effects. Unfortunately, the structural mechanisms involved in the transmission of signal across the cell membrane through the receptors are poorly understood, which limits the rational development of new molecules targetting specific signaling pathways. The angiotensin-II type 1 (AT[subscript 1]) receptor, a prototypical class A G protein-coupled receptor, can activate various effectors upon stimulation with the endogenous ligand angiotensin-II (AngII), including the G[subscript q/11] protein and β-arrestins. It is believed that the activation of those two pathways can be associated with distinct conformations of the AT[subscript 1] receptor. To verify this hypothesis, microseconds of molecular dynamics simulations were computed to explore interactions and movements that define the conformational landscape of the AT[subscript 1] receptor. We have also verified how this conformational landscape is modified by mutations (N111G, N111W, D74N) and ligands (AngII, [Sar[superscript 1]Ile[superscript 8]]AngII) that have different signaling properties on the G[subscript q/11] pathway and the β-arrestin pathway. The results provide a better understanding of the role of a hydrogen bond network formed of conserved polar residues in the receptor core which include residues N111[superscript 3.35] and D74[superscript 2.50]. The results also reveal the existence of a cluster of hydrophobic residues located right above the hydrogen bonds network and adjacent to the binding pocket that appears important for the stabilization of the ground state of the receptor as well as its ligand-induced activation. As a whole, the results suggest that activation of the G[supbscript q/11] pathway is associated with a specific conformational transition stabilized by the agonist, whereas the activation of the β-arrestin pathway is linked to the stabilization of the ground state of the receptor.

Sandra Pavlíčková Physiological effects mediated by the brain angiotensin receptors Diploma thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Pharmacy Department of Biological and Medical Science Supervisor: Doc.MUDr. Josef Herink, DrSc. Renin-angiotensin system (RAS) is one of the oldest and the most important hormonal systems. "Classic" angiotensin system regulates the blood pressure and homeostasis of water and electrolytes. The main bioactive peptide of this system is angiotensin II (Ang II), which, according to recent research, does not affect only one organ. Installation of the so-called "tissue" RAS, which in many cases complements "systemic" Ang II system, changes the view on RAS. It was established, that RAS components are located on other non- typical places, which cannot be incorporated to the known endocrinal function of this system. Especially, discovery of angiotensin components and receptors in brain led to formation of new hypothesis and functional concepts about local effects of RAS, based on local synthesis of Ang II and angiotensin IV (Ang IV). Current studies found that physiological effects of the central angiotensin receptors can play an important role in neuroprotection and brain perfusion, can affect stress and behavioral disorders and influence...

Certains antagonistes du récepteur AT1 (« angiotensin II type 1 receptors ») utilisés dans le traitement de l'hypertension artérielle ont par la suite également montré une activité au niveau de PPAR[gamma] (« Peroxisome Proliferator Activated Receptor [gamma] »), un récepteur impliqué dans la régulation du métabolisme du glucose. Cela constitue une nouvelle approche thérapeutique vers un traitement concomitant de l'hypertension artérielle et du diabète de type II, qui sont souvent associés. Dans ce contexte, nous nous sommes dirigés vers la conception rationnelle de molécules capables d'interagir à la fois sur les deux récepteurs impliqués dans ces affections. Pour cela, nous avons utilisé le concept de « designed multiple ligand » tel qu'il a été défini par certains chercheurs de l'Industrie pharmaceutique. Nous l'avons appliqué en combinant les pharmacophores propres aux antagonistes du récepteur AT1 et aux agonistes de PPAR[gamma], afin de générer une série diversifiée de composés. Afin de diriger la conception de ces molécules, nous avons par ailleurs réalisé des expérimentations de modélisation moléculaire (« docking ») sur PPAR[gamma]. Cela nous a conduits à développer une nouvelle méthode dans le but de prédire le caractère agoniste des composés étudiés. Enfin les molécules ont été évaluées pour leurs propriétés antagonistes AT1 et agoniste PPAR[gamma]. D'intéressantes relations structures activités ont été dégagées / Some angiotensin II-type 1 receptor (AT1) antagonists, used for blood pressure control, exhibit also an activity on peroxisome proliferator activated receptor [gamma] (PPAR[gamma]), which is involved in the control of glucose metabolism. Such compounds could be promising drugs for the treatment of both hypertension and type II diabetes, which are often concomitant. Therefore, we have rationally designed molecules potentially able to interact with both receptors involved in these diseases. We used the "design multiple ligands" concept, as previously developed by industrial pharmacists, to build up a diversified molecule set via combination of both pharmacophores of AT1 and PPAR[gamma] receptor antagonists and agonists, respectively. Molecular modeling experiments (docking) on PPAR[gamma] were conducted to rationalise the synthesis and allow us to predict in some extent the agonistic activity of the studied compounds

Le Système Rénine Angiotensine tient une place prépondérante au sein de la circulation cérébrale. Les Antagonistes des Récepteurs AT1 à l'Angiotensine II (ARAII) ont prouvé leur efficacité dans la prévention de l'Accident Vasculaire Cérébral (AVC), indépendamment de leur effet anti-hypertenseur. Plusieurs mécanismes pourraient être impliqués dans cette cérébroprotection. D'une part, en bloquant les récepteurs AT1, les ARAII favorisent la stimulation des récepteurs AT2 à l'angiotensine II. Le caractère bénéfique lié à la stimulation des récepteurs AT2 s'oppose au caractère délétère lié à la stimulation des récepteurs AT1. Nous avons montré que cet équilibre AT1 - AT2 est modifié au niveau cérébrovasculaire suite à un régime hypersodé. En effet, la vasodilatation des artérioles cérébrales médiée par les récepteurs AT2 est abolie, ce qui pourrait constituer un élément délétère lors de la survenue d'un évènement ischémique. D'autre part, certains ARAII présentent une affinité pour les récepteurs PPAR-gamma. Cette activité, démontrée comme protectrice à différents niveaux vasculaires, pourrait également être bénéfique pour la circulation cérébrale. Nous avons en particulier montré que l'activation PPAR-gamma améliore les effets des ARAII au niveau de la circulation cérébrale (diamètre artériolaire, réactivité à l'angiotensine II). Les mécanismes en jeu semblent impliquer des modifications de la fonction des récepteurs AT1-AT2, indépendamment de leur expression. La stimulation des récepteurs AT2 et l'activation PPAR-gamma constituent donc deux propriétés particulières des ARAII. Ces propriétés pourraient participer au caractère cérébroprotecteur des ARAII, au-delà du seul blocage des récepteurs AT1. Le développement de molécules duales regroupant les activités antagoniste AT1 - agoniste PPAR-gamma pourrait constituer un avenir thérapeutique intéressant dans le traitement de l'hypertension en apportant une protection cérébrovasculaire supérieure aux traitements actuels / The Renin Angiotensin System plays a major role in cerebral circulation. AT1 receptor blockers (ARBs) afford protection against cerebrovascular complications that go beyond that to be expected from their blood pressure lowering action. Several mechanisms could explain such beneficial effects. Firstly, by blocking AT1 receptors, ARBs promote AT2 receptor stimulation by angiotensin II. The beneficial effect related to stimulation of AT2 receptors (vasodilation) counterbalances the deleterious actions of AT1 receptors stimulation. Changes in this ratio may then alter cerebral circulation. We demonstrated that the AT1- AT2 ratio is modified at the cerebrovascular level during high salt intake, which is a risk factor for stroke. The AT2-mediated vasodilation of pial arterioles is abolished. Secondly, some ARBs act as partial agonists of PPAR-gamma. Such an activity, which has been demonstrated to protect extracerebral vessels, could also be beneficial for cerebral circulation. Our results showed that PPAR-gamma activation improves ARB effects on cerebral circulation (arteriolar diameter, angiotensin II reactivity). The underlying mechanisms could imply functional regulation of AT1-AT2 receptors without any change in expression status. AT2 receptor stimulation and PPAR-gamma activity are two special properties of ARBs. These properties could contribute to the cerebroprotection induced by ARBs, beyond the AT1-receptor blockade. Development of new molecules with AT1-receptor blockade and PPAR-gamma activity could take part into the future therapeutic management of hypertension, providing a better cerebrovascular protection

Les accidents vasculaires cérébraux sont la deuxième cause de mortalité dans le monde, le développement de nouvelles thérapeutiques est donc urgent. Deux acteurs jouent un rôle majeur dans la régulation de la circulation cérébrale : le monoxyde d’azote (NO) et le système rénine angiotensine (SRA). Le chapitre 1 de ce manuscrit s’intéresse tout d’abord au NO, son rôle physiologique et ses voies de signalisation. Nous présentons les donneurs de NO disponibles sur le marché ainsi que ceux en développement. La bucillamine dinitrosée, développée dans notre laboratoire, fait l’objet d’une évaluation in vitro et in vivo. La deuxième partie de l’introduction s’intéresse au SRA, en rappelant son rôle prépondérant dans le maintien de la pression artérielle et de la régulation cérébrovasculaire. Nous présentons les récepteurs de l’angiotensine II (AngII), AT1 et AT2, responsables respectivement d’une vasoconstriction et d’une vasodilatation des artères cérébrales. Enfin la dernière partie présente la régulation des récepteurs de l’AngII par le NO, en particulier via la S-nitrosation du récepteur, la liaison d’un groupement NO sur une fonction thiol d’un résidu cystéine. Nous présentons les travaux de Leclerc qui montrent que l’exposition de cellules surexprimant le récepteur AT1 à un donneur de NO entraine une diminution d’affinité de l’AngII pour AT1 (Leclerc et al., 2006). Le chapitre 2 est consacré aux études expérimentales. L’objectif des travaux présentés dans cette thèse est d’étudier l’importance de la S-nitrosation des récepteurs de l’AngII au niveau cérébrovasculaire. Tout d’abord nous abordons la problématique actuelle concernant l’aspécificité des anticorps anti-AT1. Nous montrons que le nouvel anticorps monoclonal anti-AT1, censé être plus spécifique, ne reconnaît pas AT1 en western blot et en immunofluorescence, rendant donc son utilisation impossible. Nous faisons ensuite la démonstration pharmacologique des effets de la S-nitrosation sur les récepteurs de l’AngII. Nous montrons que l’exposition à un donneur de NO (S-nitrosoglutathion ou nitroprussiate de sodium) abolit spécifiquement la vasoconstriction médiée par AT1 comparé à d’autres vasoconstricteurs partageant ou non sa voie de signalisation. De plus cette exposition abolit aussi le tonus myogénique AT1-dépendant indépendant de la stimulation par l’AngII suggérant que l’altération survient sur le récepteur lui-même. Nous montrons par ailleurs que cet effet (i) ne dépend pas du NO endogène, (ii) se fait par une S-nitrosation plutôt que par la voie de la GMPc/GCs. Enfin nous étudions l’internalisation du récepteur par cytométrie en flux, sur un modèle hétérologue d’expression AT1. Nos résultats montrent que le GSNO ne modifie pas la localisation d’AT1 à la membrane et n’empêche pas son internalisation, indiquant que la voie ß-arrestine n’est pas impactée par la nitrosation.L’ensemble de ces résultats permet d’établir que la S-nitrosation d’AT1 constitue une cible thérapeutique potentiellement intéressante dans les AVC, où l’augmentation de la vasoconstriction médiée par AT1 est délétère / Stroke is the second leading cause of death worldwide, the development of new therapeutics is thus urgent. Two actors play a major role in the regulation of cerebral circulation: nitric oxide (NO) and the renin-angiotensin system (RAS). The first chapter of this manuscript focuses on NO, its role and its signaling pathways. We present the available NO donors as well as those in development. Dinitrosobucillamine, a new NO donor developed in our team, is evaluated in vitro and in vivo. The second part of the introduction focuses on RAS and its preponderant role in blood pressure maintenance and cerebrovascular regulation. We present the angiotensin II (AngII) receptors, AT1 and AT2 responsible for vasoconstriction and vasodilation of cerebral arteries, respectively. Finally, the last part presents the regulation of AngII receptors by NO, in particular through S-nitrosation of the receptors, the covalent bound between NO and cysteine residues. We present the work of Leclerc, showing that exposure of cells overexpressing AT1 to NO causes a decrease in AngII affinity for AT1 (Leclerc et al., 2006). The second chapter is devoted to the experimental studies. The objective of this work is to study the importance of AngII receptor S-nitrosation at the cerebrovascular level. First, we address the current problematic concerning the nonspecificity of anti-AT1 antibodies. We show here that the new monoclonal anti-AT1 antibody, which is supposed to be more specific, does not recognize AT1 in western blot and immunofluorescence, making its use impossible. We then make a pharmacological demonstration of S-nitrosation effects on AngII receptors. We show that exposure to NO donors (S-nitrosoglutathione or sodium nitroprusside) specifically abolishes AT1-mediated vasoconstriction compared to other vasoconstrictors sharing or not its signaling pathway. Moreover, this exposure also abolishes AT1-mediated AngII-independent myogenic tone, suggesting an alteration on the receptor itself. We also show that this effect (i) does not depend on endogenous NO, (ii) is mediated by S-nitrosation rather than by the cGMP/sGC pathway. Finally, we study AT1 internalization by flow cytometry on a heterologous model of AT1 expression. Our results show that GSNO does not alter AT1 cell surface localization and does not prevent its internalization, indicating that the ß-arrestin pathway is not impacted by nitrosation

Demonstramos na fase crônica da hipertensão por coarctação, depressão acentuada do controle reflexo da freqüência cardíaca (Michelini et al, Hypertension, 1992; 19:II159-II163) e que o tratamento crônico com losartan, embora não reverta os elevados níveis de pressão, normaliza o controle reflexo da freqüência cardíaca (Santos et al, Am. J. Physiol, 1995; 269:H812-H818). No presente estudo investigamos em ratos hipertensos e seus controles normotensos os efeitos do bloqueio crônico dos receptores AT1 sobre a atividade aferente do nervo depressor aórtico (NDA, protocolo I) e sobre a atividade simpática esplâncnica (ASE, protocolo II) na situação basal e após estimulação por hipotensões e hipertensões transitórias. Ratos Wistar adultos machos (180-300g) foram tratados cronicamente com veículo (VEH=água destilada, 0,1ml/100g/dia, po.) ou losartan (LOS= 10mg/kg/dia, po.) por 8 dias. No 4º dia após a determinação da pressão de cauda, foram submetidos à coarctação subdiafragmática da aorta (CH) ou à cirurgia fictícia (SHAM) e ao final do 7º dia, instrumentados com cânula arterial para registro direto da pressão arterial, realizada no 8º dia, com os animais acordados. Foram a seguir anestesiados para isolamento do nervo depressor aórtico ou do simpático esplâncnico, que foram registrados simultaneamente à pressão arterial em duas situações distintas: a) durante a situação basal (registro da atividade espontânea por 10-15 minutos), b) durante estimulação dos pressorreceptores por variações transitórias da pressão arterial (infusões/retiradas de sangue e injeções/infusões de fenilefrina e nitroprussiato de sódio iv.). Os registros da atividade neural foram retificados, integrados e aquisitados simultaneamente aos registros de pressão arterial em computador (programa de aquisição de dados Codas - Windaq DI-200, Ohio, USA). Tratamento com LOS determinou queda significante da pressão de cauda (104+-3 vs. 117+-3 mmHg nos grupos VEH). Em ambos os grupos VEH e LOS, CH determinou aumento significativo e similar da pressão arterial (em média 29%) que foi acompanhada, nos grupos tratados com VEH, por significativo aumento da variabilidade associada à depressão no ganho da correlação da atividade do NDA com a pressão arterial (CHVEH=1,04+-0,11 vs. SHAMVEH=1,63+-0,14 %/ciclo/mmHg, p<0,05, protocolo I) e por facilitação da resposta da ASE (CHVEH=-10,36+-1,05 vs. SHAMVEH=-5,81+-0,60 %/ciclo/mmHg, p<0,05, protocolo II). Nos grupos tratados com LOS, o estabelecimento da hipertensão foi acompanhado por redução da variabilidade e significativa melhora no ganho do NDA, uma vez que na faixa fisiológica de variações da pressão a depressão da atividade do NDA foi significativamente menor (CHLOS=3,30+-0,33 vs. CHVEH=2,18+-0,37 %/ciclo/mmHg, p<0,05, uma recuperação de 40% quando comparado aos respectivos controles ~5,01+-0,33 %/ciclo/mmHg). Houve ainda nos CHLOS normalização do ganho de resposta de ASE (CHLOS=-6,58+-0,62 %/ciclo/mmHg que não diferia dos SHAMLOS e SHAMVEH). O tratamento crônico com LOS determinou ainda correção parcial da atividade basal do NDA, mas não alterou a descarga espontânea da ASE. As alterações de atividade do NDA e ASE observadas nos CHLOS ocorreram simultaneamente, mas foram independentes da redução da pressão arterial pelo LOS. Nossos dados sugerem que a Ang II, ativada durante o desenvolvimento da CH, deprime a sinalização aferente pelo NDA, sendo responsável pela facilitação da resposta simpática durante alterações transitórias da pressão arterial. Nossos dados permitem ainda discriminar entre o efeito pressor e o efeito modulatório da Ang II, indicando restauração parcial do ganho da NDA e normalização da resposta simpática após o bloqueio crônico dos receptores AT1, mesmo na presença da hipertensão. / In the chronic phase of coarctation hypertension (CH) we have shown both marked depression of baroreceptor reflex control of heart rate (Michelini et al, Hypertension, 1992, 19: II159-II163) and normalization of the depressed reflex control even with the persistence of hypertension in losartan-treated animals (Santos et al, Am. J. Physiol, 1995, 269: H812-H818). In the present study we analyzed the effects of chronic AT1tors blockade on the both the afferent aortic nerve activity (AON, protocol I) and splanchnic sympathetic nerve activity (SSNA, protocol II) of CH and sham operated controls in two conditions: spontaneous activity (basal condition) and stimulated discharge during transient increases/decreases in arterial pressure. Male Wistar rats (180-300g aged 2-3 months) were chronically treated with vehicle (VEH=distilled water, 1ml/kg/day, po.) or losartan (LOS=10mg/kg/day, po.) during 8 days. Tail pressure was measured at the beginning and on the 4th day, before subdiaphragmatic aortic coarctation (CH) or sham surgery (SHAM). On day 7 the rats were instrumented with a catheter to record arterial pressure in conscious freely moving rats on day 8. Rats were then anesthetized to record AON or SSNA simultaneously with pressure during 10-15 min (basal or spontaneous activity) and during baroreceptor loading/unloading (infusion/withdrawal of blood or injections/infusions of phenylephrine and sodium nitroprusside iv.). Nerve activity was rectified and integrated and acquired simultaneously with pressure in a computer (Windaq DI-200, Ohio, USA). Losartan-treatment caused a significant decrease in tail pressure (104+-3 vs. 117+-3 mmHg in VEH groups). In both LOS- and VEH-treated groups, CH caused significant and similar increases in arterial pressure (mean of 29%) that was accompanied in the VEH groups by both significant increase in variability and depression of the AON/activity/pressure relationship (CHVEH=1,04+-0,11 vs. SHAMVEH=1,63+-0,14 %/cycle/mmHg, p<0,05, protocol I) and by potentiation of SSNA responses (CHVEH=-10,36+-1,05 vs. SHAMVEH=-5,81+-0,60 %/cycle/mmHg, p<0,05, protocol II). In the LOS-treated groups, establishment of CH was accompanied by smaller variability and marked improvement in AON gain: in the physiological range of pressure changes, depression of AON activity was significantly smaller (CHLOS=3,30+-0,33 vs. CHVEH=2,18+-0,37 %/cycle/mmHg, p<0,05, a recovery of 40% when compared to respective controls of ~5,01+-0,33 %/cycle/mmHg). CHLOS showed also normalization of SSNA responses: gain in the CHLOS=-6,58+-0,62 %/cycle/mmHg, that was not different from SHAMLOS and SHAMVEH groups. In addition chronic treatment with LOS caused partial correction of spontaneous AON activity but did not change spontaneous SSNA discharge. Both AON and SSNA responses observed in CHLOS occurred simultaneously but were independent from pressure reductions observed in these groups. The date suggested that Ang II, activated during development of hypertension, depresses the afferent signaling by aortic receptors and is factor responsible for the facilitation of SSNA during pressure changes. The date permits to discriminate between pressor and a modulatory effects of Ang II and indicates that after chronic AT1 receptors blockade hypertension persists, but there is a partial restoration of AON gain accompanied by normalization of the sympathetic response.

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