Les mégacaryocytes sont les précurseurs cellulaires hautement spécialisés qui produisent des plaquettes via des extensions cytoplasmiques appelées proplaquettes. La formation des proplaquettes exige de profonds changements dans l’organisation du cytosquelette: microtubules et actine. Les formines sont une famille de protéines hautement conservées chez les eucaryotes composées de plusieurs domaines qui régulent le remodelage et la dynamique du cytosquelette d'actine et des microtubules. La plupart des formines sont des effecteurs protéiques des Rho-GTPase. DIAPH1, un membre de la famille des formines, est un homologue chez les mammifères du gène diaphanous de la drosophile qui fonctionne comme un effecteur de la petite GTPase Rho et régule le cytosquelette d'actomyosine ainsi que les microtubules. Il contient le domaine de liaison à Rho (Rho-binding domain) dans la partie amino-terminale et deux régions distinctes d’homologie aux formines, FH1 localisée au centre de la protéine et FH2 dans la partie carboxy-terminale. DIAPH1 co-régule le cytosquelette des microtubules et d'actine à travers respectivement ses régions de FH2 et FH1. DIAPH1 est donc un gène candidat idéal dans toutes les fonctions cellulaires qui exigent une coopération entre cytosquelettes d’actine et de microtubules.L'objectif de ce projet de thèse était d’étudier le rôle de DIAPH1 dans la mégacaryopoïèse. A la fin de la maturation des mégacaryocytes, la formation de proplquettes et la migration sont associées à des modifications importantes de la structure du cytosquelette. Nous avons émis l’hypothèse que grâce à la sa double fonction dans la polymérisation de l'actine et la stabilisation des microtubules, DIAPH1 pourrait jouer un rôle essentiel dans les temps terminaux de la différenciation mégacaryocytaire.Nos résultats ont montré qu’au cours de la différenciation mégacaryocytaire, l’expression de DIAPH1 augmente, alors que celles de DIAPH2 et DIAPH3 diminuent, ce qui suggère que DIAPH1 pourrait jouer un rôle plus important que DIAPH2 et DIAPH3 dans les stades tardifs de la différenciation mégacaryocytaire. Les études en immunomarquage montrent que DIAPH1 co-localise avec l’actine F, la tubuline et la myosine IIa en niveau de la membrane plasmique et des proplaquettes. Nous avons étudié la fonction de DIAPH1 par des stratégies d’invalidation (knockdown) et de surexpression d’une forme active de DIAPH1. Les résultats montrent que DIAPH1 est un effecteur important de Rho, pour réguler négativement la formation des proplaquettes en remodelant le cytosquelette d’actine et les microtubules. Le travail antérieur de notre équipe avait montré que Rho-ROCK régulait aussi négativement la formation des proplaquettes, en inhibant l’activation de la myosine IIa. En inhibant simultanément DIAPH1 et ROCK/myosine, nous avons montré que ces deux voies jouent un rôle additif dans la formation des proplaquettes.Ces résultats suggèrent que la coopération entre les voies DIAPH1 et ROCK/myosine est nécessaire pour la formation de structures cellulaire dépendant de l'actomyosine, telles les fibres de stress et l'anneau contractile en agissant à la fois sur le remodelage du cytosquelette et en assurant un équilibre entre l'actomyosine et microtubules. / Megakaryocytes (MKs) are the highly specialized precursor cells that produce platelets via cytoplasm extensions called proplatelets. Proplatelet formation (PPF) requires profound changes in microtubule and actin organization. Formins are a family of highly conserved eukaryotic proteins with multidomains that govern dynamic remodeling of the actin and microtubule cytoskeletons. Most formins are Rho-GTPase effectors proteins. DIAPH1, a member of the formin family, is a mammalian homolog of Drosophila diaphanous gene that works as an effector of the small GTPase Rho and regulates the actomyosin cytoskeleton as well as microtubules. It contains the Rho-binding domain in the N-terminal and two distinct regions of formin homology, FH1 in the center and FH2 in the C-terminus. DIAPH coordinates microtubules and actin cytoskeleton through its FH2 and FH1 regions respectively, making DIAPH an ideal candidate in cell functions that depend closely on the cooperation between the actin and microtubule cytoskeletons.The objective of the project was to decipher the role of DIAPH1 in megakaryopoiesis. At the end of the MK maturation, PPF and MK migration are associated with profound changes in cytoskeleton organization. Due to its dual function in actin polymerization and microtubule stabilization, DIAPH1 was an obvious candidate to play an essential role in PPF and MK migration.Our results showed that DIAPH1 expression increased during MK differentiation, whereas DIAPH2 and DIAPH3 expression decreased, suggesting that DIAPH1 may play a more important role than DIAPH2 and DIAPH3 in the late stages of MK differentiation. Immunostaining showed that DIAPH1 co-localized with F-actin, tubulin and myosin IIa along the plasma membrane and proplatelet. Using a knockdown strategy with shRNA and expression of an active form of DIAPH1, we showed that DIAPH1 is an important effector of Rho that negatively regulates PPF by remodeling actin and microtubule cytoskeletons. A previous work of our team has shown that Rho-ROCK also negatively regulates in PPF by inhibiting myosin IIa activation. By the double inhibition of the DIAPH1 and the ROCK/Myosin pathway, we showed that DIAPH1 and ROCK played additive roles in the negative regulation of PPF. These observations suggest that the cooperation between DIAPH1 and ROCK is required for the formation of cell structures dependent on actomyosin, such as the stress fibers and the contractile ring. Collectively, these results strongly suggest that cooperation of DIAPH1/microtubules and ROCK/Myosin may regulate PPF by modifying the balance between actomyosin and microtubules.

Le cytosquelette d'actine est une structure dynamique capitale pour la cellule, qui intervient dans les processus de signalisation et génère des forces mécaniques pour compléter des fonctions aussi diverses que l'adhésion, la migration, la division ou la différenciation. Les protéines qui régulent cette structure sont capables de moduler ces fonctions. J'ai identifié une nouvelle famille de protéines régulatrices de l'actine, les protéines Refilines (RefilineA et RefilineB), dont l'expression est corrélée avec l'engagement des cellules dans des programmes de différenciation. La RefilineA est induite lors de la différenciation des cellules précurseurs neurales multipotentes en cellules progénitrices gliales. La RefilineB est stabilisée dans les cellules épithéliales lors de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) induite par le TGF-β. Dans ces cellules, les Refilines agissent en se complexant à la FilamineA, une protéine qui se lie aux filaments d'actine et forme le maillage. Des syndromes génétiques de mutations sur le gène de la FilamineA entrainent d'importants défauts développementaux, cependant la fonction précise de la protéine reste à ce jour obscure. Le complexe Refiline/FilamineA induit la formation de câbles d'actine et génère également une nouvelle structure d'actine périnucléaire appelée coiffe d'actine (« actin cap ») ou « ligne TAN» qui s'ancre à l'enveloppe nucléaire pour réguler les mouvements et la morphologie du noyau. Les Refilines sont les seules protéines identifiées à ce jour capables de catalyser la formation de structures périnucléaires d'actine. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives pour appréhender les fonctions de la FilamineA ainsi que la biologie et les fonctions des structures périnucléaires d'actine. / The actin cytoskeleton is a highly dynamic structure involved in cell signaling and that creates mechanical force for the completion of diverse functions such as adhesion, migration, division or differentiation. Proteins that regulate this structure can modulate its function. We identified a new protein family that regulates the actin cytoskeleton, Refilin proteins (RefilinA and RefilinB), and whose expression correlates with differentiation switches. RefilinA is induced during differentiation of neural multipotent precursors into glial progenitors, while RefilinB is stabilized in epithelial cells during epithelial-mesenchymal transition (EMT) induced by TGF-β. In cells, Refilins interact with FilaminA, a protein that binds actin filaments to organize them into a network. Genetic syndromes where the FilaminA gene is mutated lead to important developmental defects, The Refilin/FilaminA complex generates actin cables as well as a new perinuclear structure called « actin cap » or «TAN line» that interacts with the nuclear envelope to regulate nuclear movement and shape. Refilin proteins are the only proteins identified so far that induce the formation of perinuclear actin structures. These results open up new perspective for the understanding of FilaminA's function as well as for the biology and functions of perinuclear actin structures.

Les protéines Hsp70 appartiennent à une famille de chaperons moléculaires très conservés qui jouent un rôle essentiel dans le contrôle qualité des protéines et qui protègent les cellules contre diverses agressions de l'environnement. Pour fonctionner comme un chaperon moléculaire, les protéines Hsp70 agissent de concert avec plusieurs co-chaperons et co-facteurs nécessaires au fonctionnement de son cycle ATPasique. Nos travaux montrent que les bactéries du genre Mycobacterium codent pour une nouvelle famille de protéines atypiques apparentées à Hsp70 dont l'architecture s'articule autour d'un domaine ATPase putatif à l'extrémité N-terminale, similaire au domaine de la superfamille Hsp70-actine, d’un segment transmembranaire (TMD) putatif et d'une longue région riche en proline/thréonine (P/T) en sa partie C-terminale. Le but de ce travail de thèse était d’étudier la fonction et la localisation cellulaire des protéines de type Hsp70 chez les mycobactéries. Nous avons d’abord constaté que la protéine Hsp70-Like de M. smegmatis (Msmg_Hsp70-Like) se localisait en foci distincts à la membrane des cellules et que son expression induisait un phénotype d’agrégation cellulaire. Afin d’éclaircir le rôle des domaines putatifs TMD et P/T, nous avons construit un ensemble de mutants dans lesquels ces éléments structurels ont été supprimés. Nous avons constaté que le domaine TMD putatif était important pour la localisation de Hsp70-Like, pour la formation des foci à la membrane et pour le phénotype d'agrégation des cellules. En revanche, le domaine riche en P/T n’a aucun effet sur ces phénotypes. In vitro, le domaine ATPase putatif de Msmg_Hsp70-Like a été purifié et des essais de cristallisation sont en cours. Des expériences supplémentaires restent cependant nécessaires pour évaluer la fonction de cette nouvelle famille de protéines. / Hsp70 belongs to a highly conserved family of molecular chaperone proteins that unambiguously plays essential roles in protein quality control, protecting cells against various environmental insults. To function as a bona fide molecular chaperone, Hsp70 acts in concert with several co-chaperones and nucleotide exchange factors to complete its ATP-dependent chaperone cycle. Our work shows that bacteria from the genus Mycobacterium encode new atypical Hsp70-Like proteins that share a common architecture: a putative ATPase domain at the N-terminus similar to members of the Hsp70-actin superfamily, a single putative transmembrane domain (TMD) in the middle of the protein and a long proline/threonine (P/T) - rich region at the C-terminal. The aim of this thesis work was to shed light on the function and the cellular localization of Hsp70-like proteins in mycobacteria. We first found that Msmg Hsp70-Like protein localizes to discrete foci within cells and that its expression induces a cell aggregation phenotype. To shed light on the role of the putative TMD and P/T- rich domains in Hsp70-Like, we engineered a set of mutants in which these structural elements were deleted. We found that the central putative TMD was important for the cell envelop localization of Hsp70-Like, for the formation of foci and for cell aggregation. In contrast, the P/T-rich had no effect on these phenomena. In vitro the putative ATPase domain of Msmg Hsp70-Like was purified and crystallization trials were performed. Further research is needed to assess the function of this novel family of proteins.

Les fibres musculaires et les touffes ciliaires mécanosensibles de l'oreille interne des vertébrés sont deux systèmes complexes capables de développer une activité mécanique spontanément oscillatoire, dans des conditions où, au niveau moléculaire, des groupes de moteurs moléculaires opèrent au voisinage de leur force d'arrêt et sont soumis à une force de rappel élastique.<br />Nous avons construit un dispositif reproduisant in vitro une configuration semblable. Nous avons observé qu'une assemblée de myosines II musculaires, consommant de l'ATP en interagissant avec un filament d'actine, et soumise à une force de rappel élastique exercée par une pince optique, est un système minimal capable d'osciller spontanément. La relation force-vitesse du système présente un comportement non-monotone lié à l'activité des moteurs. Cette propriété fournit un mécanisme pour interpréter les oscillations spontanées, comme il l'a été suggéré par différentes études théoriques antérieures.<br />Par ailleurs, des expériences préliminaires à l'échelle de la molécule individuelle indiquent que la raideur de l'accrochage actine-myosine II pourrait dépendre de la tension imposée au filament d'actine. Cette propriété pourrait expliquer les écarts entre les raideurs mesurées in vitro et estimées à partir d'expériences sur les fibres musculaires.

L'objectif de cette thèse est de caractériser l'influence de facteurs protéiques sur la dynamique du cytosquelette cellulaire au moyen d'outils de micromanipulation contrôlés. Nous avons déterminé la réponse microrhéologique du réseau d'actine pour des cellules uniques. Nous avons appliqué grâce à un système de pinces optiques des forces statiques et oscillantes à des microbilles de verres attachées de manière spécifique au réseau d'actine de divers types cellulaires. Dans le cas statique nous avons mesuré des modules élastiques dans la gamme 29

Toxoplasma gondii, le protozoaire intracellulaire obligatoire responsable de la toxoplasmose, fait partie du phylum des Apicomplexa. Comme les autres membres de ce phylum, il a développé des propriétés mobiles particulières qui lui permettent de se déplacer et d'envahir très rapidement la cellule dans laquelle il se multiplie. Ces processus de locomotion et d'invasion sont dépendants du cytosquelette d'actine du parasite. Une protéine, la toxofiline, identifiée uniquement chez T. gondii, a été caractérisée au laboratoire comme étant capable de réguler la dynamique du cytosquelette d'actine. Plus précisément, la toxofiline séquestre l'actine monomérique, empêchant ainsi sa polymérisation. L'affinité de la toxofiline pour l'actine est modulée par phosphorylation/déphosphorylation par une caséine kinase 2 et une sérine-thréonine phosphatase de type 2C (TgPP2C). Mon projet de thèse a porté sur l'étude du rôle de la TgPP2C dans l'interaction entre T. gondii et sa cellule hôte. Le premier objectif de mon travail a été de disséquer les interactions moléculaires entre les trois membres du complexe actine G - toxofiline - TgPP2C. J'ai ainsi identifié, par différentes approches biochimiques, les régions et les acides aminés de la toxofiline, critiques pour sa liaison avec ses deux partenaires. Tout d'abord, la toxofiline possède un domaine suffisant pour lier et séquestrer l'actine G dans des tests de polymérisation. Ce domaine, qui a été appelé CC1A, correspond à une région de 9 kDa comprenant un domaine en super hélice. Trois séries de peptides chevauchants, présents dans CC1A, capables de lier l'actine G, ont été plus précisément détectés. Nous avons également identifié d'autres régions de la toxofiline ayant des propriétés de liaison différentes à l'actine, en particulier dans le domaine N-terminal (NoCC). Le premier domaine en super hélice, et en position C-terminale de CC1A, lie la TgPP2C. Une autre séquence de plusieurs acides aminés, dans la région N-terminale et contenant la sérine 53, substrat de la TgPP2C, interagit avec la phosphatase. Le deuxième objectif de mon projet de thèse a porté sur l'analyse des propriétés fonctionnelles de la TgPP2C dans le tachyzoïte. Par une stratégie de surexpression dans les parasites, nous avons tout d'abord montré que la TgPP2C jouait un rôle dans la multiplication du parasite. En effet, des tachyzoïtes qui surexpriment la forme active de la TgPP2C ne se divisent pas normalement dans la vacuole parasitophore et finissent par dégénérer. On observe des parasites anormaux avec un noyau géant, qui suggère un défaut dans la division nucléaire ou l'individualisation des cellules filles. Nous avons également mis en évidence que la TgPP2C est sécrétée par le parasite dans le cytoplasme et le noyau de sa cellule hôte. Cette sécrétion est dépendante du domaine N-terminal unique de 18 acides aminés de cette phosphatase. Enfin, le troisième objectif de mon travail a consisté à étudier le rôle de la TgPP2C dans la cellule infectée. Par une approche d'expression ectopique de la phosphatase dans des cellules de mammifère, nous avons mis en évidence que la TgPP2C agissait au niveau du cycle de ces cellules. En effet, les cellules qui expriment la phosphatase parasitaire sont bloquées en phase G2/M. Certaines cellules en division n'achèvent pas la cytocinèse et restent reliées par un long pont cytoplasmique contenant de l'ADN et la TgPP2C. A un temps plus tardif, elles présentent les signes caractéristiques d'une apoptose. D'autre part, nous avons réalisé un crible double hybride en levure afin d'identifier les partenaires hôtes de la TgPP2C. Plusieurs protéines candidates on ainsi été obtenues, dont la protéine Spire qui possède des propriétés de nucléation de l'actine in vitro et dont nous avons confirmé l'interaction avec la TgPP2C. La poursuite de cette étude permettra de caractériser l'effet de la TgPP2C sur Spire, et le rôle de cette dernière dans le développement des tachyzoïtes.

Les microtubules (MTs) sont des polymères dynamiques essentiels pour de nombreux processus cellulaires tels que la division, la migration et le transport intracellulaire. Leurs propriétés dynamiques et leur organisation spatiale sont régulées par des protéines associées, les MAPs (Microtubule-Associated Proteins). Une des premières MAPs à avoir été identifiée dans les neurones est la protéine tau, connue pour stabiliser les MTs et les organiser en faisceaux au niveau des axones. Du fait de son implication dans la maladie d'Alzheimer, tau a fait l'objet de nombreuses études et son interaction avec les MTs est aujourd'hui relativement bien caractérisée. En revanche, les mécanismes responsables de la formation des faisceaux de MTs par cette protéine restent indéterminés. Le premier objectif de ma thèse a été de définir les bases moléculaires de ce processus, grâce à la reconstitution de faisceaux de MTs in vitro et à leur observation en temps réel par microscopie à onde évanescente. Les résultats montrent que le domaine de projection de tau inhibe la formation des faisceaux, alors que les deux hexapeptides localisés dans le domaine C-terminal de tau et responsables de son agrégation au cours de la maladie d'Alzheimer sont essentiels à l'organisation des MTs en faisceaux. En parallèle, je me suis intéressée à l'effet de tau sur l'interaction MTs/actine. En effet, les filaments d'actine constituent, comme les MTs, un élément majeur du cytosquelette. La coordination entre les MTs et les filaments d'actine est essentielle à la différenciation et à l'activité neuronales. Cependant, les effecteurs responsables de cette coopération MTs/actine restent aujourd'hui très mal caractérisés. La protéine tau a été proposée comme pouvant s'associer directement à l'actine. De plus, elle a été observée dans des compartiments neuronaux riches en actine tels que l'extrémité des axones en croissance et les synapses, dans lesquels les microtubules peuvent entrer transitoirement. Tau est donc un potentiel intermédiaire moléculaire entre les MTs et les filaments d'actine. Grâce à la mise au point d'un système original permettant la visualisation de l'assemblage simultané des MTs et des filaments d'actine, j'ai étudié le rôle de tau dans la coordination des cytosquelettes de MTs et d'actine et également les mécanismes moléculaires sous-jacents. J'ai pu montrer que tau interagit simultanément avec les MTs et l'actine, induit le co-alignement des deux réseaux ainsi que leur croissance couplée. L'utilisation de formes tronquées de tau montre qu'au moins deux de ses quatre motifs répétés, initialement identifiés comme liant la tubuline, sont nécessaires à l'interaction entre les MTs et les filaments d'actine. Nous proposons un modèle selon lequel tau coordonne les deux cytosquelettes via la répartition de ses motifs répétés entre les deux types de polymères. J'ai également participé à une étude dans des neurones en culture, confirmant l'interaction directe de tau avec l'actine et la triple co-localisation tau/MTs/actine. L'ensemble de ces résultats nous ont donc permis d'identifier les bases moléculaires impliquées dans la formation des complexes macromoléculaires MTs/MTs et MTs/actine induits par tau. / Microtubules (MTs) are dynamic polymers involved in fundamental cellular processes such as cell division, migration and intracellular transport. Their dynamic properties and spatial organization are regulated by numerous Microtubule-Associated Proteins (MAPs). Tau is one of the first MAPs identified in neurons and is known to stabilize MTs and organize them into bundles in axons. Due to its involvement in Alzheimer's disease, this protein has been widely studied and its interaction with MTs is now quite well characterized. However, the mechanisms by which tau organizes MTs into bundles remain to be determined. The first aim of my thesis was to define the molecular basis of MT bundling, by using in vitro reconstitution of MT bundles and by monitoring them in real time using evanescent wave microscopy. Results show that tau's projection domain inhibits MT bundling, whereas the two hexapeptides in the tau's C-terminal domain that are involved in tau aggregation during Alzheimer's disease are fundamental for MT organization into bundles. Furthermore I focused on the effect of tau on the crosstalk between MTs and actin. Actin filaments are another major cytoskeletal elements. The coordination between MTs and actin filaments is essential for neuronal differentiation and activity. However, the effectors responsible for MTs/actin cooperation remain poorly characterized. Tau protein has been proposed to directly interact with actin filaments. Besides, tau has been observed in neuronal actin-rich compartments like the extremity of growing axons and synapses, in which MTs can enter transitorily. Thus tau appears as a potential molecular linker between MTs and actin filaments. By developing an original cell-free system to visualize concomitant MTs and actin assembly, I studied the role of tau in the coordination of MTs and actin filaments and characterized the underlying molecular mechanisms of this phenomenon. I showed that tau is able to interact simultaneously with MTs and actin filaments, inducing the co-alignment of both polymers and their coupled growth. By using truncated tau proteins, I showed that at least two of the four tau's repeat motifs, initially characterized to bind tubulin, are necessary for the MTs/actin interaction. We propose a model in which tau coordinates the two networks through the distribution of its repeat motifs between the two polymers. I also participated to a study in cultured neurons, which confirmed the direct association of tau with actin and a triple co-localization between MTs/actin and tau. Altogether, these results led us to identify the molecular basis involved in the formation of MTs/MTs and MTs/actin macromolecular complexes induced by tau.

Le cytosquelette d'une cellule eucaryote est constitué de trois types de polymères différents qui sont l'actine, les filaments intermédiaires et les microtubules. Ces éléments confèrent à la cellule l'essentiel de ses propriétés mécaniques telles que le maintien de l'architecture ou la modification de sa forme pour permettre le déplacement cellulaire. Ils sont également impliqués dans le transport d'organites ou de nutriments d'un bout à l'autre de la cellule, dans la ségrégation des chromosomes lors de la mitose ou encore dans le processus de division cellulaire. Pour répondre aux différents besoins de la cellule, ces filaments sont extrêmement dynamiques et peuvent se désassembler pour se réassembler à un autre endroit de la cellule. Cette dynamicité est régulée par de nombreuses protéines accessoires qui vont être capables de modifier les propriétés intrinsèques des différents filaments (dynamique, mécanique et organisatrice). Parmi ces protéines régulatrices, l'on distingue tout particulièrement les MAPs, pour Microtubule Associated Proteins, capables de modifier la dynamique et la structure des microtubules. MAP6, ou encore STOP pour Stable Tubule Only Peptide, est une MAP neuronale qui fut initialement décrite pour sa capacité à protéger les microtubules d'une exposition au froid ou encore de drogues dépolymérisantes comme le nocodazole. Des souris délétées pour le gène MAP6 montrent des troubles cognitifs et comportementaux proches des patients atteints de schizophrénie, impliquant au moins en partie des défauts de stabilisation des microtubules. Cependant, les effets de la protéine sur les microtubules restaient encore à déterminer. Dans ce contexte, à l'aide de diverses approches biochimiques et vidéomicroscopiques, nous avons montré que la protéine MAP6 est capable d’interagir de façon directe avec les microtubules in vitro et permet leur stabilisation. Elle permet aussi de réguler la dynamique des microtubules en augmentant la vitesse de polymérisation de l'extrémité (+), de diminuer la fréquence de catastrophe et l'apparition d’événements de sauvetage, de façon similaire à d'autres MAPs comme Tau ou MAP2. Cependant, contrairement aux autres MAPs, nous avons montré que MAP6 présente une dualité d'action sur le bout (-) des microtubules en diminuant et figeant très rapidement la dynamique de cette extrémité. Cette dualité pourrait ainsi conférer à MAP6 un rôle essentiel de nucléateur de microtubules en figeant l'extrémité (-) du microtubule et en favorisant la polymérisation et la stabilisation de l'extrémité (+). De plus, la protéine MAP6 est capable de modifier fortement la structure des microtubules. De part leur composition et leur rôle, les microtubules sont les éléments les plus rigides du cytosquelette et forment naturellement un tube creux linéaire. Or en présence de MAP6, les microtubules perdent cet aspect linéaire et adoptent une structure hélicoïdale (avec un pas d'environ 4,5 μm et une hauteur d'environ 1 μm) qui n'avait encore jamais été observée jusqu'à présent. La présence d'une telle population de microtubules dans la cellule pourrait ainsi apporter une certaine résistance mécanique ou encore permettre le maintien de l'architecture de l'axone. Enfin, nous avons montré que MAP6 peut aussi interagir de façon directe avec les filaments d'actines et les associer entre eux pour former des faisceaux. Dans les neurones, de nombreuses molécules ont été identifiées comme étant des régulateurs clés dans le « crosstalk » entre les filaments d'actines et les microtubules. L'interaction et la coordination entre les différents éléments du cytosquelette jouent un rôle essentiel dans la transmission et le relais du message synaptique. MAP6 pourrait être importante pour l'ensemble de ces mécanismes ce qui expliquerait les défauts de plasticité synaptique ainsi que les défauts cognitifs observés chez les souris KO MAP6. / The eukaryotic cell's cytoskeleton is constitued by three types of different polymers which are the actin filaments, the intermediate filaments and the microtubules. These elements confer on the cell the main part of its mechanical properties such as the architecture preservation or the modification of its shape to allow the cellular movement. They are also involved in the organelles or nutrients transport throughout the cell, in the chromosomes segregation during mitosis or still in the cellular division process. To answer the cell's various needs, these filaments are extremly dynamics and are able to dis-assemblate to re-assemblate in another place of the cell. Tis dynamic is regulated ny numerous proteins which are going to be capable of modifiying the intrinsic properties of the different filaments (dynamic, mechanic and structure). Among them are present the MAPs, for Microtubule-Associated Proteins, which will be able to influence the microtubule dynamics and structure. MAP6, also known as STOP for Stable Tubule Only Peptide, is a neuronal MAP which was initially described for its capacity to protect microtubule from cold or nocodazole exposure. KO MAP6 mice display cognitive and behavioral disorders close to patient with schyzophrenia, involving at least partially microtubules stabilization defects. However, the effects of the protein on the microtubules still remained to determine. In this context, using diverse biochemical and cideomicroscopy technics, we showed that MAP6 is able to directly interact in vitro with the microtubules and stabilizes them. It also regulates the microtubule dynamics by increasing the microtubule growth rate of the plus end extremity, decreases the shrinkage frequency and allows rescue of shrinking microtubules, similarly to other MAPs like Tau or MAP2. However, contrary to the other MAPs, we showed that MAP6 has another effect on the microtubule (-) end by decreazing and freezing its dynamics. This dual effect could confer to MAP6 an essential role of microtubules nucleation by stabilizing the new formed microtubule (-) end and by stabilizing and increasing the (+) end microtubule growth rate. Furthermore, MAP6 is also able to strongly modify the microtubule structure. Microtubules are the stiffest elements of the cytoskeleton and naturally form due to their composition linear hollow tubes. Yet in presence of MAP6, microtubules lose their usual shape and adopt a helical structure (4,5 μm pitch and approximatly 1 μm thickness) which had never been observed until now. The presence of such a population of microtubules in the neuron could thus provide a mechanical strength and allow the preservation of the axon architecture. Finally, we showed that MAP6 can also directly interact with the actin filaments to associate them and form bundles. In neurons, several molecules have been identified as key regulators in the " crosstalk " between actin filaments and microtubules. The interaction and coordination between the different cytoskeletal elements play a vital role in the synaptic transmission. MAP6 may be important for all these mechanisms which would explain the synaptic plasticity and cognitive defects observed in KO MAP6 mice.

LIMK1 et LIMK2 sont des sérines/thréonine kinases capables de phosphoryler et d’inactiver la cofiline, un facteur de dépolymérisation de l’actine. Elles sont régulées négativement par la neurofibromine, responsable de la neurofibromatose de type 1, et pourraient être impliquées à la fois dans les aspects tumoraux et cognitifs de cette maladie par leur rôle dans la dynamique de l’actine. Nous avons étudié l’isoforme LIMK2‐1 de LIMK2, spécifique des hominidés et précédemment associée à la déficience intellectuelle. Cette isoforme possède un domaine kinase tronqué et un domaine inhibiteur de la phosphatase 1 (PP1i) en C‐terminal. Nos résultats montrent, d’une part, que LIMK2‐1 existe sous forme de protéine et qu’elle est exprimée dans le système nerveux central chez l’homme, en particulier au cours du neurodéveloppement. D’autre part, il apparaît que cette isoforme favorise la polymérisation de l’actine. Cette action semble indépendant de l’activité kinase puisque LIMK2‐1 ne phosphoryle pas la cofiline. Nous avons également montré que le domaine PP1i interagissait spécifiquement avec la phosphatase 1 et des résultats complémentaires suggèrent un rôle de ce domaine dans l’inhibition de la dépolymérisation de l’actine. Ces données mettent en évidence un mécanisme moléculaire nouveau pour une protéine de la famille des LIMK et soulignent l’intérêt d’étudier ces protéines afin de mieux comprendre leur implication dans les troubles cognitifs et dans la neurofibromatose de type 1. / LIMK1 and LIMK2 are serine/threonine kinases that phosphorylate and subsequently inactivate cofilin, an actin-depolymerizing factor. Neurofibromin, the protein responsible for neurofibromatosis type 1, negatively regulates these proteins that may be involved in tumoral and cognitive aspects of the disease through their role in actin dynamics. We studied LIMK2-1, a hominidae-specific isoform previously involved in intellectual disability. This isoform possesses a truncated kinase domain and a protein phosphatase 1 inhibitory (PP1i) domain at its C-terminal extremity. Our results showed that LIMK2-1 exists at a protein level and that it is expressed in human central nervous system, especially during neurodevelopment. Moreover, LIMK2-1 promotes actin polymerization independently from a kinase activity, since this isoform does not phosphorylate cofiline. We also highlighted an interaction between the PP1i domain and protein phosphatase 1 and complementary results suggest a role of this domain in the inhibition of actin depolymerization. These data highlight a new molecular mechanism for a LIMK protein and emphasize the interest of studying these proteins to understand their involvement in cognitive disorders and in neurofibromatosis type 1.

Les travaux présentés se sont intéressés à la régulation des forces produites par le cytosquelette d'actine. Le rôle primordial joué par le microenvironnement a été au centre de nos investigations. L'étude de ces phénomènes a nécessité le développement de techniques innovantes. La première permet le contrôle en temps réel de la forme de la cellule. Elle utilise un laser UV pulsé pour modifier le microenvironnement adhésif de la cellule et contrôler les zones disponibles pour son étalement. La seconde est une amélioration d'une technique existante au sein du laboratoire. Il s'agit de produire des îlots de protéines d'adhésions, de forme contrôlée, sur un substrat déformable d'acrylamide. Ces supports permettent le contrôle de la taille de la cellule et de son organisation interne. En outre, l'élasticité de l'acrylamide permet la mesure des forces générées par la cellule. La dernière technique a combiné le patterning sur acrylamide avec l'ablation laser. Les forces produites au sein d'une structure particulière du cytosquelette ont ainsi pu être estimées. Deux grands mécanismes de régulation des forces ont pu être mis en évidence. L'utilisation de techniques de spectrométrie de masse, de mesure de forces et de biologie moléculaire a permis de mettre en évidence la coopération entre les différents types d'intégrines au niveau de l'adhésion cellulaire. Cette coopération permet un couplage entre l'architecture du cytosquelette et la quantité de moteurs moléculaires mettant en tension ces structures. Ces mécanismes sont primordiaux pour l'adaptation de la cellule à la rigidité de son environnement. Ce sont les structures d'actine qui produisent les forces qui seront transmises au niveau des adhésions. La corrélation entre la taille de ces structures et les forces générées est encore mal caractérisée. La relation entre taille des fibres de stress et répartition des forces au sein de la cellule a pu être étudiée et suggère que la force produite par une fibre de stress augmente avec sa longueur. Une étude systématique de la contractilité des cellules, sur des patterns de différentes tailles, a permis de montrer la relation entre la taille des fibres de stress et la force générée. Une relation biphasique a ainsi été mise en évidence. Quand la taille de la cellule augmente, la force générée au sein des fibres de stress commence par augmenter avant de diminuer au delà d'une longueur critique. Cette longueur correspond également à la taille maximale observée sur des cellules libres de s'étaler sans contraintes. Les résultats obtenus suggèrent que cette chute de force est liée à une augmentation excessive du ratio myosine/actine qui ne permet plus une production de force efficace. Le mécanisme pourrait faire intervenir le désassemblage des structures d'actine par la myosine ou la quantité insuffisante d'actine pour permettre un travail efficace des moteurs moléculaires. La rencontre de ces deux mécanismes permet de définir le champ des possibles pour la cellule en terme de contractilité. Le mécanisme de chute de forces observé n'a pas pu être expliqué à ce jour mais nous travaillons activement pour qu'il le soit dans les mois à venir. Ce phénomène aura sans doute un grand rôle à jouer dans l'intégrité mécanique des tissus et les phénomènes de migration. La chute de force au delà de la longueur critique permet en effet de déstabiliser les adhésions et pourrait être à l'origine de la rétraction de la cellule dans la migration ou du détachement d'une cellule de ces voisines dans le cas d'un tissu sous forte contraintes. Ce détachement protégerait ainsi la cellule d'un déchirement sous l'effet de forces trop importantes. / Our work has been focused on the regulation of the forces generated by the actin cytoskeleton. We have more precisely studied the role of the cellular microenvironment in this process. It was necessary to overcome some technical challenges to study these mechanisms. We developed two new techniques. The first one allows for the dynamic control of cell shape. A pulsed UV laser is used to modify the adhesive microenvironment around the cell and to create new area available for cell spreading. The second technique is an improvement of an existing technique from the laboratory. It consists in producing ECM protein islands on a elastic acrylamide substrate. This substrate provides the control of cell shape and internal organization. Plus, the elasticity of the substrate is compatible with traction forces measurements. The last technique combines acrylamide micropatterning and laser ablation of intracellular actin structures. Thus, the forces produced by a particular intracellular structure can be estimated. Two keys mechanisms of force regulation were shown. The use of mass spectrometry, traction force microscopy and molecular biology made it possible to study the interaction between different integrins in the adhesion complex. Cooperation was shown. It allows for the coupling between the architecture of the cytoskeleton and the amount of molecular motors in action. This process is necessary for the adaptation of cell forces to substrate stiffness. Actin structures are the one responsible for force production. This force can then be transmitted to the environment through adhesions.. The link between the length of actin fibers and the force produced was more precisely studied. The results showed a correlation between stress fibers length and the force generated inside it. This was true only above a certain critical value. After that, the force was rather decreasing with increasing fiber length. This critical length corresponds to the maximal length of cell axis on infinite 2D substrate. Our main hypothesis is that a too high myosin/actin ratio will block the proper force production/transmission within the fiber. Disassembly of actin by myosin or limited pool of actin are the two explanations we are currently following. The combination of these two-regulation process put brakes on force production by the cell. Above a certain length, the force produced is decreasing. This decreases in turn the strength of the adhesions anchored to these fibers. This will destabilize the adhesions and causes cell retraction The interplay between the regulation by the adhesion and the production of forces within the fiber set some limits on the level of forces produced by the cell. These processes are likely to be modified in a pathological context and can lead to tumor formation. They also protect the cell from being destroyed by stretching. If the length/stretch is too high, the cell will decrease its forces and detach from neighboring cells. This provide a system protecting the cell from being destroyed by massive deformations within the body