A Síndrome de Rubinstein-Taybi (RTSs) é uma doença rara de herança autossômica dominante, caracterizada por dismorfismos craniofaciais, polegares e háluces alargados, deficiência intelectual e de crescimento. RTSs tem sido associada com mutações no gene CREBBP (CBP) e mutações menos frequentes no gene EP300 que foram descritas em oito indivíduos. CBP e p300 possuem alta homologia e são extremamente importantes em várias vias de sinalização, principalmente como coativadores de transcrição e na acetilação das histonas. Nosso estudo baseou-se na análise de alterações moleculares por sequenciamento direto do CBP, FISH e array-CGH em 20 pacientes com RTSs. Dos 20 pacientes avaliados por sequenciamento direto foram identificadas oito alterações moleculares, dentre estas, seis são alterações moleculares novas as quais não foram descritas na literatura, são elas: i) duas deleções (p.M747fs STOP830 e p.G1011fs STOP1021) ii) duas alterações do tipo nonsense (p.Arg1341X, p.Arg1498X) iii) três do tipo missense (p.Arg1907Trp, p.Leu604Pro e p.His1291Arg). Também identificamos um polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) (rs115594471/ c.5874CT). Dois pacientes apresentaram deleção do gene CBP em um dos alelos, identificado pelo método array-CGH. Outro, apresentou uma translocação aparentemente equilibrada t(2;16), cuja análise subsequente com FISH revelou uma quebra na região do CBP. Neste trabalho, a taxa de detecção de alteração molecular no CBP por sequenciamento direto foi de 40% (08/20). Porém, a taxa de detecção das alterações moleculares no CBP foi de 55% (11/20), considerando a combinação das diferentes técnicas utilizadas (FISH, sequenciamento direto e array-CGH). Não houve correlação genótipo-fenótipo, exceto por uma maior frequência da presença de epicanto nos pacientes com alteração no CBP. Os resultados obtidos neste trabalho servem como o diagnóstico molecular para os pacientes com RTSs atendidos no Ambulatório do Laboratório de investigação Médica 001 (ALIM 001) do Instituto da Criança - FMUSP, contribuindo para uma melhor orientação médica, como também para realização do aconselhamento genético às famílias / Rubinstein-Taybi syndrome (RTSs) is a rare autosomal dominant disease characterized by craniofacial dysmorphisms, broad thumbs and toes, mental and growth deficiency. RTS has been associated with CREBBP (CBP) gene mutations and less frequently with mutations in EP300 gene, which have been reported in eight individuals. CBP and p300 have high homology and are extremely important in many signaling pathways especially as transcriptional coactivators and histone acetylation. Our study was based on the alteration analysis by direct sequencing of the CBP, by FISH and array-CGH in 20 RTSs patients. We identified eight molecular alterations in 20 RTSs patients evaluated by direct sequencing: i) two deletions (p.M747fs STOP830 and p.G1011fs STOP1021) ii) two nonsense alterations (p.Arg1341X and p.Arg1498X) iii) Three missense alteration (p.Arg1907Trp, p.Leu604Pro and p.His1291Arg). Single-nucleotide polymorphism were also identified (rs115594471 / c.5874CT), and six of these are new molecular alterations, not described in literature. Two RTSs patients studied had CBP gene deletion in one allele, identified by array-CGH method. Other patient, presented with apparent balanced translocation t(2;16) in which the subsequent analysis using FISH, showed a break in region of CBP. In this work, the rate of detection of molecular alteration in CBP by direct sequencing in RTSs patient was 40.0% (08/20). However, the rate of detection of molecular alteration in CBP was 55.0% (11/20), considering the combination of different techniques (FISH, direct sequencing and array-CGH. No significant correlation could be established in this study between the different types of mutations and genotype-phenotype of RTSs patients, except a higher frequency of the presence of epicanthus in the RTS patients with alteration in the CBP. The results of this study serve as a molecular diagnosis for RTSs patients treated at the Ambulatory of the Medical Investigation Laboratory 001 (ALIM 001) of the Instituto da Criança - FMUSP, and this contributes to better clinical management, such as making an appropriate genetic counseling for families

A Síndrome de Rubinstein-Taybi (RTSs) é uma doença rara de herança autossômica dominante, caracterizada por dismorfismos craniofaciais, polegares e háluces alargados, deficiência intelectual e de crescimento. RTSs tem sido associada com mutações no gene CREBBP (CBP) e mutações menos frequentes no gene EP300 que foram descritas em oito indivíduos. CBP e p300 possuem alta homologia e são extremamente importantes em várias vias de sinalização, principalmente como coativadores de transcrição e na acetilação das histonas. Nosso estudo baseou-se na análise de alterações moleculares por sequenciamento direto do CBP, FISH e array-CGH em 20 pacientes com RTSs. Dos 20 pacientes avaliados por sequenciamento direto foram identificadas oito alterações moleculares, dentre estas, seis são alterações moleculares novas as quais não foram descritas na literatura, são elas: i) duas deleções (p.M747fs STOP830 e p.G1011fs STOP1021) ii) duas alterações do tipo nonsense (p.Arg1341X, p.Arg1498X) iii) três do tipo missense (p.Arg1907Trp, p.Leu604Pro e p.His1291Arg). Também identificamos um polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) (rs115594471/ c.5874CT). Dois pacientes apresentaram deleção do gene CBP em um dos alelos, identificado pelo método array-CGH. Outro, apresentou uma translocação aparentemente equilibrada t(2;16), cuja análise subsequente com FISH revelou uma quebra na região do CBP. Neste trabalho, a taxa de detecção de alteração molecular no CBP por sequenciamento direto foi de 40% (08/20). Porém, a taxa de detecção das alterações moleculares no CBP foi de 55% (11/20), considerando a combinação das diferentes técnicas utilizadas (FISH, sequenciamento direto e array-CGH). Não houve correlação genótipo-fenótipo, exceto por uma maior frequência da presença de epicanto nos pacientes com alteração no CBP. Os resultados obtidos neste trabalho servem como o diagnóstico molecular para os pacientes com RTSs atendidos no Ambulatório do Laboratório de investigação Médica 001 (ALIM 001) do Instituto da Criança - FMUSP, contribuindo para uma melhor orientação médica, como também para realização do aconselhamento genético às famílias / Rubinstein-Taybi syndrome (RTSs) is a rare autosomal dominant disease characterized by craniofacial dysmorphisms, broad thumbs and toes, mental and growth deficiency. RTS has been associated with CREBBP (CBP) gene mutations and less frequently with mutations in EP300 gene, which have been reported in eight individuals. CBP and p300 have high homology and are extremely important in many signaling pathways especially as transcriptional coactivators and histone acetylation. Our study was based on the alteration analysis by direct sequencing of the CBP, by FISH and array-CGH in 20 RTSs patients. We identified eight molecular alterations in 20 RTSs patients evaluated by direct sequencing: i) two deletions (p.M747fs STOP830 and p.G1011fs STOP1021) ii) two nonsense alterations (p.Arg1341X and p.Arg1498X) iii) Three missense alteration (p.Arg1907Trp, p.Leu604Pro and p.His1291Arg). Single-nucleotide polymorphism were also identified (rs115594471 / c.5874CT), and six of these are new molecular alterations, not described in literature. Two RTSs patients studied had CBP gene deletion in one allele, identified by array-CGH method. Other patient, presented with apparent balanced translocation t(2;16) in which the subsequent analysis using FISH, showed a break in region of CBP. In this work, the rate of detection of molecular alteration in CBP by direct sequencing in RTSs patient was 40.0% (08/20). However, the rate of detection of molecular alteration in CBP was 55.0% (11/20), considering the combination of different techniques (FISH, direct sequencing and array-CGH. No significant correlation could be established in this study between the different types of mutations and genotype-phenotype of RTSs patients, except a higher frequency of the presence of epicanthus in the RTS patients with alteration in the CBP. The results of this study serve as a molecular diagnosis for RTSs patients treated at the Ambulatory of the Medical Investigation Laboratory 001 (ALIM 001) of the Instituto da Criança - FMUSP, and this contributes to better clinical management, such as making an appropriate genetic counseling for families

Orientador: José Paes de Oliveira-Filho / Resumo: Dermatosparaxia é uma enfermidade autossômica recessiva do tecido conjuntivo caracterizada clinicamente por fragilidade e hiperextensibilidade cutâneas. Estas características impedem que o animal seja mantido no sistema de criação, sendo descartado na maioria dos casos. Descrita em diversas espécies, a dermatosparaxia foi relatada também em algumas raças de ovinos. O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) c.421G>T no gene ADAMTS2 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I motif, 2), em homozigose, é responsável pela enfermidade em ovinos da raça White Dorper. Recentemente a doença foi descrita no Brasil, contudo acredita-se que possa ter sido subdiagnosticada, uma vez que a enfermidade já foi descrita em diversos países. O objetivo desta pesquisa foi estimar a frequência alélica do SNP c.421G>T no gene ADAMTS2 em ovinos da raça White Dorper do estado de São Paulo a partir de uma metodologia diagnóstica que utilizasse a reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida do sequenciamento direto da região desse SNP. Neste estudo, foram coletadas amostras de sangue para extração do DNA de 303 ovinos da raça White Dorper. Após a extração do DNA, realizou-se PCR para amplificar a região do SNP e, então, o sequenciamento genético para determinar sua presença no gene ADAMTS2. A frequência alélica do SNP na população estudada foi de 7,8%. Este resultado indica que as medidas de controle devem ser adotadas para prevenir a propagação do SNP c.421G>T no gene ADAMTS2 nos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-03T16:36:35Z No. of bitstreams: 1 monete_r_gomes_ioc_bcs_0002_2010.pdf: 4408396 bytes, checksum: dc300c2a3e79c9521a3d4a99c18e5e9d (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-03T16:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 monete_r_gomes_ioc_bcs_0002_2010.pdf: 4408396 bytes, checksum: dc300c2a3e79c9521a3d4a99c18e5e9d (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Leishmania major, Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi (Tritryps) são protozoários unicelulares que causam a leishmaniose, a doença do sono e a doença de Chagas, respectivamente. Essas doenças causam ônus econômicos principalmente em regiões subtropicais e tropicais. Atualmente, não existem vacinas comercialmente disponíveis e não há tratamento eficaz para tais doenças. Isso se deve ao fato dos fármacos disponíveis apresentarem muitos efeitos colaterais e estarem propensas ao desenvolvimento de resistência. A maioria desses fármacos foi descoberta através da seleção de um grande número de compostos contra parasitas íntegros. Porém, nos últimos anos, uma nova abordagem vem ganhando espaço sob o termo de “desenho racional de fármacos”. Este termo representa a busca por compostos contra alvos moleculares específicos, visando diferenças bioquímicas e fisiológicas entre o parasita e o hospedeiro. A era pós-genômica gerou uma grande quantidade de informações que permitem a identificação ótima de novos alvos. Neste contexto, a partir de dados públicos dos genomas de Tritryps, reconstruímos as vias de processamento da informação genética (com ênfase nas vias de replicação e reparo, transcrição e tradução) nesses organismos, para adquirir uma melhor representação das enzimas envolvidas nestes processos. Estas análises permitiram estudos comparativos para identificar candidatos a novos alvos terapêuticos. Em nossa metodologia utilizamos a ferramenta AnEnPi (http://bioinfo.pdtis.fiocruz.br/AnEnPi/) para buscar nas seqüências genômicas por enzimas análogas. Utilizando os dados provindos do KEGG, primeiro houve uma etapa de clusterização das estruturas primárias de todas as enzimas desse banco de dados anotadas com o mesmo EC. Para isso utilizou-se uma pontuação (score) de similaridade no Blastp de 120, como parâmetros de corte. Encontramos 830 grupos de ECs com mais de um cluster e 1430 com um único cluster. Após isso, foi realizado um passo de reanotação. Para isto, foi rodado um novo Blastp, assumindo como ponto de corte um e-value de 10e-20, entre todas as proteínas preditas nos genomas de cada Tritryp contra todos os clusters. Desses dados geramos mapas das vias de interesse para esses organismos e os comparamos aos mapas que o KEGG disponibiliza como padrão. Identificamos alguns casos de analogia nestas vias entre seres humanos e Tritryps que podem vir a ser utilizados como novos alvos terapêuticos para o desenvolvimento de fármacos contra esses parasitas. Foi feita a modelagem por homologia de um análogo (6.1.1.-, de T. brucei), utilizando a ferramenta MHOLline. Além disso, buscamos no banco de alvos terapêuticos para doenças negligenciadas, TDRTARGETS (http://tdrtargets.org/), pelos ECs identificados como possíveis novos alvos, e não encontramos nenhuma ocorrência. Tal fato pode indicar que com a metodologia aplicada conseguimos identificar novos candidatos a alvos terapêuticos contra estes parasitas. Em análises futuras, vamos testar e-values mais restritivos na etapa de reanotação, para assim, testar o potencial de reanotação da ferramenta. / Leishmania major, Trypanos oma brucei e Trypanosoma cruzi (Tritryps) are unicellular protozoa that cause leishmaniasis, sleeping sickness and Chagas disease, respectively. These diseases cause economic burden mainly in subtropical and tropical regions. Currently, there are no commer cially available vaccines and no effective treatment for such diseases. This is because the available drugs present many side effects and are willing to develop resistance. Most of these drugs were discovered through the screening of large numbers of compo unds against whole parasites. However, a new approach has been gaining ground under the term "rational drug design", recently. This term represents the search for compounds against specific molecular targets, aiming physiological and biochemical difference s between parasites and hosts. The post - genomic era generated a lot of information that allow optimal identification of new targets. In this context, from public data of the Tritryps’ genomes, we reconstructed the genetic information processing pathway (wi th emphasis on replication and repair, transcription and translation) of these organisms, to obtain a better representation of enzymes involved in these processes. These analyses allowed comparative studies to identify candidates for new therapeutic target s. In our methodology we used the AnEnPi tool ( http://bioinfo.pdtis.fiocruz.br/AnEnPi/ ) to search the genomes for analogous enzymes. Using the data coming from KEGG, there was first a clustering step of the primary structures of all enzymes annotated with the same EC in this database. For this we used a Blastp similarity score of 120 as threshold. We found 830 groups of ECs with more than one cluster and 1430 with only one cluster. After that, we performed a reannotation step. For this task a new Blastp was done, assuming an e - value cutoff of 10e - 20 , among all pr edicted proteins, from each Tritryp genome, against all clusters. From these data we generated maps, for Tritryps, of the pathways of interest and compared them to the KEGG standard maps. We identified some cases of analogy in these pathways between humans and Tritryps that may be used as new therapeutic targets for developing drugs against these parasites. The homology modeling was done for an analog (6.1.1. - , T. brucei ), using the tool MHOLline. Furthermore we also searched in the therapeutic targets data base for neglected disease, TDRTARGES (http://tdrtargets.org/), for the ECs identified as possible new targets, and no occurrences were found. This may indicate that with the methodology applied we managed to identify new candidates for therapeutic targets against these parasites. In further analysis, we will test more restrictive e - values on the reannotation step to test the potential of reannotation of the tool.

A neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (NEM1) é uma doença genética, de herança autossômica dominante, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores endócrinos acometendo, principalmente, hipófise, paratireoide e pâncreas/duodeno endócrinos. É causada, principalmente, por mutação germinativa no gene supressor tumoral MEN1 (11q13). A tumorigênese segue o modelo de Knudson (1971). O diagnóstico genético de famílias com NEM1 reconhece os portadores assintomáticos de mutação MEN1, permite o diagnóstico e tratamento precoce de tumores, promove a redução da morbimortalidade relacionada à NEM1 e exclui familiares não portadores de mutação do rastreamento clínico periódico. O diagnóstico genético de NEM1 tem sido realizado por meio da técnica de sequenciamento Sanger. Entretanto, limitações desta técnica a tornam menos custo efetiva, devido a sua reduzida capacidade de geração de dados, que leva a necessidade de obtenção de produtos de PCR de até 700 pb para adequada leitura do sequenciamento. Além disto, condições específicas do gene MEN1, como a ausência de \"hot spots\" mutacionais, levam a necessidade de sequenciamento de toda sua extensão (7Kb) e contribuem para tornar esta técnica laboriosa e dispendiosa. A subdivisão do gene para sequenciamento Sanger pode ocultar informações, principalmente de regiões intrônicas, que podem ser importantes para o desenvolvimento da doença. Tais dificuldades impedem a incorporação do diagnóstico gênico de NEM1 na prática clínica. Desde 2005, estão disponíveis tecnologias denominadas NGS (Next- Generation Sequencing), que consistem em ferramentas para o sequenciamento genético com capacidade aumentada de geração de dados, tornando-as mais atrativas e de melhor custo-benefício. O NGS confere, ainda, maior velocidade ao processo de obtenção de dados e detém a capacidade de realizar a leitura completa do gene, incluindo regiões promotoras e intrônicas. Por isto, torna a leitura mais ampla e informativa, sem desconsiderar aspectos qualitativos. Dentre várias opções de NGS disponíveis, plataformas leves são consideradas mais adequadas para aplicação clínica, destacando-se as plataformas Ion PGM e Illumina MiSeq. Uma forte tendência tem sido mostrada de migração do sequenciamento Sanger para o NGS, incluindo a aplicação da mesma em diagnóstico genético de doenças complexas e de câncer hereditário. Entretanto, não há estudos prévios envolvendo NGS em NEM1. Diante disto, foi avaliado a qualidade desta técnica como método de diagnóstico genético em NEM1 em comparação ao sequenciamento Sanger. Objetivos: validação da técnica de NGS utilizando como parâmetro o sequenciamento Sanger; avaliação da sensibilidade, especificidade e relação custo-benefício do NGS. Para tal, foram analisados 76 casos-índices com diagnóstico clínico de NEM1 na plataforma Illumina MiSeq. As análises foram subdivididas em duas fases. O enriquecimento da região genômica do gene MEN1 foi realizado por meio de PCR longa. Com base nos dados obtidos foi possível aferir 96% de reprodutibilidade entre as diferentes fases do estudo e aproximadamente 99% de precisão para detecção de variantes. Exatidão, sensibilidade e especificidade resultaram em 100%. Não houve falsos-positivos ou negativos. A técnica de NGS também se mostrou mais custo-efetiva do que o sequenciamento Sanger. Este estudo permitiu validar e introduzir esta técnica como ferramenta de diagnóstico gênico de NEM1 para rastreamento genético de casos-índices / The multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) is a genetic, autossomic and dominant disease and is correlated with the development of endocrine tumors affecting pituitary gland, parathyroid, endocrine pancreas or duodenum. It is mainly caused by a germinative mutation in tumor suppressor gene MEN1 (11q13). The tumorigenesis follow the Knudson\'s model (1971). Genetic diagnosis of families with MEN1 is essential to recognizes asymptomatic mutation carriers, and allows an earlier detection and treatment of tumors leading to a reduction of mortality and morbidity associated to MEN1. Furthermore, it can exclude family members that do not carry mutations from the periodical screening. The genetic diagnosis for MEN1 is held using Sanger sequencing. However, limitations of this technique make it less cost-effective, mostly, the less capacity of data generation that leads to the need of PCR products up to 700 bp to obtain a suitable read. Moreover, specific conditions of the MEN1 gene contributes to make this process more laborious and expensive, like the need to read all gene sequence (7kb) to make a correct analysis due to the absence of \"hot spots\". This way, the need of \"fragmentation\" to allow the sequencing can hide important information to disease development, mostly in introns. These limitations preclude the clinical application of genetic diagnosis of MEN1. Since 2005, new technologies are available; they are called Next Generation Sequencing (NGS) and consist in a new tool that allow the same sequencing, but with a larger data generation capacity, making them more attractive and costeffective. The NGS also gives a higher speed to the process of data acquiring and allows the complete read of gene, including promoters and introns. Therefore, it makes the results more informative, not forgetting quality aspects. Among lot of options of NGS available, lighter platforms are recommended, for example, Ion PGM and Illumina MiSeq. A strong tendency has been shown in order to change the Sanger sequencing to NGS, including clinical application to genetic diagnosis of complex diseases and inherited cancer. However, there is not previous studies evaluating NGS to MEN1 genetic diagnosis. Thus, present study evaluated NGS as a genetic diagnosis method for MEN1, comparing with Sanger sequencing. This study aimed to validate the NGS method using as model the Sanger sequencing and evaluated sensibility, specificity and costeffectiveness of NGS. For this purpose, 76 index-cases with clinical MEN1 diagnosis were analyzed on Illumina MiSeq. Analyzes were divided in two phases. After analyzes, 96% of reproducibility and 99% of precision were calculated. Accuracy, sensibility and specificity were resulted in 100%. There were not falses negatives or positives. NGS showed more cost-effectiveness with lower costs. This study allowed validation of genetic screening of MEN1 indexcases applying NGS platform

Orientadores: Reginaldo Palazzo Junior, Marcio de Castro Silva Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Eletrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:43:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rocha_AndreaSantosLeiteda_D.pdf: 5117477 bytes, checksum: e8f0c742c67382cad01387d3e62f6705 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Um dos desafios em biologia matemática e mostrar a existência de qualquer forma de códigos corretores de erros na estrutura do DNA. Usando os conceitos da teoria de comunicação, propomos um modelo para o sistema de codificacao e decodificaçao do mecanismo de importaçao de proteínas mitocondriais similar a um sistema de comunicacoes digital. Este modelo consiste de um mapeador responsável por transformar os nucleotídeos (A, C, G, T) no alfabeto (0,1, 2, 3) usado pelo codigo sobre a estrutura de anel; um codificador (cádigo BCH); e um modulador (codigo genetico, tRNA e rRNA). O processo de decodificaçao baseia-se em uma analogia entre o processo de decodificacão do algoritmo Berlekamp-Massey para aneis e o complexo TOM (complexo ancorado na membrana externa da mitocondria responsavel por auxiliar na importacçãao das proteínas precursoras). Neste processo temos um demodulador (proteínas Tom 70 e Tom20), um decodificador (o complexo GIP - poro geral de inserção) e o receptor (subcompartimento mitocondrial). Neste trabalho mostramos que as sequencias de DNA (sequencias de direcionamento) são identificadas como palavras-codigo de um código G-linear sobre a extensão de um anel de Galois. Além disso, essas sequências de DNA e suas fitas complementares estão relacionadas matematicamente através dos polinómios primitivos e seus polinómios recíprocos, respectivamente. Um estudo filogenético sugere que a proteína malato desidrogenase da Arabidopsis thaliana encontrada no banco de dados NCBI e uma sequência derivada da proteína malato desidrogenase reproduzida pelo cídigo corretor de erros. Este modelo também reproduz com notível precisão os parâmetros cinéticos baseados em substituicões de aminoíacidos em oligopeptídeos sintéticos. Apresentamos, pela primeira vez, a existência de códigos corretores de erros associados com as sequências de DNA, os quais sugerem fortemente a existência de códigos concatenados no genoma. Os resultados apresentados neste trabalho contribuem para o desenvolvimento de um procedimento sistemático que podera ser empregado em analises de mutacães/polimorfismos com aplicações na engenharia geníetica. / Abstract: One of the puzzling problems in mathematical biology is to show the existence of any form of error-correcting code in the DNA structure. Using information theory considerations we propose a model for the biological coding system similar to that of a digital communication system. This model consists of a mapper (transformations from the set of nucleotides either to the set (0, 1, 2, 3) ring; an encoder (BCH code); and a modulator (genetic code, tRNA and rRNA). The decoding process is based on the Modified Berlekamp-Massey algothm in an analogy with the TOM complex (translocase of the mitochondrial outer membrane). In this process we have a demodulator (Tom 70 and Tom 20 proteins), a decoder (GIP complex) and the receiver (mitochondrion). In this work we show that DNA sequences (targeting sequences) are identified as codewords of a G-linear code over Galois ring extensions. In addition, these DNA sequences and their complementary strands are mathematically related to the primitive polynomials and their reciprocal polynomials, respectively. A phylogenetic study suggest that the MDH protein, Arabidopsis thaliana, found in the NCBI databank is a derived sequence of the MDH protein reproduced by the error correcting code. This model also reproduces with remarkable accuracy kinetic parameters based on amino acid substitutions on synthetic oligopeptides. We show, for the first time, the existence of error-correcting codes associated with DNA sequences, which strongly infer on the existence of nested codes within the genome. The results presented in this work contribute to the development of a systematic procedure which may be employed in the mutations/polymorphisms analysis with applications in genetic engineering. / Doutorado / Telecomunicações e Telemática / Doutor em Engenharia Elétrica

As maiores taxas de incidência de câncer de mama ocorrem em mulheres idosas, que apresentam tumores com expressão de receptores de estrógeno e/ou progesterona, de baixo estadiamento e menor taxa de proliferação, se comparado com as jovens. Um dos fatores de predisposição ao câncer de mama é mutação germinativa nos genes BRCA1 ou BRCA2, que podem compreender entre 5-10% das pacientes diagnosticadas. A grande maioria dos casos são ditos esporádicos, em que não há como estabelecer um único fator determinante. Dentre o escopo de possíveis causas estão as mutações somáticas, acumuladas no tecido mamário ao longo da vida. A identificação destas mutações permite melhor compreensão da carcinogênese e possibilita a criação de tratamentos cada vez mais personalizados. O gene PIK3CA, por exemplo, já está determinado como driver (responsáveis pela obtenção de vantagem seletiva de um determinado clone) para câncer de mama. As mutações patogênicas que ocorrem neste gene levam a ativação da via de Akt/mTOR, entre outras, que mantém o ciclo celular ativo. Um gene que vem sendo estudado recentemente é o PRKD1, cujas funções parecem estar ligadas à manutenção do fenótipo epitelial das células do tecido mamário. Assim, o objetivo desse trabalho identificar mutações germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2, analisando também o histórico familiar para câncer de mama/ovário/próstata, e mutações somáticas no gene PRKD1 em pacientes pós menopausadas,. Foram incluídas quarenta e nove pacientes diagnosticadas com carcinoma ductal invasivo em idade superior a 54 anos, que preenchessem critérios da NCCN (National Comprehensive Cancer Network) para Síndrome de Câncer de Mama e/ou Ovário Hereditário e tinham disponível um fragmento tumoral emblocado em parafina coletado na ausência de tratamento neo adjuvante. A extração de DNA foi realizada a partir do sangue periférico para sequenciamento de BRCA1 e BRCA2, realizado através da plataforma Ion Torrent(TM) ou pelo método de Sanger. Os resultados obtidos por Ion Torrent(TM) foram analisados, primeiramente, através da ferramenta online Ion Reporter e os de Sanger através do programa Mutation Surveyor v.3.20. Para a caractetização das variantes encontradas foram utilizados: os bancos de dados BIC, LOVD, LOVD-IARC, UMD e ClinVar além dos preditores in silico da conservação dos aminoácidos entre as espécies Polyphen-2, SIF, Provean e AlignGVGD e do preditor de efeito no splicing HSF e bancos de dados de frequência alélica ExAC, 1000 genomas e NHLBI GO Exome Sequencing Project, seguindo os critérios da American College of Medical Genetics and Genomics em conjunto com a Association for Molecular Pathology. Para caracterização de mutação somática do gene PRKD1 determinou-se duas regiões de maior importância para serem sequenciadas: Ser738/Ser742 e Ser910 que fosforilam o domínio quinase da proteína, ativando-o. Vinte e três amostras tumorais tiveram DNA extraído. Também foi realizada uma análise das informações sobre PRKD1 do banco de dados COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) e a construção de curvas de sobrevida (Kaplan-Meier) da expressão de PRKD1 utilizando a ferramenta online KM Plotter. A idade mediana das pacientes foi de 62 anos ao diagnóstico e de 64 anos na época de inclusão no estudo. A maioria tinha tumores de grau histológico II (63,27%), estádio clinico II (20%) e do subtipo luminal B (53,06%). Trinta e duas relataram parentes de primeiro grau afetados com câncer de mama/ovário/ próstata. Trinta e oito pacientes tiveram sequenciamento completo de BRCA1 e BRCA2 por Ion Torrent(TM) e onze tiveram sequenciamento parcial de BRCA1 e BRCA2 por Sanger. Variantes patogênicas foram encontradas em quatro pacientes (BRCA1=2/BRCA2=2). Uma nova variante missense foi identificada em BRCA2: c.3371A > G (p.Q1124R). Para o sequenciamento de PRKD1 quinze foram sequenciadas para Ser910 e de oito foi possível analisar o resultado. Nenhuma variante patogênica foi encontrada. Os dados obtidos sobre PRKD1 no COSMIC foram: de 2773 amostras, em apenas 15 (0,54%) foram identificadas mutações em PRKD1, 46% (7/15) provém de mulheres com idade superior a 55 anos e subtipo molecular Luminal. PRKD1 apresenta maiores frequência de mutação em câncer de intestino grosso (4,22%) e pele (4,02%). As curvas de sobrevida construídas no KM Plotter demonstram a alta expressão do gene parece ter impacto positivo na sobrevida das pacientes. Apesar da baixa frequência de mutações no PRKD1 este gene, outros dados demonstram que parece ter um papel de gene supressor de tumor no câncer de mama, que deve ser inibido de através de outros mecanismos como metilaçao de DNA / The highest rates of breast cancer incidence occur in elderly women, who present estrogen and / or progesterone receptor tumors, with a low clinical staging and lower proliferation rate compared to the young women. One of the factors predisposing to breast cancer is germline mutation in the BRCA1 or BRCA2 genes, which may comprise between 5-10% of the diagnosed patients. The vast majority of cases are said to be sporadic, in which there is no way to establish a single determining factor. Among the scope of possible causes are somatic mutations, accumulated in the breast tissue throughout life. The identification of these mutations allows a better understanding of carcinogenesis and enables the creation of increasingly personalized treatments. The PIK3CA gene, for example, is already determined as a driver (responsible for the selective advantage of a particular clone) for breast cancer. The pathogenic mutations that occur in this gene lead to the activation of Akt / mTOR pathway, among others, which keeps the cell cycle active. One gene that has recently been studied is PRKD1, whose functions seem to be linked to the maintenance of the epithelial phenotype of the mammary tissue cells. Thus, the objective of this work was to identify germline mutations in BRCA1 and BRCA2 genes, also analyzing the family history for breast / ovarian / prostate cancer, and somatic mutations in the PRKD1 gene in postmenopausal patients. Forty-nine patients diagnosed with ipsilateral ductal carcinomas over the age of 54 years who completed NCCN (National Comprehensive Cancer Network) criteria for Breast Cancer and / or Hereditary Ovarian Syndrome and had a tumor paraffin embedded in paraffin collected in the absence of neo adjuvant treatment available. DNA extraction was performed from the peripheral blood for sequencing of BRCA1 and BRCA2, performed through the Ion Torrent (TM) platform or by the Sanger method. The results obtained by Ion Torrent (TM) were first analyzed through the online tool Ion Reporter and those by Sanger through the program Mutation Surveyor v.3.20. The BIC, LOVD, LOVD-IARC, UMD and ClinVar databases were used in addition to the in silico predictors of amino acid conservation among Polyphen-2, SIF, Provean and AlignGVGD species and the effect predictor in the HSF splicing and allelic frequency databases ExAC, 1000 genomes and the NHLBI GO Exome Sequencing Project, following the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics in conjunction with the Association for Molecular Pathology. In order to characterize the somatic mutation of the PRKD1 gene, we determined two regions of greater importance to be sequenced: Ser738 / Ser742 and Ser910 that phosphorylate the protein kinase domain, activating it. Twenty-three tumor samples had DNA extracted. An analysis of PRKD1 information from the COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer) database and the construction of survival curves (Kaplan-Meier) for PRKD1 expression using the online KM Plotter tool was also performed. The median age of the patients was 62 years at diagnosis and 64 years at the time of inclusion in the study. Most of them had tumors of histological grade II (63.27%), clinical stage II (20%) and molecular subtype luminal B (53.06%). Thirty-two reported first-degree relatives affected with breast / ovarian / prostate cancer. Thirty-eight patients had BRCA1 and BRCA2 complete sequencing by Ion Torrent (TM) and eleven had BRCA1 and BRCA2 partial sequencing by Sanger. Pathogenic variants were found in four patients (BRCA1 = 2 / BRCA2 = 2). For PRKD1 sequencing, fifteen patients tumors were sequenced for Ser910 and in eight samples it was possible to analyze the result. No pathogenic variant was found. The data obtained on PRKD1 in COSMIC were: from 2773 samples, in only 15 (0.54%) mutations were identified in PRKD1, 46% (7/15) came from women aged over 55 years and had tumor molecular subtype Luminal. PRKD1 shows higher mutation frequency in cancer of the large intestine (4.22%) and skin (4.02%). The survival curves constructed in KM Plotter demonstrate the high expression of the gene seems to have a positive impact on the patients survival . Despite the low frequency of mutations in PRKD1 gene, other data demonstrate that it appears to play a role of tumor suppressor gene in breast cancer, which must be inhibited by other mechanisms such as DNA methylation

Orientador: Reginaldo Palazzo Júnior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-18T18:43:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_LuzineteCristinaBonanide_D.pdf: 17107444 bytes, checksum: 4faf2de7876247b3c74423dc7a3043d1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Um dos grandes desafios da comunidade científica em teorias da informação genética, comunicação genética e codificação genética é verificar a existência de uma estrutura matemática relacionada com a estrutura do DNA. Este trabalho propõe modelos para o sistema de comunicação de informação genética e genômica análogos ao modelo de um sistema de comunicação digital. Ambos os modelos são capazes de identificar, reproduzir e classificar matematicamente diferentes sequências de DNA. O primeiro identifica e reproduz a sequência de nucleotídeos de uma fita simples do DNA através da codificação genética e, o segundo identifica e reproduz a sequência das bases complementares da fita dupla do DNA através da codificação genômica. Os objetivos principais do presente trabalho são: a) caracterização matemática dos modelos de codificação genética e codificação genômica, b) proposta de um algoritmo para identificação de sequências de DNA; c) mostrar que sequências de DNA com características biológicas distintas, incluindo proteínas, gene e genoma em termos das fitas simples do DNA e da dupla hélice do DNA são identificadas como palavras-código dos códigos G-linearidade (BCH sobre corpos e BCH sobre anéis), reproduzidas e classificadas matematicamente, d) representação algébrica via polinômios primitivos/geradores e seus polinômios recíprocos das fitas simples do DNA (fita codante e fita não codante) e da dupla hélice do DNA, e) mostrar a existência de códigos concatenados (nested codes) entre algumas sequências de direcionamento e suas respectivas proteínas organelares, f) mostrar a arquitetura biológica (Biological frame) do genoma do plasmídeo Lactococcus lactis. Os resultados apresentados neste trabalho contribuem para o desenvolvimento de uma metodologia que poderá ser aplicada em análises mutacionais e de polimorfismos, produção de novos fármacos, melhoramento genético, entre outros, reduzindo tempo e custos laboratoriais / Abstract: One of the great challenges of the scientific community on theories of genetic information, genetic communication and genetic coding is to determine a mathematical structure related to the structure of DNA. This thesis proposes a model of a communication system for genetic and genomic information similar to the model of a digital communication system. Both models are able to identify, reproduce and classify mathematically different sequences of DNA. The first model identifies and reproduces the nucleotide sequence of a single DNA strand via the genetic encoding. The latter identifies and reproduces the sequence of the complementary bases of the double DNA strand through genomic encoding. The aims of this work are: a) a mathematical characterization of the models of genetic coding and genomic coding, b) the proposal of an algorithm for the identification of DNA sequences, c) to show that DNA sequences with distinct biological characteristics, including protein, gene and genome in terms of the single strands of DNA and of the double helix of DNA are identified as codewords of the G-linearity codes (BCH codes over fields and BCH codes over rings), mathematically reproduced and classified, d) algebraic representation via primitive/generator polynomials and their reciprocal polynomials of single DNA strands (coding strand and non-coding strand) and the double DNA strand, e) to show the existence of concatenated codes (nested codes) between some targeting sequences and their corresponding organelles proteins, f) to show the biological architecture (Biological frame) of the plasmid Lactococcus lactis genome. The results presented in this work contribute to the development of a methodology that can be applied to mutational analysis and polymorphisms, production of new drugs, genetic improvement, among others, reducing time and laboratory costs / Doutorado / Telecomunicações e Telemática / Doutor em Engenharia Elétrica

O Hespesvírus 8 humano (HHV-8) é hiperendêmico na população indígena, mas os seus mecanismos de transmissão ainda são desconhecidos. Método: Os anticorpos contra o antígeno LANA e lítico do HHV-8 foram detectados por imunofluorescência, em 339 indígenas e 181 não-indígenas da Amazônia brasileira. Marcadores sorológicos de transmissão oro-fecal (hepatite A), parenteral (hepatites B e C) e sexual (herpes simples 2 e sífilis) foram detectados por Elisa específicos. O DNA do HHV-8, extraído da saliva, foi detectado por nested-PCR e sequenciado. Resultados: Os anticorpos contra o antígeno LANA ou lítico foram detectados em 79,1% nos indígenas e 6,1% nos não-indígenas. A soroprevalência do HHV-8 aumentou com a idade entre os indígenas sendo que as crianças já apresentavam alta prevalência, mas não houve diferença com relação ao sexo em nenhuma das populações. As populações indígenas e nãoindígenas não apresentaram diferenças na soroprevalência para os marcadores de transmissão oro-fecal e parenteral, entretanto a soroprevalência de marcadores de transmissão sexual foi menor entre os indígenas. O DNA do HHV-8 na saliva foi detectado em 23 % dos indígenas soropositivos. A detecção de DNA do HHV-8 diminuiu com a idade e foi mais comum em homens. As amostras positivas foram sequenciadas e agrupadas como subtipo E. Conclusão: Os dados sugerem a hipótese de transmissão horizontal e precoce, via saliva, do subtipo E do HHV- 8 na população indígena. / Human herpes virus type 8 (HHV-8) is hyperendemic in Amerindian populations, but its modes of transmission are unknown. Objectives: 1. Study the Human Herpesvirus-8 Infection and Oral Shedding in Amerindian and Non-Amerindian Populations in the Brazilian Amazon Region. 2. Methods: Antibodies against either HHV-8 latency-associated nuclear antigen (LANA) or HHV-8 lytic antigen were detected, by immunofluorescence assays, in 339 Amerindians and 181 non-Amerindians from the Brazilian Amazon. Serological markers of oro-fecal (hepatitis A), parenteral (hepatitis B and C), and sexual (herpes simplex virus type 2 and syphilis) transmission were measured by specific ELISA. Salivary HHV-8 DNA was detected by use of a nested polymerase chain reaction assay and was sequenced. Results: Antibodies against either LANA antigen or lytic were detected in 79.1% of Amerindians and in 6.1% of non-Amerindians. HHV-8 seroprevalence increased with age among Amerindians and already had high prevalence in childhood but was not sex specific in either population. The 2 populations did not differ in seroprevalence of oro-fecal or parenteral markers, but seroprevalence of markers of sexual transmission was lower among Amerindians. HHV-8 DNA in saliva was detected in 23 % of HHV-8 seropositive Amerindians. Detection of HHV-8 decreased with age and was more common in men. HHV-8 DNA samples were sequenced, and all clustered as subtype E. Conclusion: The data support the hypothesis of early acquisition and horizontal transmission, via saliva, of HHV-8 subtype E in Amerindian populations.

INTRODUÇÃO: Na última década surgiu uma nova técnica, o sequenciamento de nova geração, que, contrário ao método tradicional de Sanger, permite o sequenciamento em paralelo e em larga escala de múltiplos genes, ou até mesmo todos os genes humanos, a menor custo e com uma análise mais acelerada. Essa técnica possibilitou a descoberta de novos genes responsáveis por diversas doenças mendelianas, sendo rapidamente incorporada no contexto clínico. OBJETIVOS: comparar os resultados das técnicas de Sanger e sequenciamento de nova geração em amostras controle; introduzir a técnica de sequenciamento de nova geração no contexto clínico nas casuísticas de doenças ósseas genéticas e RASopatias; avaliar a sensibilidade diagnóstica desta técnica em amostras sem dados clínicos fornecidos. MÉTODOS: o sequenciamento de nova geração (sob a forma de um painel de genes customizado ou do exoma) foi realizado em amostras com mutações identificadas previamente por Sanger e em dois grupos de doenças mendelianas, 144 pacientes com doenças ósseas e 79 com RASopatias, além de 90 amostras sem dados clínicos conhecidos (45 casos e 45 controles). A técnica de Sanger foi aplicada em 29 amostras de doenças ósseas e em 81 amostras para confirmação de variantes identificadas pelo sequenciamento de nova geração. RESULTADOS: A sensibilidade da técnica de sequenciamento de nova geração foi estimada em 95,92% e a especificidade em 98,77%. Na casuística de doenças ósseas, a sensibilidade diagnóstica das amostras sequenciadas por Sanger foi de 69% (20/29), por painel customizado, 60% (75/125) e por exoma, 63% (12/19). Na casuística de RASopatias, a sensibilidade diagnóstica através do exoma foi de 46% (36/79). Como resultado deste trabalho, dois genes novos associados a RASopatias (LZTR1 e SOS2) e um associado a uma displasia esquelética (PCYT1A) foram identificados. Na análise das amostras sem conhecimento prévio da hipótese clínica foi obtida uma sensibilidade diagnóstica de 46,67% (21/45), mas que chegou a 73,08% (14/26) para as hipóteses de erros inatos do metabolismo. CONCLUSÕES: Foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da técnica do sequenciamento de nova geração são altas e correspondentes a valores encontrados por outros grupos na literatura. Essa técnica foi considerada apropriada não apenas no contexto de pesquisa, demonstrado aqui pela descoberta de três novos genes associados a doenças mendelianas, como também para análises clínicas. Neste estudo a técnica foi aplicada com sucesso no contexto clínico, seja pelo painel customizado, seja pelo exoma, com uma positividade semelhante à encontrada pela técnica de Sanger. Mesmo na análise de amostras sem história clínica prévia foi possível identificar variantes patogênicas em quase metade dos casos, e numa porcentagem ainda maior quando a doença era um erro inato do metabolismo. Essa sensibilidade é comparável à obtida pela espectroscopia de massas em Tandem aplicada à triagem de múltiplas condições simultaneamente, o que sugere que a técnica do sequenciamento de nova geração poderá ser incorporada ao programa de triagem neonatal no futuro, ampliando o emprego de testes genéticos em complementaridade aos testes bioquímicos tradicionais / INTRODUCTION: In the last decade a new technique, the next generation sequencing, has emerged, which, contrary to the traditional Sanger method, performs parallel and high-throughput sequencing of multiple genes, or even all human genes, at a lower cost and with a faster analysis. This technique allowed the discovery of new genes responsible for several Mendelian diseases and has been quickly incorporated into the clinical context. OBJECTIVES: to compare the results of Sanger technique and next generation sequencing in control samples; to apply the next generation sequencing technique in the clinical practice to the cases of genetic skeletal disorders and RASopathies; to evaluate the diagnostic yield of this technique in samples without clinical data provided. METHODS: Next generation sequencing (in the form of a customized gene panel or exome) was performed in samples with mutations previously identified by Sanger sequencing and in two groups of Mendelian diseases, 144 patients with skeletal disorders and 79 patients with RASopathies, besides 90 samples with unknown clinical data (45 cases and 45 controls). The Sanger technique was applied in 29 samples of skeletal disorders and in 81 samples for confirmation of variants identified by next generation sequencing. RESULTS: The sensitivity of the next generation sequencing technique was estimated at 95.92% and the specificity at 98.77%. In the case of skeletal disorders, the diagnostic yield of the samples sequenced by Sanger was 69% (20/29), by customized panel, 60% (75/125), and by exome, 63% (12/19). In the individuals with RASopathies, the diagnostic yield through exome sequencing was 46% (36/79). As a result of this study, two new genes associated with RASopathies (LZTR1 and SOS2) and one associated with a skeletal dysplasia (PCYT1A) were identified. In the analysis of the samples without previous knowledge of the clinical hypothesis, a total diagnostic yield of 46.67% (21/45) was obtained, but it was up to 73.08% (14/26) in the group with hypothesis of inborn errors of metabolism. CONCLUSIONS: It was demonstrated that the sensitivity and specificity of the next generation sequencing technique are high and are similar to values found by other groups in the literature. The technique was considered appropriate not only for research, as demonstrated here by the identification of three new genes associated to Mendelian diseases, but also for clinical analysis. In this study the technique was successfully applied in the clinical context, both by customized panel and by exome, with positivity similar to that obtained by the Sanger technique. Even in the analysis of samples with no previous clinical history, it was possible to identify pathogenic variants in almost half of the cases, and an even greater percentage was obtained when the disease was an inborn error of metabolism. This sensitivity is comparable to that obtained by Tandem mass spectroscopy applied to multi-condition screening, suggesting that the next generation sequencing technique may be incorporated in the future into the neonatal screening program, increasing the use of genetic testing in complementarity to the biochemical tests