Les polérovirus infectent de nombreuses plantes d'intérêt économique telles que la pomme de terre, la betterave à sucre et les cucurbitacées. Ces virus icosaédriques renferment un ARN simple brin et leur capside est constituée d'une protéine majeure (CP) et d'un composant mineur (RT*) localisé à la surface des virions. Ces virus sont restreints aux cellules du phloème dans lesquelles ils se multiplient et se déplacent. Les protéines CP et RT sont essentielles à la dissémination du virus par le puceron vecteur et à son mouvement dans la plante. L'objectif de cette étude a consisté à identifier dans les cellules du phloème, les protéines associées aux virions susceptibles d'intervenir dans le cycle viral en criblant une banque d'ADNc de cellules compagnes (CC) d'A. thaliana avec les protéines de structure ou des domaines protéiques du CABYV. Quatre gènes codant pour une protéine Heat Shock (HSP), la profiline 3 (PRF3) une glysosyl hydrolase ; et la protéine " Response to low sulfur 3 " ont été identifiés. Tous ces gènes candidats interagissent avec le domaine RTC-ter du CABYV et avec la protéine RT* pour la protéine HSP. En plus de ces gènes candidats, je me suis intéressée à la protéine ALY, identifiée au laboratoire, au cours du criblage d'une banque d'ADNc de puceron entier avec les deux protéines de structure du Turnip yellows virus (un autre polérovirus). Cette protéine possède quatre orthologues chez Arabidopsis susceptibles d'être impliquées dans le mécanisme de gene silencing mis en place contre le Tomato Bushy Stunt Virus. Les protéines ALY sont donc des candidats intéressants et j'ai montré une interaction entre les protéines de structure du CABYV et du TuYV et les quatre orthologues d'Arabidopsis. L'implication de ces gènes candidats n'a pas pu être confirmée à ce jour dans des mutants knock-out d'arabidopsis. Les résultats complexes obtenus pour le candidat PRF3 au cours des analyses de validation fonctionnelle, m'a conduit à étudier l'interaction entre ce candidat et le domaine RTC-ter du CABYV in planta par FLIM mais aucune interaction n'a pu être confirmée à ce jour. Tous les candidats isolés lors du criblage de la banque d'ADNc de CC interagissant avec le domaine RTC-ter du CABYV, ce travail m'a conduit à analyser le rôle dans le cycle viral de ce domaine et de la protéine RT (sous sa forme complète ou dépourvue du domaine RTC-ter), en étudiant l'accumulation de ces mutants dans les plantes et le clivage de la protéine RT. Tout d'abord, afin de localiser précisément le site de clivage de la protéine RT, des mutants ponctuels dans la zone de clivage ont été réalisés ce qui a permis de montrer que la structure secondaire de la protéine est importante pour son clivage. Puis, afin d'analyser le rôle du domaine RTC-ter dans le cycle viral, j'ai obtenu par délétion, un mutant n'exprimant plus ce domaine. Ce mutant synthétise uniquement la protéine RT tronquée, forme des particules virales semblables au virus sauvage et est transmissible par puceron. Par contre, de façon surprenante, ce mutant est incapable d'envahir les feuilles non-inoculées d'une plante. Ce résultat suggère que les deux formes de la protéine RT (complète et tronquée) sont indispensables au mouvement à longue distance du virus et nous proposons un modèle dans lequel le domaine C-terminal de la protéine RT agit en trans sur la particule virale pour promouvoir le mouvement du CABYV à longue distance.

L‟eutrophisation croissante des écosystèmes aquatiques favorise le développement des cyanobactéries, parmi lesquelles Microcystis est la plus représentée dans les régions tempérées. La capacité de Microcystis à produire une puissante hépatotoxine, la microcystine, est à l‟origine de diverses perturbations écologiques, et de nombreuses nuisances sanitaires. La compréhension des facteurs déterminant la toxicité des efflorescences de Microcystis constitue, de fait, un enjeu majeur des recherches actuelles. Dans ce contexte, l‟objectif premier de ce travail de thèse était d‟étudier la variabilité temporelle et l‟implication potentielle de la toxicité de Microcystis à l‟échelle de son cycle de développement annuel. Pour cela, il était nécessaire de considérer, en particulier, les parties les moins connues du cycle de développement : la phase de survie benthique, et les transitions entre les phases benthique et planctonique, via les processus de recrutement et de sédimentation. Nous avons alors étudié le potentiel toxique des populations de Microcystis grâce à des approches complémentaires menées à différentes échelles spatio-temporelles, en considérant à la fois les gènes impliqués dans la synthèse de microcystines, leur transcription et les concentrations en microcystines. Cette étude s‟est appuyée, en parallèle, sur la caractérisation de la structure génétique des populations de Microcystis dans les compartiments benthique et planctonique. La prise en compte systématique de la phase de vie benthique a tout d‟abord permis d‟améliorer nos connaissances sur cette phase du cycle de développement de Microcystis. Ainsi, Microcystis peut survivre plusieurs années en profondeur dans les sédiments, sans que les populations ne perdent leur potentiel toxique, ou que leur structure génétique soit altérée. En revanche, en surface des sédiments, le potentiel toxique et la structure génétique des populations sont variables, de manière similaire à ce qui peut être observé dans la colonne d‟eau. Enfin, ces travaux ont également mis en évidence l‟influence des phases de transition entre l‟eau et les sédiments dans la variabilité du potentiel toxique et de la structure génétique des populations de Microcystis. Les processus de recrutement benthique et de sédimentation occasionnent, en effet, une sélection génétique, qui, bien que paraissant indépendante du potentiel toxique des génotypes, peut grandement affecter le potentiel toxique des sous-populations benthiques et planctoniques de Microcystis.

L'objectif principal de ce travail est la préparation de nanoparticules d'argent (AgNPs) stabilisées par des oligo-et polysaccharides et leur application en catalyse et pour la détection de lectines. Pour atteindre cet objectif, deux stratégies ont été utilisées, l'une utilisant le polysaccharide dextran comme stabilisant et l'autre utilisant des composés amphiphiles oligosaccharidiques dérivés du maltose, lactose, maltoheptaose et du xyloglucane. Dans les deux stratégies, la préparation des nanoparticules AgNPs a été optimisée en réalisant une analyse multifactorielle basée sur l'étude de la bande de résonance plasmonique de surface (SPR) des nanoparticules. Toutes les suspensions colloïdales stables de nanoparticules ont été caractérisées par spectroscopie ultraviolet-visible (UV-vis), microscopie électronique à transmission (TEM), diffraction des rayons X aux petits angles (SAXS) et par diffusion dynamique de lumière (DLS). Les activités catalytiques des nanoparticules ont été déterminées pour la réaction de réduction du p-nitrophénol (Nip) par NaBH4, dans l'eau ou dans des mélanges eau-éthanol. Parmi les différentes nanoparticules préparées, celles stabilisées par du dextran ou par le dérivé de maltoheptaose Mal7NAcC12 ont montré les meilleures propriétés catalytiques pour la réduction du Nip par NaBH4 avec des constantes de vitesse respectives de 1,41 et 1,11 s-1 m-2 L. Ces valeurs sont parmi les plus élevées de la littérature. L'effet du solvant et notamment de la présence d'éthanol sur les propriétés catalytiques des nanoparticules a également été évalué. Il a été montré que la présence d'éthanol inhibe l'activité des nanoparticules, probablement par formation d'une couche de solvant à la surface des particules entrant en compétition avec le réducteur. Enfin, trois systèmes différents (Ag-Mal7NAcC12 Ag-XGONAcC12 et Ag-LacNAcC12) ont été évalués comme biocapteurs potentiels pour la détection de lectines. Les nanoparticules Ag-Mal7NAcC12 en particulier ont permis la détection colorimétrique et sans marquage de la Concanavaline A.

La paroi végétale assure des fonctions biologiques majeures définissant la singularité des plantes ; elle est également à l'origine de multiples applications en tant que ressource agro-alimentaire, source de biomatériaux ou encore pour la production de biocarburants. Malgré cette importance fondamentale et pratique de la paroi végétale, la connaissance de sa biosynthèse apparaît à ce jour toujours très limitée. En effet, la faible abondance des glycosyltransférases (GTs) responsables de sa biosynthèse, l'absence de substrat spécifique et les difficultés à obtenir certains nucléotides-sucres nécessaires aux tests enzymatiques, a souvent rendu difficile les approches de biochimie classiques. Cependant, le séquençage de génomes (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Poplar populus), la création de banques de mutants d'insertion et la classification des activités glycosyltransférases dans la base de données CAZy (www.cazy.org) sont autant d'outils récents ayant permis des avancées significatives vers la compréhension de la biosynthèse de la paroi des végétaux. Le CERMAV a participé à ce type d'avancée en 2009, en publiant une liste de 24 gènes candidats, nommés " NGT " pour " Nouvelles GlycosylTransférases ", présentant des signatures caractéristiques des glycosyltransférases. Afin de démontrer l'implication des gènes NGT dans les processus d'édification de la paroi végétale, nous avons développé une approche de génomique fonctionnelle, analysant en parallèle des lignées mutantes d'Arabidopsis altérées pour les gènes NGT et testant l'activité GT de ces protéines exprimées en systèmes hétérologues. Durant mes travaux de thèse j'ai pu caractériser 15 lignées mutantes à l'état homozygote pour 7 des 24 gènes NGT. Ces lignées homozygotes ont été criblées afin de rechercher un phénotype d'altération du développement ou de la composition en sucres de leur paroi qui soit corrélé à l'altération des gènes NGT. Ce travail de criblage a conduit à s'intéresser plus particulièrement aux mutants ngt1-1 et ngt1-2 altérés pour le gène NGT1 (At5g28910). La caractérisation des lignées mutantes ngt1-1 et ngt1-2 a permis de quantifier un phénotype de croissance foliaire réduit de 38%, par comparaison au développement des feuilles de la plante sauvage. Par ailleurs, la caractérisation biochimique de la paroi des mutants a révélé des réductions significatives et quantitatives de l'arabinose, du galactose et du rhamnose dans la paroi des mutants, ainsi que des modifications qualitatives marquées principalement des arabinanes. L'altération des arabinanes a d'ailleurs pu être confirmée par microscopie après immuno-marquage de sections d'hypocotyle de mutants à l'aide des anticorps monoclonaux LM6 et LM13 dirigés contre des épitopes α-1,5-arabinanes. Il a pu être montré également que la complémentation des mutants par une construction 35S::NGT1 permet de restaurer un phénotype sauvage à ces mutants. Par ailleurs, de façon à tester l'activité glycosyltransférase de la protéine NGT1, nous avons réalisé son expression en système hétérologue. A ce jour, malgré des résultats préliminaires encourageants, il n'a pas été possible de déterminer des conditions de tests permettant d'observer une activité glycosyltransférase suffisante et reproductible pour la protéine NGT1, que ce soit une activité fucosyltransférase (correspondant à la signature de la séquence du gène) ou bien une activité arabinosyltransférase (correspondant au phénotype biochimique des mutants ngt1).

Le projet principal a consisté à étudier le rôle d'ATAD3 dans un modèle de différenciation cellulaire en culture, les cellules adipocytaires 3T3-L1 induites par l'insuline. L'induction de ces cellules provoque la mise en route du programme d'adipogenèse qui précède la synthèse de gouttelettes de triglycérides (lipogenèse). Nous avons observé qu'au cours de la différenciation, une synthèse et un remodelage du réseau mitochondrial ont lieu. ATAD3, exprimée dans les pré-adipocytes, s'accumule avant la synthèse et le remodelage du réseau mitochondrial et est maintenue élevée tout au long de la différenciation. Nous avons réalisé des lignées invalidées constitutivement pour ATAD3 (siRNA) et étudié la différenciation de ces cellules. Nous avons montré que l'invalidation d'ATAD3 inhibe la lipogenèse et le remodelage du réseau mitochondrial sans affecter la signalisation par l'insuline ni la synthèse des protéines mitochondriales. Le phénotype a été récupéré par transfection d'ATAD3 et une complémentation par Drp1 a été mise en évidence. Ces résultats montrent qu'ATAD3 est nécessaire et limitant dans la différenciation adipocytaire. Trois projets annexes ont complétés ce travail de thèse : Le premier a consisté à contribuer à la purification d'ATAD3 humaine, produite chez la levure. Ces expériences n'ont pas permis de révéler l'activité ATPasique d'ATAD3 mais ont permis d'obtenir une quantité significative de protéine recombinante qui pourra servir à la production d'anticorps ainsi qu'à d'autres applications. Le second a consisté à étudier les isoformes d'ATAD3 chez l'homme et les rongeurs. Ces expériences ont permis de révéler l'existence de plusieurs isoformes tissulaires. Un troisième projet a consisté à identifier des partenaires protéiques d'ATAD3 afin de tenter de comprendre la fonction de cette protéine. A l'aide de sondes protéiques d'ATAD3 radiomarquées (transcription/traduction in vitro), nous avons réalisé des tests d'interaction de type Far Western. Ces expériences ont aboutis à quelques candidats potentiels interagissant avec les parties N- ou C-terminale d'ATAD3.

La mort cellulaire par apoptose est un processus biologique fondamental, nécessitant des interactions fines avec le système immunitaire pour une reconnaissance et une élimination efficace des cellules mortes. C'est ainsi que C1q, une molécule du complément, essentielle dans le système immunitaire inné, a été mise en évidence comme fortement impliquée dans le mécanisme de reconnaissance et d'élimination des cellules apoptotiques, notamment via sa région globulaire (C1qGR). Récemment, la translocation de la calréticuline (CRT) au niveau externe de la membrane plasmique des cellules cancéreuses a été identifiée comme un signal " eat-me " pouvant être immunogène. Initialement, l'interaction entre la CRT et C1q a été caractérisée à la surface des phagocytes et la CRT a été considérée comme un récepteur pour les queues collagènes de C1q (C1qCLF). L'ensemble de ces observations est en faveur d'un double rôle de la CRT, à la surface des phagocytes et des cellules apoptotiques. Dans un premier temps, l'élaboration d'une stratégie de FRET a permis de détecter une interaction directe entre la CRT et C1qGR à la surface de la cellule HeLa en apoptose précoce. Dans un second temps, la mise en place de tests de phagocytose a permis de montrer que la calréticuline exposée à la surface des cellules apoptotiques peut moduler la phagocytose : des effets opposés ont été observés selon le modèle cellulaire utilisé (HeLa traitées par des ARNi ou MEF CRT-/-) et dans certaines conditions, une modulation combinée de la calréticuline et de C1q a été observée sur la réponse inflammatoire (production de cytokines).

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d'ARNr 5S sont transcrits par l'ARN polymérase III qui fait intervenir plusieurs facteurs de transcription dont TFIIIA qui reconnaît spécifiquement le promoteur interne de ces gènes et permet ainsi le recrutement de l'ensemble du complexe de transcription. Le gène TFIIIA est composé de sept exons dont le troisième, résultant de l'exonisation d'une molécule d'ARNr 5S, est épissé de façon alternative produisant ainsi deux transcrits. Le transcrit ES, qui ne contient pas cet exon, code pour la protéine TFIIIA pleine longueur et fonctionnelle. Le transcrit EI, dans lequel l'exon " 5S-like " est maintenu, est reconnu et dégradé par la voie NMD (Non-Mediated Decay). L'exon " 5S-like " a, en effet, la particularité de contenir un codon stop prémature qui en fait une cible de la voie NMD. Lors de l'étude de l'expression des transcrits ES et EI ainsi que celle de l'accumulation de la protéine TFIIIA au cours du développement, nous avons montré que le taux de la protéine TFIIIA fonctionnelle est soumis à plusieurs niveaux de régulation. En effet, la production de la protéine TFIIIA pleine longueur est le résultat de la synthèse du transcrit ES et de sa traduction mais également de l'efficacité du clivage protéolytique de la protéine. Lors de la maturation de la graine, l'accumulation croissante de protéine TFIIIA résulte d'une augmentation des quantités de transcrits ES couplée à une diminution du clivage protéolytique. Dans les premiers jours du développement, la protéine TFIIIA n'est détectée qu'après le 4ème jour, suite à la diminution du clivage. Sa présence est corrélée au remodelage de la chromatine de l'ADNr 5S. La combinaison de ces deux mécanismes permet ainsi la production de TFIIIA et de son produit de transcription l'ARNr 5S en fonction des besoins de la plante.

Le stress est impliqué dans le développement et l'exacerbation de diverses pathologies notamment au niveau intestinal. Les effets du stress dépendent de l'expression de neuromédiateurs spécifiques (CRF) et de leurs récepteurs. Notre étude porte sur la régulation et la fonction du CRF2 au niveau des entérocytes et des cellules tumorales coliques humaines. In vivo, nous avons montré que le stress et l'inflammation conduisent à l'augmentation de l'expression du CRF2 dans les colonocytes chez le rat. Dans les tumeurs, l'expression du CRF2 augmente avec le grade tumoral. In vitro, dans les cellules HT-29, l'activation du CRF2 induit une altération des jonctions adhérentes et des adhérences focales par la voie Src/ERK/FAK. Ces mécanismes sont responsables de la régulation de la perméabilité épithéliale et de l'augmentation de la migration des cellules tumorales. Ces travaux contribuent à la compréhension des mécanismes impliquant le stress dans le développement des pathologies intestinales.

SIRT1, appartenant à la famille des sirtuines, est une déacétylase NAD-dépendante, jouant un rôle essentiel dans le contrôle de l'expression génique. En plus de modifier les histones, SIRT1 peut affecter l'activité de certains facteurs de transcription et leurs gènes cibles. Une question fondamentale est de comprendre le mécanisme moléculaire par lequel SIRT1 contrôle l'expression des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et le métabolisme énergétique. Pour identifier les partenaires protéiques de SIRT1, nous avons utilisé la méthode de purification TAP-TAG à partir d'une fraction nucléaire soluble et d'une fraction ancrée à la chromatine de cellules Mef exprimant stablement une copie ectopique de SIRT1 (e-SIRT1). Nous avons ainsi pu identifier un complexe SIRT1 associé à la fois au facteur de prolifération cellulaire Ki67, et à la sous-unité TFIIIC, nécessaire à l'assemblage du complexe de pré-initiation de l'ARN Polymérase III. En délétant sirt1, et en inhibant spécifiquement l'expression de Ki67, nous avons montré que la machinerie de transcription de l'ARN Polymérase III et la prolifération cellulaire étaient fortement affectées. L'ensemble de mes résultats démontre très clairement que SIRT1, Ki67, et TFIIIC sont au sein d'un même complexe protéique, SIRT1 et Ki67 agissant de manière coordonnée pour réguler le niveau d'expression des SINEs et des LINEs, transcrits issus de la machinerie de transcription de l'ARN Polymérase III.

Le système génétique complexe des mitochondries de plantes supérieures n'a pu être étudié par des approches transgéniques car les méthodes conventionnelles ne permettent pas de transformer ces organites. Une approche alternative a été développée au laboratoire, grâce à l'existence d'un processus naturel assurant l'import d'ARN de transfert (ARNt) du cytosol dans les mitochondries. Il a été montré qu'un mime d'ARNt peut servir in vivo de navette pour importer dans les mitochondries de plante des ARN-passagers exprimés à partir de transgènes nucléaires. L'utilisation d'un transribozyme comme séquence-passagère a permis d'obtenir l'invalidation spécifique d'un ARN messager (ARNm) majeur dans les mitochondries de cellules végétales transformées. Nous avons mis en oeuvre cette stratégie pour développer des études de régulation mitochondriale. Cinq ARNm mitochondriaux (nad9, sdh3, cob, cox3 et atp9) ont été choisis comme cibles pour des transribozymes spécifiques à tête de marteau. Après validation de l'activité de ces ribozymes in vitro, les vecteurs d'expression portant les transgènes correspondants ont servi pour transformer des cultures cellulaires de Nicotiana tabacum, des plantes d'Arabidopsis thaliana (pour nad9, cob, cox3 et atp9) et des plantes de N. tabacum (pour sdh3). L'invalidation spécifique des ARN mitochondriaux ciblés par les ribozymes a été établie in vivo. La réponse, en termes de régulation, à l'invalidation des cibles individuelles a été analysée au niveau de l'ensemble du transcriptome. Alors qu'il a été généralement considéré jusqu'à présent que les processus de régulation mitochondriaux chez les plantes se passent essentiellement au stade post-transcriptionnel, nos résultats sont fortement en faveur de mécanismes de coordination des ARNm dans les mitochondries et entre les organites et le noyau.