Durant mon travail de thèse, j'ai étudié le rôle central de l'ADF/cofiline, une protéine qui se lie au cytosquelette d'actine, décore spécifiquement les parties ‘âgées' des filaments d'actine, diminue localement par un facteur 5 la rigidité du filament et provoque la fragmentation du filament à l'interface entre les sections nues et décorées. Dans ma première étude (Suarez et al., Current Biology, 2011), j'ai utilisé la microscopie à onde évanescente et une ADF/cofiline fluorescente pour démontrer que l'ADF/cofiline est un marqueur de l'état nucléotidique (ATP, ADP-Pi ou ADP) des sous-unités d'un filament d'actine en cours de polymérisation. De plus, l'ADF/cofiline, en accélérant la dissociation du phosphate inorganique (Pi), limite la taille du cap ATP/ADP-Pi du filament d'actine, sans toutefois le réduire à une taille zéro. Des analyses statistiques sur filaments isolés établissent une corrélation parfaite entre la densité de fixation de l'ADF/cofiline et son efficacité de fragmentation. Paradoxalement, l'efficacité de fragmentation est maximale pour une densité d'ADF/cofiline de 0.5. Ceci est confirmé par des analyses supplémentaires qui montrent que les sites de fragmentation du filament coïncident avec la position des frontières entre zones décorées et zones nues. Les conséquences de ce dernier résultat paradoxal sont l'objet de ma seconde étude (McCullough et al., 2011, Biophysical Journal). En combinant différentes sources d'ADF/cofilines (vertébré et levure) et d'actines (vertébré et levure), nous montrons, sur les quatre couples actine-ADF/cofiline possibles, qu'il existe une très forte corrélation entre (1) l'efficacité de fragmentation (qui dépend de la combinaison entre actine et ADF/cofiline) et (2) la déformation du filament, mesurée à la frontière entre zone décorée et zone nue. Au cours de ma troisième étude (Reymann et al., Molecular Biology of the Cell, 2011), nous montrons que le mécanisme de fragmentation ADF/cofiline-dépendant, établi à l'échelle d'un filament isolé, peut s'appliquer aussi à l'échelle d'une comète d'actine qui comporte un réseau complexe de filaments. Mon travail de thèse a montré que le mode d'action de l'ADF/cofiline se situe à l'intersection entre mécanismes microscopiques et macroscopiques, d'une part, et entre chimie et physique, d'autre part. Les caractéristiques microscopiques des interactions de cette protéine avec un filament d'actine isolé sont fondamentales pour expliquer des évènements macroscopiques, comme la fragmentation de filaments ou de structures complexes. D'autre part, nous avons montré comment les propriétés chimiques de l'ADF/cofiline modifient les propriétés physiques locales du filament et conduisent à la fragmentation. L'ADF/cofiline a un rôle central pour l'intégration de mécanismes physico-chimiques, à l'échelle microscopique, afin d'assurer un comportement cohérent à l'échelle de la cellule. / During my thesis, I have studied the pivotal role of ADF/cofilin, a protein that binds to the actin cytoskeleton, specifically decorates ‘old' actin filament parts, decreases by a factor of 5 the local filament rigidity and triggers filament fragmentation at boundaries between decorated and non-decorated filament sections. In my first study (Suarez et al., Current Biology, 2011), I have used evanescent wave microscopy and labeled ADF/cofilin to demonstrate that ADF/cofilin is a marker of the nucleotide state (i.e. ATP, ADP-Pi or ADP) associated with the actin sub-units in actively polymerizing filaments. In addition, because ADF/cofilin accelerates inorganic phosphate (Pi) release, the size of the ATP/ADP-Pi cap is diminished, although it cannot be reduced to zero. Fragmentation events frequency, determined from a thorough analysis of a population of single filaments decorated with labeled ADF/cofilin, is perfectly correlated with the binding density of ADF/cofilin on filaments. However, the maximal severing efficiency is obtained for half ADF/cofilin density. This paradoxical result is confirmed by analysis showing that severing sites are mainly associated with boundaries between decorated and bare actin filament sections. In consequence, in a second paper (McCullough et al., Biophysical Journal, 2011), I have took part in the study of actin filament deformation in relation with severing efficiency. Using different ADF/cofilin (vertebrate and yeast) and actin (vertebrate and yeast), we have shown that filament deformation at the boundary between bare and ADF/cofilin-decorated filament sections (which depends on the ADF/cofilin/actin combination) and severing are highly correlated. During my third study, (Reymann et al., Molecular Biology of the Cell, 2011), we established that stochastic dynamics, discovered at the molecular level for single filaments (or bundles of them), is also relevant to describe the macroscopic fragmentation of a comet tail consisting of hundreds of thousands filaments. I have shown that ADF/cofilin activity is at the crossroad between macroscopic and microscopic systems, on one hand, and physics and chemistry, on the other hand. The characteristics of microscopic interactions of ADF/cofilin with a single filament are fundamental to understand the macroscopic dynamics of a fragmenting comet. In addition, we have established how the binding of ADF/cofilin (chemistry) controls the mechanical properties of the filament (physics) before fragmentation. ADF/cofilin is essential in the integration of physical and chemical mechanisms at the microscopic level, to ensure consistent behavior at the cell scale.

Le cytosquelette est un assemblage de protéines intracellulaires qui assure le maintien de la forme des cellules et la production de force. Ce cytosquelette est formé de trois types de polymères, dont les filaments d'actine qui sont impliqués dans des fonctions essentielles telles que la motilité cellulaire, la division cellulaire ou encore la morphogénèse. Les filaments d'actine s'agencent en structures organisées dont la dynamique est assurée par la polymérisation et le désassemblage des filaments, contrôlés spatio-temporellement. La plupart des structures d'actine sont dans un état stationnaire dynamique où l'assemblage est compensé par le désassemblage, ce qui permet de maintenir une concentration de monomères intracellulaire élevée. En effet, le réservoir d'actine in vivo est limité et la formation de nouvelles structures de filaments d'actine est dépendante d'un désassemblage efficace des structures les plus âgées. Le but de ma thèse a été d'étudier comment l'organisation architecturale des structures d'actine influence le désassemblage par la machinerie protéique composée de l'ADF/cofiline et d'un de ses cofacteurs Aip1.J'ai d'abord pu montrer que l'efficacité du désassemblage dépendait de l'agencement des filaments d'actine. Quand les réseaux branchés ne requièrent que l'action de l'ADF/cofiline pour être désassemblés efficacement, les faisceaux de filaments d'actine ont besoin de la présence simultanée de l'ADF/cofiline et de l'Aip1. Une étude à l'échelle moléculaire a ensuite été menée pour comprendre le mécanisme du désassemblage des filaments d'actine par ces deux protéines au niveau du filament individuel.Dans un second temps, j'ai développé un système expérimental composé de micropuits de taille comparable à la cellule. Cette technologie nous a permis de réaliser des expériences en milieu confiné, dans lequel le réservoir d'actine était limité de la même manière que le réservoir d'actine cellulaire. J'ai mis ce système a profit pour reconstituer le turnover d'une comète d'actine, un réseau branché formé à la surface d'une bille recouverte de nucléateurs de l'actine.Ce travail de thèse a permis d’établir des lois fondamentales contrôlant la dynamique de l’actine et plus particulièrement comment l’architecture de l’actine et l’environnement peuvent influencer le désassemblage de structures complexes. / The actin cytoskeleton is a major component of the internal architecture of eukaryotic cells. Actin filaments are organized into different structures, the dynamics of which is spatially and temporally controlled by the polymerization and disassembly of filaments. Most actin structures are in a dynamic steady state regime where the assembly is balanced by the disassembly, which maintains a high concentration of intracellular actin monomers. In vivo the pool of actin monomers is limited and the formation of new actin filament structures is dependent on an effective disassembly of the older structures. The goal of my thesis was to study the influence of different architectures of actin by the disassembly machinery made of ADF/cofilin and its cofactor Aip1.Firstly, I showed that the efficiency of the disassembly was dependent on the architecture of actin filaments organizations. Although the branched networks need only ADF/cofilin to be efficiently disassembled, the actin cables require the simultaneous action of ADF/cofilin and Aip1. Further investigations at the molecular scale indicate that the cooperation between ADF/cofilin and Aip1 is optimal above a certain threshold of molecules of ADF/cofilin bound to actin filaments. During my PhD I demonstrated that although ADF/cofilin is able to dismantle selectively branched networks through severing and debranching, the stochastic disassembly of actin filaments by ADF/cofilin and Aip1 represents an efficient alternative pathway for the full disassembly of all actin networks. We propose a model in which the binding of ADF/cofilin is required to trigger a structural change of the actin filaments, as a prerequisite for their disassembly by Aip1.Secondly, I developed an experimental system made of cell-sized microwells. This technology allowed us to develop experiments in a closed environment in which the actin pool is limited in the same way as the cellular environment. I used this experimental system to study how a limited pool of components limits both the assembly and the disassembly of a branched network.This thesis highlights the importance of developing new tools to obtain more “physiological” reconstituted systems in vitro to establish some of the general principles governing actin dynamics.

Le cortex d'actine est une fine couche de gel d'une épaisseur de l'ordre du micron, attaché à la membrane lipidique de la cellule. Il est constitué d'un réseau de filaments d'actine qui sont constamment polymérisés à la membrane puis dépolymérisés, dans un mouvement de « tapis roulant ». Des moteurs moléculaires, les myosines, génèrent des contraintes internes dans le gel.Le cortex contrôle ainsi les variations de forme de la cellule. Dans cette thèse nous utilisons le modèle des gels actifs pour explorer certaines propriétés du cortex d'actine. Le gel est décrit a l'échelle mésoscopique comme un matériau viscoélastique nématique dans lequel les myosines utilisent l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP pour produire des contraintes actives, c'est à dire plaçant le système hors d'équilibre thermodynamique. Dans un premier temps nous étudions de quelle façon l'épaisseur du cortex peut être régulée, et nous discutons l'apparition d'instabilités actives dans la couche. Nous utilisons l'instabilité du gel ainsi décrite pour interpréter l'observation expérimentale d'oscillations de formes de fibroblastes induites par des canaux calciques mecanosensibles. ­­En incluant un paramètre d'ordre nématique dans notre description, nous montrons que soumettre le cortex à une concentration inhomogène de myosines doit conduire à l'apparition d'un flux de filaments et à la formation d'un anneau, ainsi qu'observé dans plusieurs systèmes expérimentaux, en particulier lors de la cytocinèse. Nous terminons ce travail par une analyse de la mécanique de formation d'un bleb unique induit par une rupture artificielle du cortex par ablation laser.

Nous avons étudié la croissance de contacts cellulaires asymétriques: les jonctions adhérentes et les contacts focaux. Nous avons montré par des expériences d'imageries, de micromanipulation, et d'altération des assemblages cellulaires, que la brisure de symétrie des jonctions adhérentes entre des cellules apparemment identiques s'explique par des rôles différents du cytosquelette d'actine des deux cellules formant le contact. Une cellule «donneuse» polymérise de l'actine, ce qui amène les membranes cellulaires en contact. La cellule «receveuse» assemble des faisceaux contractiles d'acto-myosine qui exercent localement des forces sur les jonctions et régulent leur longueur. Des courbes de croissance de ces jonctions adhérentes ont par ailleurs été mesurées pour des cellules soumises à des augmentations contrôlées de force contractile par incubation dans le nocodazole. L'ajustement des courbes de croissance expérimentales par des lois théoriques a permis de déterminer les forces contractiles mises en jeu par la cellule «receveuse». Le tracé du diagramme force-extension des jonctions adhérentes a pu donc être réalisé pour la première fois et par une méthode non-invasive. Les approches biologiques pour l'identification des assemblages en jeu et physiques pour l'ajustement des lois de croissance ont l'une et l'autre montré que les contacts entre cellules se renforcent localement à la manière des contacts focaux. Nous avons enfin observé la dynamique interne des contacts focaux en croissance par TIRFM pour différentes protéines participant au contact (fibronectine, intégrine, vinculine, actine) afin de proposer un mécanisme de mécanosension.

DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM EST UN ORGANISME UNICELLULAIRE SE NOURRISSANT PAR PHAGOCYTOSE DE MICROORGANISMES ET ENDOCYTOSE DE PHASE FLUIDE. ELLE EST CAPABLE DE MIGRATION SUR UN SUBSTRAT, PAR EMISSION DE PROTRUSIONS SUR LE FRONT CELLULAIRE AVANT, ET PAR RETRACTION DU FRONT ARRIERE. LA MOTILITE EST LIEE A L'ADHERENCE DES CELLULES SUR LE SUBSTRAT, SIEGE DE LA TRANSMISSION DES FORCES EXERCEES PAR LA CELLULE. SOUMISE A UNE FORCE DE CISAILLEMENT HYDRODYNAMIQUE, DICTYOSTELIUM SE DEPLACE DANS LE SENS DU FLUX. NOUS AVONS ETUDIE LES MECANISMES BIOCHIMIQUES MIS EN JEU EN REPONSE A LA FORCE OU A L'ETALEMENT. NOUS AVONS ANALYSER LE COMPORTEMENT DE CELLULES SAUVAGES ET DE MUTANTS D'INVALIDATION, A L'ECHELLE DE LA CELLULE ET DU BORD CELLULAIRE. NOUS MONTRONS PLUSIEURS RESULTATS. LE CALCIUM LIBRE EXTRACELLULAIRE AUGMENTE LA VITESSE DE MIGARTION DES CELLULES ET LEUR SENSIBILITE AUX FORCES. CECI EST DU A UNE AUGMENTATION DE LA DYNAMIQUE DES BORDS CELLULAIRES, LES PROTRUSIONS ETANT PLUS GRANDES ET LES RETRACTIONS PLUS EFFICACES. IL Y A DES OSCILLATIONS DES BORDS CELLULAIRES, AVEC DES PERIODES PROPRES DIFFERENTES A L'AVANT ET A L'ARRIERE DE LA CELLULE. CES PERIODES NE DEPENDENT NI DE LA CONCENTRATION NI DU TYPE CELLULAIRE. LE CALCIUM AUGMENTE LA CINETIQUE ET LA REGULARITE DE L'ETALEMENT, EN AGISSANT SUR LA POLYMERISATION D'ACTINE. L'ETALEMENT NE DEPEND QUE DE LA POLYMERISATION D'ACTINE ET DE L'EMISSION DE PROTRUSIONS, TANDIS QUE LES RETRACTIONS NE PEUVENT EXISTER SANS MYOSINE 2. ENFIN, LES PROTEINES G ET LES RECETEURS A L'IP3 SONT IMPLIQUES DANS LA SIGNALISATION CALCIQUE.

Nous avons étudié l'agrégation de protéines adhésives (les cadhérines) lors de la formation de contacts intercellulaires. Les cadhérines sont liées au cytosquelette d'actine par un complexe protéique. Nous avons déterminé des rôles respectifs pour la membrane et pour l'actine dans la formation des jonctions adhérentes: les lois de nucléation et croissance d'agrégats de cadhérines fluorescentes entre cellules ont été acquises et confrontées à des modèles faisant intervenir les propriétés de membrane et la polymérisation d'actine. On a pu ainsi montré le rôle structurant de l'actine qui impose la forme des contacts. Nous avons aussi mis au point un montage dans lequel une cellule adhère sur une surface recouverte de cadhérines. L'apparition de motifs cadhérines allongés a été observée par microscopie à ondes évanescentes. Nous avons montré, comme l'avaient prédit les physiciens, que ces agrégats se forment à la suite d'une augmentation de la tension membranaire.

Le complexe Scar/WAVE génère la formation des lamellipodes par l'intermédiaire du complexe Arp2/3 responsable de la polymérisation de réseaux d'actine branchés. Dans le but d'identifier de nouveaux régulateurs du complexe Scar/WAVE, nous avons conduit un crible en cellules de Drosophiles combinant une approche protéomique à une approche de génomique fonctionnelle. La chaîne lourde de la clathrine a été identifiée au cours de ce crible comme une protéine interagissant avec le complexe Scar/WAVE et dont la déplétion affecte la formation des lamellipodes. Ce rôle de la clathrine dans la formation des lamellipodes peut être découplé de son rôle classique dans le transport vésiculaire en utilisant différentes approches. De plus, la clathrine est localisée au lamellipode en l'absence d'adapteurs et des protéines accessoires de l'endocytose. La surexpression de la clathrine affecte le recrutement membranaire du complexe WAVE réduisant ainsi la vélocité des protrusions membranaire et la migration cellulaire. Par opposition, lorsque la clathrine est envoyée artificiellement à la membrane plasmique par une fusion à une séquence myristoylée, on observe une augmentation du recrutement membranaire du complexe Scar/WAVE, de la vélocité des protrusions membranaires et de la migration cellulaire. L'ensemble de ces résultats montrent que la clathrine envoie le complexe Scar/WAVE à la membrane plasmique et donc contrôle la formation des lamellipodes en plus de son rôle plus classique dans le traffic membranaire.

Le cytosquelette d'actine est une structure dynamique capitale pour la cellule, qui intervient dans les processus de signalisation et génère des forces mécaniques pour compléter des fonctions aussi diverses que l'adhésion, la migration, la division ou la différenciation. Les protéines qui régulent cette structure sont capables de moduler ces fonctions. J'ai identifié une nouvelle famille de protéines régulatrices de l'actine, les protéines Refilines (RefilineA et RefilineB), dont l'expression est corrélée avec l'engagement des cellules dans des programmes de différenciation. La RefilineA est induite lors de la différenciation des cellules précurseurs neurales multipotentes en cellules progénitrices gliales. La RefilineB est stabilisée dans les cellules épithéliales lors de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) induite par le TGF-β. Dans ces cellules, les Refilines agissent en se complexant à la FilamineA, une protéine qui se lie aux filaments d'actine et forme le maillage. Des syndromes génétiques de mutations sur le gène de la FilamineA entrainent d'importants défauts développementaux, cependant la fonction précise de la protéine reste à ce jour obscure. Le complexe Refiline/FilamineA induit la formation de câbles d'actine et génère également une nouvelle structure d'actine périnucléaire appelée coiffe d'actine (" actin cap ") ou " ligne TAN" qui s'ancre à l'enveloppe nucléaire pour réguler les mouvements et la morphologie du noyau. Les Refilines sont les seules protéines identifiées à ce jour capables de catalyser la formation de structures périnucléaires d'actine. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives pour appréhender les fonctions de la FilamineA ainsi que la biologie et les fonctions des structures périnucléaires d'actine.

Plusieurs mécanismes biologiques utilisent la polymérisation des filaments d'actine comme moteur mécanique. L'énergie chimique libérée à l'addition d'un monomère dans le filament est convertie en travail mécanique et une force est générée. Les filaments ainsi formés s'organisent grâce à des protéines liant l'actine et forment des structures qui diffèrent par leurs propriétés mécaniques et élastiques mais aussi de leurs fonctions dans les différents processus biologiques. Notre système expérimental permet d'étudier le lien entre les propriétés mécaniques et les mécanismes à l'origine de la production de la force. La polymérisation des filaments est directement initiée sur la surface de particules magnétiques. En présence d'un champ magnétique, ces dernières s'organisent en chaîne par des interactions dipôle-dipôle, et une force magnétique compressive est induite sur les filaments qui polymérisent. La polymérisation écartent les particules au cours du temps et en fonction de la force appliquée, la vitesse d'écartement des particules est ralentie. En suivant l'évolution de la distance entre particules, nous détaillons la relation force-vitesse et les propriétés mécaniques des filaments.

Les cadhérines sont des récepteurs d'adhésion intercellulaires permettant d'établir un lien entre la cellule adjacente et le cytosquelette. Pendant la formation des contacts, l'association des cadhérines avec l'actine via le recrutement des caténines alpha et bêta a été largement étudié. Pourtant la contribution des microtubules (MT) commence seulement à être abordée. Mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude de la relation entre la N-cadhérine (Ncad) et les MT dans deux contextes particuliers : l'adhésion et la migration cellulaires. En utilisant des substrats de Ncad recombinante, j'ai pour la première fois montré que dans un contexte d'adhésion cellulaire (lignée myogénique, souris), que (i) l'engagement de la Ncad inhibe le recrutement et la dynamique des MT à travers la régulation de l'actine et (ii) que la stabilisation des MT mène à une accumulation de la Ncad aux contacts. Dans ce contexte la Ncad et les MT établiraient donc une boucle de rétrocontrôle négatif. Ensuite j'ai démontré que pendant la migration cellulaire (modèle de neurones d'hippocampe de rat), la Ncad stimule la dynamique des MT. En conclusion, ces résultats révèlent un lien fonctionnel Ncad/MT dépendant de l'actine, dont la nature est différente selon le contexte cellulaire. Mon travail met à jour un nouveau mécanisme moléculaire impliqué dans la formation des contacts et la migration cellulaires. J'ai également participé à l'étude du rôle de la Ncad au cours de la survie, travail publié dans PlOS ONE. Nous avons montré que la Ncad promeut la survie neuronale par stimulation de la voie de signalisation activant les kinases Mek1/2, menant à la dégradation de la protéine pro-apoptotique Bim