Le cytosquelette d’actine régule la forme de la cellule au cours du temps. Pour lecomprendre, il faut étudier les mécanismes moléculaires qui le constituent. In vivo,ces mécanismes sont masqués par la complexité du vivant. Si nous parvenons àreproduire pièce par pièce le cytosquelette d’actine in vitro et si nous pouvons lecontrôler, aussi bien dans l’espace et dans le temps, alors nous pourrons élucider lessecrets de son fonctionnement. Cette thèse montre que nous avons maintenantdéveloppé la technologie qui nous permet de le faire pour certaines architectures ducytosquelette d’actine.Nous avons développé de nouvelles méthodes de « micropatterning » pour contrôlerla nucléation des monomères d’actine dans l’espace en deux dimensions. Ceci nous aamenés à la reconstitution et au guidage de réseaux de filaments d’actine parallèles àpolarité identique et à la reconstitution de l’anneau de cytocinèse.J’ai crée une puce microfluidique innovante pour contrôler la compositionbiochimique des systèmes d’actine reconstitués au cours du temps. Ceci nous a permisde contrôler la cinétique de polymérisation du filament d’actine individuel libre, et decontrôler la séquence d’intervention des protéines sur les réseaux de filamentsd’actine parallèles à polarité identique.Enfin, nous avons utilisé cette même puce microfluidique pour étudier ladifférentiation des cellules souches hématopoïétiques. / Actin cytoskeleton regulate cell shape over time. To understand that, we have to studymolecular mechanisms that constitute actin cytoskeleton. In vivo, those mechanismsare hidden by cellular complexity. If we achieve to reproduce piece by piece actincytoskeleton in vitro and if we can control it in space and time, then we are able toelucidate the secrets of it operate. This thesis show that we have developed thetechnology that allow us to do it for a few actin cytoskeleton architectures.We have developed new micro-patterning methods to control actin monomersnucleation into two-dimensional space. This led us to the reconstitution and guidanceof parallel actin filament networks with same polarity and allowed us to reconstituteactin contractil ring.I created an innovating microfluidic chip to control biochemical composition ofreconstituted actin systems over time. This allowed us to control kinetics of freeindividual actin filament polymerisation and to control the intervention sequence ofproteins on parallel actin filament networks.Finaly, we used the microfluidic chip to study hematopoïetic stem cellsdifferentiation.

La contractilité cellulaire, un phénomène orchestrée par le système d'actomyosine, est un régulateur critique d'une large gamme de processus cellulaires, y compris l'établissement de la polarité cellulaire, la migration cellulaire, l'intégrité des tissus au cours de la morphogenèse ou du développement. Une simple perturbation de la génération de la force et des propriétés mécaniques des cellules peut affecter leurs fonctions physiologiques et par conséquent peut conduire à des défauts pathologiques y compris le cancer.Cependant, les mécanismes qui contrôlent la production de la force par le système acto-myosine et leurs modes de régulation dans les cellules ne sont pas pleinement compris. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé un système biomimétique fait d'un ensemble minimal de protéines purifiées pour étudier les propriétés contractiles du système actomyosin.L'objectif était de comprendre comment l'architecture des filaments d'actine peut modifier la réponse contractile. A cet effet, j'étais d'abord intéressée par la construction d'une variété d'organisation de l'actine qui servira après comme substrat pour les moteurs moléculaires (la myosine) lors de la contraction.Afin de comprendre les principes généraux qui dictent l'assemblage de l'actine, nous avons développé un modèle numérique qui nous a permis d'identifier les paramètres clés, y compris l'interaction entre les filaments d'actine, les propriétés mécaniques de ces filaments et l'activation par contact entre une région de nucléation et les filaments d'actine qui poussent à partir d'un motif adjacent. Ce modèle a été utilisé en premier lieu pour implémenter les propriétés reliées à l'actine et en second lieu pour évaluer la réponse contractile des structures d'actine induite par la myosine.Durant ma thèse, j'ai pu démontrer que le niveau de connectivité module la déformation du réseau d'actine induite par la myosine, selon leur architecture. J'ai montré aussi que les protéines de pontages des filaments d'actine sont nécessaires pour effectuer une déformation et générer des forces au niveau des réseaux d'actine dynamiques en présence de la myosine. De plus, nous avons développé les simulations numériques dans le but de relier la déformation macroscopique des structures d'actines due à la myosine avec le mécanisme microscopique sous-jacent.Ce travail a révélé comment la variété des réseaux d'actine contracte d'une façon différente même en respectant les mêmes conditions biochimiques et a démontré l'importance de l'effet du réarrangement dynamique des structures d'actine sur la modulation de sa contractilité. / Cellular contractility – the internal generation of force by a cell orchestrated by theactomyosin machinery – is a critical regulator of a wide range of cellular processes includingthe establishment of cell polarity, cell migration, tissue integrity or morphogenesis duringdevelopment. Disruptions of the force generation and of mechanical properties of living cellsaffect their physiological functions and consequently can lead to pathological defectsincluding cancer. However, the parameters or mechanisms that drive force production by theactin-myosin system and their mode of regulation in cells are not fully understood. During myPhD, I used biomimetic system made of a minimum set of proteins to study the properties ofactomyosin contractile systems. The goal was to understand how/if the actin architecture canmediate the contractile response. For this purpose, I was first interested in building a varietyof actin organization that will serve next as substrate for myosin during contraction. Tounderstand the general principles that dictate geometrically-controlled actin assembly, wedeveloped a model that allowed us to identify key parameters including filaments/filamentsinteraction, filament mechanical property and contact activation between actin filamentsgrowing from the adjacent pattern and the nucleation area. These actin templates were usedthen to evaluate the response of oriented actin structures to myosin-induced contractility. Idemonstrated that crosslinking level modulates the myosin-induced deformation of actinnetworks according to their architecture. I showed also that crosslinkers are necessary tosustain myosin-driven deformation and force production of dynamic actin networks. Inaddition, we developed numerical simulation in order to relate the observed myosin-drivenactin deformation with the underlying microscopic mechanism. This work revealed howdiverse cellular actin networks contract differently to a define set of biochemical conditionsand hence how dynamic rearrangements can modulate network contractility

Le PI(4,5)P2 est un des principaux régulateurs de la dynamique de l'actine. Entre autres, ce lipide active de multiples complexes impliqués directement dans la polymérisation de l'actine. Comprendre comment est régulée la concentration locale de PI(4,5)P2 dans le temps et l'espace est à cet égard un enjeu biologique important. L'hydrolyse du PI(4,5)P2 est cruciale pour le trafic endosomal et dépend essentiellement de la phosphatase OCRL dans les cellules non-neuronales. Cependant, le mécanisme qui permet le recrutement de cette enzyme sur les vésicules recouvertes de clathrine, précisément après leur scission de la membrane plasmique, est encore méconnu. Nous avons montré que la GTPase Rab35 recrute directement la phosphatase OCRL immédiatement après la scission de la vésicule recouverte de clathrine. De plus, la déplétion de Rab35 ou d'OCRL entraîne l'accumulation de récepteurs internalisés, tels que le CI-MPR, sur des endosomes à la périphérie de la cellule. Ces endosomes, alors anormalement associés à la clathrine, présentent également une accumulation de protéines liées au PI(4,5)P2 (telles que AP-2) ou à l'actine (telles que cortactine ou Arp2/3). Nous avons par ailleurs observé que le recrutement de Rab35 sur les vésicules recouvertes de clathrine suit rapidement le recrutement de DENND1A, la protéine GEF de Rab35 et la disparition d'EPI64B, la GAP de Rab35. Nos résultats montrent que l'activation spatiale et temporelle précise de la GTPase Rab35 déclenche le recrutement de la protéine OCRL sur les endosomes nouvellement formés pour contrôler les niveaux de PI(4,5)P2 et d'actine, et permettre un trafic intracellulaire normal à partir de ces endosomes. / PI(4,5)P2 is one of the major regulators of actin dynamics. This lipid activates numerous complexes that are directly involved in actin polymerisation. Therefore, it is a major biological issue to understand how the local concentration of PI(4,5)P2 is regulated in time and space. The hydrolysis of PI(4,5)P2 is crucial for endosomal trafficking and principally depends on the phosphatase OCRL in non-neuronal cells. However, this enzyme is recruited on clathrin-coated vesicles right after their separation from the plasma membrane but the underlying mechanism remained unanswered so far. During my thesis, I have shown that the GTPase Rab35 recruits a phosphatase, OCRL, straight after the separation of the clathrin-coated vesicle from the plasma membrane. The depletion of Rab35 or OCRL leads to an accumulation of internalised receptors such as CI-MPR on peripheral endosomes. These endosomes are abnormally associated with clathrin and also present an accumulation of proteins linked to PI(4,5)P2 (such as AP-2) or to actin (such as cortactin or Arp2/3). Moreover, we observed that the recruitment of Rab35 on clathrin-coated vesicles quickly follows the recruitment of DENND1A, the GEF of Rab35, and the disappearance of EPI64B, the GAP of Rab35. Our results reveal that the precise spatial and temporal activation of GTPase Rab35 triggers the recruitment of the protein OCRL on newly formed endosomes to control the levels of PI(4,5)P2 and actin thus enabling normal intracellular trafficking from these endosomes.

La dissémination des cellules cancéreuses et la formation de métastases sont des étapes cruciales dans la progression tumorale et constituent une cause majeure des décès dus au cancer. La métalloprotéase transmembranaire MT1-MMP est un acteur clé impliqué dans le franchissement des barrières tissulaires et le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) par les cellules cancéreuses. MT1-MMP est présente dans des vésicules intracellulaires, appelées endosomes, via lesquels elle est adressée à la membrane plasmique (PM) afin d'y dégrader la ECM. Des travaux menés au laboratoire ont identifié le complexe exocyste (CE) comme un acteur important pour la formation d'invadopodes dans la lignée d'adénocarcinome mammaire MDA-MB-231. Ce complexe multiprotéique (Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 et Exo84) est impliqué dans l'arrimage des vésicules intracellulaires à la PM. Des cribles double-hybride ont identifiés la protéine WASH comme partenaire potentiel du CE (via les sous-unités Exo84 et Sec3). WASH est capable d'induire la polymérisation de l'actine en activant le complexe Arp2/3. In vitro, nous avons montré que les complexes WASH et exocyste interagissent physiquement et coordonnent le trafic intracellulaire et l'adressage de MT1-MMP à la PM. Ces résultats mettent en évidence une étroite collaboration entre le cytosquelette d'actine et les mécanismes d'exocytose lors des étapes précoces de dégradation de la ECM ainsi que dans l'invasion tumorale. / Cancer cell invasion is a prerequisite to tumor progression and metastasis. In order to disseminate, tumor cells must degrade and remodel the extracellular matrix (ECM) in a process that requires the trans-membrane matrix metalloproteinase MT1-MMP, which is a key component of the ECM remodeling apparatus of cancer cells. MT1-MMP overexpression in cancers is associated with increased invasion and metastasis. Many cellular proteins are involved in the transport and delivery of MT1-MMP-containing vesicles to the PM. Previous work from the laboratory identified the exocyst complex (EC) as a key component required for matrix proteolysis and invasion of cancer cells. This multiprotein complex (Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 and Exo84) plays essential roles in docking secretory vesicles at the PM for exocytosis. To better characterize this complex, a yeast two-hybrid screen was performed, identifying the protein WASH as a potential partner of Exo84 and Sec3. WASH is a Nucleation Promoting Factor (NPF) able to activate the actin nucleating Arp2/3 complex. Results of the present study showed that WASH and the exocyst complexes interact and localize on MT1-MMP-positive endosomes in MDA-MB-231 breast cancer cells. This study highlight a direct implication of WASH and exocyst complex in ECM degradation by cancer cells through the docking and exocytosis of MT1-MMP-containing endosomes at the PM through connections between these compartments and the extracellular medium. This WASH- and exocyst-dependent MT1-MMP exocytosis mechanism is required for degradation of adjacent tissue by cancer cells during tumour cell invasion.

Chez Saccharomyces cerevisiae, le cytosquelette d'actine est formé de câbles d'actine et de granules corticaux. La surexpression d'ARF3 dans trois souches présentant un défaut soit dans la formation des câbles soit dans l'organisation des granules corticaux a entraîné une correction de leurs phénotypes. Ces résultats suggèrent un rôle pour Arf3p dans la formation et/ou l'organisation de ces deux structures. La mutagenèse dirigée a permis de démontrer que la myristoylation d'Arf3p est nécessaire à son activité. La localisation spécifique d'Arf3p est dépendante des protéines Bni1p, Drs2p, Gea1p et Gea2p qui ont un rôle dans l'organisation du cytosquelette d'actine. De plus, ARF3 démontre une interaction génétique avec GEA2 et la surexpression de GEA2 et de la région fonctionnelle de BNI1 corrigent le bourgeonnement aléatoire d'arf3?. Ces résultats indiquent un rôle important pour Arf3p dans l'organisation du cytosquelette d'actine ainsi qu'un lien entre cette protéine et plusieurs autres impliquées dans cette structure.

La métastase est la cause principale de décès chez les individus atteints de tumeurs solides. Lors d'un criblage pan-génomique d’ARN interférence, 22 gènes candidats suppresseurs de métastase ont été identifiés (Gobeil et al., 2008). Parmi ceux-ci, le gène de la cathepsine O (Ctso) et celui de l’actine alpha des muscles lisses (Acta2), ont été choisis pour être caractérisés. Les résultats obtenus en faisant des études de perte de fonction par ARN interférence et de gain de fonction via une expression ectopique, suggèrent que Ctso et Acta2 sont impliqués dans l’adhésion et la migration et potentiellement dans la survie/croissance cellulaire ainsi que dans l’invasion des cellules tumorales. De plus, mes résultats démontrent que la protéine Ctso est secrétée par des cellules de mélanome murin, suggérant une fonction extracellulaire. Bien que ces résultats tendent à démonter l’implication de Ctso et Acta2 dans la métastase, d’autres études doivent être accomplies pour approfondir leur rôle.

Les nanotubes de tunnellisation (TNT) sont des structures riches en F-actine qui relient des cellules distantes, permettant le transport de nombreux composants cellulaires (des vésicules, des organites etc.). Les TNT sont impliqués dans des processus cellulaires clés, tels que le développement, l'immunité et la régénération des tissus, mais également dans la transmission de divers agents pathogènes. Plusieurs facteurs moléculaires ont été identifiés pour participer à la formation de la formation de TNT. Le complexe de l'exocyste est l'un des premiers facteurs moléculaires impliqués dans cette formation. Il est impliqué dans l’attachement des vésicules sécrétoires, suggère que les protéines qui régulent le trafic vésiculaire pourraient jouer un rôle dans la formation de TNT. Nous avons émis l'hypothèse que la formation de TNT est modulée par des protéines qui participent à la fois à la régulation du trafic vésiculaire et au remodelage du cytosquelette d'actine, deux processus qui sont essentiels pour la formation de ces structures. Comme les Rab-GTPase sont les principaux régulateurs du trafic vésiculaire et participent à la régulation du cytosquelette d'actine, nous avons examiné le rôle de cette famille de protéines dans la formation de TNT. Tout d'abord, nous avons effectué un criblage de plusieurs protéines de Rab pour son effet sur le transfert de vésicule dépendant de TNT. Nous avons constaté que Rab8a, Rab11a et Rab35 ont un effet positif sur le transfert de vésicule. Surexpression de Rab8a et Rab11a augmentait également le nombre de cellules connectées au TNT. Lors de la surexpression de VAMP3 (une autre protéine impliquée dans le trafic vésiculaire), augmentait du nombre de cellules connectées au TNT. Une analyse plus poussée a montré que les trois protéines (Rab11a, Rab8a et VAMP3), ont un effet sur la formation de TNT de manière cascade. Pour établir une relation entre Rab11a et Rab8a, nous avons vérifié le rôle de Rabin8 sur la formation de TNT (une protéine qui interagit avec Rab11 et qui active Rab8) et nous n’avons observé aucun effet dans la formation de TNT. De plus, nous avons vérifié une autre protéine dont la fonction est similaire à Rabin8, à savoir GRAB (facteur d’échange de nucléotide de guanine-GAP- pour Rab3A) et son rôle dans la formation de TNT. Surexpression de GRAB augmente la formation de TNT, mais qu’elle agit de manière indépendante de Rab11 et Rab8a pour réguler la formation de TNT. L'analyse de Rab35-GTP, impliquée dans le recyclage des endocytes, la cytokinèse et la croissance des neurites, augmente la formation de TNT. La croissance des neurites est nécessaire pour la connectivité neuronale et le recyclage des vésicules joue un rôle crucial dans ce processus. Rab35 interagit avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire, telles que ACAP2 (GAP de ARF6), MICAL-L1 (molécule interagissant avec CasL-like1 et participe dans le recyclage des vésicules) EHD1 (un ciseau moléculaire) qui participe dans la scission de la vésicule). Sur les endosomes positifs pour ARF6, Rab35 recrute ACAP2 et MICAL-L1 et forme un complexe qui se lie à EHD1 pour réguler la croissance des neurites. Nos données suggèrent fortement que ces effecteurs pourraient également être impliqués dans la formation de TNT. Individuellement, ACAP2, EHD1 et ARF6-GDP régulent la formation de TNT de manière positive et MICAL-L1 ne montre aucun effet sur les TNT. En outre, des données préliminaires indiquent que Rab35 et EHD1 agissent dans un mécanisme en cascade pour réguler la formation de TNT, suggérant que la formation de TNT et la croissance des neurites peuvent agir de manière similaire. Les molécules identifiées constituent des cibles moléculaires potentielles pour les thérapies visant à bloquer la propagation d'agents pathogènes transférés à travers les TNT. Cette étude prouve que les protéines jouant un rôle dans le trafic vésiculaire et la croissance des neurites participent également à la formation de TNT. / Tunneling nanotubes (TNTs) are F-actin rich structures that connect distant cells, allowing the transport of many cellular components, including vesicles, organelles and different kind of molecules. TNTs are implicated in key cellular processes, such as development, immunity and tissue regeneration, but also in the transmission of various pathogens. Several molecular factors have been identified to participate in the regulation of TNT formation. One of the early molecular factors that is implicated in TNT formation is the exocyst complex. This complex is also involved in the tethering of secretory vesicles during secretion, which suggest that proteins that regulate vesicle trafficking could have a role in TNT formation. We have hypothesized that the formation of TNTs is modulated by proteins that participate in both, the regulation of vesicle trafficking and the remodelling of the actin cytoskeleton, and that these two processes are key for the formation of these structures. Since Rab GTPases are the major regulators of vesicle trafficking and also participate in actin cytoskeleton regulation, we examined the role of this protein family in TNT formation. First, we performed a screening of several different Rab proteins for its effect on TNT-dependent vesicle transfer. We found that Rab8a, Rab11a and Rab35 have a positive effect on vesicle transfer. Additional studies demonstrated that Rab8a and Rab11a overexpression also increase the number of TNT connected cells. Upon overexpression of VAMP3 (another protein involved in vesicle trafficking), we also observed an increase in the number of TNT connected cells. Further analysis showed that all three proteins, i.e. Rab11a, Rab8a and VAMP3, show an effect on TNT formation in a cascade dependent manner. To establish a relationship between Rab11a and Rab8a, we checked the role of Rabin8 (a protein that interacts with Rab11 and activates Rab8), on TNT formation and we found that it has no role in TNT formation. Additionally, we checked another protein whose function is similar to Rabin8, i.e. GRAB (guanine nucleotide exchange factor for Rab3A) and its role in TNT formation. The results show that GRAB overexpression increases TNT formation, but it acts in a pathway independent of Rab11 and Rab8a to regulate TNT formation. The analysis of Rab35, a protein involved in endocytic recycling, cytokinesis and neurite outgrowth, showed that the GTP-Rab35 bound form also increases TNT formation. Neurite outgrowth is an essential process in order to establish neural connectivity and vesicle recycling plays a crucial role in this process. Rab35 interacts with several proteins, that are involved in vesicle trafficking such as such as ACAP2 (acts as GAP of ARF6), MICAL-L1 (molecule interacting with CasL-like 1, which plays a role in vesicle recycling) EHD1 (a molecular scissor that has a role in vesicle scission). At the ARF6 positive endosomes, Rab35 recruits ACAP2 and MICAL-L1, and forms a complex that binds to EHD1 to regulate neurite outgrowth.Our data strongly suggest that these effectors may also be involved in the formation of TNTs. Individually, ACAP2, EHD1 and ARF6-GDP regulate TNT formation in a positive manner. But MICAL-L1 overexpression in cells shows no effect on TNTs. Also, preliminary data, indicates that Rab35 and EHD1 acts in a cascade mechanism to regulate TNT formation. This indicates that TNT formation and neurite outgrowth may act in a similar, but not exact pathway. The molecules identified here that have a role in TNT formation, constitute potential molecular targets for therapies aiming to block the spreading of pathogens that transfer through TNTs.This study proves that proteins that have a role in vesicle trafficking and neurite outgrowth, such as Rab proteins, are also involved in TNT formation.

L'organisation du cytosquelette d'actine chez Saccharomyces cerevisiae nécessite plusieurs protéines dont la profiline, impliquée dans la polymérisation des filaments d'actine. Les cellules pfy1 [delta] présentent un phénotype anormal; les granules corticaux sont dépolarisés et il y a absence de câbles d'actine visibles. Le gène SYP1 a été identifié en tant que suppresseur de la souche pfy1 [delta]. Nous avons étudié SYP1 dans le but de lui attribuer une fonction cellulaire. La surexpression de SYP1 dans les souches bni1 [delta], cdc10 [delta], chs5 [delta], end3 [delta] et sla2 [delta] provoque un retard important de la croissance tandis qu'elle corrige le défaut de bourgeonnement de la souche arf3 [delta] ainsi que le défaut d'endocytose des souches ede1 [delta], sla1 [delta] et sac6 [delta]. La localisation cellulaire dans des souches mutantes révèle que Syp1p est délocalisée dans les souches bni1 [delta], cdc10 [delta], cdc12-6, chs1 [delta] et cla4 [delta]. Ces résultats nous permettent de conclure que Syp1p joue un rôle dans l'organisation du cytosquelette d'actine ainsi que dans l'endocytose.

Titre de l'écran-titre (visionné le 30 octobre 2023) / Le processus complexe de division des cellules eucaryotes repose en grande partie sur l'organisation et la régulation méticuleuses de divers composants cellulaires, tels que les microtubules et le cortex d'actine. La coordination entre ces deux structures est essentielle au cours de la division cellulaire car un défaut de cette dernière peut conduire à une aneuploïdie. Le rôle des microtubules est central dans la division cellulaire, en particulier lors de la mitose. Lorsque les cellules entrent en mitose, elles subissent un processus de remodelage rapide et dynamique, au cours duquel les microtubules de l'interphase se désassemblent et se réassemblent, à partir des centrosomes, en microtubules plus courts et plus dynamiques. Lorsque la rupture de l'enveloppe nucléaire (NEBD) se produit, ces microtubules s'étendent et atteignent les chromosomes, formant un fuseau bipolaire au centre duquel les chromosomes seront alignés. Une fois les chromosomes alignés correctement, le point de contrôle d'assemblage du fuseau est satisfait et les cellules entrent en anaphase, au cours de laquelle les chromosomes se séparent. L'importance du cytosquelette d'actine au cours de la mitose est largement reconnue. Lors de l'entrée en mitose, les cellules perdent leurs adhésions focales, leurs extrémités se rétractent, elles s'arrondissent et le fuseau mitotique se forme. La mise en place de cette réorganisation cellulaire nécessite l'activation du complexe Cyclin B/CDK1 puis sa relocalisation vers le noyau. La géométrie de l'adhésion cellulaire peut influencer la position du fuseau mitotique et la mémoire des événements cellulaires entre générations, soulignant l'importance du cytosquelette d'actine dans le processus d'entrée en mitose. Alors que les changements dans la dynamique des microtubules et du cytosquelette d'actine lors de l'entrée en mitose semblent indépendant l'un de l'autre, des observations récentes suggèrent qu'il y aurait des interactions entre le fuseau mitotique et le cortex d'actine par l'intermédiaire des GTPases (Matthews et al., 2012). Les GTPAses de la famille RHO sont activées par les facteurs d'échange nucléotidiques (GEFs) en réponse à une pléthore de stimuli extracellulaires, régulant plusieurs réponses cellulaires telles que la prolifération, la différentiation et le mouvement. De nombreux événements de signalisation cellulaire sont contrôlés par les GTPAses de la famille RHO, notamment les changements dans la morphologie cellulaire, l'adhésion, la motilité, la progression du cycle cellulaire, la survie, l'apoptose et la cytokinèse. ARHGEF17, aussi appelé TEM4 (tumor endothelial marker 4), une protéineGEF de la famille RHO, qui est spécifique de RHOA/B/C, est impliquée dans la régulation du cytosquelette interphasique. Il a été démontré que TEM4 se lie directement à l'actine et aux filaments d'actine dynamiques nouvellement assemblés via son extrémité N-terminale, indépendamment de son activité RHOGEF. Dans les cellules en interphase, il est suspecté que TEM4 et RHOC suppriment la contractilité de la myosine et contrôlent le désassemblage des adhésions focales. TEM4 a aussi été identifiée comme une protéine essentielle à la mitose requise pour la localisation du fuseau monopolaire 1 (MPS1) au kinétochore. L'objectif de cette thèse est d'identifier les fonctions de TEM4 au cours du cycle cellulaire. Cette étude met en évidence le manque de spécificité de l'anticorps commercial le plus communément utilisé pour marquer TEM4 et démontre que cette protéine joue un rôle crucial dans l'entrée en mitose, l'alignement des chromosomes et la formation du fuseau mitotique. L'inhibition de l'expression de TEM4 empêche les cellules de s'arrondir et altère l'actine corticale dans les cellules mitotiques, entrainant une augmentation de RHOA actif, comme le montre la quantification de la RHOA-GTP au niveau du cortex mitotique, ce qui confirme sa fonction de régulateur de la contractilité cellulaire. Les phénotypes mitotiques observés en absence de TEM4 sont dus en partie à de faible niveaux de Cyclin B, expliquant le délai mitotique observé. L'expression exogène de Cyclin B rétablit la progression du cycle cellulaire, augmente l'index mitotique et résout l'excès de chromosomes retardés observé en absence de TEM4. Dans l'ensemble, cette étude apporte un nouvel éclairage sur l'importance de TEM4 dans le cycle cellulaire et contribue aux connaissances de son rôle dans les mécanismes cellulaires. / The intricate process of eukaryotic cell division relies heavily on the meticulous organization and regulation of various cellular components, such as the microtubules and the actin-based cortex. Proper coordination between these two structures is essential during cell division, as failure to do so can result in aneuploidy. The role of microtubules is central to cell division, particularly during mitosis. When cells enter mitosis, they undergo a rapid and dynamic remodeling process, during which the interphase microtubules disassemble and give rise to shorter, more dynamic microtubules emanating from centrosomes. Once Nuclear Envelope Breakdown (NEBD) occurs, these microtubules extend and reach the chromosomes, forming a bipolar spindle in the midzone of which captured chromosomes will align. Upon achieving proper orientation and satisfying the spindle assembly checkpoint, cells enter anaphase, during which the chromosomes separate. The importance of the actin cytoskeleton during the process of mitosis is widely recognized. Mitotic entry is characterized by the retraction of the cell margin, followed by the rounding up of the cell and the formation of the mitotic spindle. CDK1-Cyclin B activation and subsequent translocation into the nucleus are required for this process to occur. Upon activation of the complex and its translocation to the nucleus, there is a loss of cellular adhesion, followed by cell rounding up, culminating in mitotic entry. The geometry of cell adhesion can also impact the position of the mitotic spindle and the memory of cellular events between cell generations, highlighting the significance of the actin cytoskeleton to the mitotic entry process. While changes in the dynamics of the microtubule and actin cytoskeletons at the onset of mitosis appear to occur independently, recent evidence suggests that there may be crosstalk between the mitotic spindle and the actin cortex through GTPases (Matthews et al., 2012). RHO family GTPases are activated by guanine nucleotide-exchange factors (GEFs) in response to a plethora of extracellular stimuli, regulating several cellular responses, such as proliferation, differentiation, and movement. Among the numerous signaling events driven by RHO family GTPases are changes in cell morphology, adhesion, motility, cell cycle progression, survival, apoptosis, and cytokinesis. ARHGEF17, also called TEM4 (tumor endothelial marker 4), a RHO family GEF specific for RHOA/B/C, has been shown to regulate the interphase cytoskeleton. TEM4 has been shown to directly bind actin, specifically dynamic newly assembled actin filaments, via its N-terminus independently of its RHOGEF activity. In interphase cells, TEM4 and RHOC are proposed to suppress myosin contractility and to control focal adhesion disassembly. TEM4 has also been identified as an essential mitotic protein required for the localization of Monopolar Spindle 1 (MPS1) at the kinetochore. This thesis aims to understand the functions of TEM4 during the cell cycle. This study highlights the lack of specificity of the most commonly used commercial antibody against TEM4 and provides evidence that TEM4 plays a crucial role in mitotic entry, chromosome alignment, and spindle formation. The downregulation of TEM4 prevents cells from rounding up and alters cortical actin in mitotic cells, leading to an increased activation of RHOA, as shown by quantification of RHOA-GTP at the mitotic cortex, confirming its function as a regulator of cellular contractility. The mitotic phenotypes observed in the absence of TEM4 are found to be partially due to low levels of Cyclin B, explaining the observed mitotic delay. The expression of exogenous Cyclin B restores cell cycle progression, increases the mitotic index, and rescues the excessively lagging chromosomes observed in the absence of TEM4. Overall, despite the limited literature available on TEM4, this study sheds new light on the importance of TEM4 in the cell cycle and contributes to our understanding of this protein's role in cellular processes.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La mort cellulaire programmée assure l'élimination des cellules représentant une menace pour l'organisme. Des lésions génétiques permettant de résister à la mort par apoptose contribuent à la progression tumorale et à la résistance aux thérapies anticancéreuses classiques. Les travaux présentés dans cette thèse visent une meilleure compréhension des programmes alternatifs de mort cellulaire agissant efficacement dans les cellules tumorales. La protéine E4orf4 de l'adénovirus active un tel programme indépendant de p53 et de l'activité des caspases. Des données suggèrent que E4orf4 redirige l'activité oncogénique de Src vers la réorganisation de l'actine au détriment des voies de survie cellulaire. L'objectif de cette thèse est d'étudier la contribution de la dynamique de l'actine dans la mort cellulaire induite par E4orf4. Les résultats indiquent que E4orf4 induit deux programmes alternatifs de mort cellulaire selon sa localisation dans les cellules transformées. E4orf4 induit un programme indépendant de Src à partir du noyau et un programme dépendant de Src et de l'activité des calpaïnes à partir d'un compartiment membranaire. Une étude approfondie du programme dépendant de Src a révélé que la translocation de E4orf4 dans le cytoplasme et les membranes active la myosine II et stimule une nouvelle polymérisation de l'actine, laquelle est associée avec le recrutement et l'ancrage des endosomes de recyclage dans une région juxtanucléaire. Ce remodelage de l'actine requiert l'association de E4orf4 avec Src et une activation locale des voies de signalisation des petites GTPases RhoA/Rho kinase, Racl et Cdc42/N-Wasp. Certains résultats suggèrent que la présence de E4orf4 dans les radeaux lipidiques pourrait favoriser le recrutement de la machinerie de régulation de l'actine par la production de PIP2. E4orf4 détournerait le trafic endosomal pour permettre l'assemblage d'un anneau contractile juxtanucléaire ancré à la périphérie de la cellule par des fibres de stress. Des résultats solides indiquent que l'activité cytotoxique de E4orf4 relève de son effet sur la dynamique de l'actine. Cette thèse propose qu'un dérèglement de la dynamique de l'actine qui interfère avec le trafic membranaire normal peut déclencher un programme de mort cellulaire alternatif à partir des voies de sécrétion.