La cardiomyopathie dilatée est l'une des principales causes d'insuffisance cardiaque en Europe. Dans le cadre de la cardiomyopathie liée aux mutations du gène LMNA, en dépit des soins médicaux conventionnels, aucun traitement satisfaisant ne permet de pallier à la dilatation cardiaque progressive et à la perte de la contractilité. Le gène LMNA code pour les lamines nucléaires de type A, qui sont les principaux constituants de la lamina nucléaire. De précédents travaux démontrent que l'activation anormale de ERK 1/2 est impliquée dans la pathophysiologie de la cardiomyopathie dilatée liée aux mutations du gène LMNA. L'inhibition de la voie ERK 1/2 ralentit également la progression de la fibrose myocardique, relativement développée chez l'homme, en cas de cardiomyopathie dilatée. Dans le cadre de ma thèse, j’ai suggéré que l'activité aberrante de la voie TGF-β pourrait participer à l’activation anormale de ERK 1/2 et être impliquée dans la physiopathologie de dysfonction contractile ventriculaire gauche dans la cardiomyopathie liée aux mutations du gène LMNA. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la modulation de la signalisation ERK1/2, causée dans le cœur, par les mutations du gène LMNA, restent totalement incertains. De ce fait, j'ai testé l'hypothèse selon laquelle la modulation anormale de ERK1/2 induirait l'altération des cibles cytosoliques et modifierait le réseau du cytosquelette cardiaque. Mon travail a mis en évidence un nouveau partenaire de la forme active (phosphorylée) d’ERK1/2 : cofiline-1. La cofiline induit la déramification des filaments d'actine. Ce projet met en lumière un rôle inattendu joué par la signalisation ERK1/2 dans la dynamique de l'actine et dans le développement de la dysfonction ventriculaire gauche de la cardiomyopathie liée aux mutations du gène LMNA. / Dilated cardiomyopathy is one of the leading causes of heart failure in Europe. Despite of the conventional medical care, there is no definitive treatment for the progressive cardiac dilatation and loss of contractility in LMNA cardiomyopathy often leading to sudden death or heart transplantation. LMNA gene encodes nuclear A-type lamins, which are the main constituents of the nuclear lamina. Previous studies clearly show that the abnormal ERK1/2 activation is involved in the pathophysiology of LMNA dilated cardiomyopathy. However, its role in the development of cardiac dysfunction remains unclear. Inhibition of ERK1/2 signaling also slows progression of myocardial fibrosis, which is prominent in humans with dilated cardiomyopathy. I suggested that aberrant TGF-β signaling activity could participate to the abnormal ERK1/2 activation and be involved is the pathophysiology of left-ventricular contractile dysfunction in LMNA cardiomyopathy. Given that the understanding of molecular and cellular mechanisms underlying the modulation of ERK1/2 signaling in the heart caused by LMNA mutation remains totally unclear, I tested the hypothesis that ERK1/2 abnormal modulation leads to alteration of cytosolic targets and alter cardiac cytoskeleton network. My work highlighted a novel partner of activated (phosphorylated) ERK1/2, ADF/cofilin-1. Cofilin promotes debranching of actin filaments. I showed that disrupted actin dynamics leads to abnormal sarcomere structure. This project unraveled an unexpected role played by ERK1/2 signaling in actin dynamics and in the development of left-ventricular dysfunction in LMNA cardiomyopathy.

La maladie d'Alzheimer est une pathologie neurodégénérative caractérisée par une perte progressive des fonctions cognitives. Cette perte des fonctions cognitives est directement liée à une atteinte neuronale et plus particulièrement synaptique. Deux caractéristiques histopathologiques en lien avec des dérégulations protéiques sont retrouvées chez les patients atteints de la MA : les plaques séniles extracellulaires composées de peptides β-amyloïdes (Aβ) fibrillaires et la dégénérescence neurofibrillaire constituée d'agrégats intracellulaires de protéines tau hyper et anormalement phosphorylées. Les formes agrégées de ces protéines ont longtemps été considérées comme neurotoxiques, cependant, il est maintenant avéré que les formes solubles de ces protéines dérégulées étaient à l'origine de la pathologie. Les synapses excitatrices situées au niveau des épines dendritiques sont les cibles du peptide Aβ sous forme soluble et oligomèrique (Aβo). Ce dernier en altère la fonction et induit leurs pertes. Récemment, il a été montré que cette action synaptotoxique de l'Aβo est dépendante de la protéine tau. De plus, dans un autre modèle de tauopathie, la démence fronto-temporale avec syndrome parkinsonien liée au chromosome 17 (FTDP-17), la synaptotoxicité de tau s'est révélée dépendante de son état de phosphorylation. Ainsi, il émerge le concept de tau synaptique dans un contexte pathologique. Cependant, des études plus récentes ont montré que, en condition physiologique, une petite portion de tau se retrouve au niveau de la synapse. Au regard de ces nouvelles données, il est possible que tau, en plus d'être une protéine axonale, nucléaire et membranaire, soit aussi synaptique. Dans ce contexte, les travaux présentés dans cette thèse visent à étudier l'implication de la protéine tau dans la fonction synaptique et les perturbations induites par la présence d'Aβo. Ces travaux ont été effectués sur un modèle cellulaire de cultures primaires de neurones corticaux et sur tranche d'hippocampe de souris par des méthodes biochimiques et d'analyse dynamique en microscopie confocale sur cellules vivantes. Afin d'étudier l'impact d'une activation synaptique sur un système de culture neuronal, l'utilisation combinée de la bicuculline, antagoniste des récepteurs gabaergique GABAa et de 4-amino pyridine, bloqueur de canaux potassique, permet d'établir une potentialisation à long terme sur les synapses. Grâce à un protocole d'extraction permettant d'isoler le compartiment post-synaptique (fraction contenant la densité post synaptique dont le marqueur protéique PSD-95), nous avons montré que l'activation synaptique enrichit la fraction PSD en protéine tau suggérant son implication dans les phénomènes de plasticité synaptique. L'étude du cytosquelette d'actine prépondérant au niveau synaptique a révélé que l'actine filamenteuse est un partenaire de tau. Dans un contexte pathologique, l'incubation d'Aβo induit le recrutement de tau à la synapse et perturbe l'organisation du cytosquelette d'actine. Ce changement structurel du cytosquelette d'actine pourrait être à l'origine des perturbations de la plasticité et du maintien synaptique induit par Aβo. En conclusion, l'ensemble des résultats de cette thèse suggère que tau exerce une fonction physiologique au sein de la synapse impliquant une interaction avec le cytosquelette d'actine et qu'en conditions pathologiques (induites par Aβo), on observe une altération fonctionnelle du rôle de tau à la synapse qui pourrait participer aux perturbations cognitives caractéristiques de la MA. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive loss of cognitive functions. This loss of cognitive functions is directly related to neuronal impairment, and more specifically, synaptic dysfunction. Two histopathological features found in AD patients' brains are related to protein deregulation: extracellular neuritic plaques composed of fibrillar β-amyloid peptide (Aβ) and intracellular aggregates composed of hyper-phosphorylated tau, named neurofibrillary tangles. Aggregated forms of these peptides have been considered neurotoxic, however, it is now recognized that soluble forms of these deregulated proteins are causal to the pathology. Soluble, oligomeric forms of Aβ peptide (Aβo) target excitatory synapses where they diminish synaptic function and cause loss of dendritic spines. Recently, it has been shown that the Aβo synaptotoxicity is tau-dependent. Another tauopathy, fronto-temporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17), exhibits synaptotoxicity, which has proved to be dependent on the phosphorylation state of tau. Thus, emerged the concept of synaptic tau in a pathological context. Recent studies have shown that a small quantity of tau is present in synapses under physiological conditions. These new data suggest that tau is a synaptic protein, in addition to being axonal, nuclear and membrane-associated. In this context, the work presented in this thesis characterizes the involvement of tau in synaptic function and its Aβo-induced disturbances. This work was conducted using primary cortical neurons cultured from mice and hippocampus slices and employed biochemical methods and confocal live-cell imaging. To study the impact of a synaptic activation on synaptic tau, we combined bicuculline, an antagonist of GABAa receptors and 4-amino-pyridine, potassium channel blocker, to establish long-term synaptic potentiation. By isolating the post-synaptic compartment (i.e. the fraction containing the post synaptic density and its marker PSD-95), we have shown that synaptic activation induced an enrichment of tau in PSD. This suggests its involvement in synaptic plasticity. The study of the actin cytoskeleton, which is specifically enriched in dendritic spines, revealed that filamentous actin is a molecular partner of tau, which may provide a means of recruiting tau to the synapse. Turning our attention to a pathological context, exposure to Aβo induced tau recruitment to the synapse and disrupts the actin cytoskeleton organization without exogenous synaptic stimulation. This structural modification of the actin cytoskeleton could underlie the disturbance of plasticity and synaptic maintenance induced by Aβo. In conclusion, this thesis provides evidence that tau performs a physiological synaptic function that involves an interaction with the actin cytoskeleton. Further, the synaptic function of tau is altered in pathological conditions (i.e. exposure to Aβo), and may contribute to the cognitive disturbances in AD.

La mécanotransduction est une propriété essentielle au développement des tissus, leur homéostasie et leur physiopathologie. La voie de signalisation YAP (Yes-Associated Protein) est apparue comme un régulateur particulièrement important de la mécano-réponse. Un défaut de mécanosensibilité défectueuse, associant une signalisation aberrante de la voie YAP, a récemment été rapportée dans des myoblastes humains de patients souffrant de dystrophie musculaire congénitale liée à des mutations du gène de la lamine (L-CMD) (Bertrand et al., 2014). La L-CMD est une forme grave de dystrophie musculaire à début précoce. Mon projet de doctorat visait à disséquer les défauts de la mécanosensibilité de cellules précurseurs du muscle présentant la mutation ΔK32. Mes résultats ont montré que les myoblastes mutants ΔK32 présentaient des un défaut de contact cellule-cellul, attestant d’anomalies de transmission des forces mécaniques entre cellules. Contrairement à ce que l’on observe dans les cellules contrôles à confluence, la voie YAP reste activée dans les myoblastes mutants ΔK32. Cela s‘est traduit par une activité transcriptionnelle accrue de YAP et une localisation nucléaire persistante de YAP dans les myoblastes ΔK32. La suractivité de YAP dans les myoblastes mutants ΔK32 n'était pas liée à une altération de la voie Hippo, voie de signalisation canonique qui régule YAP. La signalisation YAP défectueuse a été associée à une désorganisation de différents sous-ensembles du cytosquelette d'actine, incluant l'actine supranucléaire, l'actine basale et les fibres d'actine de la jonction cellule-cellule. La formation et la maturation de jonctions cellule-cellule était défectueuse dans les myoblates ΔK32, et les expressions protéiques des deux principales cadhérines, M et N-cadhérins, étaient significativement réduites à confluence. De plus, les myoblastes mutants ΔK32 présentaient une perte accrue de contact cellule-cellule pendant la migration, responsable d’une perte de la migration collective dans les cellules mutantes. Enfin, nous avons rapporté une augmentation de l'activité transcriptionnelle de la signalisation Smad 1/5/8 dans les myoblastes mutants ΔK32. En conclusion, ces résultats de thèse suggèrent que les défauts de mécanosensibilité dans les myoblastes mutants ΔK32 affectent la capacité des myoblastes à former des contacts cellule-cellule et à migrer collectivement. Ces défauts de mécanosensibilité peuvent contribuer à la physiopathologie de la L-CMD. / Mechanotransduction is critical for tissue development, homeostasis and diseases. YAP (Yes-Associated Protein) signaling has emerged as a particularly important regulator of the mechano-response. A defective mechanosensing response, including aberrant YAP signaling, has been recently reported in human myoblasts from patients suffering from LMNA related congenital dystrophy (L-CMD) (Bertrand et al., 2014). L-CMD is a severe early-onset form of muscular dystrophies caused by mutations in A-type lamins. My PhD project aims to further dissect mechanosensing defects of immortalized muscle precursor cells which carry the L-CMD causing ∆K32 mutation. My results showed that ∆K32 mutant myoblasts had a defective translation of mechanical forces at cell-cell contact sides. ∆K32 mutant myoblasts failed to inactivate YAP in high cell-cell contact conditions, as attested by an increased transcriptional activity of YAP and a persistent nuclear localization. YAP overactivity in ∆K32 mutant myoblasts was not related to an impaired activation of the Hippo signaling pathway. Defective YAP signaling was associated with a disorganization of different subsets of the actin cytoskeleton, including the supranuclear actin, the basal actin and the actin fibers at cell-cell junction. The formation of mature cell-cell contacts in ∆K32 myoblats was defective, and the protein expressions of both M- and N-cadherins were significantly reduced in high cell-cell contact conditions. Moreover, ∆K32 mutant myoblasts showed an increased loss of cell-cell contact during migration, which caused a shift from a sheet-like to a single cell migration pattern. Finally, we reported an increased transcriptional activity of mechanosensitive Smad 1/5/8 signaling in ∆K32 mutant myoblasts. Taken together, these results suggest that mechanosensing defects in ∆K32 mutant myoblasts affect the ability of myoblast to form cell-cell contacts and to migrate collectively. These mechanosensing defects may contribute to the pathophysiology of L-CMD.

La zone latérale des filaments branchiaux des bivalves Codakia orbiculata et Lucina pensylvanica est le lieu d'une symbiose chimioautotrophe avec des bactéries sulfo-oxydantes hébergées dans des cellules spécialisées, appelées bactériocytes. Dans cette étude, nous nous sommes proposés de déterminer les mécanismes qui sous-tendent la plasticité cellulaire et tissulaire observée au cours des processus de décolonisation et de recolonisation bactérienne. Pour ce faire, des individus collectés dans leur milieu naturel, ont été maintenus au laboratoire dans des bacs d'eau de mer filtrée en absence de nourriture et de soufre réduit, afin de provoquer la décolonisation bactérienne des filaments branchiaux. Lorsque la branchie apparaissait purgée de ses symbiotes, les individus ont été remis dans leur habitat naturel afin de provoquer sa recolonisation. L'analyse des branchies au cours de ces processus a fait appel à des techniques variées (histologie, immunohistochimie, hybridation in situ, cytométrie en flux, dosage des protéines et spectrométrie de fluorescence X). Les résultats obtenus ont permis de montrer que l'acquisition environnementale mise en évidence chez les juvéniles des Codakia se poursuivait tout au long de la vie des adultes. Cette étude a également permis une meilleure compréhension des mécanismes tissulaires sous-jacents à la plasticité du filament branchial en mettant en évidence les processus d'apoptose et de prolifération cellulaire qui ont lieu au cours des processus de décolonisation et de recolonisation. Ces processus s'accompagnent d'une variation de la teneur en soufre élémentaire, ainsi que de la taille relative et du contenu génomique des symbiotes / The lateral zone of gills filaments of coastal bivalves Codakia orbiculata and Lucina pensylvanica is the site of chemoautotrophic symbiosis with sulfur-oxidizing bacteria, housed in specialized cells called bacteriocytes. The objective of this thesis is to determine the mechanisms underlying cel1 plasticity and tissue plasticity observed in the lateral zone of gills filaments during the processes of bacterial decolonization and recolonization. In order to do this, the individuals collected in their natural habitat were maintained at the laboratory in seawater filtered tanks, without food and reduced sulfur, to cause bacterial decolonization. When the gills seemed to be purged, the individuals were returned to their natural habitat in order to cause the bacterial recolonization of gills filaments. The analysis of the gills during these processes involves several techniques (histology, immunohistochemistry, molecular hybridization, flow cytometry, total protein assays, protein sulfur assays, X-ray fluorescence spectrometry).This study shows that symbiont acquisition can occur during the entire life of Codakia bivalves. It also allows a better understanding of gills filaments plasticity by highlighting apoptosis and cell proliferation during decolonization and recolonization processes.Theses processes are accompanied with of elemental sufur, relative size and genomic content of symbiontes.

La migration cellulaire est une étape clé intervenant à un stade précoce de la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme, et est donc responsable de la formation des métastases qui tuent environ nonante pourcent des patients atteints de cancer. De plus, ces cellules migrantes résistent à l’apoptose grâce à l’activation constitutive de voies de signalisation anti-apoptotiques, et développent donc une résistance vis-à-vis des traitements anti-cancéreux actuels qui sont généralement pro-apoptotiques. Nous avons pris pour cible ce processus de migration cellulaire dans l’espoir d’identifier des agents anti-migratoires qui permettraient de lutter contre la formation des métastases et de restaurer chez les cellules migrantes une certaine sensibilité aux traitements pro-apoptotiques.<p>Dans la première partie de notre travail, nous avons analysé les effets anti-angiogéniques et anti-migratoires des agents anti-tubuline. Nous avons confirmé que le Taxol® présentait une action anti-angiogénique à des concentrations non-cytotoxiques. Nous avons ensuite démontré que d’autres agents anti-tubuline exerçaient la même action que le Taxol®, et que cette action leur était spécifique. Nous avons montré que certains de ces agents étaient également capables de réduire la migration de lignées cellulaires tumorales, toujours à des concentrations non-cytotoxiques, et que cette action pouvait s’exercer via une affectation du cytosquelette d’actine.<p>Dans la deuxième partie du présent travail, nous avons démontré l’importance de la mise au point d’une approche pharmacologique originale permettant l’identification de composés à action anti-migratoire puisque l’outil utilisé par le U.S. National Cancer Institute pour le criblage de nouvelles molécules anti-cancéreuses ne permet pas de discerner l’activité anti-migratoire des molécules testées.<p>Enfin dans la troisième partie de ce travail, après avoir souligné la raison du choix de l’actine comme cible pour inhiber la migration cellulaire, nous avons développé une stratégie pharmacologique in vitro originale de découverte de composés anti-actine à activité anti-migratoire. Grâce à une approche divisée en plusieurs étapes, à savoir un essai de cytotoxicité, une étude de la dynamique de la polymérisation d’actine en tubes ou sur cellules entières, et des essais de migration bidimensionnelle sur cellules individuelles ou sur population cellulaire, nous avons montré d’une part que des molécules connues pour affecter le cytosquelette actinique étaient capables d’affecter la migration cellulaire, et d’autre part que la méthodologie que nous avons développée permettait bien l’identification de composés affectant l’actine et capables de réduire la migration de cellules tumorales. En conclusion, cette stratégie in vitro pourrait être utilisée dans l’identification de nouvelles molécules à activité anti-migratoire pour lutter contre le cancer.<p> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les travaux effectués dans cette thèse concernent la mécanique des gels d'actine branchés in vitro ainsi que leur processus de génération de forces contre des parois. Pour étudier ces effets, nous avons développé un nouveau montage expérimental, basé sur des mesures via l'auto assemblage de microcylindres superparamagnétiques sous un champ magnétique. Cela nous permet d'en déduire les relations entre force et vitesse des réseaux d'actine branchés, ainsi que de faire le lien entre force et mécanique, des sujets cruciaux en mécanique et en migration cellulaire. / The work done during this tesis concerns the mechanics and force generation processes of branched actin networks reconstructed in vitro. To study these effects, we’ve developped a new experimental setup, based on self assembly of supermaramagnetic microcylinders under a magnetic force. This allows us to obtain relations between force and growth velocity of branched actin networks, as well as linking force generation with mechanics, which are crucial to understand cell mechanics and migration.

Les cellules ciliées sont les cellules sensorielles de la cochlée, l’organe de l’audition, et assurent la transduction des stimulations acoustiques en message nerveux compréhensible par le système nerveux central. Nous avons étudié le rôle du cytosquelette dans le transfert synaptique et dans le cadre d’une neuropathie auditive.La première partie de cette thèse a consisté à déterminer le rôle des filaments d’actine dans l’exocytose des cellules ciliées. Pour ce faire, nous avons infusé des toxines connues pour dépolymériser les filaments d’actine directement dans les cellules ciliées internes. Après 10 minutes d’infusion, nous avons mesuré l’exocytose des cellules ciliées à partir de l’enregistrement de la capacité membranaire, indice de la fusion vésiculaire. Dans nos expériences, la dépolymérisation de l’actine provoquait une augmentation de l’exocytose. De plus nos résultats suggèrent qu’une fraction des vésicules éloignées des canaux calciques se rapproche des sites de libération après dépolymérisation du réseau d’actine. Ces travaux ont donc permis d’identifier une sous-population de vésicules synaptiques dont la disponibilité aux sites de fusion est dépendante des filaments d’actine. La seconde partie de cette thèse porte sur les mécanismes à l’origine d’une neuropathie auditive, la surdité AUNA1. Cette dernière se caractérise par la surexpression cytoplasmique de la protéine Diaph3, dont la fonction est de réguler la nucléation de l'actine et des microtubules. Pour étudier AUNA1, nous avons montré que les souris transgéniques qui surexpriment la protéine Diap3 (protéine murine) développent une surdité progressive, similaire à la neuropathie auditive AUNA1 : soit une élévation des seuils auditifs et des otoémissions normales, témoins de l’activité des cellules ciliées externes (qui ont pour rôle d’amplifier les stimulations sonores). En outre, le potentiel de sommation, qui reflète l’activité in vivo des cellules ciliées internes est altéré chez les souris transgéniques. L’observation des cellules ciliées internes en microscopie électronique à balayage montre un gonflement de la plaque cuticulaire, qui est une plateforme dense en actine servant à ancrer les stétéocils. L’observation en microscopie confocale du réseau de microtubules montre que ce dernier entoure la plaque cuticulaire chez les souris sauvages. A l’inverse, les microtubules envahissent la plaque cuticulaire chez les souris transgéniques. L’ensemble de ces résultats a donc permis de montrer un défaut d’adressage des microtubules à l’origine de la surdité AUNA1. / Inner hair cells transduce sound stimulation into neurotransmitter release onto the afferent auditory nerve fibers. Here, we studied how cytoskeleton modulates the transduction capabilities of the inner hair cells. Exocytosis at the inner hair cell ribbon synapse is achieved through the coupling between calcium channels and glutamate-filled synaptic vesicles. Using membrane capacitance measurements, we probed whether the actin filament network regulates the exocytosis of synaptic vesicles at the auditory hair cell. Our results suggest that actin network disruption increases exocytosis and that actin filaments may spatially organize a sub-fraction of synaptic vesicles with respect to the calcium channel.The auditory neuropathy 1 (AUNA1) is a form of human deafness, which results from a point mutation in the 5’untranslated region of the Diaphanous homolog 3 (DIAPH3) gene. Strikingly, the DIAPH3 mutation leads to the overexpression of the Diaph3 protein, a formin family member involved in the cytoskeleton nucleation and stabilization. Here, we examined in further details the anatomical, functional and molecular mechanisms that account for AUNA1. We found out that the Diap3-overexpressing transgenic mice show a progressive threshold shift associated to a defect in the inner hair cells. While synaptic function was not affected, Diap3-overexpression results into a selective and early-onset alteration of the inner hair cells cuticular plate, a dense plateform anchoring the stereocilia bundle. Molecular dissection of the apical components revealed that the microtubule meshwork undergoes an aberrant targeting into the cuticular plate of the transgenics’ inner hair cells at early onset, leading to the inabilities of these sensory cells to transduce incoming sound stimulation at later stages.

La dystrophine est une très grande protéine codée le gène DMD et située sous la membrane plasmique des fibres musculaires. Elle joue un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la cellule musculaire lors des cycles de contraction/relaxation. Cette protéine filamenteuse est composée de quatre domaines structuraux dont le domaine central composé de 24 répétitions homologues à la spectrine. Chaque répétition est organisée en faisceau de trois α-hélices appelé « coiled-coil ». Des mutations du gène DMD sont à l’origine des myopathies de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD) qui s’accompagnent d’un déficit total ou d’une dystrophine mutée et induisent de ruptures fréquentes de la membrane des cellules musculaires. La connaissance de la structure de la dystrophine est nécessaire au développement de thérapies à ce jour inexistantes pour les myopathies. Au laboratoire, des données structurales du domaine central de la dystrophine ont été acquises par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS, Small Angles X-ray Scattering). Cette thèse présente le développement d’une approche multi-échelle combinant des données expérimentales SAXS et des données in silico pour la reconstruction de modèles haute-résolution des fragments du domaine central de la dystrophine et d’un fragment muté observé dans une mutation BMD fréquente. Nous avons également cartographié l’interaction de ce domaine central avec deux de ses partenaires fonctionnels importants, l’actine filamenteuse et avec la nitroxyde synthase neuronale (nNOS) et proposé les premiers modèles atomiques des complexes macromoléculaires correspondants. L’ensemble de ces résultats permettra à terme l’optimisation de thérapies pour le traitement des dystrophies musculaires. / Dystrophin is a large protein encoded by DMD gene and located under the plasma membrane of muscle fibers. It plays an essential role in maintaining the integrity of muscle cells during contraction/relaxation cycles. This filamentous protein is composed of four structural domains including the central domain consisting of 24 spectrin-like repeats and four hinges. Each repetition is folded in three α-helices in a ‘coiled-coil’ assembly. Mutations in the DMD gene leads to Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker (MDBs), which are accompanied by frequent plasma membrane ruptures, due to the loss or modification of dystrophin protein. There are very few structural data available concerning the central domain of dystrophin, which is subject to many mutations involved in DMD and BMD diseases. However, the description and the understanding to an atomic level of dystrophin structure and its interaction is essential for optimization of therapies. Given the impossibility to solve its structure by X-ray crystallography or NMR, structural data of the dystrophin central domain were acquired by small angles X-rays scattering (SAXS, Small Angles X-ray Scattering). This thesis presents the development of an innovative multi-scale approach combining experimental SAXS and in silico derived data, allowing the reconstruction of high-resolution models of dystrophin central domain fragments. Structural data were also obtained on a mutated dystrophin frequently observed in BMDs. Furthermore, we also mapped the interactions of the central domain with two of its majors functional partners, Filamentous actin and neuronal nitroxyde synthase (nNOS) and proposed models of the related macromolecular complexes. At long-term, all of these results will allow optimization of therapies for the treatment of muscular dystrophies.

L'efficacité de la transmission synaptique GABAergique est influencée par la concentration intracellulaire en ions chlorure. Dans les neurones matures, l'extrusion de ces ions par le transporteur neuronal potassium chlore de type 2 (KCC2) permet l'influx d'ions chlorure lors de l'activation des récepteurs du GABA de type A. Néanmoins, KCC2 est aussi enrichi à proximité des synapses excitatrices portées par les épines dendritiques qui correspondent à des protrusions dendritiques enrichies en actine. Alors que l'effet d'une suppression de KCC2 sur l'homéostasie des ions chlorure et la transmission GABAergique est largement documenté, peu de choses sont connues sur l'impact qu'une telle suppression peut avoir sur la transmission glutamatergique. Lors de ma thèse, j'ai exploré le rôle de KCC2 dans la potentialisation à long terme (LTP) de la transmission glutamatergique à l'origine des phénomènes d'apprentissage et de mémorisation. Ce travail a révélé que la suppression de KCC2 compromet les modifications fonctionnelles et structurales sous-tendant la LTP. Cet effet est associé à une inhibition de la cofilin, protéine responsable de la dépolymérisation de l'actine, qui corrèle avec une augmentation de la quantité d'actine filamenteuse dans les épines dendritiques. En empêchant l'inhibition de la cofilin liée à l'absence de KCC2, il m'a alors été possible de restaurer la LTP suggérant que KCC2 pourrait influencer cette forme de plasticité en régulant la dynamique de polymérisation du cytosquelette d'actine. Mes résultats démontrent que la fonction de KCC2 va au-delà du contrôle de l'homéostasie des ions chlorure et influence les mécanismes de plasticité de la synapse excitatrice. / The polarity and efficacy of GABAergic synaptic transmission are both influenced by the intra-neuronal chloride concentration. In mature neurons, chloride extrusion through the neuronal K/Cl cotransporter KCC2 allows an inhibitory influx of chloride upon activation of GABAA receptors. Nevertheless, KCC2 is enriched in the vicinity of excitatory synapses within the dendritic spines that are actin-rich protrusions emerging from dendritic shafts. While it has become clear that KCC2 suppression alters chloride homeostasis and GABA signaling, little is known on its impact on glutamatergic transmission. In the laboratory, we have previously demonstrated that KCC2 suppression in mature neurons leads to decreased glutamatergic transmission efficacy through an ion-transport independent function of KCC2. During my PhD, I have explored how KCC2 may also impact LTP of glutamatergic synapses. My work reveals that KCC2 suppression compromises both functional and structural LTP at these synapses. This effect is associated with inhibition of the actin-severing protein cofilin and enhanced mobilization of F-actin in dendritic spines. Since LTP can be rescued by preventing cofilin inhibition upon KCC2 suppression, I suggest KCC2 might influence LTP through altered actin cytoskeleton dynamics. My results demonstrate that KCC2 function extends beyond the mere control of neuronal chloride homoeostasis and suggest regulation of KCC2 membrane stability may act as a metaplastic switch to gate long term plasticity at excitatory synapses in cortical neurons.

On a longtemps pensé que la communication intercellulaire était essentiellement régie par les signalisations juxta-, endo- et paracrine, les gap junctions et, plus récemment, les exosomes. Cependant, les travaux de plusieurs groupes dont le nôtre ont révélé que les Tunneling Nanotubes (TNT), des protrusions membranaires riches en actine qui relient le cytoplasme de cellules distantes et permettent le transport intercellulaire dynamique de leur contenu biologique, fournissent également l'infrastructure et les machines pour une communication efficace entre cellules. Malgré des progrès significatifs, la caractérisation de ces nouveaux organites a été limitée par le manque d'informations moléculaires et structurelles. Combler ces lacunes à l'aide d'une série d'outils de pointe et d'approches novatrices est devenu l'objectif principal de ma thèse. Plus précisément, j'ai exploré le rôle des complexes régulateurs de l’actine dans la formation des TNT reliant les cellules neuronales. Mes analyses montrent que les voies moléculaires connues pour être impliquées dans la formation d'autres protrusions membranaires régulent différemment la génération des TNT. En utilisant la microscopie par imagerie en direct, la microscopie électronique cryocorrélative et la tomographie, j'ai également étudié la nano-architecture des TNT neuronaux. Mes découvertes ont démontré que les TNT des cellules neuronales sont composés de plusieurs TNT individuels permettant le passage de vésicules et de mitochondries. En raison des difficultés d'identification des TNT in vivo, mes travaux ont également porté sur la mise en œuvre d'une approche « Connectomic » structurelle pour détecter les TNT dans les tissus sans avoir besoin d'un marqueur spécifique de TNT. Mes résultats indiquent que des structures de type TNT relient les cellules granulaires cérébelleuses migratrices des souris nouveau-nées, ce qui suggère que la communication intercellulaire pendant des événements migratoires dans le cerveau pourrait être médiée par des processus mettant en jeu des TNT. La squelettisation des structures identifiées fournit des informations géométriques qui corroborent les observations faites dans des expériences de couplage de colorants. L'ensemble de mes travaux de thèse fait la lumière sur la formation et la structure des TNT neuronaux in vitro et sur de nouvelles approches pour l'identification des TNT in vivo. / Inter-cellular communication has long been thought to be governed by juxta-, endo-, and paracrine signaling, tight junctions, and more recently, exosomes. However, large efforts from our and other groups revealed that Tunneling Nanotubes (TNTs), actin-rich membranous protrusions that connect the cytoplasm of distant cells and allow the dynamic inter-cellular transport of biological cargo, also provide the infrastructure and machinery for effective cell-to-cell communication. Despite significant progress made to unveil TNT-mediated cell communication, the characterization of these novel organelles has been limited by unanswered questions that hail from the lack of both molecular and structural information. Exploring these gaps in the field using a series of state-of-the-art tools and novel approaches became the main focus of my dissertation. Specifically, I explored the specific role of actin-regulator complexes in the formation of TNTs connecting neuronal cells. My analyses show that molecular pathways known to be involved in the formation of other membranous protrusions behave differently in the generation of TNTs. By employing live imaging microscopy, cryo-correlative electron microscopy and tomography approaches, I also studied the nano- architecture of neuronal TNTs. My findings demonstrated that TNTs of neuronal cells are comprised of multiple individual TNTs capable of transporting vesicles and mitochondria. Owing to the difficulties of identifying TNTs in vivo, my work also focused on the implementation of a structural Connectomic approach to detect TNTs in tissue without the need for a TNT-specific marker. My findings indicate that TNT-like structures connect migratory cerebellar granule cells of neonate mice, suggesting that inter-cellular communication during migratory events in the brain could be mediated by TNT-like processes. Skeletonization of the structures identified provide my findings with geometrical information that can be compared with observations made by corroborative dye-coupling experiments. Taken together, my dissertation work sheds light on the formation and structure of neuronal TNTs in vitro, and novel approaches for the identification of TNTs in vivo.