Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Toxoplasmosis is a zoonotic disease caused by Toxoplasma gondii, often leading to functional, biochemical and structural changes, especially in the central nervous system. These changes are usually accompanied by a marked immune-inflammatory response, in immunocompetent hosts. Primary infections with T. gondii stimulate production of high levels of interleukins, such as IL-12 and IFN-γ, by cells of the innate immune system, being central efforts to resistance to the disease. In terms of immune response, the purinergic and cholinergic systems have some well-defined properties, but we still without much information on the interrelation of these properties with toxoplasmosis. Thus, the objectives of this study were to evaluate the activities of the (1) E-NTPDase and E-ADA in lymphocytes; (2) AChE on total blood and lymphocytes, and BChE on serum, using the RH (virulent) strain of T. gondii, with sampling on day 5 and 10 post-infection (pi); and (3) assess the purine levels and E-ADA activity in brain, using strains RH and Me-49 (cystogenic). First assessment´s result demonstrated that the hydrolysis of ATP and ADP was increased, as well as the E-ADA activity also was increased. In the second experiment, there was an increase in AChE activity on lymphocytes and on whole blood. Finally, on the third experiment, it was found, in infection with RH, a significant increase of ATP, ADP, AMP, adenosine, hypoxanthine and xanthine levels, along with a reduction of inosine levels. Animals infected with the strain Me-49 showed increased concentrations of ATP and ADP, followed by a reduction of nucleotides and nucleosides levels. Regarding to E-ADA activity, it was observed a reduction on its activity on RH infection, and initially for Me-49 infection; however, E-ADA increased its activity, for this cystogenic at the end of the third experiment. The evaluations of E-NTPDase and E-ADA activities led to the preposition that their hydrolytic activity would be linked to a mechanism of protection against secondary tissue damage, possibly generated by an exacerbated response against T. gondii infection. Additionally, the data of AChE activity, in corresponding samples, confirm the onset of a pro-inflammatory response, corroborating with the hypothesis of necessity of a modulation mechanism. On brain tissue, the experimental model using RH strain repeated its pro-inflammatory pattern, with data of this pattern better observed in a long run, when the results of Me-49 study were evaluated. On Me-49 infection model, it was observed an increase in extracellular ATP, at the beginning of infection, with histopathology data showing inflammatory infiltrate and identification of tissue cysts later on the experiment. Finally, in this last period, it was observed a decrease in purine´s concentration, most likely as a result of the aggravation of local cellular condition, due to the disease´s evolution. Therefore, it was possible to observe that there was a direct involvement of purinergic and cholinergic systems on immunomodulation of experimental toxoplasmosis, with virulent or cystogenic strains, contributing to the establishment of an adequate immune response on the parasite, and also to a mechanism of tissue damage reduction, which is normally associated with direct parasite damage and excessive immune response. / A toxoplasmose é doença zoonótica causada pelo Toxoplasma gondii, podendo levar à alterações funcionais, bioquímicas e estruturais, especialmente no sistema nervoso central. Estas, geralmente, são acompanhadas por uma marcante resposta imunoinflamatória em hospedeiros imunocompetentes. Infecções primárias com T. gondii estimulam a produção de altos níveis de citocinas, tais como IL-12 e IFN-γ, pelas células do sistema imune inato, consistindo em um ponto principal no controle do parasito e resistência a doença. Em se tratando de resposta imune, os sistemas purinérgico e colinérgicos possuem algumas propriedades bem definidas, porém sem muitas informações sobre a inter-relação destes com a toxoplasmose. Desta maneira, os objetivos deste estudo foram avaliar as atividades (1) da E-NTPDase e E-ADA em linfócitos; (2) da AChE no sangue total e linfócitos, e BChE no soro; utilizando a cepa RH (virulenta) do T. gondii; e (3) avaliar os níveis de purinas e atividade da E-ADA no cérebro, utilizando-se as cepas RH e Me-49 (cistogênica). Os resultados da primeira avaliação demonstraram que a hidrólise do ATP e ADP foram aumentadas, bem como a atividade da E-ADA também esteve aumentada. No segundo experimento, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no sangue total. Por fim, no terceiro experimento, verificou-se na infecção com a cepa RH um aumento nos níveis de ATP, ADP, AMP, adenosina, hipoxantina e xantina, e redução nos níveis de inosina. Nos animais infectados com a cepa Me-49, observaram-se inicialmente um aumentos nas concentrações de ATP e ADP, seguido de uma redução na concentração dos nucleotídeos e nucleosídeos. Em relação à atividade da E-ADA, verificou-se uma redução na infecção pela cepa RH, e inicialmente para a cepa Me-49, porém a E-ADA aumentou suas atividades para esta cepa cistogênica no final do experimento. A avaliação das atividades da E-NTPDase e E-ADA levou a preposição de que seus comportamentos hidrolíticos estariam ligados a um mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas a infecção pelo T. gondii. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. No tecido cerebral, a cepa RH repetiu o seu comportamento pró-inflamatório, e este comportamento pode ser analisado em longo prazo, no estudo que envolveu a cepa Me-49. Neste modelo, observou-se um aumento do ATP extracelular no início da infecção, como dados de histopatologia mostrando infiltrado inflamatório e a identificação de cistos teciduais tardiamente. Por fim, neste último período, observou-se uma diminuição na concentração das purinas, muito provavelmente em consequência da agravação da condição celular local em decorrência da evolução da infecção. Desta forma, foi possível se observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da toxoplasmose experimental com cepas virulenta ou cistogênica, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada ao parasito, e para um mecanismo de redução de danos teciduais associados a danos parasitários diretos e a resposta imune exacerbada.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pesticides can affect toxicological parameters and cause oxidative stress in fish. In Brazil there are few studies linking pesticide toxicity with fish. For this reason, two experiments were conducted to evaluate possible effects of herbicides on some toxicological parameters in carp (Cyprinus carpio). The fish were exposed to two commercial herbicides, one composed of a mixture formulated imazetapir and imazapic and the second composed of clomazone. The periods of exposure were seven days in the laboratory and seven, 30 or 90 days on rice field condition. After the experimental period, metabolic and toxicological parameters in the liver, brain and muscle tissues were evaluated. The enzymatic parameters analyzed in different tissues of this species were acetylcholinesterase activity (AChE), catalase (CAT) and glutathione S-transferase (GST). Also, oxidative stress parameters, such as carbonyl protein and TBARS levels in hepatic tissue, were analyzed. The metabolic parameters analyzed in liver and muscle of carp were glucose, glycogen, lactate, protein, amino acids and ammonia. Moreover, metabolic assessments were made (glucose, lactate and protein) in carp plasma. The results showed that AChE activity was increased in carp brain after seven days of exposure to a commercial formulation containing imazethapyr and imazapic herbicides both under field and laboratory conditions. In the same period of exposure, muscle tissue showed reduced activity of AChE after exposure to all herbicides (imazetapir and imazapic and clomazone) under laboratory conditions. At 30 days, in the field, AChE activity was reduced in brain and enhanced in muscle of carps exposed to imazethapyr and imazapic. Fish exposed to clomazone herbicide did not show any change in the activity of this enzyme in this period. On the other hand, at 90 days of exposure, only the fish exposed to the herbicide clomazone, showed a reduction in muscle AChE activity. The antioxidant enzyme catalase showed increased activity in liver tissue after seven days of exposure under both experimental conditions. At 30 days of exposure, catalase activity showed no further changes and after 90 days of exposure activity was reduced in liver of carp exposed to clomazone herbicide. The enzyme glutathione S-transferase was altered only after 30 and 90 days of exposure in the field. GST activity was reduced in liver tissue after exposure to both herbicides tested. TBARS levels were increased in almost all periods, terms of exposure and tissues considered, with the exception of brain tissue, which presented a decrease in TBARS levels at 30 days of exposure. Protein carbonyl was reduced in liver of carp exposed to clomazone herbicide after seven days under laboratory conditions. Moreover, at 30 and 90 days of exposure, the protein carbonyl levels were increased in the liver of fish exposed to both herbicides. After exposure to both herbicides, the carp showed metabolic disorders. In general, protein and amino acid levels were reduced and the amount of glycogen was enhanced in liver and muscle of carp exposed to both herbicides at all times tested. However, ammonia, lactate and glucose levels were increased and reduced according to the tissue considered, time of exposure and herbicide tested. These results indicate that the parameters measured may be good indicators of contamination of these commercial herbicides in Cyprinus carpio. / Os pesticidas podem afetar parâmetros toxicológicos e ainda causar estresse oxidativo em peixes. No Brasil existem poucos estudos relacionando toxicidade de pesticidas com peixes. Por esta razão foram conduzidos dois experimentos com objetivo de avaliar possíveis efeitos dos herbicidas sobre alguns parâmetros toxicológicos em carpas (Cyprinus carpio). Os peixes foram expostos a dois herbicidas comerciais, um composto pela mistura formulada de imazetapir e imazapic e o segundo composto por clomazone. Os períodos de exposição foram de sete dias em laboratório e por sete, 30 ou 90 dias em condição de lavoura de arroz. Após os períodos experimentais, nos tecidos hepático, cerebral e muscular foram avaliados parâmetros metabólicos e toxicológicos. Os parâmetros enzimáticos analisados foram a atividade da acetilcolinesterase (AChE), catalase (CAT) e glutationa S-transferase (GST) em diferentes tecidos desta espécie. Além disso, analisaram-se parâmetros de estresse oxidativo, como a carbonilação de proteínas e níveis de TBARS no tecido hepático. Os parâmetros metabólicos analisados foram glicose, glicogênio, lactato, proteína, amônia e aminoácidos em fígado e músculo de carpas. Ademais, foram feitas avaliações metabólicas (glicose, lactato e proteína) em plasma de carpas. Os resultados mostraram que a atividade da AChE foi aumentada em cérebro de carpas, após sete dias de exposição a formulação comercial contendo os herbicidas imazetapir e imazapic, em condições de campo e laboratório. Neste mesmo período de exposição, o tecido muscular mostrou redução da atividade da AChE após exposição as duas formulações comerciais em laboratório. Aos 30 dias em campo, a atividade da enzima AChE foi reduzida em cérebro e aumentada em músculo de carpas expostas a formulação contendo a mistura dos herbicidas imazetapir e imazapic. Os peixes expostos ao herbicida clomazone não mostraram alteração na atividade desta enzima, neste período. Já aos 90 dias de exposição, somente os peixes expostos ao herbicida clomazone, mostraram uma redução na atividade da AChE muscular. A enzima antioxidante catalase mostrou sua atividade aumentada no tecido hepático após sete dias de exposição em ambas as condições experimentais e às duas formulações comerciais testadas. Aos 30 dias de exposição, a enzima não foi alterada e após 90 dias de exposição a sua atividade foi reduzida em fígado de carpas expostas ao herbicida clomazone. A enzima glutationa S-transferase só foi alterada após 30 e 90 dias de exposição em campo. Sua atividade foi reduzida no tecido hepático após exposição às formulações comerciais dos herbicidas testados. Os níveis de TBARS foram aumentados em praticamente todos os períodos, condições de exposição e tecidos considerados, com exceção do tecido cerebral que aos 30 dias de exposição, mostrou os níveis de TBARS diminuídos. Os níveis de proteína carbonil foram diminuídos em fígado de carpas expostas por sete dias ao herbicida clomazone em laboratório. Por outro lado, aos 30 e 90 dias de exposição os níveis de proteína carbonil foram aumentados no fígado de peixes expostos as duas formulações comerciais. Após exposição aos dois herbicidas comerciais, as carpas demonstraram desordens metabólicas. De uma maneira geral, os níveis de proteína e aminoácidos foram diminuídos e o conteúdo de glicogênio aumentado em fígado e músculo de carpas expostas aos dois herbicidas comerciais e tempos testados. Porém, os níveis de amônia, lactato e glicose mostraram alterações variáveis de acordo com o tecido considerado, com o tempo de exposição e com o herbicida testado. Estes resultados indicam que os parâmetros medidos podem ser bons indicadores da contaminação destes herbicidas comerciais em Cyprinus carpio.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aquatic ecosystems may be constantly receiving metals from industrial discharges and agriculture generated by anthropogenic activities. Thus, the organisms in the aquatic environment may be the target of these contaminants. The aim of this study was verify cadmium effects on silver catfish (Rhamdia quelen) metabolism. First was verified the lethal concentration (LC50) 96 hours of cadmium for silver catfish and was obtained the value of 1.7 mg/L. Then juvenile of R. quelen were exposed for seven and 14 days to 10% and 20% of LC50. At the end of exposure periods the fish were subjected to recovery periods of seven and 14 days. The parameters analyzed were the activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) (brain and muscle), oxidative stress through parameters such as protein carbonyl (liver), TBARS (brain, liver, kidney, gills) and the antioxidant enzymes catalase, glutathione S-transferase and superoxide dismutase (liver, kidney and gills). Furthermore, general parameters related to metabolism as glycogen, glucose, lactate, protein, amino acids and ammonia (liver, muscle and plasma) and metal accumulation were verified. The activity of brain AChE was not changed after seven days of exposure but significant inhibition was observed after 14 days of exposure and recovery. After the exposure periods, the muscle AChE was increased (seven days) and inhibited (14 days). Increase in protein carbonyl occurred after seven days of exposure and reduction was found after seven days of recovery. The same exposure period caused an increase in TBARS in the brain and gills and reduction in kidney. Following the recovery for seven days, an increase of TBARS occurred in the liver and reduction in the gills. After the exposure for 14 days TBARS increase was observed in all tissues tested. In the kidney values return to the control levels after the recovery of 14 days. The activity of liver catalase increased and reduced in gills after the exposure periods and the recovery for seven days caused reduction of the enzyme in the two tissues. In the kidney no change was observed in the activity of this enzyme. The activity of liver glutathione S-transferase increased after exposure for seven days and reduced after the same recovery period. In the gills a significant decrease occurred after exposure (seven and 14 days) and activity only returned to the control values after 14 days of recovery. The liver superoxide dismutase activity reduced after exposure periods and was recovered only after 14 days. The metabolic parameters presented changes according to tissue and time of exposure. In the liver occurred increase of lactate, protein and amino acids and reduction of glucose after exposure to cadmium for seven days. In the recovery period of seven days, the glycogen levels increased and the other parameters returned to the control values. Following 14 days of exposure the liver protein concentration reduced however, the amino acids and ammonia levels increased. After the recovery of 14 days, amino acids and ammonia remained increased, lactate also increased and reduced glycogen in this period. In the muscular tissue protein reduction and increase of amino acids, ammonia, glycogen and glucose were observed after exposure (seven days). In seven days of recovery, glucose remained increased and protein reduced. After 14 days of exposure also was observed reduction of protein, but there was an increase of glucose. In the recovery of 14 days only the ammonia levels had increased. In plasma, glucose, lactate and protein were altered after exposure to cadmium. Lactate increased after seven days and silver catfish showed glucose, lactate and protein reduced after 14 days. Lactate reduced after seven days in recovery and the protein levels remained low after the recovery for 14 days. In general the cadmium accumulation was higher in kidney, liver and gills as compared to the brain and muscle. Thus, the changes observed indicate that cadmium affects the silver catfish metabolism. The parameters analyzed can be good indicators of cadmium toxicity. / Os ecossistemas aquáticos podem estar recebendo constantemente metais provenientes de descargas industriais e da agricultura geradas por atividades humanas. Desta forma, os organismos presentes no meio aquático podem ser alvo destes contaminantes. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos do cádmio sobre o metabolismo de jundiás (Rhamdia quelen). Neste trabalho primeiramente verificou-se a concentração letal média (CL50) do cádmio para o jundiá, obtendo-se o valor de 1,7 mg/L. Em seguida juvenis de R. quelen foram expostos por sete e 14 dias à 10% e 20% do valor da CL50. Ao final da exposição, os peixes foram submetidos a períodos de recuperação de sete e 14 dias. Os parâmetros analisados foram a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) (cérebro e músculo), ocorrência de estresse oxidativo através de parâmetros como proteína carbonil (fígado), formação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (cérebro, fígado, rim, brânquias) e as enzimas antioxidantes catalase, glutationa S-transferase e superóxido dismutase (fígado, rim e brânquias). Além disso, parâmetros gerais relacionados ao metabolismo como glicogênio, glicose, lactato, proteína, aminoácidos e amônia (fígado, músculo e plasma) e acumulação de metais (cérebro, músculo, fígado, rim e brânquias) foram determinados. A atividade da AChE cerebral não foi alterada após sete dias de exposição mas foi observada significante inibição após 14 dias de exposição e recuperação. Após os períodos de exposição, a AChE muscular foi aumentada (sete dias) e reduzida (14 dias). Ocorreu aumento de proteína carbonil após sete dias de exposição e redução após sete dias de recuperação. O mesmo período de exposição provocou aumento de TBARS no cérebro e brânquias e redução no rim. Seguindo a recuperação por sete dias ocorreu aumento de TBARS no fígado e redução nas brânquias. Após a exposição de 14 dias foi observado aumento de TBARS em todos os tecidos analisados, e somente no rim os valores retornam aos níveis do controle após a recuperação de 14 dias. A atividade da catalase aumentou no fígado e reduziu nas brânquias após os períodos de exposição. Na recuperação (sete dias) ocorreu redução da atividade da enzima nos dois tecidos. No rim nenhuma alteração foi observada na atividade desta enzima. A atividade da glutationa S-transferase aumentou no fígado após a exposição por sete dias e reduziu após o mesmo período de recuperação. Nas brânquias ocorreu um decréscimo significante após exposição (sete e 14 dias) e a atividade só retornou aos valores do controle depois de 14 dias de recuperação. A atividade da superóxido dismutase, analisada no fígado, reduziu após os períodos de exposição e foi recuperada somente após 14 dias em água sem adição de cádmio. Os parâmetros relacionados ao metabolismo apresentaram alterações de acordo com o tecido considerado e tempo de exposição. No fígado ocorreu aumento de lactato, proteína e aminoácidos e redução de glicose na exposição ao cádmio por sete dias. Na recuperação por sete dias, os níveis de glicogênio aumentaram e os demais parâmetros retornaram aos valores do controle. Seguindo 14 dias de exposição, a concentração de proteína hepática reduziu enquanto os níveis de aminoácidos e amônia aumentaram. Após a recuperação de 14 dias, aminoácidos e amônia permaneceram aumentados, lactato também aumentou e glicogênio reduziu neste período. No tecido muscular ocorreu redução de proteína e aumento de aminoácidos, amônia, glicogênio e glicose após exposição (sete dias). Na recuperação por sete dias, glicose permaneceu aumentada e proteína reduzida. Após 14 dias de exposição também foi verificada redução de proteína, mas ocorreu aumento de glicose e neste período de recuperação somente os níveis de amônia apresentaram aumento. No plasma, glicose, lactato e proteína foram alterados após exposição ao cádmio. Lactato aumentou após sete dias e depois de 14 dias expostos, jundiás demonstraram redução de glicose, lactato e proteína. Lactato reduziu após sete dias em recuperação e os níveis de proteína continuaram reduzidos após a recuperação por 14 dias. De maneira geral a acumulação de cádmio foi maior no rim, fígado e brânquias em comparação com o cérebro e músculo. Desta forma, as alterações observadas indicam que o cádmio afeta o metabolismo de jundiás. Os parâmetros analisados podem ser bons indicadores de toxicidade para cádmio.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / 2,4-Diamin (2,4-D), or 2,4 dichlorophenoxyacetic acid is a systemic herbicide widely used in the world to control of broadleaf weeds. Agrochemicals of various classes are considered essential to agricultural development, but owing to toxic effects some of them can affect ecosystems through environmental contamination of soil and water. The presence of herbicides in aquatic system can contaminate fish and consequently, others animals, which feed on fish, causing indirectly contamination. Thus, the objective of this study was to investigate the effects of commercial formulation of herbicide 2,4-D concentrations of 400, 600 and 700 mg L−1, on metabolic parameters, acetylcholinesterase (AChE) activity and liver histological evaluation of silver catfish (Rhamdia quelen) exposed for 96 h. AChE activity increased in brain (600 and 700 mg L−1) and decreased in all concentrations tested in muscle tissue. Hepatic glycogen was reduced after 2,4-D exposure ranging from 47.7% (400 mg L−1) and 59.3% (700 mg L−1). Hepatic tissue showed lactate reduction at all 2,4-D concentrations tested and glucose was reduced only at 700 mg L−1. In the highest concentration tested hepatic glycogen, glucose reduced and plasma glucose levels increased. White muscle tissue showed glycogen reduction in fingerlings exposed to all herbicide concentrations and glucose reduction at 700 mg L−1. Muscle lactate levels increase at all 2,4-D concentrations tested. Vacuolation of hepatocytes and changes in their arrangement cords were observed by histologic al analysis in the group treated with 700 mg L−1 2,4-D. These results suggest that silver catfish exposed to 2,4-D concentrations near CL50 showed metabolic and histological responses to compensate some stress caused by herbicide exposure. Taken together parameters measured can be used as biomarkers to monitor fish contaminating by 2,4-D. / 2,4-diamin (2,4-D), ou ácido 2,4 diclorofenoxiacético é um herbicida sistêmico amplamente utilizado no mundo para controle de plantas daninhas broadleaf. Agroquímicos de diversas classes são considerados essenciais para o desenvolvimento agrícola, mas podem afetar os ecossistemas através da contaminação ambiental do solo e da água, devido. A presença de herbicidas no sistema aquático pode contaminar os peixes e, consequentemente, outros animais, que se alimentam de peixes, causando indiretamente uma maior contaminação contaminação. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da formulação comercial do herbicida 2,4-D nas concentrações de 400, 600 e 700 mg L-1 sobre parâmetros metabólicos, atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) e avaliação histológica do fígado de jundiás (Rhamdia quelen) expostos por um período de 96 h. Como resultados observamos que a atividade da AChE mostrou-se aumentada no cérebro (600 e 700 mg L-1) e diminuída no tecido muscular em todas as concentrações testadas. O glicogênio hepático foi reduzido, após exposição ao 2,4- D variando entre 47,7% (400 mg L-1) e 59,3% (700 mg L-1). Já no tecido hepático houve reduções do lactato em todas as concentrações testadas e da glicose apenas na concentração de 700 mg L-1 2,4-D. Na maior concentração testada o glicogênio hepático e a glicose apareceram reduzidos, ao contrário da glicose plasmática que estava com níveis aumentados. O glicogênio do tecido muscular mostrou-se reduzido nos alevinos expostos a todas as concentrações testadas do herbicida e na concentração de 700 mg L-1 houve redução da glicose. O lactato muscular aumentou em todas as concentrações de 2,4-D testadas. Foi observada vacuolização de hepatócitos e alterações no arranjo dos cordões hepáticos através da analise histológica no grupo tratado com 700 mg L-1 2,4-D. Estes resultados sugerem que os jundiás expostos a concentrações de 2,4-D perto da CL50 mostraram resposta metabólica e histológica compensatória ao estresse causado pelo herbicida. Assim, este conjunto de parâmetros medidos pode ser utilizado como biomarcador para acompanhar a possível contaminação dos peixes pelo herbicida 2,4-D.

The intensification of agricultural production in the Mekong Delta has faced serious challenges with respect to increased use of agrochemicals and especially pesticides. The indiscriminate use of pesticide could potentially impact on the long-term food production, environmental and human health in the delta. The aim of this thesis was to investigate the negative side effects of the current use of pesticides on climbing perch (Anabas testudineus) in rice fields using brain acetylcholinesterase (hereafter referred to as AChE) activity as a biomarker. The empirical work, on which this thesis is based, includes structured questionnaires, laboratory and field experiments. First, a field survey using questionnaires was carried out to gain a better understanding of the current state of rice farming systems, the use of pesticides and attitude to pest management strategies among rice and rice-fish farmers, as well as to provide basic information for the set-up of the laboratory and field experiments. Secondly, laboratory studies were conducted to clarify if the selected insecticides applied alone and in mixtures caused negative side effects on climbing perch fingerlings. Thirdly, further toxicity studies were carried out, under rice field conditions, to further investigate the toxicity effects of the insecticides, applied alone, in mixtures and under sequential applications, on climbing perch fingerlings. The results showed that although there were a more selective use of pesticides and an increased awareness among farmers of the negative side effects of pesticides in 2007 as compared to 1999, the current use of pesticide in the Mekong Delta still cause many problems to the environment and human health. Chlorpyrifos ethyl (hereafter referred to as CPF) was found to cause a significant and more prolonged inhibition on the brain AChE activity in climbing perch than fenobucarb (hereafter referred to as F). The inhibition by the mixture of CPF and F were significantly higher than the inhibition by only F, but less prolonged and significant lower than the inhibition by only CPF. The results suggest that the combined effect from a mixture of F and CPF can create both additive effects initially and later antagonistic effects. CPF and F applied at concentrations used by farmers, either as separate doses, in a mixture or in sequential doses, decreased the brain AChE activity, growth and survival rates in climbing perch. The results demonstrate that brain AChE activity in climbing perch is a relevant biomarker for monitoring of exposure to, and sub-lethal impacts from organophosphates and carbamates under tropical conditions. The result also shows that 2-PAM re-activate the brain AChE activity, and can be used as an alternative method to assess the AChE inhibition level in organisms recently exposed to OP’s, in situation where it may be difficult to find unexposed individuals as controls. In conclusion, this thesis shows that the current use of pesticides in the Mekong Delta has a negative effect on climbing perch living in rice fields. It indicates that a sustained long-term food production in the Mekong Delta must be based on ecological principles, taking advantages of ecosystem biodiversity and productivity, and not through intensified use of pesticides. / <p>At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 3: Submitted. Paper 5: Submitted.</p>

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Botany and Ecology Candidate: Daniela Hulcová Consultant: Prof. RNDr. Lubomír Opletal, CSc. Title of Diploma Thesis: Biological aktivity of plants metabolites. XXVII. Alkaloids of Fumaria officinalis L. and their effect on acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase The summary ethanolic and diethylether extract were prepared from the herbs of a plant Fumaria officinalis L. We have obtained 201 fractions from this extract by column chromatography on the neutral Al2O3 (aluminium oxide). Joined fraction 68-76 were processed by thin layer chromatography, and 3 substances were obtained in pure state: DH-1, DH-2, DH-3. These 3 compounds were identified as protopine, (+)-fumariline and N- methylcorydaldine by the comparison with the literature and results of MS and NMR. These alkaloids were tested for the inhibitory activity against human erythrocytic acetylcholinesterase and plasmatic butyrylcholinesterase by Ellman`s method. The isolated alkaloids did not show any significant inhibitory activity (IC50, µM) compared with the standard galanthamine (IC50, µM; AChE 1,710 ± 0,065, BuChE 42,30 ± 1,30): protopin: AChE: 345,42 ± 31,12, BuChE: 239,66 ± 20,89, (+)-fumarilin: AChE: 2939,2 ± 309,41, BuChE: 330,62 ±...

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2017-11-20T21:56:50Z No. of bitstreams: 1 DISSERTA??O JULIANA PAIX?O-2016.pdf: 2113185 bytes, checksum: 9e5f3d0a2c6c528f026640900a5db77a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-20T21:56:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTA??O JULIANA PAIX?O-2016.pdf: 2113185 bytes, checksum: 9e5f3d0a2c6c528f026640900a5db77a (MD5) Previous issue date: 2016-03-23 / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado da Bahia - FAPEB / Chemical characterization and biological activity tests of plants are important approaches to drug discovery, rational use of elements of our biodiversity in view of the variety of plants reflects the diversity of their secondary metabolites and therapeutic potential. Brazil is an invaluable source of natural resources to obtain drugs, however, little study has been done on the pharmacological potential of native species. The Bromeliaceae family includes about 58 genera and about 3,352 species. Brazil comprises about 40% of the total species with Ananas comosus being the best known. Some plants of this family are used for the treatment of various diseases and there are reports on the presence of secondary metabolites such as triterpenoids, steroids, flavonoids, glycerols, cinnamic acid derivatives and others. This study aimed to know the chemical composition and biological activities of accessions and hybrids of different botanical varieties of Ananas genus in partnership with (EMBRAPA). The leaves of the harvested specimens were dried, ground, and subjected to an extraction procedure with methanol and were pre-selected via the screening and biological screening in order to obtain the best species profile. Three accessions and one hybrid were selected, they were subjected to extraction with methanol, then partitioned with solvents of different polarities. Artemia salina lethality, antioxidants and acetylcholinesterase activity tests were performed. The chromatographic fractionation of the species with better chromatography profile was performed using different techniques. The results revealed that 21 collected accessions have different secondary metabolites, and a wide variation among themselves showing no standard. In relation to biological testing several accessions showed lethality to Artemia salina, antioxidants and acetylcholinesterase activity. The results indicate that extracts of accessions contain active constituents that present such activities confirming its biological potential. As a result of preliminary studies the accessions BGA-739, BGA-804, BGA-820 and hybrid HE were selected for further study, and biological tests were conducted. The BGA- 804 access, chloroform fractions (CL) and ethyl acetate (ACT) has been shown to have high potential antioxidant represented by the EC50 in ?g.ml-1 804-CL (203,5?0,528) e 804-ACT 192,5?0,193, lethality represented by the LC50 in ?g.ml-1 804-CL (69,3?0,47) and 804-ACT (87,7?0,49) and inhibition of the enzyme cholinesterase in % 804-ACT (53.230 ? 4,44). Fractionation, chemical profile by HPLC / DAD and chemical characterization of the BGA-804 access, resulted in the finding of the presence of phenolic compounds, flavonoids and the isolation and identification of daucosterol originating from 804 CL fraction. / Caracteriza??o qu?mica de plantas e testes de atividades biol?gicas s?o abordagens importantes na descoberta de novos medicamentos e para o aproveitamento racional de elementos de nossa biodiversidade, tendo em vista que a variedade de plantas reflete a diversidade dos seus metab?litos secund?rios e seu potencial terap?utico. O Brasil ? fonte inestim?vel de recursos naturais para obten??o de farm?cos, contudo as esp?cies nativas t?m sido pouco estudadas quanto ao potencial farmacol?gico. A fam?lia Bromeliaceae inclui aproximadamente 58 g?neros e cerca de 3.352 esp?cies. O Brasil abriga cerca de 40% do total de esp?cies, sendo a mais conhecida o Ananas comosus. Algumas plantas desta fam?lia s?o utilizadas para tratamento de diversas afec??es e existem relatos da presen?a de metab?litos secund?rios, como: triterpenos, esteroides, flavonoides, glicer?is, derivados do ?cido cin?mico e outros. Este estudo teve como objetivo conhecer a composi??o qu?mica e as atividades biol?gicas de acessos e h?bridos de diferentes variedades bot?nicas do g?nero Ananas, em parceria com (EMBRAPA). As folhas dos esp?cimes coletadas foram secas, mo?das, submetidas ao procedimento de extra??o com metanol e pr?-selecionadas via screening e triagem biol?gica, com a finalidade de obter esp?cies com o melhor perfil. Foram selecionados 3 acessos e 1 h?brido, estes foram submetidos a extra??o com metanol, posteriormente particionados com solventes de diferentes polaridades e realizados testes de letalidade frente ? letalidade frente ? Artemia salina, atividade antioxidantes e anticolinester?sica, o fracionamento cromatogr?fico das esp?cies com melhor perfil foi realizado utilizando diferentes t?cnicas de cromatografia. Os resultados revelaram que os 21 acessos coletados apresentam diferentes metab?litos secund?rios e uma varia??o grande entre si, n?o apresentando nenhum padr?o. Com rela??o aos testes biol?gicos v?rios acessos mostraram letalidade frente ? Artemia salina, atividade antioxidantes e anticolinester?sica. Os resultados obtidos indicam que os extratos dos acessos cont?m constituintes ativos que apresentam tais atividades, confirmando seu potencial biol?gico. Como resultado dos estudos preliminares os acessos BGA- 739, BGA-804, BGA-820 e h?brido HE foram selecionados para continua??o dos estudos, sendo realizado os testes biol?gicos. O acesso BGA-804, fra??es clorof?rmio (CL) e acetato de etila (ACT) demonstrou ter alto potencial antioxidante representado pela EC50 em ?g.ml-1 804-CL (203,5?0,528) e 804-ACT 192,5?0,193, letalidade representado pela LC50 em ?g.ml-1 804-CL (69,3?0,47) e 804-ACT (87,7?0,49) e inibi??o da enzima colinesterase em % 804-ACT (53.230 ? 4,44). O fracionamento, perfil qu?mico por CLAE/DAD e a caracteriza??o qu?mica do acesso BGA-804, resultou na verifica??o da presen?a de compostos fen?licos, flavonoides e no isolamento e identifica??o do daucosterol oriundo da fra??o 804 CL.

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) faz parte da etiologia de diversas patologias neurológicas e é causa de graves sequelas. Os mecanismos patofisiológicos dessa lesão começam com o insulto imediato após a HI e se estendem por dias ou semanas, pelo aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio associada a redução da defesas anti-oxidantes e reação glial, sendo a lesão secundária parte crucial no processo que culmina no dano final. A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor do sistema nervoso central (SNC) que parece ter uma importante ação neuroprotetora após a HI. A acetilcolinaesterase (AChE) é responsável pela degradação da ACh, inibidores dessa enzima vêm sendo utilizados para o tratamento de danos neurológicos. Sua ação positiva sobre a HI foi demonstrada em estudos realizados em nosso laboratório, onde a administração do extrato de Huperzia quadrifariata (inibidor de AChE) reduziu os déficits cognitivos e histológicos causados por essa lesão Para avaliar os efeitos das administrações pré e pós-hipóxia de galantamina, inibidor da AChE, no modelo de HI perinatal, ratos Wistar no 7º dia de vida pós-natal (DPN7) foram submetidos à combinação da oclusão unilateral da artéria carótida direita e exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de O2) durante 60 minutos. Foram aplicadas injeções intraperitoniais de salina para os grupos Sham e HI+Salina (HIS) e de galantamina nos grupos HI+Galantamina 5 mg/kg pré-hipóxia (HIG5-Pré), HI+Galantamina 10 mg/kg pré-hipóxia (HIG10-Pré), HI+Galantamina 5 mg/kg pós-hipóxia (HIG5-Pós) e HI+Galantamina 10 mg/kg pós-hipóxia (HIG10-Pós). Os grupos Pré receberam galantamina imediatamente antes da hipóxia e os grupos Pós nos intervalos de 1, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia. No DPN45 foi feita a análise do volume das estruturas encefálicas que demonstrou a redução do volume do hipocampo do grupo HIS em relação ao Sham e uma prevenção desse efeito no grupo HIG10-Pré, mas não nos demais grupos. Análises bioquímicas foram feitas no hipocampo ipsilesional 24 horas após a lesão e revelaram: através da citometria de fluxo uma redução na sobrevivência de neurônios no grupo HIS em relação ao Sham que foi prevenida no grupo HIG10-Pré; através de ELISA uma hipertrofia dos astrócitos no grupo HIS que foi revertida no grupo HIG10-Pré e um aumento na atividade da enzima anti-oxidante catalase. O tratamento pré-hipóxia com galantamina foi capaz de prevenir os déficits histológicos, aumentar a sobrevivência celular, reduzir a reação astrocitária e aumentar a atividade anti-oxidante em ratos submetidos à HI. / Neonatal hypoxia ischemia (HI) has a role in etiology of several neurological pathologies and causes severe sequelae. The pathophysiological mechanisms of this lesion start immediately after HI and last for days or weeks, with the secondary injury being a crucial part the process that culminates in the final damage. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter of the central nervous system that seems to have an important neuroprotective action after HI. Acetylcholinesterase (AChE) degradates ACh and inhibitors of this enzyme have been used to treat neurological damage. Its positive action on HI has been demonstrated in studies performed in our laboratory, where the administration of the alkaloid extract of Huperzia quadrifariata (An inhibitor of AChE) reduced the cognitive and histological deficits caused by this lesion. To evaluate the effects of the pre and post-hypoxia administrations of galantamine, a cholinesterase inhibitor, in the model oh perinatal HI, Wistar rats in the post-natal day 7 (PND7) were subjected to a combination of unilateral occlusion of the right charotid artery and of exposure to a hypoxic exposure (8% O2) for 60 minutes. Intraperitoneal injections of saline in the groups Sham anf HI+Saline (HIS) and of galantamine in the groups HI+Galantamine 5 mg/kg pre-hypoxia (HIG5-Pre), HI+Galantamine 10 mg/kg pre-hypoxia (HIG10-Pre), HI+Galantamine 5 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post) and HI+Galantamine 10 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post). The Pre groups received galantamine immediately before hypoxia and the Post groups in the intervals of 1, 24, 48 and 72 hours after HI. On PND45 the analysis of the volume of brain structures showed a reduction of the volume of the ipsilesional hippocampus in the HIS group when compared to the sham and a prevention of this effect in the HIG10-Pre, but not in any other group. Biochemical analysis was performed in the ipsilesional hippocampus 24 hours after the lesion and revealed: a reduction of the number of surviving neurons in the HIS group when compared to the Sham that was prevented in the HIG10-Pre; a hypertrophy of the astrocytes in the HIS group that was prevented in the HIG10-Pre group and an increase in the activity of the anti-oxidant enzyme catalase in the HIG10-Pre group. The treatment with galantamine was able to prevent the histological deficits, increase the survival of neurons, reduce astrocytic reaction and increase the anti-oxidant activity in rats submitted to HI.

L'AChE, enzyme clé pour la neurotransmission, est la cible des neurotoxiques organophosphorés utilisés comme agents de guerre tels que le tabun. En inhibant irréversiblement l'AChE, ces neurotoxiques peuvent entraîner la mort par asphyxie. Des antidotes à ces organophosphorés existent : il s'agit d'oximes, qui sont des nucléophiles puissants. Malheureusement, aucune oxime à l'heure actuelle n'est capable de restaurer l'activité de l'AChE inhibée par le tabun. C'est pourquoi nous nous sommes particulièrement intéressés au complexe AChE-tabun en utilisant une méthodologie hybride QM/MM. Nous avons ainsi défini notre modèle théorique sur l'acétylcholine, substrat naturel de l'AChE, ce qui nous a permis de mettre en évidence la grande flexibilité de l'AChE et la difficulté de la traiter en chimie théorique quantitativement. Nous nous sommes ensuite penchés sur l'inhibition de l'AChE par le tabun pour montrer l'influence de la structure du tabun sur sa réactivité dans le site actif. Notamment le rôle stérique du groupement N-diméthyle a été souligné. Enfin, nous avons abordé la réactivation du complexe AChE-tabun. L'influence du mécanisme (une ou deux étapes) a permis d'expliquer la difficile réactivation du complexe AChE-tabun. Un nouveau réactivateur a pu être conçu à partir de ces informations, synthétisé et testé in vitro. Ce réactivateur n'est malheureusement pas efficace contre le complexe AChE-tabun du fait de paramètres physico-chimiques que nous ne pouvons pas prendre en compte d'un point de vue théorique. Notre travail a donc permis de mettre au point un modèle théorique efficace pour traiter les interactions de l'AChE avec différents substrats.

A poluição ambiental por metais pesados tem aumentado muito devido às ações antropogênicas tais como as atividades industriais e o uso de fertilizantes fosfatados na agricultura. Entre os metais tóxicos encontrados no meio ambiente, o cádmio (Cd) é um dos que apresenta maior interesse clínico, uma vez que as intoxicações por esse metal são de difícil tratamento. O Cd pode afetar vários órgãos como o fígado, rins, pulmões, ovários, ossos, testículos e cérebro. A toxicologia do Cd é extremamente complexa e tem sido amplamente estudada, mas ainda não está completamente esclarecida. Sendo assim, o objetivo da presente tese foi investigar os efeitos da intoxicação por Cd sobre parâmetros comportamentais e memória, bioquímicos, hematológicos e a bioacumulação desse metal em diferentes tipos celulares de ratos expostos ao cloreto de Cd (CdCl2) ou ao Cd proveniente de batatas contaminadas, e ainda utilizar o antioxidante N-acetilcisteína (NAC) no tratamento deste tipo de intoxicação buscandose avaliar o seu possível efeito protetor. Para tal, foram realizados dois experimentos: a) ratos machos Wistar adultos foram expostos oralmente a 2 mg/kg de Cd e/ou 150 mg/kg de NAC, um dia sim e outro não, durante um período experimental de 30 dias; b) ratos machos Wistar recém desmamados ingeriram, durante 5 meses, dieta a base de bolo contendo 1, 5 ou 25 mg/kg de CdCl2 ou Cd presente em tubérculos de batatas crescidas na presença de 10 μM de CdCl2. A partir desses experimentos pode-se concluir que: a) A intoxicação por CdCl2 causa aumento na concentração de Cd nas estruturas cerebrais (cerebelo, estriado, hipotálamo, hipocampo e córtex cerebral), nos níveis de peroxidação lipídica e na atividade da enzima AChE nas diferentes estruturas cerebrais estudadas ocasionando prejuízos à memória dos ratos. Além disso, a NAC é capaz de diminuir os níveis de peroxidação lipídica e subsequentemente restaurar a atividade da AChE modulando assim, a neurotransmissão colinérgica e melhorando os processos cognitivos. Sendo assim, sugere-se que a NAC possa ser um fármaco promissor em terapias alternativas contra a neurotoxicidade induzida pelo Cd; b) A exposição ao CdCl2 promove um aumento na concentração de Cd no plasma, baço e timo, causa danos hematológicos, não altera a atividade da enzima NTPDase em linfócitos, diminui a atividade da AChE em linfócitos e sangue total bem como da BChE em soro de ratos. Além disso, a NAC foi eficaz em diminuir os efeitos danosos do Cd provavelmente por diminuir os níveis de Cd nos órgãos linfóides, reverter ou amenizar os danos hematológicos e relacionados aos leucócitos mesmo sem alterar a atividade das enzimas colinesterases; c) O CdCl2 aumenta a hidrólise de nucleotídeos de adenina em sinaptossomas de córtex cerebral e diminui em plaquetas de ratos. Provavelmente, o aumento na atividade das enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase no SNC causado pelo Cd seja uma resposta compensatória do organismo uma vez que a rápida hidrólise de ATP e ADP favorece a produção de adenosina, uma molécula neuroprotetora. Por outro lado, em plaquetas o Cd causou uma diminuição na atividade da NTPDase e, não alterou a atividade da 5’-nucleotidase sugerindo que a possível elevação no nível de ATP e ADP conduza a um estado hipercoagulável nos ratos intoxicados por esse metal. Além disso, a NAC restaura a atividade dessas enzimas no SNC, mas não apresenta interferência sobre elas em plaquetas; d) A dieta prolongada com CdCl2 ou com Cd proveniente de batatas contaminadas ocasiona aumento no comportamento de ansiedade e prejuízo à memória de ratos o que provavelmente, seja resultado de uma concentração aumentada de Cd e de uma atividade aumentada da AChE e diminuída da Na+,K+-ATPase em diferentes estruturas cerebrais devido a esse metal. Em linhas gerais, os resultados obtidos na presente tese demonstram que apesar de todos os mecanismos propostos pelos quais o Cd poderia afetar o comportamento continuarem a gerar controvérsia, é evidente que a exposição ao CdCl2 tanto a curto quanto a longo prazo, bem como ao Cd proveniente de batatas contaminadas interfere nas funções cerebrais aumentando a concentração de Cd, diminuindo ou aumentando a atividade da AChE, aumentando a lipoperoxidação bem como diminuindo a atividade da Na+,K+-ATPase em diferentes estruturas cerebrais, consequentemente sendo prejudicial ao comportamento animal, como memória e ansiedade. O Cd afeta sistematicamente o organismo dos animais estando presente tanto no plasma, quanto nos órgãos linfóides e no encéfalo alterando, assim, a atividade das enzimas NTPDase, 5’-nucleotidase, AChE e BChE de diferentes tipos celulares. Além disso, a NAC é capaz de reverter ou amenizar vários efeitos danosos causados pelo Cd sugerindo que este fármaco possa ser considerado após estudos adicionais um importante aliado em terapias contra a intoxicação por esse metal. / The environmental pollution by heavy metals has increased greatly due to anthropogenic activities such as industrial activities and the use of phosphate fertilizers in agriculture. Among the toxic metals found in the environment, cadmium (Cd) is a metal that presents the greatest clinical interest, since poisoning by this metal is difficult to treat. Cd may affect various organs such as liver, kidneys, lungs, ovaries, bones, testes and brain. The toxicology of Cd is extremely complex and has been widely studied, but it is not yet fully elucidated. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the effects of Cd intoxication on memory as well as behavioral, biochemical, hematological and bioaccumulation parameters of this metal in different cell types of rats exposed to Cd chloride (CdCl2) or Cd from contaminated potatoes. Also, we investigated the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) in the treatment of this type of poisoning seeking to evaluate its possible protective effect. Two experiments were performed: i) adult male Wistar rats were exposed orally to 2 mg/kg Cd and/or 150 mg/kg NAC, every other day for 30 days; ii) weaned male Wistar rats fed for 5 months, cake-based diet containing 1, 5 or 25 mg/kg CdCl2 or Cd present in tubers of potatoes grown in the presence of 10 μM of CdCl2. From these experiments we conclude: Firstly, CdCl2 intoxication caused an increase in the Cd concentration in brain structures (cerebellum, striatum, hypothalamus, hippocampus and cerebral cortex), in the levels of lipid peroxidation, and in the AChE activity of different brain structures studied causing damage to memory of rats. NAC was able to reduce the levels of lipid peroxidation and subsequently restore the AChE activity, modulating thereby the cholinergic transmission and improving the cognitive processes. Thus, NAC may be a promising drug for alternative therapies against neurotoxicity induced by Cd. Secondly, the exposure to CdCl2 increased the Cd concentration in plasma, spleen and thymus, caused damages in the hematological parameters, did not alter the NTPDase activity in lymphocytes as well as decreased the AChE activity in lymphocytes and whole blood and the BChE activity in serum of rats. NAC was effective in reducing the harmful effects of Cd probably by decreasing the levels of Cd in the lymphoid organs, reversing or minimizing the hematological damage and related to leukocytes even without changing the activity of cholinesterases. Thirdly, CdCl2 increases the hydrolysis of adenine nucleotides in synaptosomes of cerebral cortex and decreases in platelets of rats. The increase in the NTPDase and 5'-nucleotidase activities in CNS caused by Cd could be a compensatory response of the organism since the rapid hydrolysis of ATP and ADP favors the production of adenosine, a neuroprotective molecule. On the other hand, Cd decreased the NTPDase activity and did not alter 5'-nucleotidase activity in platelets suggesting that the possible increase in the ATP and ADP levels could lead to a hypercoagulable state in rats intoxicated with this metal. NAC restores the activity of these enzymes in the CNS, but had no interference in platelets. Finally, the prolonged diet with CdCl2 or Cd from contaminated potatoes resulted in an increased anxiety-like behavior and damaged memory of rats which was likely to be a result of the increased concentration of Cd, the increased AChE activity and decreased Na+,K+-ATPase activity in the different brain structures studied. In general, the results obtained in this thesis show that despite all the proposed mechanisms by which Cd could affect the behavior still generate controversy, it is clear that the exposure to CdCl2 at both short and long terms as well as to Cd from contaminated potatoes interferes the brain function by increasing Cd concentration, decreasing or increasing the AChE activity, increasing lipid peroxidation and decreasing Na+,K+-ATPase activity in several brain structures, thus being detrimental to the animal behavior influencing memory and anxiety. Cd affected systematically the animal body since it is present in plasma, lymphoid organs and brain, changing the activity of the enzymes NTPDase, 5'-nucleotidase, AChE and BChE of different cell types. In addition, NAC was able to reverse or ameliorate several deleterious effects caused by Cd suggesting that this drug may be, after additional studies, considered an important factor in therapies against intoxication by this metal.