O uso da microfluídica na área de análises genéticas possibilita não apenas a diminuição de custos, mas também menor manipulação de amostras e reagentes e ainda maior portabilidade das análises. Com isso aumenta a possibilidade da sua utilização em locais remotos, sem a infraestrutura de um laboratório bem equipado. Dispositivos capazes de usar apenas a força centrifuga para movimentação de fluidos juntamente com a utilização de válvulas passivas para controle dos fluidos pode potencializar a sua utilização nos diagnósticos Point-of-Care. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um microdispositivo descartável de poliéster para análises genéticas, visando a extração e amplificação do DNA alvo, de forma rápida, barata, integrada e automatizada. Os resultados confirmam a viabilidade dos dispositivos poliéster-toner (PeT) e poliéster-fita dupla face (PeDF) automatizados de extração, obtendo por meio da extração dinâmica em fase sólida de amostras complexas, DNA com qualidade compatível à técnica da reação em cadeia de polimerase (PCR). Esses resultados foram confirmados por meio da amplificação por PCR dos genes β-globina nas amostras de sangue e urina, e o gene malB nas amostras de Escherichia coli. Também foi confirmado a compatibilidade dos dispositivos de PeT para amplificação por PCR mediado por infravermelho (IV-PCR) do gene malB presente no DNA genômico de bactéria E. coli. Por fim, os dispositivos de extração e amplificação foram interligados para obtenção de um dispositivo integrado e automatizado formado pela combinação de dispositivos fabricados com diferentes filmes e métodos, PeT e PeDF. O controle de todas as soluções no interior dos dispositivos foi realizado por meio da força centrífuga combinada a válvulas passivas, sem qualquer necessidade de equipamento adicional. Portanto, podemos concluir que o dispositivo integrado PeDF - PeT possui grande potencial para aplicações em análises genéticas de forma mais barata, portátil e com menor manipulação das amostras pelo analista. / The development of microfluidics for genetic analysis allows not only cost reduction but also reduces sample and reagents handling, and increases the chances of a portable analysis. With this, increasing the possibility to use the techniques on remote places without the infrastructure of an equipped laboratory. Microdevices capable of using the centrifugal force in combination with passive valves to fluidic control can promote Point-of-Care analysis. The primary goal of this thesis was to associate these tools for the development of a disposable microdevice for genetic analysis, aiming faster, inexpensive, integrated and automated DNA extraction and amplification. The results confirmed the viability of PeT and PeDF automated microdevices, for DNA dynamic solid phase extraction, in providing high-quality DNA compatible to PCR analysis using complex samples. These results were confirmed by the β-globin PCR amplification using blood and urine samples, and the malB gene amplification in Escherichia coli samples. We have also verified the compatibility of the PeT microdevices with IV-PCR for malB gene amplification in genomic E. coli DNA. The extraction and amplification modules were interconnected to obtain an integrated and automated microdevice by the combination of devices made with different films and microfabrication methods, PeT and PeDF. The fluidic control in the devices was made using the centrifugal force combined to passive valves, with no requirement of any extra equipment. Therefore, we can conclude that the integrated PeDF - PeT microdevice has a great potential for cheaper and portable genetic analysis application, with less operator manipulation.

A produção de microssistemas de análises totais (µTAS) tem sido objeto de esforços intensos pela comunidade científica. A necessidade de produção de uma plataforma que realize extração, amplificação e separação de DNA--um verdadeiro \"lab on a chip\"--é impulsionada pelas vantagens associadas com as análises em plataformas miniaturizadas. Esta Tese foca no desenvolvimento de métodos para análises de DNA em dispositivos microfluídicos que podem ser associados em µTAS. Inicialmente, foi feito o desenvolvimento de um novo método de extração em fase sólida em que a eficiência de extração depende da manipulação magnética das partículas e não do fluxo da solução através da fase sólida. A utilidade desta técnica em isolar DNA puro de alta qualidade (amplificável) a partir de uma amostra biológica complexa foi demonstrada através da purificação de DNA a partir de sangue total e a subsequente amplificação do fragmento do gene β-globina. A técnica descrita é rápida, simples e eficiente, permitindo uma recuperação de mais de 60% de DNA a partir de 600 nL de sangue em concentração suficiente para amplificação via reação em cadeia da polimerase (PCR). Após o desenvolvimento da extração dinâmica de DNA em fase sólida (dSPE) em microchip de vidro, o método foi adaptado para o uso em microchips de poliéster-toner (PT). Além da extração, a amplificação e separação de DNA também foram realizadas em microchips de PT. O processo convencional de fabricação dos dispositivos de PT produz canais com 12 µm de profundidade. Este trabalho descreve um novo processo de fabricação dos microchips de PT com canais mais profundos. Uma cortadora a laser de CO2 é usada para definir a estrutura desejada no filme de poliéster recoberto com toner. Estes filmes de poliéster recobertos com toner e os canais recortados são utilizados com partes intermediárias no microchip. A tampa e a base (filmes de poliéster) são laminadas juntamente com as partes intermediárias. Desta forma microchips com canais mais profundos podem ser criados. Microchips com 4 filmes de poliéster (base, tampa, e dois filmes centrais) foram utilizados para realizar dSPE. Estes microchips possuem canais com ~270 µm de profundidade. A dSPE adaptada para os microchips de PT demonstrou ser capaz de extrair eficientemente DNA (~65%), e o DNA purificado apresentou qualidade suficiente para PCR. A PCR realizada em microchips de PT demonstrou que os dispositivos de PT são compatíveis com os reagentes da PCR e o sucesso da reação de PCR foi demonstrado através da amplificação do fragmento de 520 pares de bases do λ-DNA. A possibilidade de manipular diferentes soluções que são necessárias para realizar a extração e a PCR demonstra o grande potencial desta plataforma para realizar análises genéticas. Além da extração e amplificação, a separação também foi demonstrada nos dispositivos de PT. Duas integrações foram feitas nos microchips de PT, dSPE-PCR e PCR-separação. Na primeira integração a dSPE e PCR foram realizadas em uma única câmara, e a amplificação do fragmento de 520 pb do λ-DNA foi demonstrada. Na segunda integração, o dispositivo foi fabricado com espessuras diferentes para os diferentes domínios. No domínio da PCR as câmaras possuem profundidade de ~270 µm de profundidade, e para o domínio da eletroforese os canais apresentam 12 µm de profundidade. A integração realizada sem válvulas foi demonstrada através da amplificação e detecção do fragmento de 520 pb do λ-DNA em um mesmo microchip. Este trabalho demonstra o grande potencial dos microchips de PT para produzir dispositivos descartáveis totalmente integrados para análise genética. / Efforts to develop a microfluidic-based total analysis system (µTAS) have been intense in the scientific community. The goal of achieving a device comprising DNA extraction, amplification, and detection in a single device, a true \"lab on a chip,\" is driven by the substantial advantages associated with such a device. This Thesis focus on development of methods for DNA analysis on microdevices, that can be associated with µTAS. Sequentially, the first step was the development of a novel solid-phase extraction technique in which DNA is bound and eluted from magnetic silica beads in a manner that efficiency is dependent on the magnetic manipulation of the beads and not on the flow of solution through a packed bed. The utility of this technique in the isolation of reasonably pure, PCR-amplifiable DNA from complex samples is shown by isolating DNA from whole human blood, and subsequently amplifying a fragment of the β-globin gene. The technique described here is rapid, simple, and efficient, allowing for recovery of more than 60% of DNA from 600 nL of blood at a concentration which is suitable for PCR amplification. The second step was the use of polyester-toner (PT) microchips for DNA analysis (extraction, PCR and separation). The laser-printing of toner onto polyester films has been shown to be effective for generating PT microfluidic devices with channel depths on the order of 12 µm. We describe a novel and innovative process that allows for the production of multilayer PT microdevices with substantially larger channel depths. Utilizing a CO2 laser to create the microchannel in polyester sheets containing a uniform layer of printed toner, multilayer devices can easily be constructed by sandwiching the channel layer between uncoated cover sheets of polyester containing precut access holes. The process allows for the fabrication of channels several hundred microns in depth, with ~270 µm deep microchannels utilized here to demonstrate the effectiveness of multilayer PT microchips for dynamic solid phase extraction (dSPE) and PCR amplification. Dynamic SPE adapted for PT microchip was able to recover more than 65% of DNA from 600 nL of blood and the DNA was compatible with downstream microchip-based PCR amplification. The compatibility of PT microchips was demonstrated by successful amplification of a 520 bp fragment of λ-phage DNA. The ability to handle the diverse chemistries associated with DNA purtification and extraction is a testimony to potential utility of PT microchips beyond separations, and presents a promising new platform for genetic analysis that is low cost and easy to fabricate. Two integrations were carrying out on PT microchip, dSPE - PCR and PCR-ME. The first integration was made in a single chamber and the amplification of 520 bp fragment of λ-phage was demonstrated. The second integration describes a process that allows the production of a multidomain microchip with different channel depths for the different domains for genetic analysis. The final device was made by the conventional sandwiching of the four polyester films of the PCR domain with the two polyester films for the electrophoresis domain. The successful valveless integration of PCR and separation was demonstrated by amplification and detection of a 520 bp fragment of λ-phage DNA. This work shows the enormous potential of PT microchips to be used for total genetic analysis.

O uso da microfluídica na área de análises genéticas possibilita não apenas a diminuição de custos, mas também menor manipulação de amostras e reagentes e ainda maior portabilidade das análises. Com isso aumenta a possibilidade da sua utilização em locais remotos, sem a infraestrutura de um laboratório bem equipado. Dispositivos capazes de usar apenas a força centrifuga para movimentação de fluidos juntamente com a utilização de válvulas passivas para controle dos fluidos pode potencializar a sua utilização nos diagnósticos Point-of-Care. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um microdispositivo descartável de poliéster para análises genéticas, visando a extração e amplificação do DNA alvo, de forma rápida, barata, integrada e automatizada. Os resultados confirmam a viabilidade dos dispositivos poliéster-toner (PeT) e poliéster-fita dupla face (PeDF) automatizados de extração, obtendo por meio da extração dinâmica em fase sólida de amostras complexas, DNA com qualidade compatível à técnica da reação em cadeia de polimerase (PCR). Esses resultados foram confirmados por meio da amplificação por PCR dos genes β-globina nas amostras de sangue e urina, e o gene malB nas amostras de Escherichia coli. Também foi confirmado a compatibilidade dos dispositivos de PeT para amplificação por PCR mediado por infravermelho (IV-PCR) do gene malB presente no DNA genômico de bactéria E. coli. Por fim, os dispositivos de extração e amplificação foram interligados para obtenção de um dispositivo integrado e automatizado formado pela combinação de dispositivos fabricados com diferentes filmes e métodos, PeT e PeDF. O controle de todas as soluções no interior dos dispositivos foi realizado por meio da força centrífuga combinada a válvulas passivas, sem qualquer necessidade de equipamento adicional. Portanto, podemos concluir que o dispositivo integrado PeDF - PeT possui grande potencial para aplicações em análises genéticas de forma mais barata, portátil e com menor manipulação das amostras pelo analista. / The development of microfluidics for genetic analysis allows not only cost reduction but also reduces sample and reagents handling, and increases the chances of a portable analysis. With this, increasing the possibility to use the techniques on remote places without the infrastructure of an equipped laboratory. Microdevices capable of using the centrifugal force in combination with passive valves to fluidic control can promote Point-of-Care analysis. The primary goal of this thesis was to associate these tools for the development of a disposable microdevice for genetic analysis, aiming faster, inexpensive, integrated and automated DNA extraction and amplification. The results confirmed the viability of PeT and PeDF automated microdevices, for DNA dynamic solid phase extraction, in providing high-quality DNA compatible to PCR analysis using complex samples. These results were confirmed by the β-globin PCR amplification using blood and urine samples, and the malB gene amplification in Escherichia coli samples. We have also verified the compatibility of the PeT microdevices with IV-PCR for malB gene amplification in genomic E. coli DNA. The extraction and amplification modules were interconnected to obtain an integrated and automated microdevice by the combination of devices made with different films and microfabrication methods, PeT and PeDF. The fluidic control in the devices was made using the centrifugal force combined to passive valves, with no requirement of any extra equipment. Therefore, we can conclude that the integrated PeDF - PeT microdevice has a great potential for cheaper and portable genetic analysis application, with less operator manipulation.

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No. of bitstreams: 1 TeseASMCS.pdf: 3312400 bytes, checksum: c898700835e5f7333425c663a26a29d4 (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The intense destruction of the environment contributed to the decline and isolation of wild populations, providing an intensification of genetic drift and inbreeding effects. These factors reduce the ability of individuals to adapt to environmental changes, making them more vulnerable to extinction. The two largest predators of the Americas, the cougar (Puma concolor) and jaguar (Panthera onca) are animals which are threatened by the reduction and fragmentation of habitats, especially in the Atlantic Forest, which is one of the most degraded biomes in the world due to human actions. The present study aimed to investigate both demographic parameters and the distribution of the genetic diversity of cougar and jaguar populations within Atlantic Forest remnants. The chosen areas (Serra da Mantiqueira, Serra do Mar continuous and Iguaçu National Park) are among the most important for the conservation of these cats. Mostly non-invasive samples (feces and hair) were collected in protected areas present in those remaining. The depositor species was confirmed by amplification of the ATP6 gene and the samples were individualized using microsatellite loci, which were also employed in population analyses. The sex of the individuals was determined using a small fragment of amelogenin gene. The results suggest that at least seven individuals of jaguars (4F:3M) inhabit the Iguaçu National Park and 12 (5F:7M) are present in the Serra do Mar continuous. These populations seem to be different, with evidence of low gene flow between them (lack of migrant and mixed individuals and pairs of highly related individuals). In Iguaçu is also estimated to exist at least seven cougars (3F:4M), also four (1F:3M) in the Serra da Mantiqueira and 14 (5F:9M) in the Serra do Mar continuous. Genetic structure was detected in this species, but evidencing gene flow maintenance between two detected populations (sign of migrants and mixed individuals and predominantly non related individuals). In both species high genetic diversity could be observed. This study obtained critical information and still unknown, about the demographic and structure of jaguar and cougar populations in the Atlantic Forest remain. These data will provide substantial information that can be used in monitoring, as well as being crucial and decisive in the increase of effective strategies for the conservation of these species. / A intensa devastação no ambiente vem contribuindo significativamente para o declínio e isolamento de populações selvagens, proporcionando uma intensificação dos efeitos da deriva genética e na taxa de endogamia. Estes fatores, por sua vez, reduzem a habilidade dos indivíduos se adaptarem às mudanças ambientais, tornando-os vulneráveis à extinção. Os maiores predadores das Américas, a onça-parda (Puma concolor) e a onça-pintada (Panthera onca) estão entre os animais ameaçados pela redução e fragmentação dos habitats, principalmente na Mata Atlântica, que é um dos biomas mundiais mais antropizados. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar parâmetros demográficos e a distribuição da diversidade genética de populações de onças presentes em remanescentes de Mata Atlântica. Os fragmentos elegidos (Serra da Mantiqueira, contínuo da Serra do Mar e Parque Nacional do Iguaçu) estão entre os mais importantes para a conservação desses felinos. Amostras predominantemente não invasivas (fezes e pelos) foram coletadas em Unidades de Conservação presentes nesses remanescentes. A espécie depositora das fezes foi confirmada através da amplificação do gene ATP6 e as amostras foram individualizadas por meio de locos de microssatélites, os quais também foram empregados nas análises populacionais. O sexo dos indivíduos foi determinado por meio de um fragmento do gene da amelogenina. Os resultados indicaram que ao menos sete indivíduos de onças-pintadas (4F:3M) habitam o Parque Nacional do Iguaçu e 12 (5F:7M) estão presentes no contínuo da Serra do Mar. Essas populações parecem estar diferenciadas, com evidência de baixo fluxo gênico entre elas (ausência de indivíduos migrantes e misturados, além de pares de indivíduos altamente relacionados). No Iguaçu também foi estimado existir pelo menos sete onças-pardas (3F:4M), além de quatro (1F:3M) na Serra da Mantiqueira e 14 (5F:9M) no contínuo da Serra do Mar. Estruturação genética foi detectada nessa espécie, entretanto, com indícios de fluxo gênico entre as duas populações detectadas (evidência de indivíduos migrantes e misturados, além de pares de indivíduos predominantemente não relacionados). Em ambas as espécies foram exibidos altos níveis de diversidade genética. Este estudo gerou informações primordiais, ainda desconhecidas, sobre a demografia e a estruturação de populações de onças na Mata Atlântica. Tais dados poderão ser utilizados em monitoramentos, além de serem cruciais e decisivos no incremento de estratégias efetivas para a conservação dessas espécies.

A produção de microssistemas de análises totais (µTAS) tem sido objeto de esforços intensos pela comunidade científica. A necessidade de produção de uma plataforma que realize extração, amplificação e separação de DNA--um verdadeiro \"lab on a chip\"--é impulsionada pelas vantagens associadas com as análises em plataformas miniaturizadas. Esta Tese foca no desenvolvimento de métodos para análises de DNA em dispositivos microfluídicos que podem ser associados em µTAS. Inicialmente, foi feito o desenvolvimento de um novo método de extração em fase sólida em que a eficiência de extração depende da manipulação magnética das partículas e não do fluxo da solução através da fase sólida. A utilidade desta técnica em isolar DNA puro de alta qualidade (amplificável) a partir de uma amostra biológica complexa foi demonstrada através da purificação de DNA a partir de sangue total e a subsequente amplificação do fragmento do gene β-globina. A técnica descrita é rápida, simples e eficiente, permitindo uma recuperação de mais de 60% de DNA a partir de 600 nL de sangue em concentração suficiente para amplificação via reação em cadeia da polimerase (PCR). Após o desenvolvimento da extração dinâmica de DNA em fase sólida (dSPE) em microchip de vidro, o método foi adaptado para o uso em microchips de poliéster-toner (PT). Além da extração, a amplificação e separação de DNA também foram realizadas em microchips de PT. O processo convencional de fabricação dos dispositivos de PT produz canais com 12 µm de profundidade. Este trabalho descreve um novo processo de fabricação dos microchips de PT com canais mais profundos. Uma cortadora a laser de CO2 é usada para definir a estrutura desejada no filme de poliéster recoberto com toner. Estes filmes de poliéster recobertos com toner e os canais recortados são utilizados com partes intermediárias no microchip. A tampa e a base (filmes de poliéster) são laminadas juntamente com as partes intermediárias. Desta forma microchips com canais mais profundos podem ser criados. Microchips com 4 filmes de poliéster (base, tampa, e dois filmes centrais) foram utilizados para realizar dSPE. Estes microchips possuem canais com ~270 µm de profundidade. A dSPE adaptada para os microchips de PT demonstrou ser capaz de extrair eficientemente DNA (~65%), e o DNA purificado apresentou qualidade suficiente para PCR. A PCR realizada em microchips de PT demonstrou que os dispositivos de PT são compatíveis com os reagentes da PCR e o sucesso da reação de PCR foi demonstrado através da amplificação do fragmento de 520 pares de bases do λ-DNA. A possibilidade de manipular diferentes soluções que são necessárias para realizar a extração e a PCR demonstra o grande potencial desta plataforma para realizar análises genéticas. Além da extração e amplificação, a separação também foi demonstrada nos dispositivos de PT. Duas integrações foram feitas nos microchips de PT, dSPE-PCR e PCR-separação. Na primeira integração a dSPE e PCR foram realizadas em uma única câmara, e a amplificação do fragmento de 520 pb do λ-DNA foi demonstrada. Na segunda integração, o dispositivo foi fabricado com espessuras diferentes para os diferentes domínios. No domínio da PCR as câmaras possuem profundidade de ~270 µm de profundidade, e para o domínio da eletroforese os canais apresentam 12 µm de profundidade. A integração realizada sem válvulas foi demonstrada através da amplificação e detecção do fragmento de 520 pb do λ-DNA em um mesmo microchip. Este trabalho demonstra o grande potencial dos microchips de PT para produzir dispositivos descartáveis totalmente integrados para análise genética. / Efforts to develop a microfluidic-based total analysis system (µTAS) have been intense in the scientific community. The goal of achieving a device comprising DNA extraction, amplification, and detection in a single device, a true \"lab on a chip,\" is driven by the substantial advantages associated with such a device. This Thesis focus on development of methods for DNA analysis on microdevices, that can be associated with µTAS. Sequentially, the first step was the development of a novel solid-phase extraction technique in which DNA is bound and eluted from magnetic silica beads in a manner that efficiency is dependent on the magnetic manipulation of the beads and not on the flow of solution through a packed bed. The utility of this technique in the isolation of reasonably pure, PCR-amplifiable DNA from complex samples is shown by isolating DNA from whole human blood, and subsequently amplifying a fragment of the β-globin gene. The technique described here is rapid, simple, and efficient, allowing for recovery of more than 60% of DNA from 600 nL of blood at a concentration which is suitable for PCR amplification. The second step was the use of polyester-toner (PT) microchips for DNA analysis (extraction, PCR and separation). The laser-printing of toner onto polyester films has been shown to be effective for generating PT microfluidic devices with channel depths on the order of 12 µm. We describe a novel and innovative process that allows for the production of multilayer PT microdevices with substantially larger channel depths. Utilizing a CO2 laser to create the microchannel in polyester sheets containing a uniform layer of printed toner, multilayer devices can easily be constructed by sandwiching the channel layer between uncoated cover sheets of polyester containing precut access holes. The process allows for the fabrication of channels several hundred microns in depth, with ~270 µm deep microchannels utilized here to demonstrate the effectiveness of multilayer PT microchips for dynamic solid phase extraction (dSPE) and PCR amplification. Dynamic SPE adapted for PT microchip was able to recover more than 65% of DNA from 600 nL of blood and the DNA was compatible with downstream microchip-based PCR amplification. The compatibility of PT microchips was demonstrated by successful amplification of a 520 bp fragment of λ-phage DNA. The ability to handle the diverse chemistries associated with DNA purtification and extraction is a testimony to potential utility of PT microchips beyond separations, and presents a promising new platform for genetic analysis that is low cost and easy to fabricate. Two integrations were carrying out on PT microchip, dSPE - PCR and PCR-ME. The first integration was made in a single chamber and the amplification of 520 bp fragment of λ-phage was demonstrated. The second integration describes a process that allows the production of a multidomain microchip with different channel depths for the different domains for genetic analysis. The final device was made by the conventional sandwiching of the four polyester films of the PCR domain with the two polyester films for the electrophoresis domain. The successful valveless integration of PCR and separation was demonstrated by amplification and detection of a 520 bp fragment of λ-phage DNA. This work shows the enormous potential of PT microchips to be used for total genetic analysis.