Post-transcriptional regulations (PTRs) have always been considered features of organisms with higher complexity. However recently, the interest toward the post- transcriptional mechanisms in prokaryotes increased. The bacterial proteome is much more complex compared to the genome size, suggesting a tight and articulate regulation of proteins production, extremely important for the bacterial adaptation to an always changing environment. Bacterial PTRs are responsible of modulation of mRNA stability and decay, translation initiation and elongation, modulation of the access of ribosome to the ribosome binding site and control of termination of the transcript. The main actors in the PTRs are small non-coding RNA (responsible of the inhibition of the transcription) and RNA binding proteins (RBPs), which modulate the translation and half-life of the mRNA. RBPs, are particularly of my interest since I wanted to find a possible orthologous of the eukaryotic Elav-like (Elavl) family of proteins in Acinetobacter baumannii. Elav-like proteins are present in all metazoans and are characterized by two highly conserved sequences: RNP-1 (a quite well conserved hexamer) and RNP-2 (a really well conserved octamer) that are responsible of binding to the mRNA. Each species has a different number of Elavl paralogous that is totally independent from the complexity of the organisms, suggesting a more ancient origin. In particular, I focused on the human paralog HuR (human antigen R). HuR is characterized by three RNA Recognition motif (RRM) -domains, is ubiquitously expressed and is mainly localized into the nucleus (where it is responsible of maturation of the mRNA), but under stress stimuli, can shuttle into the cytoplasm where protect the target mRNA from degradation, by binding AU/U rich sequences (ARE sequences). Its high concentration into the cytoplasm can lead to the overexpression of oncogenes and pro-tumorigenic factors. The choice of Acinetobacter baumannii comes from the increasing worldwide concern toward this pathogen that is becoming multidrug resistant. Indeed, in Italy, more the 50% of nosocomial infections are caused by A. baumannii. I found a putative protein (AB-Elavl), composed by a single RRM domain endowed with similar features of the eukaryotic RRM domain as the presence of a quite well conserved RNP-2 and a less conserved RNP-1. I expressed this protein with recombinant tools and confirmed the production of the protein in the host by western blot and mass spectrometry. I evaluated the binding activity of AB-Elavl testing the EC50 and the Kd with different biochemical assays (EMSA, AlphaScreen and HTRF- FRET) toward three different RNA sequences, in order to test the specificity. By X- RAY and NMR, I confirmed the folded structure that can be overlapped to the HuR’s one and the interaction with the probes tested, highlighting the presence of binding, but with different specificity. I also tested some small molecules developed for interfering in the binding of HuR with the target sequence and found a possible compound able to interact with AB-Elavl, by disrupting the binding with the target probe. All these results suggest an ancient origin of the metazoans’ Elavl family of proteins that probably share a common ancestor with AB-Elavl. More studies should be performed to better understand the role of AB-Elavl in A. baumannii as well as in other bacteria. In fact, I found the presence of other ARE sequence-binding proteins also in Pseudomonas aeruginosa. Interesting would be to check the presence of this protein in all the multidrug resistant ESKAPE bacteria.

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Nos últimos 30 anos, Acinetobacter tornou-se um dos patógenos de maior preocupação clínica pela falta de terapias eficazes em virtude do fenótipo de multirresistência frequentemente apresentado. Dentre as espécies do gênero Acinetobacter, A. baumannii, A. genoespécie 3 e A. genoespécie 13TU são as mais comumente encontradas a partir de amostras biológicas. Estas espécies ao lado de A. calcoaceticus constituem o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii (ACB). Este estudo propõe um esquema composto de duas PCRs para a identificação das espécies de interesse médico que fazem parte do complexo ACB. O método é simples, rápido e, além de identificar as espécies, permite pesquisar a presença de genes de resistência. Foram identificadas 515 amostras do complexo ACB, isoladas de pacientes no período de janeiro de 2005 a dezembro de 2010. A identificação das espécies do complexo ACB foi realizada por esquema composto de duas reações de PCR. Foram avaliados os perfis de sensibilidade por disco difusão e a pesquisa da presença dos genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaSPM e blaGIM foi realizada por PCR utilizando-se iniciadores específicos. No grupo de amostras estudas, 82,5% são A. baumannii (425), 11,5% A. genoespécie 13TU (59) e 6,0% A. genoespécie 3 (30), sendo A. baumannii mais isolado em pacientes internados em UTIs (p=0,0407) e A. genoespécie 13TU mais isolado em pacientes de outros ambientes hospitalares (p=0,0204). A. baumannii apresentou menor sensibilidade a todos os antimicrobianos quando comparado com A. genoespécie 13TU e A. genoespécie. 3 (p<0,05). Foi possível observar ao longo do período estudado o aumento significativo da resistência aos carbapenêmicos e da sensibilidade a gentamicina por A. baumannii entre os isolados de pacientes de UTIs (p<0.05). Nenhum dos genes codificadores para metalo-lactamases foi detectado nas amostras estudadas Dentre os cepas resistentes aos carbapenêmicos (176) o gene blaOXA-23 foi detectado em 81,25% e uma amostra de A. baumannii apresentou o gene codificador para OXA-72. A tipagem molecular foi realizada por RAPD e para os isolados resistentes aos carbapenêmicos também por PFGE. Resultados obtidos por RAPD revelaram menor diversidade entre os isolados de pacientes internados em UTIs. O dendrograma obtido utilizando-se PFGE separou dois clones cujos componentes eram resistentes aos carbapenêmicos, no entanto não apresentavam o gene blaOXA-23-like. A produção de acil-homoserina lactona, autoindutor-2 e autoindutor-3 de três amostras de cada espécie clínica do complexo ACB foi pesquisada utilizando-se bioensaios. Apenas Autoindutor 3 foi detectado por bioensaio e em menor quantidade no meio précondicionados obtido a partir de A. genoespécie 3 quando comparado com A. genoespécie 13TU e A. baumannii (p<0.05). Três cepas de cada espécie clínica do complexo ACB foi avaliada quanto a capacidade de adesão em monocamada de células Hep-2, MRC-5 e NCI-H292, sendo essa última a que revelou diferenças entre as espécies clínicas do complexo ACB. A. baumannii apresentou adesão difusa, A. genoespécie 13 TU adesão com formação de agrupamentos e A. genoespécie 3 não aderiu. Esse mesmo ensaio foi realizado na presença de propanolol e notou-se a diminuição de células aderidas por campo observado. Dez cepas de cada espécie clínica do complexo ACB foram pesquisadas quanto a produção de biofilme por ensaio colorimétrico utilizando cristal violeta e foi possível notar a produção significativa de biofilme por A. baumannii, quando comparado com A. genoespécie 3 (p<0.05). Esse mesmo ensaio na presença de de fentolamina, mostrou a diminuição significativa na produção do biofilme por A. baumannii. A interferência no ensaio de adesão bacteriana e biofilme, na presença de fentolamina ou propanolol, sugerem o envolvimento do autoindutor-3 na regulação desses mecanismos de virulência. / The genus Acinetobacter has emerged as one of the most troublesome pathogens for health care institutions globally. Its clinical significance, especially over the last 15 years, has been driven by its remarkable ability to up regulate or acquire resistance determinants, making it one of the organisms threatening the current antibiotic era. A. baumannii, A. 3 and A. 13TU are the most commonly species found from biological samples. These species beside A. calcoaceticus are very closely related and difficult to distinguish from each other by phenotypic properties. Therefore, it has been proposed to refer to these species as the A.calcoaceticus-A. baumannii complex(ACB). In the period from 2005 to 2009, the most frequent bacterial isolates among the nosocomial infection at the HU-USP was ACB (18%). Due to the frequency with which species are involved in ACB outbreaks of infection in the HU-USP and the emergency clinic because of expression of the phenotype of resistance to several classes of antibiotics, this study aimed to identify and characterize the species of complex ACB by molecular methods, to study their mechanisms of resistance and to characterize the different clones from patients admitted to different hospital areas. Furthermore, the ability to characterize biofilm formation, adhesion to different cell lines as well as the mechanisms of cell-cell communication were analyzed. From the ACB complex, 515 samples were identified, isolated from patients from January 2005 to December 2010. The identification of clinical species of the ACB was performed by molecular methods that were developed and validated for identification of Acinetobacter sp. include two reactions of PCR. The profiles of sensibility were evaluated by disc diffusion and the detection of the presence of genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaGIM, and blaSPM were performed using specific primers. Molecular typing was performed by RAPD and isolates resistant to carbapenems also by PFGE. The production of autoinducers of three clinical species complex was sought using bioassays with sensor strains. The ability adhesion was evaluated in monolayer of Hep-2 cells, MRC-5 and NCI-H292E. Ten clinical strains of each species of ACB complex were screened for the production of biofilms by colorimetric assay using crystal violet. Among all the strains studied, 82.5% were A. baumannii (425), 11.5% A.13TU (59) and 6.0% A. 3 (30). A. baumannii strains were more isolated from intensive care unit (ICU) patients (p = 0.0407) and A. 13TU from other patients in different hospital settings (p = 0.0204). A. baumannii showed less sensitivity to all drugs when compared with A. 13TU and A.3 (p <0.05). It was possible to observe during the study period a significant increase in carbapenem resistance and sensitivity to gentamicin by A. baumannii isolates from patients in ICUs (p <0.05). No genes coding for metallo-lactamase was detected in the samples studied. blaOXA-23 gene was detected in 81.25% among the 176 strains resistant to carbapenems. Results obtained by RAPD revealed less diversity among isolates from ICU patients compared to isolates from patients from other hospitals. The dendrogram obtained by PFGE showed less diversity than RAPD It was unable to detect homoserine lactone and autoinducer-2 by bioassay. The survey was positive of autoinducer-3 observed differences in yield among clinical species, smaller amount produced by strains of A. 3 when compared with A. 13TU and A. baumannii (p <0.05). Among the cells studied in adhesion testing, line NCI-H292 showed the greatest power discrimination between adhesion pattern observed and species of the ACB. A. baumannii showed diffuse adherence, A. 13 TU strains showed adhesion clustering and A. 3 did not adhere. This experiment was repeated in the presence of 100 &#181;M of propranolol and it was noted a decrease in cell A. 13TU and A. baumannii adhered per field observed. The biofilm assay showed significantly higher production of biofilms by A.baumannii compared with A. 3 (p <0.05). When the test was conducted in the presence of phentolamine at 100&#181;M, it was observed a significant decrease in the biofilm productions by A. baumannii, which revealing the involvement of the autoinducer-3 in biofilm production. The data obtained suggest that the proposed method of identification is a method for identification of species of medical interest belonging to the ACB complex which could be used in a routine laboratory. The method is simple, fast and beside the identification species, provides data about the resistance genes. Moreover, it revealed that the isolates of A. baumannii are more resistant and OXAbla genes, that was restricted to the ACB complex studied in this work. A. baumannii has also increased capacity for adhesion and biofilm formation, which regulates the expression of the phenotype may be linked to the production of autoinducers-3.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MARCIANO DE SOUSA NOBREGA.pdf: 616658 bytes, checksum: 0673ba9db2600506e22ee2169eef0af7 (MD5) Previous issue date: 2012-05-14 / The increase in bacterial resistance occurs in all regions of the world, especially in critically ill patients hospitalized in intensive care units (ICUs) and that make use of several antimicrobials. Bacterial resistance complicates therapy prolongs the ICU stay and increased morbidity and mortality. Among the microorganisms that cause infections in ICUs, we highlight P. aeruginosa and A. baumannii, gram-negative high incidence of nosocomial infections and have shown a tendency to increased antimicrobial resistance. OBJECTIVE: To evaluate microbial and bacterial resistance in adult intensive care agents P. aeruginosa and A. baumannii. MATERIALS AND METHODS: Retrospective study from January 2007 to December 2010 on the sensitivity and P. aeruginosa and A. baumannii in adult ICU patients (medical and surgical) of HC / UFG, with a diagnosis of hospital infection. We analyzed the evolution of resistance, antimicrobial consumption, mortality, topography of infections and length of stay in the units. 121 cases have been cataloged. RESULTS: The mean age of patients was 51.2 ± 17.9 years, male 45.45% and 55.55% female, mean ICU stay was 26.99 days, compared with 6.22 days of the general population unit. The mortality rate was 37.19% compared to a rate of 27.17% of the population. The primary site of infection was the respiratory tract with 41.3% followed by infection of the bloodstream with 27.27%. The initial average of bacterial resistance related of P. aeruginosa was close to 50% and A. baumannii was greater than 80%, with no significant modifications to the P. aeruginosa in this period. There was a significant increase in resistance to A. baumannii to amikacin. Consumption of antimicrobial agents showed an increase of antimicrobials amikacin, imipenem and piperacillin-tazobactam in cases of infection by P. aeruginosa infections and imipenem in A. baumannii. No correlation was found between bacterial resistance and antimicrobial consumption. CONCLUSION: Mortality and length of stay were higher in the study group. The bloodstream and respiratory tract were the main sites of infection by A. baumannii and P. aeruginosa multiresistant. The susceptibility profile revealed that P. aeruginosa and A. baumannii are highly resistant to antimicrobials. There were no significant changes in the evolution of antimicrobial resistance to the antibiotics tested, except for amikacin used in infections caused by A. baumannii. The consumption of antimicrobials showed increased consumption of amikacin, imipenem and piperacillin-tazobactam in patients infected with P. aeruginosa and to A. baumannii increased consumption was only to imipenem. The relationship between consumption of antimicrobials and increased bacterial resistance was not identified. / O aumento da resistência bacteriana ocorre em todas as regiões do mundo, principalmente em pacientes graves, internados em unidades de terapia intensiva (UTIs) e que fazem uso de vários antimicrobianos. A resistência bacteriana dificulta a terapia, prolonga a permanência nas UTIs e aumenta a morbimortalidade. Dentre os microrganismos causadores de infecções em UTIs, destacam-se P. aeruginosa e A. baumannii, gram-negativos de alta incidência em infecções hospitalares e que vêm apresentando aumento da resistência aos antimicrobianos. OBJETIVO: Avaliar os aspectos microbiológicos e a resistência bacteriana em UTIs dos agentes P. aeruginosa e A. baumannii. MATERIAL E MÉTODOS: Estudo retrospectivo, de janeiro de 2007 a dezembro de 2010, sobre o perfil de sensibilidade e P. aeruginosa e de A. baumannii em pacientes de UTIs adulto (clínica e cirúrgica) do HC/UFG, com diagnóstico de infecção hospitalar. Analisou-se a evolução da resistência, consumo de antimicrobianos, mortalidade, topografia das infecções e tempo de permanência nas unidades. Foram catalogados 121 casos. RESULTADOS: A média de idade dos pacientes foi 51,2±17,9 anos, sendo 45,45% do sexo masculino e 55,55% do sexo feminino; a média de permanência na UTI foi de 27 dias, comparado com 6,22 dias da população geral da unidade. A taxa de mortalidade foi de 37,19% ante uma taxa de 27,17% da população geral. O principal local de infecção foi a via respiratória com 41,3% seguido pela infecção de corrente sanguínea com 27,27%. A taxa média inicial de resistência bacteriana da P. aeruginosa foi próxima de 50% e A. baumannii foi superior a 80%, não se observando modificações para a P. aeruginosa nesse período. Houve um aumento significativo na resistência para o A. baumannii para amicacina. O consumo de antimicrobianos apresentou aumento dos antimicrobianos amicacina, imipenem e piperacilina-tazobactam nos casos de infecção por P. aeruginosa e imipenem nas infecções por A. baumannii. Não foi encontrada correlação entre a resistência bacteriana e o consumo de antimicrobianos. CONCLUSÃO: A mortalidade e o tempo de permanência foram maiores no grupo em estudo. A corrente sanguínea e o trato respiratório foram os principais sítios de infecção por A. baumannii e P. aeruginosa multirresistentes. O perfil de susceptibilidade revelou que P. aeruginosa e A. baumannii são altamente resistentes aos antimicrobianos testados. Não houve mudanças significativas na evolução da resistência aos antimicrobianos para os antibióticos testados, exceto para a amicacina usada nas infecções por A. baumannii. O consumo de antimicrobianos aumentou para amicacina, imipenem e piperacilina-tazobactam, nos pacientes com infecção por P. aeruginosa e, para A. baumannii o aumento do consumo foi apenas para o imipenem. A relação entre o consumo de antimicrobianos e o aumento da resistência bacteriana não foi identificada.

Acinetobacter baumannii é um importante agente de infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente nas unidades de terapia intensiva no Brasil, sua resistência a antimicrobianos vem aumentando nas últimas décadas e as opções para o tratamento são restritas. Em 2011, no HC-FMUSP, ocorreu um surto de infecção por A. baumannii resistente a todos os antibióticos e desde então isolados resistentes a todas as classes de antibióticos vêm sendo identificados no hospital. O estudo investigou o efeito de combinações antimicrobianas contra 20 isolados clínicos de A. baumannii, sendo sete isolados resistentes (2011 a 2012) e treze sensíveis a colistina (2002 a 2004), obtidas do banco de cepas do LIM-54 com diferentes mecanismos de resistência. Foram realizados, concentração inibitória mínima dos antibióticos, avaliação da clonalidade por Pulsedfield gel electrophoresis, detecção de mecanismos de resistência por reação de amplificação em cadeia da polimerase, análise de proteínas da membrana externa e baseado na clonalidade e o sequenciamento total do genoma de quinze isolados. Sinergismo foi investigado usando os métodos de checkerboard e time-kill. Para monitorização da expressão do sistema regulatório PmrCAB e dos genes responsáveis pela biossíntese do lipopolissacarídeo, foi realizada reação em cadeia da polimerase quantitativa. Todos os isolados foram resistentes ao meropenem e a rifampicina. OXA- 23 e OXA-143 foram as carbapenemases mais frequentes. Quatro isolados mostraram perda de uma proteína de membrana externa denominada OMP 43kDa. Os isolados sensíveis a colistina pertenciam a diferentes clones e Multilocus Sequence Types, também apresentaram o maior efeito sinérgico com fosfomicina-amicacina. A resistência a colistina foi associada com a superexpressão do gene pmrA. Seis isolados resistentes a colistina, pertenciam ao Complexo Clonal 113 e o maior efeito sinérgico foi observado com combinações de colistina-rifampicina seguido de colistina-vancomicina. Foram encontrados diferentes genes de virulência envolvidos com formação de biofilme, aderência, produção de enzimas e captação de ferro / Acinetobacter baumannii is an important agent of infections related to health care, especially in intensive care units in Brazil, its antimicrobial resistance has increased in recent decades and the options for treatment are restricted. In 2011, in the HC-FMUSP, there was an outbreak of A. baumannii infection resistant to all antibiotics and since then isolates resistant to all classes of antibiotics have been identified in the hospital. The study investigated the effect of antimicrobial combinations against 20 clinical isolates of A. baumannii, seven isolates colistin resistant (2011-2012) and thirteen colistin sensitive (2002-2004) from LIM-54 strains bench with different resistance mechanisms. Minimum inhibitory concentration of antibiotics, clonality evaluation by pulsed-field gel electrophoresis and detection of resistance mechanisms by polymerase chain reaction, outer membrane protein analysis and based on clonality, the whole genome sequencing of fifteen isolates were performed. Synergism was determined using checkerboard and time-kill methods. For expression monitoring of the regulatory system PmrCAB and the genes responsible for the biosynthesis of lipopolysaccharide, it was performed quantitative polymerase chain reaction. All isolates were resistant to meropenem and rifampicin. OXA-23 and OXA-143 were the most frequent carbapenems. Four isolates showed loss of one outer membrane protein called OMP 43kDa. Colistin susceptible isolates belonged to different clones and Multilocus Sequence Types; it also showed the greatest synergistic effect with fosfomycin-amikacin. The colistin resistance was involved in overexpression of the pmrA gene. Six colistin-resistant isolates belonged to Clonal Complex 113 and higher synergistic effect were observed with colistin-rifampicin followed by colistin-vancomycin combinations for these isolates. We found different virulence genes involved in biofilm formation, adhesion, enzyme production and iron uptake

Acinetobacter baumannii é um importante agente de infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente nas unidades de terapia intensiva no Brasil, sua resistência a antimicrobianos vem aumentando nas últimas décadas e as opções para o tratamento são restritas. Em 2011, no HC-FMUSP, ocorreu um surto de infecção por A. baumannii resistente a todos os antibióticos e desde então isolados resistentes a todas as classes de antibióticos vêm sendo identificados no hospital. O estudo investigou o efeito de combinações antimicrobianas contra 20 isolados clínicos de A. baumannii, sendo sete isolados resistentes (2011 a 2012) e treze sensíveis a colistina (2002 a 2004), obtidas do banco de cepas do LIM-54 com diferentes mecanismos de resistência. Foram realizados, concentração inibitória mínima dos antibióticos, avaliação da clonalidade por Pulsedfield gel electrophoresis, detecção de mecanismos de resistência por reação de amplificação em cadeia da polimerase, análise de proteínas da membrana externa e baseado na clonalidade e o sequenciamento total do genoma de quinze isolados. Sinergismo foi investigado usando os métodos de checkerboard e time-kill. Para monitorização da expressão do sistema regulatório PmrCAB e dos genes responsáveis pela biossíntese do lipopolissacarídeo, foi realizada reação em cadeia da polimerase quantitativa. Todos os isolados foram resistentes ao meropenem e a rifampicina. OXA- 23 e OXA-143 foram as carbapenemases mais frequentes. Quatro isolados mostraram perda de uma proteína de membrana externa denominada OMP 43kDa. Os isolados sensíveis a colistina pertenciam a diferentes clones e Multilocus Sequence Types, também apresentaram o maior efeito sinérgico com fosfomicina-amicacina. A resistência a colistina foi associada com a superexpressão do gene pmrA. Seis isolados resistentes a colistina, pertenciam ao Complexo Clonal 113 e o maior efeito sinérgico foi observado com combinações de colistina-rifampicina seguido de colistina-vancomicina. Foram encontrados diferentes genes de virulência envolvidos com formação de biofilme, aderência, produção de enzimas e captação de ferro / Acinetobacter baumannii is an important agent of infections related to health care, especially in intensive care units in Brazil, its antimicrobial resistance has increased in recent decades and the options for treatment are restricted. In 2011, in the HC-FMUSP, there was an outbreak of A. baumannii infection resistant to all antibiotics and since then isolates resistant to all classes of antibiotics have been identified in the hospital. The study investigated the effect of antimicrobial combinations against 20 clinical isolates of A. baumannii, seven isolates colistin resistant (2011-2012) and thirteen colistin sensitive (2002-2004) from LIM-54 strains bench with different resistance mechanisms. Minimum inhibitory concentration of antibiotics, clonality evaluation by pulsed-field gel electrophoresis and detection of resistance mechanisms by polymerase chain reaction, outer membrane protein analysis and based on clonality, the whole genome sequencing of fifteen isolates were performed. Synergism was determined using checkerboard and time-kill methods. For expression monitoring of the regulatory system PmrCAB and the genes responsible for the biosynthesis of lipopolysaccharide, it was performed quantitative polymerase chain reaction. All isolates were resistant to meropenem and rifampicin. OXA-23 and OXA-143 were the most frequent carbapenems. Four isolates showed loss of one outer membrane protein called OMP 43kDa. Colistin susceptible isolates belonged to different clones and Multilocus Sequence Types; it also showed the greatest synergistic effect with fosfomycin-amikacin. The colistin resistance was involved in overexpression of the pmrA gene. Six colistin-resistant isolates belonged to Clonal Complex 113 and higher synergistic effect were observed with colistin-rifampicin followed by colistin-vancomycin combinations for these isolates. We found different virulence genes involved in biofilm formation, adhesion, enzyme production and iron uptake

<p>U skladu sa postavljenim ciljevima rada formirana je kolekcija&nbsp;<br />fenotipski i genotipski okarakterisanih multiplo rezistentnih&nbsp;<br />kultura genomske vrste <em>Acinetobacter baumannii</em>. Za sojeve iz&nbsp;<br />kolekcije kultura utvrđen je anti-<em>A. baumannii</em> efekat etarskih&nbsp;<br />ulja, biljnih ekstrakata i njihovih bioaktivnih komponenti, kao&nbsp;<br />nekonvencionalnih antimikrobnih agensa. Takođe, osim njihovog&nbsp;<br />pojedinačnog efekta utvrđen je i kombinovani efekat&nbsp;<br />konvencionalnih i nekonvencionalnih antimikrobnih agenasa, koji&nbsp;<br />je dovedo do redukcije minimalnih ihnibitronih koncentracija oba&nbsp;<br />agensa u kombinaciji. Kombinacije etarskih ulja i njihovih&nbsp;<br />bioaktivnih komponenti sa trenutno dostupnim konvencionalnim&nbsp;<br />antibioticima, čija je efikasnost smanjena kada se primenjuju&nbsp;<br />pojedinačno, predstavljaju novu perspektivnu strategiju u terapiji&nbsp;<br />infekcija multiplo rezistentnim sojevima vrste <em>A. baumannii</em>.</p> / <p>In accordance to the aims of the work the collection of phenotypic and<br />genotypic characterized multidrug-resistant cultures of genomic species<br /><em>Acinetobacter baumannii</em> was formed. For the strains from the culture<br />collection an anti-<em>A. baumannii </em>effect of the essential oils, plant extracts<br />and their bioactive components, as non-conventional antimicrobial<br />agents, was determined. Also, in addition to their individual effect the<br />combined effect of conventional and non-conventional antimicrobial<br />agents was determined, which lead to a reduction of the minimal<br />inhibitroy cocnentrations of both agents in combination. Combinations<br />of the essential oils and their bioactive components with the currently<br />available conventional antibiotics, whose efficiency reduced when<br />administered individually, represent a promising new strategy for the<br />treatment of infections caused by multidrug-resistant <em>A. baumannii.</em></p>

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-25T12:38:46Z No. of bitstreams: 2 Daniele Schaab Boff Junges.pdf: 1381190 bytes, checksum: 1006e297cb0095fbdf1ae5c2a265f559 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-25T12:38:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Daniele Schaab Boff Junges.pdf: 1381190 bytes, checksum: 1006e297cb0095fbdf1ae5c2a265f559 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The killer system is the production of substances by yeast killer able to inhibit other microorganisms, this occurs in the natural environment as a way of competition between species by ensuring nutrients. Wickerhamomyces anomalus is a producer of yeast mycocin widely distributed in the environment and resistant to extremes of pH, temperature and osmolarity. Due to these characteristics, this yeast has been used in various industrial processes, especially in the food industry to control contaminants microorganisms. Its action is considered to be minimally toxic to human cells and low potential to induce microorganisms resistance, characteristics that makes the mycocins of W. anomalus an interesting candidate for medical application. Acinetobacter baumannii is a worldwide concern due to its multiresistance, having a high mortality rate and morbidity, especially in hospital environments. This study had as objective to determine the antimicrobial action of mycocins produced by W. anomalus against multiresistant strains of A. baumannii and to evaluate the toxicity of these compounds. The supernatants of WA40, WA45 and WA92 were tested on A. baumannii using the methods of broth microdilution, solid medium test and viability of A. baumannii. To evaluate the toxicity, was made the test of hemolysis and brine shrimp toxicity test. Results evidenced the antimicrobial activity of mycocins of W. anomalus, since even at high dilutions they were able to inhibit A. baumannii. In solid medium, it was possible to observe the formation of zone of inhibition when testing WA40, WA45 and WA92 on A. baumannii, and finally, the viability test showed that in only 3 hours the mycocins of WA45 were able inhibit 100% of the multidrug-resistant cells of A. baumannii followed by 4 h for WA40 and 6 h for WA92. The three supernatants were not cytotoxic when tested on human erythrocytes and Artemia salina. Thus, the micocins of W. anomalus were effective in this study and can be used in the development of new antimicrobial substances. / O sistema killer consiste na produção de substâncias por leveduras killer capazes de inibir outros microrganismos. Isso ocorre no habitat natural como uma forma de competição entre as espécies pela garantia de nutrientes. Wickerhamomyces anomalus é uma levedura produtora de micocinas amplamente distribuída no ambiente e resistente a condições extremas de pH, temperatura e osmolaridade. Devido a essas características, esta levedura vem sendo utilizada em vários processos industriais, principalmente na indústria alimentícia como controle de microrganismos contaminantes. Sua ação é considerada minimamente tóxica às células humanas e de baixo potencial à indução de resistência aos microrganismos, características que tornam as micocinas de W. anomalus interessantes candidatas à aplicação médica. Acinetobacter baumannii é uma preocupação mundial devido à sua multirresistência, tendo por isso alta taxa de mortalidade e morbidade, principalmente em ambientes hospitalares. Este trabalho teve como objetivo verificar a ação antimicrobiana de micocinas produzidas por W. anomalus frente a cepas multirresistentes de A. baumannii e avaliar a toxicidade destes compostos. Os sobrenadantes de WA40, WA45 e WA92 foram testados sobre A. baumannii utilizando os métodos de microdiluição em caldo, testes em meio sólido e viabilidade de A. baumannii. Para avaliar a toxicidade, fez-se os testes de hemólise e de toxicidade em Artemia salina Leach. Resultados evidenciaram a atividade antimicrobiana de micocinas de W. anomalus, uma vez que, mesmo altamente diluídas, elas foram capazes de inibir A. baumannii. Em meio sólido, foi possível observar a formação de zona de inibição ao testar micocinas de WA40, WA45 e WA92 sobre A. baumannii. E por fim, o teste de viabilidade mostrou que em apenas 3 h as micocinas de WA45 foram capazes de inibir 100% das células multirresistentes de A. baumannii, seguido de 4 h para WA40 e 6 h para WA92. Os três sobrenadantes não foram citotóxicos quando testados sobre hemácias e Artemia salina. Sendo assim, as micocinas de W. anomalus mostraram-se efetivas neste estudo e podem ser utilizadas no desenvolvimento de novas substâncias antimicrobianas.

Nos últimos 30 anos, Acinetobacter tornou-se um dos patógenos de maior preocupação clínica pela falta de terapias eficazes em virtude do fenótipo de multirresistência frequentemente apresentado. Dentre as espécies do gênero Acinetobacter, A. baumannii, A. genoespécie 3 e A. genoespécie 13TU são as mais comumente encontradas a partir de amostras biológicas. Estas espécies ao lado de A. calcoaceticus constituem o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii (ACB). Este estudo propõe um esquema composto de duas PCRs para a identificação das espécies de interesse médico que fazem parte do complexo ACB. O método é simples, rápido e, além de identificar as espécies, permite pesquisar a presença de genes de resistência. Foram identificadas 515 amostras do complexo ACB, isoladas de pacientes no período de janeiro de 2005 a dezembro de 2010. A identificação das espécies do complexo ACB foi realizada por esquema composto de duas reações de PCR. Foram avaliados os perfis de sensibilidade por disco difusão e a pesquisa da presença dos genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaSPM e blaGIM foi realizada por PCR utilizando-se iniciadores específicos. No grupo de amostras estudas, 82,5% são A. baumannii (425), 11,5% A. genoespécie 13TU (59) e 6,0% A. genoespécie 3 (30), sendo A. baumannii mais isolado em pacientes internados em UTIs (p=0,0407) e A. genoespécie 13TU mais isolado em pacientes de outros ambientes hospitalares (p=0,0204). A. baumannii apresentou menor sensibilidade a todos os antimicrobianos quando comparado com A. genoespécie 13TU e A. genoespécie. 3 (p<0,05). Foi possível observar ao longo do período estudado o aumento significativo da resistência aos carbapenêmicos e da sensibilidade a gentamicina por A. baumannii entre os isolados de pacientes de UTIs (p<0.05). Nenhum dos genes codificadores para metalo-lactamases foi detectado nas amostras estudadas Dentre os cepas resistentes aos carbapenêmicos (176) o gene blaOXA-23 foi detectado em 81,25% e uma amostra de A. baumannii apresentou o gene codificador para OXA-72. A tipagem molecular foi realizada por RAPD e para os isolados resistentes aos carbapenêmicos também por PFGE. Resultados obtidos por RAPD revelaram menor diversidade entre os isolados de pacientes internados em UTIs. O dendrograma obtido utilizando-se PFGE separou dois clones cujos componentes eram resistentes aos carbapenêmicos, no entanto não apresentavam o gene blaOXA-23-like. A produção de acil-homoserina lactona, autoindutor-2 e autoindutor-3 de três amostras de cada espécie clínica do complexo ACB foi pesquisada utilizando-se bioensaios. Apenas Autoindutor 3 foi detectado por bioensaio e em menor quantidade no meio précondicionados obtido a partir de A. genoespécie 3 quando comparado com A. genoespécie 13TU e A. baumannii (p<0.05). Três cepas de cada espécie clínica do complexo ACB foi avaliada quanto a capacidade de adesão em monocamada de células Hep-2, MRC-5 e NCI-H292, sendo essa última a que revelou diferenças entre as espécies clínicas do complexo ACB. A. baumannii apresentou adesão difusa, A. genoespécie 13 TU adesão com formação de agrupamentos e A. genoespécie 3 não aderiu. Esse mesmo ensaio foi realizado na presença de propanolol e notou-se a diminuição de células aderidas por campo observado. Dez cepas de cada espécie clínica do complexo ACB foram pesquisadas quanto a produção de biofilme por ensaio colorimétrico utilizando cristal violeta e foi possível notar a produção significativa de biofilme por A. baumannii, quando comparado com A. genoespécie 3 (p<0.05). Esse mesmo ensaio na presença de de fentolamina, mostrou a diminuição significativa na produção do biofilme por A. baumannii. A interferência no ensaio de adesão bacteriana e biofilme, na presença de fentolamina ou propanolol, sugerem o envolvimento do autoindutor-3 na regulação desses mecanismos de virulência. / The genus Acinetobacter has emerged as one of the most troublesome pathogens for health care institutions globally. Its clinical significance, especially over the last 15 years, has been driven by its remarkable ability to up regulate or acquire resistance determinants, making it one of the organisms threatening the current antibiotic era. A. baumannii, A. 3 and A. 13TU are the most commonly species found from biological samples. These species beside A. calcoaceticus are very closely related and difficult to distinguish from each other by phenotypic properties. Therefore, it has been proposed to refer to these species as the A.calcoaceticus-A. baumannii complex(ACB). In the period from 2005 to 2009, the most frequent bacterial isolates among the nosocomial infection at the HU-USP was ACB (18%). Due to the frequency with which species are involved in ACB outbreaks of infection in the HU-USP and the emergency clinic because of expression of the phenotype of resistance to several classes of antibiotics, this study aimed to identify and characterize the species of complex ACB by molecular methods, to study their mechanisms of resistance and to characterize the different clones from patients admitted to different hospital areas. Furthermore, the ability to characterize biofilm formation, adhesion to different cell lines as well as the mechanisms of cell-cell communication were analyzed. From the ACB complex, 515 samples were identified, isolated from patients from January 2005 to December 2010. The identification of clinical species of the ACB was performed by molecular methods that were developed and validated for identification of Acinetobacter sp. include two reactions of PCR. The profiles of sensibility were evaluated by disc diffusion and the detection of the presence of genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaGIM, and blaSPM were performed using specific primers. Molecular typing was performed by RAPD and isolates resistant to carbapenems also by PFGE. The production of autoinducers of three clinical species complex was sought using bioassays with sensor strains. The ability adhesion was evaluated in monolayer of Hep-2 cells, MRC-5 and NCI-H292E. Ten clinical strains of each species of ACB complex were screened for the production of biofilms by colorimetric assay using crystal violet. Among all the strains studied, 82.5% were A. baumannii (425), 11.5% A.13TU (59) and 6.0% A. 3 (30). A. baumannii strains were more isolated from intensive care unit (ICU) patients (p = 0.0407) and A. 13TU from other patients in different hospital settings (p = 0.0204). A. baumannii showed less sensitivity to all drugs when compared with A. 13TU and A.3 (p <0.05). It was possible to observe during the study period a significant increase in carbapenem resistance and sensitivity to gentamicin by A. baumannii isolates from patients in ICUs (p <0.05). No genes coding for metallo-lactamase was detected in the samples studied. blaOXA-23 gene was detected in 81.25% among the 176 strains resistant to carbapenems. Results obtained by RAPD revealed less diversity among isolates from ICU patients compared to isolates from patients from other hospitals. The dendrogram obtained by PFGE showed less diversity than RAPD It was unable to detect homoserine lactone and autoinducer-2 by bioassay. The survey was positive of autoinducer-3 observed differences in yield among clinical species, smaller amount produced by strains of A. 3 when compared with A. 13TU and A. baumannii (p <0.05). Among the cells studied in adhesion testing, line NCI-H292 showed the greatest power discrimination between adhesion pattern observed and species of the ACB. A. baumannii showed diffuse adherence, A. 13 TU strains showed adhesion clustering and A. 3 did not adhere. This experiment was repeated in the presence of 100 &#181;M of propranolol and it was noted a decrease in cell A. 13TU and A. baumannii adhered per field observed. The biofilm assay showed significantly higher production of biofilms by A.baumannii compared with A. 3 (p <0.05). When the test was conducted in the presence of phentolamine at 100&#181;M, it was observed a significant decrease in the biofilm productions by A. baumannii, which revealing the involvement of the autoinducer-3 in biofilm production. The data obtained suggest that the proposed method of identification is a method for identification of species of medical interest belonging to the ACB complex which could be used in a routine laboratory. The method is simple, fast and beside the identification species, provides data about the resistance genes. Moreover, it revealed that the isolates of A. baumannii are more resistant and OXAbla genes, that was restricted to the ACB complex studied in this work. A. baumannii has also increased capacity for adhesion and biofilm formation, which regulates the expression of the phenotype may be linked to the production of autoinducers-3.

Nos últimos anos a incidência de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes aumentou expressivamente. Esse fenômeno não foi acompanhado pelo desenvolvimento de novos antimicrobianos, resultando em infecções cuja opção de tratamento é a combinação de antimicrobianos. Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Serratia marcescens são importantes agentes de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), e capazes de adquirir resistência a várias classes de antimicrobianos, como os carbapenêmicos e polimixinas. Os testes que avaliam sinergismo in vitropodem ser uma ferramenta importante na escolha do tratamento antibiótico adequado para infecções causadas por microrganismos multirresistentes. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de sinergismo in vitroque possam ser utilizados na rotina de laboratórios de microbiologia clínica como alternativa ao método considerado padrão ouro (time-kill). Foram selecionados para o estudo 48 isolados Gram-negativos não fermentadores (20 A. baumannii e 28 P. aeruginosa) e 14 fermentadores (S. marcescens) do banco de cepas do LIM-54 com diferentes mecanismos de resistência identificados por PCR e sequenciamento total do genoma. Foram realizados, concentração inibitória mínima dos antimicrobianos e avaliação do sinergismo pelos métodos time-kill (TK), disco aproximação (DA) e CIM:CIM razão.A concordância dos métodos foi avaliada por teste de kappa e os resultados discordantes foram classificados em tipos de erros baseado no FDA.Os isolados apresentaram alta proporção de resistência a meropenem e 7 isolados de A. baumanniiapresentaram resistência a colistina. A combinação de colistina com fosfomicina ou meropenem apresentou elevado efeito sinérgico para os isolados de A. baumanniiresistentes a colistina pelo DA e TK. Por outro lado, a combinação de fosfomicina-meropenem apresentou concordância boa pelo teste de kappa e baixo número de erros entre os métodos TK e DA para todos os isolados de A. baumannii. Para os isolados de P. aeruginosa não foram detectados efeitos sinérgicos pelos métodos DA e CIM:CIM razão.O método CIM:CIM razão apresentou alta concordância com o TK entre os isolados de A. baumannii resistentes a colistina. A combinação ceftazidima-avibactam com meropenem apresentou elevado efeito sinérgico para os isolados de S. marcescensportadores do gene blaKPC-2 pelo DA e TK. O método de DA apresentou uma boa correlação com o TK para a combinação de fosfomicina-meropenem e ceftazidima-avibactam-meropenem, com baixa porcentagem de erros menores, podendo ser utilizado para avaliar sinergismo in vitro para essas combinações. Não foi identificado no estudo efeito antagônico, portanto, foram encontrados somente erros menores / In recent years, the incidence of infections caused by multiresistant Gram-negative bacteria has increased. This event has not been accompanied by the development of new antimicrobials, resulting in infections which treatment option is the combination of antimicrobials. Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens are important causesof Hospital Acquired Infection (HAI), and able to acquire resistance to multiple classes of antimicrobials, such ascarbapenems and polymyxins. Synergism testing may be an important tool in choose the appropriate antibiotic treatment. The aim of this study was to evaluate in vitro synergism methods that can be used in a clinical microbiology laboratory as an alternative to the method considered the gold standard (time-kill).For the study were selected 48 non-fermenting (20 A. baumannii and 28 P. aeruginosa)and 14 fermenting(S. marcescens) Gram-negativeisolates from LIM-54strains bench with different resistance mechanisms identified by PCR and total genome sequencing.Minimum antimicrobial inhibitory concentration and synergism evaluation by time-kill (TK), disk approximation (DA) and MIC: MIC ratio were performed. Agreement of the methods was evaluated by kappa test and the discordant results were classified in types of errors based on the FDA. The isolates showed high proportion of resistant to meropenem and 7A. baumannii isolates showed resistance to colistin. The combination of colistin with fosfomycin or meropenem showed high synergistic effect for colistin-resistant A. baumannii isolates by DA and TK.On the other hand, the combination of fosfomycin-meropenem showed good concordance by kappa test and low number of errors between TK and DA for all A. baumannii isolates.For P. aeruginosa isolates no synergistic effects were detected by DA and MIC: MIC ratio.The method MIC: MIC ratio showed high concordance with the TK among the colistin-resistant A. baumannii isolates.The combination ceftazidime-avibactam with meropenem showed high synergistic effect for the isolates of S. marcescenscarryingblaKPC-2 gene by DA and TK. The DA showed a good agreement with TK for the combination of fosfomycin-meropenem and ceftazidime-avibactam-meropenem, with a low percentage of minor errors, and could be used to evaluate synergism in vitro for these combinations