Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2005. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 128-153).

Thesis (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2006. / Embargoed. Vita. Bibliography: 106-123.

Thesis (Ph. D.)--Illinois State University, 1994. / Title from title page screen, viewed March 21, 2006. Dissertation Committee: H. Tak Cheung (chair), Herman E. Brockman, Lynne A. Lucher, Philip D. Morse, Anthony J. Otsuka. Includes bibliographical references (leaves 101-111) and abstract. Also available in print.

Thesis (Ph. D.)--Chemical and Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology, 2006. / Dr. Peter A. Lane, Committee Member ; Dr. Larry V. McIntire, Committee Member ; Dr. Ronald W. Rousseau, Committee Member ; Dr. James R. Eckman, Committee Member ; Dr. Timothy M. Wick, Committee Chair.

Thesis (Ph.D.)--Uniformed Services University of the Health Sciences, 2006 / Typescript (photocopy)

IntroduÃÃo â AlteraÃÃes na expressÃo ou funÃÃo das molÃculas de adesÃo (MA) nas cÃlulas leucÃmicas podem contribuir para a evoluÃÃo e no comportamento biolÃgico das leucemias agudas. A expressÃo aumentada nas LLAs parece relacionar-se aos mecanismos de disseminaÃÃo extramedular dos linfoblastos, infiltraÃÃo do SNC e formaÃÃo de massas tumorais. Objetivos â Analisar a expressÃo da L-selectina e do CD44 nas LLAs em crianÃas e adolescentes. Avaliar os fatores prognÃsticos (idade, sexo, leucometria ao diagnÃstico, imunofenÃtipo, classificaÃÃo FAB, EGIL, Ãndice de DNA e resposta ao tratamento de induÃÃo) e as apresentaÃÃes extramedulares das LLAs e correlacionÃ-los com essas MA. Pacientes e MÃtodos â Foram avaliados 76 pacientes com LLA, tratados com o Protocolo GBTLI-LLA. O diagnÃstico foi baseado em critÃrios FAB, imunofenotÃpicos (EGIL) e citogenÃticos. A expressÃo das MA foi avaliada por citometria de fluxo, utilizando tripla marcaÃÃo. O anticorpo monoclonal CD45-PerCP (ImmunotechÂ) foi utlizado como marcador dos linfoblastos. O CD44-PE (Clone HP2/9 - ImmunostepÂ) e o CD62L-FITC (Clone HI62L - ImmunostepÂ) foram utilizados para a marcaÃÃo das MA. Para a anÃlise das amostras e o cÃlculo da intensidade mÃdia de fluorescÃncia foi utilizado o programa Cell Quest. Na anÃlise estatÃstica utilizou-se o software SPSS 16.0. A associaÃÃo entre as variÃveis, os fatores prognÃsticos e resposta foi realizada com os testes de Qui-quadrado, exato de Fisher e Mann-Whitney. Sobrevida global foi determinada por curvas Kaplan-Meier e teste log-rank. AnÃlise multivariada por modelo proporcional de Cox foi utilizada para assegurar a independÃncia dos fatores prognÃsticos. Resultados â A mÃdia de idade foi 6,3Â0,5 anos (5m -17a) e predominou o sexo masculino (65%). Ao diagnÃstico os achados clÃnicos foram: hepatomegalia (63%), esplenomegalia (58%) e linfadenomegalia (44%). A infiltraÃÃo SNC ocorreu em 6,6% dos casos e o alargamento de mediastino em 11,8%. Quanto ao risco, 54% eram baixo risco e 46% alto risco. A classificaÃÃo FAB determinou 83% como L1 e 17% L2. DiagnÃstico de LLA-B foi mais frequente (89,5%) e o da LLA-T em 10,5% dos pacientes. O subtipo EGIL mais prevalente foi B II e B III, 51,5% e 45% respectivamente. O IDNA &#8805; 1.16 foi encontrado em 19% dos pacientes e associou-se a bom prognÃstico. Na avaliaÃÃo do D8, 95% dos pacientes apresentaram contagem de blastos <1000/mm3 e leucÃcitos < 5.000/mm3. A taxa de remissÃo de induÃÃo foi de 95% e ocorreram 2,6% de Ãbitos na induÃÃo. Observou-se uma maior expressÃo do CD44 na LLA-T (87,5%/ IMF=150,44Â20,29), porÃm sem significÃncia estatÃstica. LLAs com massa tumoral apresentaram 84% de expressÃo do CD44, quando comparada a 52% das LLAs sem massa tumoral (p=0.01; OR=4,8). ExpressÃo aumentada da L-selectina na LLA-T (87,5%/IMF=272,33Â52,72) foi estatisticamente significante (p=0,004), comparado a LLA-B (54,5%/ IMF= 115,90Â12,75). NÃo houve correlaÃÃo entre os outros fatores prognÃsticos e essas MA. Na anÃlise multivariada as variÃveis de maior impacto para a sobrevida foram: a leucometria ao diagnÃstico, sexo, imunofenÃtipo T e a L-selectina. ConclusÃo â A expressÃo da L-selectina e do CD44 estÃo aumentadas nas LLAs estudadas, principalmente na LLA-T. O CD44 correlacionou-se com LLAs com massas tumorais e parece estar relacionado aos mecanismos de disseminaÃÃo extramedular dos linfoblastos / Introduction â Altered expression or function of adhesion molecules on leukemic blasts may contribute to the evolution of acute leukemia and its biological behavior. The elevated expression of adhesion molecules in ALL might be correlated with the extramedullary dissemination of blast cells, CNS involvement and leukemia tumor burden. Purpose â To analyze the expression of L-selectin and CD44 in ALL in children and adolescents. As well as to evaluate the prognostic factors (age, gender, initial leukocyte count, immunophenotype, FAB and EGIL classification, DNA index and early response to treatment) and the extramedullary presentation of ALL, to finally correlate the prognostic factors with these adhesion molecules. Patients and Methods â From November 2007 to November 2008, 76 patients with newly diagnosed ALL started on Brazilian GBTLI-ALL Protocol. The diagnosis was based on cytological, immunophenotypic, and cytogenetic methods. The mean fluorescence intensity (MFI) and the percentage of the adhesion molecules blasts cells was measured by flow cytometry using triple staining with McAb directly conjugated. CD45-PerCP positive cells were gated for blasts analysis. Anti-CD44-PE (Clone HP2/9 - ImmunostepÂ) and CD62L-FITC (Clone HI62L - ImmunostepÂ) were used to mark the adhesion molecules. The Cell Quest program was used for data acquisition and analysis. Statistical analysis was done by SPSS 16.0 Software. The association of features, prognosis and response to treatment was assessed by Chi-square, Fisher exact and Mann-Whitney tests. Overall survival curves were constructed by the Kaplan-Meier method and the log-rank test. Multivariate Cox regression analysis showed independent prognostic factors. Results â The mean age at diagnosis was 6.3Â0.5 years (range 9mo to 17yr) and 65% of them were boys. Clinical findings were hepatomegaly (63%), splenomegaly (58%), lymphadenopathy (44%). CNS involvement was detected in 6.6% of cases and mediastinal mass appeared in 11.8% of them. Patients were classified into low risk (54%) and high risk (46%). FAB classification identified 83% as L1 and 17% as L2. Immunophenotypically, 89.5% of patients were classified as B-lineage ALL and 10.5% as T-lineage ALL. The most frequent EGIL subtype was B common and pre-B-ALL (51.5% and 45.5%, respectively). DNA index greater than 1.16 was found in 19% of the patients and was associated with favorable prognosis. On the D8 evaluation, 95% of the patients had blast count lower than 1.000/mm3 and leukocyte count lower than 5.000/mm3. The remission induction rate was 95% and there was a rate of 2.6% of death during induction therapy. CD44 had greater expression to the rate of 87.5% in T-cell ALL (MFI=150.44Â20.29) with no statistical correlation. A significant positive correlation was demonstrated between 84% of CD44 expression and Leukemia burden tumor cases (p=0.01; OR=4.8). There was statistical correlation between L-selectin expression (87.5%/MFI=272.33Â52.72) and T-cell ALL (p=0,004). No significant correlation was detected between L-selectin and CD44 expression and other prognostic factors. Multivariate statistical analysis (adjusted for overall survival) indicated that initial leukocyte count, gender, T immunophenotype and L-selectin were independent factors. Conclusion â L-selectin and CD44 expressions were elevated in ALL studied, mainly in T-cell ALL. The research demonstrated that there is an association between CD44 expression and leukemia tumor burden, which might be involved in the dissemination of leukemic cells and the progression of the disease.

Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:35:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dominical_VeninaMarcela_M.pdf: 1517777 bytes, checksum: 002cdb44469c81ccafe110267d001ff0 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica, autoimune e sistêmica, caracterizada por ser uma poliartrite simétrica, acometendo preferencialmente os punhos, mãos e pés. O processo patológico que explique a AR ainda permanece desconhecido. A indução da resposta imune, característica da doença, resulta de uma inflamação nas articulações através da infiltração de células inflamatórias que são recrutadas para o tecido sinovial, onde elas aderem às células endoteliais e transmigram através da subcamada sinovial, formando complexos que produzirão citocinas inflamatórias, contribuindo para a hiperplasia da camada sinovial e estimulando a produção de mais citocinas e enzimas capazes de degradar a matriz óssea, provocando a destruição das articulações afetadas. No líquido sinovial, os neutrófilos são o principal tipo celular, atraídos para as articulações inflamadas por quimioatraentes como LTB4, C5a, IL-8 e TGF-?, e expostos a uma variedade de citocinas locais pró-inflamatórias como IL-1?, TNF-?, GM-CSF, IL-6 e IL-18. Estudos demonstraram que os neutrófilos têm papel indutor na geração de inflamação e esforços visando compreender os mecanismos exercidos pelos neutrófilos nesta doença podem ser um ponto chave para intervenções farmacológicas, promovendo a melhora dos sintomas e gravidade da doença. Diante disso, este estudo objetivou avaliar as propriedades adesivas e quimiotáticas de neutrófilos de pacientes com AR (com atividade e em remissão da doença) e verificar a influência das diferentes medicações utilizadas atualmente no tratamento da AR quanto a estas propriedades. Cento e vinte e três pacientes com artrite reumatoide em estado ativo ou de remissão da doença foram inclusos no estudo e divididos em três grupos: pacientes não tratados com drogas direcionadas para a AR (AR nt), pacientes tratados com drogas modificadoras da doença (AR dm) e pacientes tratados com agentes biológicos (AR ab); os indivíduos sem a doença foram nossos controles (Con). Os neutrófilos foram separados do sangue periférico e realizados ensaios de adesão estática e de quimiotaxia celular, ambos in vitro. Foi verificada a expressão gênica e de superfície de algumas proteínas envolvidas no processo adesivo. Além disso, foram quantificadas no soro e líquido sinovial destes pacientes, quimiocinas envolvidas no recrutamento de neutrófilos e a L-selectina - molécula de adesão expressa em leucócitos. Os neutrófilos da circulação periférica de pacientes com AR em atividade da doença não apresentaram alterações quanto às propriedades adesivas em relação a indivíduos saudáveis. Ainda, neutrófilos de pacientes em terapia com agentes biológicos apresentaram aumento das propriedades migratórias comparados a pacientes AR sem tratamento. Interessantemente, os neutrófilos de pacientes com AR em remissão da doença apresentaram redução da capacidade adesiva e migratória dos neutrófilos quando na ausência de estímulo por IL-8. Apesar disso, não observamos diferenças quanto à adesão e à migração destes neutrófilos quando estimulados por esta citocina. O líquido sinovial de pacientes com AR em atividade da doença possui alto potencial quimiotático frente a neutrófilos e foram encontrados níveis elevados de IL-8 e ENA-78 tanto neste fluído, como também no sangue periférico. Há aumento da expressão gênica de L-selectina em neutrófilos de pacientes com AR em atividade da doença, mas curiosamente, não encontramos diferenças quanto à expressão desta molécula na superfície dos neutrófilos ou a sua presença no soro. Em destaque, observamos redução significativa de expressão na superfície neutrofílica de L-selectina e LFA-1 em pacientes em remissão da doença. Esses resultados sugerem que a remissão do quadro inflamatório da AR parece estar associada a alterações significantes nas principais quimiocinas atraentes de neutrófilos na circulação destes indivíduos e que são acompanhadas por modificações funcionais dos neutrófilos. Especulamos se estas características podem participar na melhora do quadro clínico em pacientes com artrite reumatoide / Abstract: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that is autoimmune and systemic, and characterized by a symmetric polyarthritis, affecting mainly the wrists, hands and feet. The pathological process that explains RA remains unknown. The induction of an immune response, characteristic of the disease, results from an inflammation of the joints through the infiltration of inflammatory cells that are recruited to the synovial tissue, where they adhere to endothelial cells and transmigrate through the synovial sublayer, forming complexes that produce inflammatory cytokines. These complexes induce hyperplasia of the synovial layer and stimulate the further production of cytokines and enzymes, leading to the degradation of the bone matrix, and resulting in the destruction of affected joints. In the synovial fluid, neutrophils are the main cell type and are attracted to the inflamed joints by chemoattractants, such as LTB4, C5a, IL-8 and TGF-?, and exposed to a variety of local pro-inflammatory cytokines such as IL-1?, TNF -?, GM-CSF, IL-6 and IL-18. Studies have shown that neutrophils play a role in inducing the generation of inflammation, and efforts to understand the mechanisms deployed by neutrophils in this disease may be a key point for the development of pharmacological interventions to ameliorate symptoms and disease severity. Thus, this study evaluated the chemotactic and adhesive properties of neutrophils in patients with RA and the influence of different drugs, currently used in the treatment of this pathology, on these properties. One hundred and twenty-three patients with active RA or in disease remission were enrolled and divided into three groups; patients not treated with drugs specifically for RA (AR nt), patients treated with disease-modifying antirheumatic drugs (AR dm) and patients treated with biological agents (AR ab); healthy individuals were used as controls (Con). Neutrophils were separated from peripheral blood and static adhesion assays and cell chemotaxis assays were performed in vitro. We verified the gene and surface expression of some proteins involved in the adhesive process. Moreover, chemokines involved in the recruitment of neutrophils and L-selectin, a cellular adhesion molecule expressed in leukocytes, were quantified in the serum and synovial fluid of these patients. Neutrophils from the peripheral blood of RA patients with active disease demonstrated no difference in adhesive properties, compared to healthy subjects. Furthermore, patients on therapy with biological agents had increased migratory properties, compared to patients without specific RA treatment. Interestingly, neutrophils from RA patients in remission of disease presented reduced adhesive and migratory capacity in the absence of stimulus. Nevertheless, no differences were observed in these properties with IL-8 stimulus. The synovial fluid of RA patients with active disease has a high chemotactic potential for neutrophils and presented significantly higher levels of IL-8 and ENA-78 in this fluid, as well as in the peripheral blood. An increased gene expression of L-selectin in RA patients with active disease was observed, but interestingly, we found no differences in surface expression or presence in the serum of this molecule. Of note, a significant decrease in the surface expression of neutrophil L-selectin and LFA-1 was observed in patients in remission of disease. Results suggest that the remission of the RA inflammatory state appears to be associated with significant alterations in major neutrophil-attracting chemokines in the circulation of individuals, contributing possibly, to neutrophils function alteration in these individuals and the consequent amelioration of the disease / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Ibsen Bellini Coimbra / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T21:46:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mara_CristianeSampaiode_D.pdf: 1385801 bytes, checksum: b23144f0f1856aa53731ad5cb632b9bb (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo. O sangue do cordão umbilical contem células tronco mesenquimais (CTM) indiferenciadas que tem potencial condrogênico e podem ser usadas para reparo de lesão articular. Durante o processo de condrogênese, a atuação de fatores de crescimento ainda não está totalmente elucidada. Este estudo teve como objetivo avaliar a formação de condrócitos, matriz cartilaginosa e colágeno tipo II a partir de células do sangue do cordão umbilical humano, expondo-as a quatro diferentes fatores de crescimento: TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 e BMP-6 e cultivando-as em micromass e monolayer. Métodos: Sangue do cordão umbilical foi obtido de gestantes a termo. Células mononucleares foram separadas e colocadas em cultura, para expansão, caracterizadas por citometria de fluxo com anticorpos específicos para CTM e induzidas a diferenciação condrogênica, com TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 e BMP-6 em micromass e monolayer. O fenótipo das células foi avaliado após 21 dias por RT-PCR e Western Blotting para identificação de Colágeno tipo II, Sox-9 e Agrecano. Resultados: As células expandidas foram caracterizadas como mesenquimais. A expressão do mRNA para colágeno tipo II e agrecano foi expresso a partir do 14º dia, nas células estimuladas com TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 e BMP-6. O fator de transcrição SOX-9 foi expresso pelas células estimuladas com TGF-ß3, IGF-1 e BMP-2, o que mostra que estes fatores de crescimento estão associados com a condrogênese de condrócitos articulares, enquanto que a BMP-6 esta associada a condrogênese de condrócitos hipertróficos. No Western Blotting, nós encontramos colágeno tipo II em todos os grupos e a maior expressão foi observada no 14º dia nas células estimuladas com TGF-ß3 em sistema de cultura em micromass. Estes resultados mostram que o TGF-ß3 usado em micromass é o melhor fator de crescimento para promover a diferenciação e proliferação celular das células mesenquimais do sangue do cordão umbilical. Embora mais estudos sejam necessários, este fato nos aproxima de uma alternativa para transplantes autólogos. / Abstract. Umbilical cord blood contains undifferentiated mesenchymal stem cells (MSCs) with chondrogenic potential that may be used for the repair of joint damage. The role of growth factors during the process of chondrogenesis is still not entirely understood. The objective of this study was to evaluate the formation of chondrocytes, cartilaginous matrix and type II collagen from human umbilical cord blood stem cells exposed to four different growth factors, TGF-ß3, IGF-1, BMP-6 and BMP-2, while being cultured as a micromass or a monolayer. Umbilical cord blood was obtained from full-term deliveries, and then mononuclear cells were separated and cultured for expansion. Afterwards, these cells were induced to chondrogenic differentiation in micromass and monolayer cultures supplemented with TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 and BMP-6. Cellular phenotype was evaluated after 7, 14 and 21 d by RT-PCR and western blot analysis to identify type II collagen, Sox- 9 and Aggrecan. The expanded cells displayed surface antigens characteristic of mesenchymal progenitor cells and were negative for hematopoietic differentiation antigens. Type II collagen and aggrecan mRNAs were expressed from day 14 in cells stimulated with TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 or BMP-6. The Sox-9 transcription factor was expressed in cells stimulated with TGF-ß3, IGF-1 and BMP-2, which demonstrates those are associated with chondrogenesis in joint chondrocytes while BMP-6 is associated with the chondrogenesis of hypertrophic chondrocytes. Type II collagen was demonstrated by western blotting in all groups, and the greatest expression was observed 14 d after cells were stimulated with TGF. The results of this study demonstrate that TGF-ß3 used in micromass culture is the best growth factor for promoting the proliferation and differentiation of mesenchymal cells from UCB during chondrogenesis. Although more studies are needed, this approach may provide an alternative to autologous grafting. / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Edson Arantes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:45:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lintomen_Leticia_D.pdf: 1121941 bytes, checksum: 2c92a8ddfce83c01ed6c71e524096e0b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os eosinófilos participam da patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo infecções parasíticas e doenças alérgicas. Dentre as doenças alérgicas, a eosinofilia tem presença marcante na asma. Atualmente, a asma afeta 300 milhões de indivíduos no mundo, sendo considerada um problema de saúde pública mundial. A asma é uma doença inflamatória crônica que envolve interações entre fatores externos e genéticos, e tem como características principais a inflamação pulmonar e a hiperresponsividade brônquica. O recrutamento de eosinófilos para as vias aeríferas contribui para o caráter crônico da asma. A migração de eosinófilos para o tecido inflamado é um processo complexo, que é regulado por numerosos fatores, incluindo citocinas, quimiocinas, óxido nítrico (NO) e interações de moléculas de adesão. Estudos prévios investigaram as interações funcionais entre NO e CC-quimiocinas. Young e colaboradores (1999) mostraram que o número de eosinófilos no lavado broncoalveolar (LBA) de macacos desafiados está marcadamente aumentado 24 horas após o desafio, e que este aumento é acompanhado de altos níveis de NO no ar exalado e de eotaxina no LBA. Em pacientes com rinite, a eotaxina aumentou o número de eosinófilos no fluido do lavado nasal e também os níveis de NO nasal (Hanazawa et al., 1999). Em contraste, em modelos murinos de asma a inibição seletiva da NOS induzível resultou na redução da migração eosinofílica para os pulmões (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), que estava associada com o aumento da expressão da CC-quimiocina proteína quimiotática para monócito-1 (MCP-1) no tecido pulmonar (Trifilieff et al., 2000). Além disso, NO (ou doadores de NO) também são capazes de inibir a produção de RANTES (Frank et al., 2000). O NO via formação de peroxinitrito (ONOO-) também pode reduzir a migração de eosinófilos induzida por eotaxina (Sato et al., 2000). Entretanto, o papel modulatório do NO nas funções do eosinófilo mediadas por CC-quimiocinas ainda permanece contraditório. Portanto, o presente trabalho investigou o efeito modulatório do NO na adesão aumentada, quimiotaxia e desgranulação do eosinófilo induzidas pelas Ccquimiocinas eotaxina e RANTES in vitro, e a expressão de VLA-4 e Mac-1 na superfície do eosinófilo. Nós realizamos ensaios funcionais (adesão e desgranulação), análise da expressão de moléculas de adesão por citometria de fluxo (VLA-4 e Mac-1) e a investigação de resíduos de tirosina nitrada para avaliar interações do NO com CC-quimiocinas em eosinófilos humanos. Os ensaios de MTT mostraram que as incubações de eosinófilos por 2, 3, ou 4 horas com eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não afetam a viabilidade celular e, em determinadas condições, até promovem a ativação das células. Os resultados de adesão à fibronectina mostraram que a eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não aumentam a adesão de eosinófilos em períodos de incubação de 2 e 3 horas. Entretanto, a incubação de eosinófilos por 4 horas com eotaxina ou RANTES aumentou significativamente a adesão à fibronectina. O L-NAME (0.1 mM), individualmente, aumentou significativamente a adesão de eosinófilos à fibronectina; porém a co-incubação de L-NAME com eotaxina (ou RANTES) não afetou a adesão observada com cada agente isoladamente. Além disso, a expressão de VLA-4 e de Mac-1 não foi modificada em nenhuma das condições experimentais testadas. Eotaxina e RANTES também não foram capazes de aumentar os níveis de GMPc nos eosinófilos, em condições onde o SNP (0.1 mM), usado como controle positivo, aumentou significativamente os níveis desse segundo mensageiro. Além disso, eosinófilos tratados com L-NAME, eotaxina e RANTES, individualmente, foram capazes de desgranular estas células, mas a co-incubação de LNAME com eotaxina (ou RANTES), não alterou esta resposta. Os resultados de quimiotaxia mostraram migração significativa de eosinófilos (tratados ou não com LNAME) em resposta à eotaxina ou RANTES. Os resultados obtidos de Western blotting para 3-nitrotirosina mostraram ausência de proteínas nitradas nos eosinófilos de indivíduos sadios ou asmáticos. No conjunto, nossos resultados mostram que, nas condições experimentais estabelecidas, o NO não modula adesão, migração e desgranulação em eosinófilos estimulados com eotaxina ou RANTES / Abstract: Eosinophils participate in the pathogenesis of many inflammatory diseases, including parasitic infections and allergic diseases. Of the allergic diseases, asthma is characterized by eosinophilia. Currently, asthma affects 300 million people in world, and is an important public health problem. Asthma is an inflammatory chronic disease that involves interactions between external and genetic factors, and has lung inflammation and bronchial hyperresponsiveness as major features. The recruitment of eosinophils into airways contributes to the asthma chronic character. The eosinophil migration to inflamed tissue is a complex process regulated by several factors, including cytokines, chemokines, nitric oxide (NO) and adhesion molecule interactions. Previous studies have investigated the functional interactions between NO and CC-chemokines. Young et al. (1999) showed that the number of eosinophils in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of challenged monkeys is markedly increased at 24 h post-challenge, accompanied by higher levels of both exhaled NO and eotaxin in BAL fluid. In rhinitis patients, eotaxin increased the number of eosinophils in the nasal lavage fluid, and that was also accompanied by elevated nasal NO levels (Hanazawa et al., 1999). In contrast, in murine models of asthma, selective inhibition of inducible NOS resulted in a reduction in pulmonary eosinophil migration (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), with an increased expression of the CC-chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the lung tissue (Trifilieff et al., 2000). Moreover, NO (or NO donors) have also been shown to inhibit the production of RANTES (Frank et al., 2000). Nitric oxide via peroxynitrite (ONOO-) formation is reported to reduce eotaxin-induced eosinophil migration (Sato et al., 2000). However, the modulatory role of NO in the CC-chemokines-mediated eosinophil functions is still not well understood. Therefore, the present study was designed to investigate the modulatory effect of NO in the enhanced eosinophil adhesion, chemotaxis and degranulation induced by the Ccchemokines eotaxin and RANTES in vitro, and the expression of VLA-4 and Mac-1 on the eosinophil surface. We therefore carried out functional assays (adhesion and degranulation), flow cytometry analysis of adhesion molecules (VLA-4 and Mac-1 expression) and investigation of tyrosine nitration to evaluate the interactions between NO and CC-chemokines in human eosinophils. MTT assays showed that incubation of eosinophils for 2, 3 or 4 hours with eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not affect cellular viability and, in some conditions, even caused cellular activation. The results of adhesion to fibronectin showed that eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not increase eosinophil adhesion at 2 or 3 hours of incubation. Nevertheless, the incubation of eosinophils for 4 hours with eotaxin or RANTES significantly increased adhesion to fibronectin. L-NAME (0.1 mM), alone, significantly increased eosinophil adhesion to fibronectin; however the co-incubation of L-NAME with eotaxin (or RANTES) did not affect the adhesion of each agent. Moreover, expression of VLA-4 and Mac-1 were not modified by any of the experimental conditions. Eotaxin and RANTES did not increase eosinophil cGMP levels under the same conditions in which SNP (0.1mM), used as a positive control, significantly increased the levels of this second messenger. Furthermore, eosinophils treated with L-NAME, eotaxin and RANTES, alone, demonstrated degranulation, however the co-incubation of eosinophils with L-NAME and eotaxin (or RANTES) did not alter this response. Chemotaxis assays showed a significant eosinophil (treated or not with L-NAME) migration in response to eotaxin or RANTES. Western blotting for 3-nitrotyrosine-3 showed a lack of nitrated proteins in eosinophils from healthy or asthmatic donors. Taken together, results show that, under the experimental conditions established, NO does not modulate adhesion, migration and degranulation in eotaxin or RANTES-stimulated eosinophils / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Objetivo: As moléculas de adesão celular (MAC) são essenciais para a manutenção do fenótipo epitelial. Alguns estudos têm relatado associação entre as alterações de sua expressão e a carcinogênese, mas o seu papel no câncer de próstata não é claro. Nosso objetivo foi estudar o perfil de expressão de E-caderina, cateninas e integrinas em espécimes cirúrgicos de câncer de próstata e associar as suas expressões com a evolução do tumor. Avaliamos também o perfil de expressão em metástases ósseas e linfonodais, a fim de compreender a influência destes marcadores na progressão do câncer de próstata. Materiais e Métodos: Foram selecionados 111 pacientes com câncer de próstata localizado tratados com prostatectomia radical pelo mesmo cirurgião. Sessenta pacientes não apresentaram recidiva tumoral após acompanhamento médio de 123 meses. A expressão das MAC foi avaliada por imuno-histoquímica (IH) em microarranjo tecidual (TMA), contendo duas amostras de cada tumor. Empregamos análise semiquantitativa para avaliação da expressão e determinamos a associação entre a expressão de cada MAC com a recorrência do tumor após a cirurgia. Avaliamos também a expressão das MAC por IH em TMA contendo espécimes de 28 metástases ósseas e em outro TMA contendo 19 metástases linfonodais com seus 19 tumores primários correspondentes. Resultados: Nos tumores primários a análise multivariada mostrou que a expressão das integrinas 3 e 3 1 relaciona-se com recidiva da doença. Quando a expressão de 3 foi forte e a expressão de 3 1 foi positiva, as chances de recorrência foram de 3,0 e 2,5 vezes maior. Apenas 19% e 28% dos pacientes estavam livres de recidiva após seguimento médio de 123 meses, quando os tumores apresentavam forte imunoexpressão de 3 ou positiva para 3 1 respectivamente. Outras integrinas apresentaram expressão reduzida, exceto 6 que foi expressa pela maioria dos tumores primário e metástases. A E-Caderina e as cateninas não mostraram associação com o prognóstico no tumor de próstata localizado. No sítio metastático, houve perda global de expressão das MAC. Encontramos ganho de expressão com a progressão do câncer de próstata somente para a integrina 3 que mostrou forte expressão em metade das metástases ósseas e linfonodais. Encontramos forte expressão de e -catenina foi em 94% dos linfonodos e 45% Conclusões: Nossos experimentos demonstram que a expressão das integrinas 3 e 3 1 está independentemente associada à recidiva de câncer de próstata após prostatectomia radical, e que a perda das moléculas de adesão celular pode ser considerada uma característica da progressão desta neoplasia / Purpose: Cell adhesion molecules (CAM) are essential for the maintenance of epithelial phenotype. Some studies have reported correlations between abnormalities in their expression and carcinogenesis, but their role in prostate cancer is unclear. Our aim was to study the expression profile of E-cadherin, catenins and integrins in surgical specimens of prostate cancer and associate their expression with outcome. We also assessed these expressions in bone and lymph node metastases in order to understand their influence in the progression of prostate cancer. Materials and Methods: We selected 111 patients with localized prostate cancer who underwent radical prostatectomy performed by the same surgeon. Sixty patients had no tumor recurrence after a median follow-up of 123 months. The CAM expression was evaluated by immunohistochemistry in a tissue microarray (TMA) containing two samples of each tumor. A semiquantitative analysis was employed and we measured the association between the expression of CAM and tumor recurrence. We also evaluated CAM expression by immunohistochemistry in a TMA containing 28 bone metastases and in other TMA containing 19 lymph node metastases with their corresponding 19 primary tumors. Results: In primary tumors, multivariate analysis showed that expression of 3 and 31 integrins was related to worse outcome. When 3 expression was strong and 31 expression was positive,the odds of recurrence were 3.0 and 2.5 fold higher. Only 19% and 28% of patients were recurrence-free in a mean follow up period of 123 months, when tumors showed strong 3 or positive 31 immuno-expression respectively. Other integrins have shown reduced expression, except 6 , which was expressed in most primary and metastatic cases. E-cadherin and catenins expressions were not associated with primary tumor outcome. At the metastatic setting, there was a global loss of CAM expression. We observed reliable gain of expression with prostate cancer progression only for integrin 3 that showed strong expression in half of bone and lymph node metastases. Interestingly, strong expression of and -catenin was observed in 94% of lymph node and 45% of bone metastases. Conclusions: We have demonstrated that the expression of integrins 3 and 31 was independently associated with recurrence after radical prostatectomy. In addition, we have shown that the loss of cell adhesion molecules can be considered a characteristic of prostate cancer progression