Os mastócitos (MCs) estão presentes tanto no periodonto normal quanto inflamado, em diferentes quantidades e em vários locais. Nos últimos anos, a eficácia e a contribuição dos MCs em eliminar bactérias, através de sua atividade microbicida intracelular, estão se tornando cada vez mais reconhecidas. Assim, a partir de MCs murinos desafiados in vitro com o periodontopatógeno Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 29523) por 3, 5, 10 e 24 horas, o presente estudo teve como objetivo investigar a capacidade microbicida intracelular de MCs, e comparar com a capacidade microbicida de macrófagos peritoneais murinos (MPs), considerados fagócitos profissionais, por meio da contagem das unidades formadoras de colônias. Além disso, avaliou-se a produção e liberação de mediadores microbicidas, óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H2O2), por meio do método colorimétrico de Griess e pela degradação de substratos fluorescentes, respectivamente. Para a análise estatística, foram utilizados os testes estatísticos ANOVA Fatorial seguido do teste de Tukey e teste de correlação de Pearson (p<0.05). Nossos resultados revelaram que os MCs foram capazes de eliminar eficientemente o periodontopatógeno, principalmente após 10h de desafio intracelular. Comparando-se a atividade microbicida dos dois tipos celulares, verificou-se, nos períodos de 3h e 5h de desafio, um menor percentual de colônias viáveis no interior de MPs, em comparação aos MCs. Inversamente, nos períodos de 10h e 24h, observaram-se menores valores percentuais de colônias intracelulares nos MCs em relação aos MPs. Além disso, a produção/liberação de NO bem como, em menor proporção, de H2O2 pelos MCs foram concordantes com a sua capacidade microbicida. Este é o primeiro estudo que demonstra a eficiente ação microbicida intracelular de MCs murinos contra Aggregatibacter actinomycetemcomitans, com produção e liberação de substâncias potencialmente bactericidas, e de forma mais eficaz que os macrófagos. Esses resultados sugerem a importância dessas células nos mecanismos de defesa presentes na doença periodontal induzida por placa dentobacteriana. / Mast cells (MCs) are present in both normal and inflamed periodontal tissues, in varying amounts and locations. Recently, MCs contribution in eliminating bacteria and its effectiveness, through its intracellular microbicidal activity, have been increasingly recognized. Thus, this study aimed to investigate the intracellular microbicide capacity of MCs, and compare it with the microbicide capacity of murine peritoneal macrophages (MPs), considered professional phagocytes, by counting the colony forming units. Both cell types were challenged in vitro with periodontopathogen Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 29523) by 3, 5, 10 and 24 hours. Additionally, the production and release of microbicidal agents, nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2) were evaluated by means of colorimetric Griess method and by the degradation of fluorescent substrates, respectively. Statistical analysis was performed by ANOVA Factorial test followed by Tukey and Pearson\'s correlation test (p <0.05). Our results revealed that MCs are able to efficiently eliminate periodontopathogen, mainly after 10 hours of intracellular challenge. The microbicidal activity of both cell types, in 3 and 5 hours of challenge showed a lower percentage of viable colonies inside MPs, compared to MCs. Contradictorily, in 10 and 24 hours a lower percentage of intracellular colonies in MCs was observed in relation to MPs. Moreover, the production/release of NO and, in minor proportion, of H2O2 by MCs was in agreement with its microbicidal capacity. Therefore, this is the first report to describe the intracellular microicidal activity of murine MCs against Aggregatibacter actinomycetemcomitans, concerning production and release of potentially bactericidal substances, which is more effective than macrophages. These results suggest the importance of these cells in pathogenesis and defense mechanisms of biofilm-associated periodontal disease.

Este estudo visa determinar o efeito da infecção experimental por patógenos periodontais sobre a prenhez. Periodontite foi induzida com P.gingivalis seguindo acasalamento. Infecção por A.actinomycetemcomitans foi realizada iv em camundongos prenhes. No 16º dia da prenhez, os animais foram sacrificados. O grupo teste com Pg apresentou menor peso e menor peso fetal. Pg foi detectado no grupo teste em fetos(8/27), placentas(9/27) e líquido amniótico(1/9). Não houve diferença em citocinas na gengiva e soro. Os níveis placentários de IL-1&#946;, INF- &#947;, IL-10, GMCSF e IL-12 foram maiores no teste do que no controle. O grupo com Aa apresentou a bactéria em fetos(11/14), placentas(11/14) e líquido amniótico(1/6). Não houve diferença em parâmetros relacionados à prenhez e citocinas séricas entre teste e controle, mas os níveis placentários de TNF-&#945;, IL-4 e IL-6 foram maiores no grupo teste. Os dados sugerem a capacidade de patógenos periodontais ultrapassar a barreira placentária, colonizar e aumentar a produção de mediadores inflamatórios na unidade fetoplacentária. / This study aims to determine the effect of experimental infection by periodontal pathogens on pregnancy. Periodontitis was induced with P. gingivalis following mating. Infection was performed by A.actinomycetemcomitans IV in pregnant mice. On the 16th day of pregnancy, the animals were sacrificed. The test group Pg showed lower weight and reduced fetal weight. Pg was detected in the test group in fetuses (8/27), placentas (9/27) and amniotic fluid (1/9). There was no difference of cytokine in gum and serum. Placental IL-1&#946;, INF-&#947;, IL-10, GM-CSF and IL-12 were higher in the test compared to the control. The Aa group presented bacteria fetuses (11/14), placenta (11/14) and amniotic fluid (1/6). There was no difference in parameters related to pregnancy and serum cytokines between test and control, but the placental levels of TNF-&#945;, IL-4 and IL-6 were higher in the test group. The data suggest the ability of periodontal pathogens overcome the placental barrier, colonize and increase the production of inflammatory mediators in the fetoplacental unit.

OMP29 é uma das principais proteínas de membrana externa de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) e está associada à invasão de célula epitelial gengival (CEG). Os objetivos deste estudo foram: analisar filogeneticamente omp29 e omp29 parálogo (omp29par), em cepas de Aa; determinar a interação de OMP29 com proteínas de matriz extracelular e o efeito da sua interação com CEG, pela avaliação da expressão gênica e produção de mediadores inflamatórios. Variações filogenéticas foram observadas para omp29 e omp29par, bem como para os seus promotores e estas relacionam-se com os sorotipos. A proteína recombinante OMP29his interagiu com fibronectina plasmática e celular (p<0,05), mas não com os domínios F30 e 45 ou com colágenos tipo I, III, IV e V, fibrinogênio, laminina e plasminogênio. A interação das mutantes de Aa deficientes em omp29 e/ou omp29par (obtidas pelo sistema LoxP/Cre) e OMP29his com CEG OBA-09 demonstrou que OMP29 regula positivamente il-18 e negativamente il-6r e il-8 (p<0,05). Os dados sugerem que OMP29 está envolvida na evasão do sistema imune. / OMP29 is one of the major outer membrane proteins of Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) and is associated with invasion into gingival epithelial cells (GEC). This study aimed to evaluate phylogenetically omp29 and omp29 paralogue (omp29par) in Aa strains; determine the interaction of OMP29 with extracellular matrix proteins and its effect on GEC by gene expression analysis and production of inflammatory mediators. Phylogenetic variations were observed for omp29 and omp29par as well as their promoters, and they were related to the serotypes. The recombinant protein OMP29his interacted with plasma and cellular fibronectin (p <0.05), but not to F30 and F45 domains, neither to collagens I, III, IV and V, fibrinogen, laminin and plasminogen. The interaction of Aa mutants defective in omp29 and/or omp29par (obtained by LoxP system/Cre) and OMP29his with CEG OBA-09 indicated that OMP29 regulates positively il-18 and negatively il-6r and il-8 (p <0.05). Data suggested that OMP29 is involved in bacterial evasion of the immune system.

Submitted by Viviane Lima da Cunha (viviane@biblioteca.ufpb.br) on 2017-07-17T13:50:01Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 995552 bytes, checksum: 2e508d438daa1802facd83d5885a5854 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-17T13:50:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 995552 bytes, checksum: 2e508d438daa1802facd83d5885a5854 (MD5) Previous issue date: 2016-01-28 / To determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of terpinen-4-ol and chlorhexidine produce and characterize nanofibers PLA / PEG incorporated with terpinen-4-ol and chlorhexidine as well as quantifying the viability biofilm mobile Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) (ATCC 00078) grown on the surface of this inhibitory fiber. Methodology: The determination of MIC and MBC was performed by broth microdilution; the nanofiber terpinen-4-ol (40%) and chlorhexidine (0.12%) were produced by spinning blow solution (SBS) and characterized by scanning electron microscopy (SEM), thermal gravimetric analysis (TGA), calorimetry differential scanning (DSC) and infrared spectroscopy by Fourier transform (FTIR). The cell was observed by fluorescence quantification and nanofibers incorporated with chlorhexidine served as positive control for this assay. Results: There was an effective antimicrobial activity terpinen-4-ol (MIC and MBC = 25 mg / mL) and chlorhexidine (MIC and MBC <15 mg / mL) on planktonic cells pa PEG acted as a plasticizer resulting in a reduction in the crystallinity of the PLA, increased fiber diameter and lightweight thermal destabilization of the material. The increase in PEG concentration was not decisive for increasing the antimicrobial activity of the fibers but has contributed to formation of a more amorphous material. The terpinen-4-ol fibers showed similar antimicrobial activity to chlorhexidine fibers (p <0.05), and the Terpinen-4-ol fiber with 20% PEG had best performance among your group. Conclusion: The terpinen-4-ol and chlorhexidine had effective antimicrobial activity against A.A and SBS technique was effective in the production of PLA nanofibers / PEG antimicrobial action against A.A having the potential to drive future applications to combat periodontal disease. / Objetivo: Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) do terpinen-4-ol e clorexidina, produzir e caracterizar nanofibras de PLA/PEG incorporadas com terpinen-4-ol e clorexidina, bem como e quantificar a viabilidade celular de biofilme de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.) (ATCC 00078) crescido sobre a superfície inibitória desta fibra. Metodologia: A determinação de CIM e CBM foi realizada por microdiluição em caldo; as nanofibras de terpinen-4-ol (40%) e clorexidina (0,12%) foram produzidas através da fiação por sopro em solução (SBS) e caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), análise termogravimétrica (TGA), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e espectrometria no infravermelho por transformada de Fourrier (FTIR). A quantificação celular foi verificada por fluorescência e as nanofibras incorporadas com a clorexidina serviam de controle positivo para este teste. Resultados: Observou-se uma efetiva atividade antimicrobiana do terpinen-4-ol (CIM e CBM = 25 μg/mL) e da clorexidina (CIM e CBM < 15 μg/mL) sobre células planctônicas de A.a. O PEG agiu como agente plastificante proporcionando redução na cristalinidade do PLA, aumento do diâmetro das fibras e leve desestabilização térmica do material. O aumento da concentração do PEG não foi determinante para o aumento da atividade antimicrobiana das fibras, embora tenha contribuído para formação de um material mais amorfo. As fibras de terpinen-4-ol apresentaram atividade antimicrobiana semelhante às fibras de clorexidina (p<0,05), sendo a fibra Terpinen-4-ol com 20% de PEG a que teve melhor desempenho dentre o seu grupo. Conclusão: O terpinen-4-ol e a clorexidina apresentaram efetiva atividade antimicrobiana sobre A.a e a técnica de SBS foi eficiente na produção de nanofibras de PLA/PEG com ação antimicrobiana frente a A.a tendo potencial para conduzir futuras aplicações no combate às doenças periodontais.

O microrganismo gram-negativo Aggregatibacter actinomycetemcomitans, fortemente associado a quadros de periodontite agressiva, coloniza a cavidade oral, aderindo e invadindo as células epiteliais e participando da formação de biofilme nas superfícies do hospedeiro. A. actinomycetemcomitans expressa Aae, uma proteína de superfície, relacionada com a adesão às células epiteliais. Este estudo avaliou o papel de Aae na adesão a outros substratos tais como proteínas extracelulares colagenosas e não-colagenosas, hidroxiapatita recoberta por saliva (SHA) e na formação de biofilme. Um mutante nulo em aae foi construído e o fenótipo comparado com o da linhagem selvagem (VT1169). O mutante nulo exibiu significativa redução na adesão às células epiteliais e a SHA, na formação de biofilme, além de apresentar-se menos hidrofóbico que a linhagem parental. A capacidade de adesão ao colágeno V e a fibronectina foi fracamente afetada pela interrupção do gene aae. Entretanto, o mutante nulo em aae exibiu uma capacidade diminuída na adesão à laminina e colágenos I, III e IV. Estes dados sugerem que Aae desempenha um importante papel na colonização da cavidade oral, não somente promovendo sua adesão às células epiteliais, mas também a outros substratos. / The gram-negative organism Aggregatibacter actinomycetemcomitans, associated with aggressive periodontitis, colonizes the oral cavity by binding to and invading epithelial cells and by participating in biofilms formed in host surfaces. A. actinomycetemcomitans express Aae, a surface protein, implicated in the adhesion to epithelial cells. This study evaluated the role of Aae in adhesion to other substrates such as collagen and non-collagen extracellular matrix proteins and saliva coated hydroxyapatite (SHA) and in biofilm formation. A null mutant in aae was constructed and its behavior was compared with the wild type strain VT1169. The null mutant exhibited a decreased ability to bind to epithelial cells and to SHA, formed less biofilm and was less hydrophobic than the parental strain. The abilities to bind to collagen V and fibronectin were very poorly affected by aae interruption. However, the null aae mutant exhibited a decreased ability to adhere to laminin, collagen I, III and IV. These data suggest that Aae may play an important role in the colonization of the oral cavity by A. actinomycetemcomitans, not only by promoting its adhesion to epithelial cells, but by mediating adhesion to other substrates.

Orientador: Márcio Zaffalon Casati / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:08:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monteiro_MabelledeFreitas_M.pdf: 1431989 bytes, checksum: 55bf42377e6ffeb3626cb5a8d6551c1c (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O Resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The Abstract is available with the full electronic digital document. / Mestrado / Periodontia / Mestra em Clínica Odontológica

Os tecidos periodontais estão em confronto continuo com microorganismos capazes de disparar mecanismos da resposta imune inata, dando origem ao infiltrado inflamatório. Estudos recentes mostraram a importancia dos receptores do tipo Toll (TLRs) na fase inicial de reconhecimento de diferentes patogenos. A participação de receptores tipo Toll (TLRs) na resposta de neutrófilos e macrófagos frente a periodontopatógenos precisa ser determinada. Nesse estudo procuramos caracterizar o infiltrado inflamatório presente no peritônio de animais deficientes de TLR4-/-, avaliar a atividade fagocítica, bem como a produção de óxido nítrico (NO) e a atividade de mieloperoxidase (MPO) no curso da infecção por Aggregatibacter actinomycetemcomitans. A ausência de TLR4 não influenciou a quimiotaxia de neutrófilos e macrófagos para o local da infecção, a produção de óxido nítrico, a atividade de MPO e a viabilidade celular. No entanto, neutrófilos e macrófagos de animais TLR4-/- apresentaram menor atividade fagocítica quando comparado ao grupo controle (camundongos WT). Em relação a doença periodontal induzida experimentalmente com Aggregatibacter actinomycetemcomitans em camundongos deficientes de TLR4, os resultados mostraram que 100% dos animais deficientes de TLR4 sobreviveram a infecção durante o período de observação. Em relação a análise de perda óssea, os dados revelaram uma menor perda progressiva de osso alveolar na região dos molares de animais deficientes de TLR4. A ausência do receptor interferiu na disseminação da bactéria, uma vez que se observou um grande número de bacilos no linfonodo e baco dos animais que não expressaram TLR4, diferente do observado para os animais selvagens (WT). Os resultados indicam a importância da sinalização via TLR4 durante a resposta imune contra Aggregatibacter actinomycetemcomitans. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans is an oral gram negative bacteria that contributes to periodontitis progression. Isolated antigens from A. actinomycetemcomitans could be activating innate immune cells through Toll-like receptors (TLRs), molecules that recognize structural components conserved among microorganisms. In this study, we evaluated the role of TLR4 in the recognition of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Neutrophils and macrophage from TLR4 deficient mice and WT mice were collected and used for the subsequent assays. The phagocytosis of leukocytes against A. actinomycetemcomitans and the presence of apoptotic cells were determined by flow cytometry. The in vivo and in vitro production of NO and MPO was evaluated 24h after A. actinomycetemcomitans challenge. In addition, we examined the mechanisms that modulate the outcome of A. actinomycetemcomitans-induced periodontal disease in TLR4-/- mice. The results show that inflammatory cells influx in peritoneal cavity of TLR4-/- mice was similar to that observed into their littermate controls. The phagocytic activity was diminished by cells from TLR4-/- mice. In addition, we did not observe difference in NO and MPO production and the frequency of apoptotic cells between cells from TLR4-/- and WT mice. The results showed that TLR4-deficient mice developed less severe periodontitis after A. actinomycetemcomitans infection, characterized by significantly lower bone loss and inflammatory cell migration to periodontal tissues. Together, these data demonstrate the role TLR4 signals for neutrophils activation after A. actinomycetemcomitans infection and development of periodontal disease.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans está associado à etiologia da periodontite agressiva localizada. A colonização de tecidos do hospedeiro é necessária para patogênese e a adesão é fundamental. A proteína autotransportada Aae faz a adesão da bactéria a células epiteliais gengivais. Proteínas autotransportadas de diferentes espécies apresentam múltiplas funções e podem ser antígenos vacinais na prevenção de infecções. Para entender o papel de Aae na ligação ao hospedeiro e efeito de anticorpos contra Aae, o polimorfismo de aae na região que codifica o domínio de ligação a células epiteliais foi determinado e relacionado à adesão a células epiteliais KB . Aae recombinante foi obtida, e a capacidade de ligação a proteínas da matriz extracelular e soro foi determinada em ensaios com a recombinante e com uma amostra deficiente na expressão de Aae obtida (ensaios comparativos com amostra selvagem). Títulos de IgG contra Aae em pacientes com periodontite agressiva e saudáveis foram determinados e relacionados à resposta humoral contra sorotipos de A. actinomycetemcomitans. Por fim, o efeito de anticorpos contra Aae e/ou seu domínio efetor, produzidos em modelo animal, foi determinado na inibição da adesão mediada por Aae e opsonização por fagócitos. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans is related with etiology of localized aggressive periodontitis. Colonization of host tissues is necessary to pathogenesis and adhesion is essential. The autotransporter protein Aae mediates the adhesion of bacteria to gingival epithelial cells. Autotransporter proteins from different species have multiple functions and could be vaccine antigens to prevent infections. To understand the role of Aae in host interaction and the effect of antibodies against Aae, polymorphism of aae in codifying effector domain region of ligation to epithelial cells was determined and related with adhesion to these cells. Recombinant Aae was obtained and the ability of interaction with Extracellular matrix and serum proteins was determined through assays using the recombinant and an obtained defective sample in Aae expression (comparative assays with wild type). IgG titters against Aae were determined in patients with aggressive periodontitis and healthy and related to humoral response against A. actinomycetemcomitans serotypes. At last, the effect of antibodies against Aae and/or its effector domain, obtained in animal model, was determined in inhibition of adhesion to epithelial cells and macrophages oopsonization.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans produz fatores de virulência que induzem destruição periodontal, porém a sua regulação é pouco conhecida. O sistema de dois componentes ArcAB é um regulador da transcrição gênica que percebe concentrações de oxigênio no ambiente. Este estudo tem como objetivo construir uma amostra de A. actinomycetemcomitans arcB deficiente e comparar características fenotípicas e de transcrição gênica em relação à amostra selvagem. As curvas de crescimento em condições de microaerofilia e anaerobiose foram similares. Foram observadas diferenças nas capacidades de adesão e invasão às células epiteliais, de formação de biofilme, de adesão à hidroxiapatita recoberta por saliva e na hidrofobicidade entre as amostras. A análise de transcrição gênica por RT-PCR em tempo real mostrou expressão diferenciada de apaH, vppA, vapA e omp29. Os dados indicam que em A. actinomycetemcomitans, ArcB é capaz de detectar condições redox, sendo associado a expressão de fatores de colonização da cavidade oral, regulando a transcrição de genes associados à virulência. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans produces several virulence factors which induce periodontal destruction, but little is known about their regulation. The two components system ArcAB is a genetic transcription regulator that senses oxygen concentrations in the environment. This study aimed to construct an A. actinomycetemcomitans arcB deficient mutant and to compare phenotypic carachteristics and gene transcription with the wild type. The growth curves under microaerophilic and anaerobic conditions were similar. There were differences in abilities to adhere and invade epithelial cells, to form biofilm, to adhere to saliva-coated hydroxyapatite and in hydrophobicity between the strains. Gene transcription analysis by real time PCR showed differential expression of apaH, vppA, vapA and omp29. These data indicate that in A. actinomycetemcomitans, ArcB is able to detect redox conditions and is associated with colonization factors of the oral cavity, by regulating transcription of genes associated with virulence.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans está associado à periodontite agressiva e produz CDT. Visando contribuir no entendimento do papel da CDT na regulação da resposta imune, foi determinada sua atividade sobre macrófagos e a resposta humoral contra a toxina. CDT inibiu a proliferação de células epiteliais OBA-9 e macrófagos Raw 264.7 e também a produção de NO por células Raw 264.7 e macrófagos peritoneais de camundongos C3H/HePas e C3H/HeJ, mas estimulou a produção de IL-12. Na imunidade humoral, 75% dos soros de indivíduos com PAgL e 81,8% dos PAgG foram reativos para A. actinomycetemcomitans. Não houve diferença na resposta contra CDTA e CDTB entre o soro de pacientes com diferentes condições periodontais. Todos os pacientes PAgG foram soropositivos para a CDTC, porém apenas 8,3% dos indivíduos com PAgL, nenhum dos PC e 25% dos saudáveis foram positivos. CDT tem atividade imunomodulatória e a resposta humoral difere entre indivíduos infectados pela bactéria. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans is associated with aggressive periodontitis and produces CDT. Aiming to contribute in the understanding the CDT activity in the immune response regulation, its action on macrophages was determined and the response against the toxin analyzed. CDT inhibited the proliferation of OBA-9 epithelial cells and Raw 264.7 macrophages and also inhibited the NO production by Raw 264.7 cells and peritoneal macrophages of C3H/HePas and C3H/HeJ mice, however, stimulated the IL-12 production. In the humoral immunity, 75% of sera from LAgP subjects and 81.8% were reactive to A. actinomycetemcomitans. There was not difference in the response against CDTA and CDTB among sera of patients with different periodontal conditions. All GAgP subjects were sera-reactivity to CDTC, however only 8.3% LAgP subjects, none in CP and 25% of healthy subjects were positive. CDT has immunomodulatory activity and the humoral response differ among bacteria infected subjects.