Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / La enzima convertidora de angiotensina I homóloga (ECA2) es un nuevo componente del sistema renina-angiotensina-aldosterona que cataliza la hidrólisis de Angiotensina (Ang) I a Ang-(1-9) y de Ang II a Ang-(1-7). Se ha sugerido que esta enzima puede ser un importante blanco terapéutico en el control de las enfermedades cardiovasculares, ya que se ha determinado que tiene acciones antagónicas a la Ang II. Por otra parte, se ha comprobado la utilidad de sobreexpresar diferentes proteínas mediante transferencia genética para estudiar su papel en distintas patologías. El propósito de este trabajo fue construir un adenovirus que sobreexprese ECA2 humana en los cardiomiocitos de rata neonata y determinar si eficiencia de transducción. En este trabajo se caracterizó el gen que codifica para ECA2 humana por secuenciación y posteriormente se clonó en el vector adenoviral pDC316. Para ello el gen ECA2 contenido en un fragmento Xho I / Sal I se insertó en el sitio Sal I del vector pDC316. Como resultado se logró obtener dos construcciones, uno en orientación sentido y otro en orientación antisentido respecto al promotor de expresión PCMV. Ambos plasmidios se caracterizaron por mapa de restricción y por PCR para ECA2. Después de amplificar y purificar por gradiente de CsCl ambos plasmidios, se procedió a la construcción de los adenovirus. Para ello se cotransfectaron células HEK 293 con pBHGloxΔE1,3Cre y ambos vectores adenovirales (pDC316 / ECA2 sentido y antisentido). Después de cultivar entre 30 a 40 días se logró generar 8 clones diferentes de adenovirus para ECA2 sentido (Ad ECA2 sense) y 12 clones para el adenovirus ECA2 antisentido (Ad ECA2 anti). Mediante Western blot para ECA2 se determinó que el Ad ECA2 sense se sobreexpresó la proteína ECA2 en células HEK 293 y en cardiomiocitos en cultivo, en forma dependiente de la cantidad de virus usado en la transducción. Debido a que los niveles basales de proteína ECA2 en cardiomiocitos era muy bajo, sólo se pudo evaluar inhibición de la síntesis de ECA2 del Ad ECA2 anti en cardiomiocitos que sobreexpresaron ECA2 mediante transducción con el Ad ECA2 sense. Además, en cardiomiocitos en cultivo a las 48 h de transducción, Ad ECA2 sense aumentó significativamente la actividad enzimática ECA2 a partir de multiplicidades de infección (MOI) 300. Sin embargo, Ad ECA2 anti en estas mismas condiciones no disminuyó la actividad enzimática ECA2 en cardiomiocitos en cultivo. En resumen, estos datos demuestran que es posible sobreexpresar ECA2 humano mediante vectores adenovirales en cardiomiocitos de rata neonata in vitro.

Resultados controversos têm sido obtidos em estudos experimentais e clínicos com a infusão de insulina e glicose na lesão isquemia-reperfusão, havendo muito á ser esclarecido sobre os mecanismos deste tratamento. No coração, a insulina tem efeitos sobre a utilização dos substratos, fluxo coronariano, atua como antiinflamatório e, propõem-se efeitos diretos na sobrevivência celular; estes efeitos devem-se a ativação da via fosfatidilinositol 3-cinase (PI3k)-Akt. As interações intracelulares entre os sistemas de sinalização da insulina e da angiotensina-II são muitas, salientando-se a possível importância do cross-talk angiotensina-II/insulina. Apesar da popularidade das preparações em corações isolados no estudo das lesões isquemia-reperfusão, diversos protocolos vêm sendo utilizados quanto a duração da isquemia, dificultanto a escolha do melhor período de isquemia para se testar os efeitos de fármacos sobre a recuperação da função cardíaca. Nesse trabalho objetivamos: determinar o melhor tempo de isquemia para investigar a recuperação funcional e a capacidade de resposta do sistema reninaangiotensina (SRA) tecidual em coração isolado e os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. No estudo 1 investigamos a recuperação funcional e a capacidade de resposta do SRA tecidual em corações isolados e submetidos a diferentes períodos de isquemia. Os corações foram submetidos a diferentes períodos de isquemia global (20, 25 ou 30 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: Krebs-Henseleit (KH) (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio) ou KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC). O índice de contratilidade ventricular (dP/dtmax) e o duplo produto foram reduzidos nos corações expostos à 25 min (~73%) e 30 min de isquemia (~80%) vs 20 min de isquemia. A pressão ventricular diastólica (PVD) e a pressão de perfusão (PP) aumentaram nos corações expostos à 25 min (5,5 e 1,08 vezes, respectivamente) e 30 min de isquemia (6 e 1,10 vezes, respectivamente) vs 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou uma diminuição no dP/dtmax e no duplo produto (~85-94%) em todos os períodos isquêmicos, e um aumento na PVD e na PP (6,9 e 1,25 vezes, respectivamente) apenas aos 20 min isquemia. O captopril reverteu parcialmente ou totalmente os efeitos da angiotensina-I sobre a recuperação funcional, somente nos períodos 20 e 25 min de isquemia. Esses dados sugerem que a transição de dano pós-isquêmico leve/moderado para severo ocorre após 20 min de isquemia. Dessa forma, 20 min de isquemia é o melhor período de tempo para se estudar os efeitos de abordagens farmacológicas sobre a recuperação funcional. No estudo 2 investigamos os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. Os corações foram submetidos a um período de isquemia global (20 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: KH (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio), KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC), KH + insulina (grupo Insulina), KH + insulina + angiotensina-I (grupo IA) e KH + insulina + angiotensina-I + captopril (grupo IAC). Durante a recuperação, o grupo Angio apresentou uma redução de ~24% na pressão ventricular desenvolvida (PVDes) e de ~29% no dP/dtmáx vs período basal, e apresentou um aumento de ~2,7 vezes na PVD vs período basal, estes efeitos foram revertidos parcialmente ou totalmente pelos tratamentos AC, IA e IAC. O grupo Angio apresentou uma redução de ~24% no duplo produto vs período basal, este efeito foi revertido pelo tratamento IA, que também foi maior vs grupos KH e AC. Os grupos Angio e IA apresentaram um aumento de ~20% na PP vs período basal, e todos os grupos (exceto o insulina) foram maiores vs grupo KH; os grupos AC e IAC não diferiram dos grupos Angio e insulina. A Akt fosforilada foi maior nos grupos insulina e IA vs grupos KH (~47% e ~42%, respectivamente) e Angio (~60% e ~55%, respectivamente), os grupos AC e IAC não diferem dos demais. A AMPK fosforilada foi ~31% maior nos grupos insulina, IA e IAC vs grupos KH, Angio e AC. Os níveis de TBA-RS no grupo KH foram ~73% maior vs outros grupos; a quimiluminescência também foi maior (~2,2 vezes) no grupo KH vs outros grupos, e o grupo IA foi ~35% menor vs grupo Angio. A atividade da SOD não foi alterada pelos tratamentos, mas a atividade da catalase foi ~28% maior no grupo KH vs outros grupos (exceto o IA, P = 0,058) e a atividade da GST foi menor no grupo insulina vs grupos Angio e AC (~45% e ~50%, respectivamente). Os grupos Angio, AC e IAC apresentaram uma menor concentração da Cu/ZnSOD vs grupo KH (~40%, ~43% e ~27%, respectivamente), os grupos insulina e IA não diferem do grupo KH. Nenhum dos tratamentos alterou a concentração das enzimas GST e eNOS, os níveis de NOX ou a translocação do GLUT-4. Assim, a insulina ativa a via PI3k-Akt e parece exercer uma melhor regulação do estado redox celular, podendo ainda ativar a AMPK e ambas atuarem sinergicamente para um melhor perfil metabólico do miocárdio. Desse modo, a insulina administrada no inicio da reperfusão opõe-se aos efeitos deletérios da angiotensina-II e exerce um efeito cardioprotetor.

Situações estressantes provocam a ativação dos eixos hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e simpato-adrenal. A ativação destes sistemas leva a alterações comportamentais e periféricas que melhoram a habilidade do organismo para enfrentar a ameaça estressora e retornar à homeostase, aumentando, desta forma, a sua chance de sobrevivência. Dentre as alterações produzidas pela resposta ao estresse inclui-se a inibição da função reprodutiva, atribuída à ação central do hormônio liberador de corticotropina (CRH). Além da ativação dos eixos HPA e simpato-adrenal, os estímulos estressantes aumentam o nível de Angiotensina II (Ang II) central e periférico. Além das múltiplas funções bem conhecidas na regulação do equilíbrio hídrico e da pressão arterial, a Ang II exerce também um papel inibidor do comportamento sexual e é um importante estimulador do eixo HPA, por estimular a secreção do CRH. Neste trabalho foi testada a hipótese de que a inibição do comportamento sexual, produzida pelo estresse, ocorre via estimulação do eixo HPA, pela Ang II, na porção parvocelular do núcleo paraventricular hipotalâmico (PVN). Para tanto, o trabalho foi dividido em dois experimentos. O primeiro estudou o “Efeito da administração sistêmica crônica de Losartan sobre a inibição do comportamento de fêmeas, produzido pelo estresse agudo de contenção”, enquanto o segundo analisou o “Efeito da microinjeção de Losartan, na porção parvocelular do PVN, sobre a inibição do comportamento de fêmeas produzido pelo estresse agudo de contenção”. Foram utilizadas ratas Wistar adultas, com ciclos estrais regulares, divididas em quatro grupos, em cada experimento. A administração de Losartan se deu de forma sistêmica (na água de beber) ou local (microinjeção na porção parvocelular do PVN), conforme o experimento. O protocolo de estresse agudo utilizado foi o de contenção, o qual teve duração de 15 minutos. O registro do comportamento sexual, com a finalidade de analisar a receptividade sexual da fêmea, teve duração de 30 minutos. Imediatamente após tal registro, todos os animais foram decapitados para coleta de sangue e posterior dosagem hormonal de corticosterona. Os resultados mostraram que o estresse agudo por contenção, na noite do proestro, provoca uma redução significativa no quociente de lordose da fêmea e que esse efeito é prevenido pela administração de Losartan, na água de beber ou injetado localmente no PVN. Estes resultados indicam uma participação da Ang II na inibição do comportamento sexual produzida pelo estresse; esta ação ocorre por meio dos receptores AT1, na porção parvocelular do PVN. Este contexto sugere a possibilidade de que a inibição do comportamento sexual, provocada pelo estresse, não se dá por um efeito direto da Ang II sobre áreas moduladoras deste comportamento, e sim por meio do aumento da secreção de CRH, sabidamente um inibidor direto do comportamento sexual. / Stressful situations cause the activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA) and the sympathetic-adrenal axis. The activation of those systems leads to behavior and peripheral alterations that improve the ability of the organism to face the stressful threat and return to homeostasis, increasing, this way, the chances of survivor. Among the alterations produced by the answer to the stress it is included the reproductive function, given to the central action of the corticotropin-releasing hormone (CRH). Beyond the activation of the HPA axis and the sympathetic-adrenal axis, the stressful stimulus increases the level of Angiotensin II (Ang II) central and peripheral. Besides the multiple well-known functions in the regulation of the water balance and blood pressure, the Ang II also performs an inhibitor role of the sexual behavior and is an important stimulator from HPA axis, for stimulating the CRH secretion. In this paper was tested the hypothesis that the inhibition of the sexual behavior, produced by the stress, happens by way of stimulation of the HPA axis, by the Ang II, in the parvocellular portion of the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN). For this, the paper has been divided into two experiments. The first studied the “Effect of the chronic systemic administration of Losartan about the inhibition on the behavior of females, produced by the acute restraint stress”, while the second one analyzed the “Effect of microinjection of Losartan in the parvocellular portion of the PVN, about the inhibition on the behavior of females produced by the acute restraint stress.” Wistar adults females rats were used, with regular estrous cycles, divided into four groups, in each experiment. Losartan was used in a systematic way (in their drinking water) or local (microinjection in the parvocellular portion of the PVN), according to the experiment. The protocol of acute stress used was restraint, in which lasted for 15 minutes. The sexual behavior registry, aimed to analyze the sexual acceptance of the female, lasted for 30 minutes. Right after the registry, all animals were beheaded to blood collection and afterwards the measurements of hormonal corticosterone. The outcome showed that the acute stress of restraint, in the night of the proestrus, causes a relevant decrease in the lordosis quotient of the female and that this effect is prevented by using Losartan, in the drinking water or injected in the PVN. These results imply a role of Ang II in the inhibition of the sexual behavior produced by the stress; this action happens by means of the AT1 receivers, in the parvocellular portion of the PVN. This context suggest the possibility that the inhibition of the sexual behavior, caused by the stress, isn’t due to a direct effect of Ang II about the modulating areas of this behavior, and yes by the increase of the CRH secretion, well-known direct inhibitor of sexual behavior.

O estresse pode influenciar o comportamento reprodutivo em fêmeas, sendo a angiotensina II (Ang II) central um peptídeo que participa das respostas ao estresse e da modulação do comportamento sexual. A amígdala medial (MeA), importante estrutura reguladora deste comportamento, está fortemente envolvida na resposta ao estresse. O presente estudo tem por objetivo avaliar o efeito do estresse agudo por contenção na noite do proestro sobre a receptividade sexual, concentração plasmática de corticosterona e a participação da Ang II e MeA sobre estes efeitos. Foram utilizadas ratas Wistar adultas com ciclos estrais regulares. O protocolo de estresse agudo utilizado foi contenção por 15 min na noite do proestro. A participação da Ang II foi avaliada pela microinjeção de Ang II e antagonistas dos receptores de Ang II (losartan e PD12319) na MeA. Foi avaliado o quociente de lordose e a concentração plasmática de corticosterona em diferentes tempos. O estresse ou a microijeção de Ang II na MeA provocaram significativa redução do comportamento sexual. O bloqueio dos receptores AT1 ou AT2 presentes na MeA preveniram tanto o efeito do estresse como da microinjeção de Ang II neste núcleo sobre a receptividade sexual. O estresse provocou aumento da concentração plasmática de corticosterona e este efeito foi prevenido pelo bloqueio dos receptores AT1 na MeA. Concluímos que o estresse agudo por contenção na noite do proestro reduz o comportamento sexual e ativa o eixo HPA, e estes efeitos são mediados pela Ang II agindo na MeA. / Stress might influence the reproductive behavior in females, and central angiotensin II (Ang II) is a peptide that plays a role in the stress response and in the modulation of sexual behavior. The medial amygdala (MeA), an important structure that regulates this behavior, is strongly involved in the stress response. The aim of the present study was to evaluate the effect of acute restraint stress on the night of proestrus on sexual receptivity, plasma corticosterone concentration and the participation of Ang II and MeA in these effects. Adult female Wistar rats with regular estrous cycles were utilized. The acute stress protocol utilized was the restraint stress for 15 minutes on the night of proestrus. The participation of Ang II was evaluated by injecting Ang II and Ang II receptor antagonists (losartan and PD12319) into the MeA. The lordosis quotient and plasma corticosterone concentration were evaluated. Stress or the microinjection of Ang II into the MeA significantly reduced sexual behavior. The blockade of AT1 or AT2 receptors in the MeA prevented the effect of stress and the effect of Ang II microinjection into this nucleus on sexual receptivity. Stress caused an increase in plasma corticosterone and this effect was prevented by blockade of AT1 receptors in the MeA. We concluded that acute restraint stress on the night of proestrus reduces sexual behavior and activates the HPA, and these effects are mediated by Ang II acting in the MeA.

O sistema renina - angiotensina tem um papel importante e bem descrito na modulação do sistema cardiovascular. Sua participação em processos cognitivos tem sido assunto de diversos trabalhos. É de particular interesse a modulação da memória pela ação de seus metabólitos funcionais, angiotensina II (AII) e IV (AIV), no sistema nervoso central. Apesar dos diversos trabalhos abordando o assunto, o papel da AII no processamento da memória continua controverso. Para tentar aprofundar essa questão utilizamos o paradigma da esquiva inibitória de uma única sessão em conjunto com a infusão intra-hipocampal de AII, AIV, e antagonistas AT1 ou AT2. Ratos foram implantados com cânulas na região CA1 do hipocampo dorsal, alguns dias depois da cirurgia foram treinados em uma tarefa de esquiva inibitória e, em tempos diferentes após o treino, foram infundidos com veículo ou uma das drogas descritas acima. Os animais foram testados 3 ou 24 h após o treino; no primeiro caso para avaliar memória de curta duração (STM) e para avaliar memória de longa duração (LTM) no segundo. Verificou-se um efeito amnésico para a AII na consolidação da LTM e STM quando infundida imediatamente ou 30 min pós-treino, e na evocação da LTM quando infundida 15 min antes do teste. O efeito amnésico da AII parece ser modulado exclusivamente por sua ação em receptores AT2, não tendo participação nem receptores AT1, nem sua conversão endógena em AIV. A AII endógena não parece ter qualquer participação na formação da memória de esquiva inibitória.

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose. / Platelets are cytoplasmic fragments derived from bone marrow megakaryocytes rupture, whose major role is related to the vascular integrity maintenance. The extracellular nucleotides ATP and ADP as well as adenosine have been implicated in a great number of physiological functions: ADP is the major factor recruiting platelet, whereas ATP has been considered as a competitive inhibitor of ADP-induced platelet aggregation. Adenosine is a molecule able to induce vasodilatation and to inhibit platelet aggregation. Thus, the maintenance of normal purinergic signalling has been showed as an important issue for the treatment of cardiovascular diseases. The nucleoside di and triphosphate can be hydrolyzed by members of several families of membrane-bound or soluble ectonucleotidases, including ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterases (E-NPPs), that together with an ecto-5’-nucleotidase lead to adenosine formation. On the platelets ecto-surface, both E-NTPDase and ecto-5’-nucleotidase are already described. The renin-angiotensin system is the most important regulator of renal and cardiovascular function developing a fundamental role in the arterial blood pressure homeostasis and in the electrolytic balance. Angiotensin II (ANGII) induces physiologically the platelet activation, probably due to its vasoconstrictors properties. The aims of this study were: 1) to kinetically characterize the enzyme E-NPP from rat blood platelet, using the artificial marker substrate p-Nph-5’TMP and 2) to clarify, even though in part, the effects of ANGII upon extracellular nucleotide hydrolysis by rat platelets ectoenzymes. In the first chapter, we describe an enzymatic activity that shares the major characteristics already described for E-NPPs: optimum alkaline pH; KM and Vmax calculated values of approximately 106.22 ± 17.83 μM and 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively; and divalent cation dependence. Besides, AMP inhibited only p-Nph-5’TMP hydrolysis. On the other hand, sodium azide, in high concentrations, ANGII and gadolinium chloride just changed ATP or ADP or both hydrolysis. In the second chapter, we show that ANGII was able to increase ATP, ADP and AMP hydrolysis in platelets from rats in all tested dosis (5, 50, 500 e 5000 picomoles). However, no modification was observed regarding p-Nph-5'TMP hydrolysis. Additionally, we verified an increase on AMP hydrolysis and a reduction on p-Nph-5'TMP hydrolysis in platelets from spontaneously hypertensive rats (SHR) when compared to Wistar normotensive rats. Finally, this work shows the kinetic and biochemistry characterization of an E-NPP enzyme on the intact platelet surface as being part of a complex system for nucleotide hydrolysis that could contribute for the antiplatelet therapies and vascular diseases treatment. In addition, we present some results showing interactions between rat platelet angiotensinergic and adenosinergic systems that could contribute to the understanding and treatment of cardiovascular diseases such as hypertension and atherosclerosis.

A Angiotensina II (Ang II) é um octapeptídeo que exerce múltiplas ações centrais e periféricas, entre as quais a modulação de alguns tipos de comportamentos. Estudos prévios demonstram que microinjeções de Ang II na amígdala medial (MeA) diminui o comportamento sexual em ratos machos. Para testar a hipótese de que a Ang II central está envolvida na modulação do comportamento sexual em fêmeas, este peptídeo foi injetado na MeA em ratas. Para isto foram utilizadas ratas Wistar adultas nas quais foram implantadas cânulas guias bilateralmente na amígdala medial por estereotaxia. Após a cirurgia estereotáxica, as ratas foram divididas em seis grupos experimentais: salina - controle (n = 11), 10 pg de Ang II (n = 10), 25 pg de Ang II (n = 11), 50 pg de Ang II (n = 11), 100 pg de Ang II (n = 11) e 200 pg (n = 11) . As microinjeções (0,3 μl) na amígdala medial foram realizadas na noite do proestro, quinze minutos antes do registro de comportamento sexual. O registro comportamental consistiu na observação da fêmea em proestro junto a um macho adulto por 15 minutos Os parâmetros comportametais analisados foram: quociente de lordose (número de lordose/número de montas), freqüência e duração de locomoção. Na manhã seguinte ao registro comportamental foi contado o número de óvulos destas fêmeas. Os resultados mostraram uma redução significativa no quociente de lordose nos grupos que receberam as doses de 100 e 200 pg de Ang II , enquanto que os demais grupos não apresentaram diferença significativa quando comparados com o controle. Este efeito parece não ser devido a uma inibição comportamental geral, pois tanto a freqüência como a duração de locomoção não demonstraram alterações significativas. Estes dados sugerem que a Ang II participa da modulação do comportamento sexual em ratas via MeA. / Angiotensin II (Ang II) is a regulatory peptide well known for its role in the control of fluid balance and cardiovascular function. Previous studies showed that the microinjection of this peptide intraventricular or into the medial amygdala (MeA) decreased sexual behavior in male rats. To test the hypothesis that brain Ang II is involved in the modulation of sexual behavior in female rats, this peptide was injected into the medial amygdaloid nucleus (MeA). The sexual behavior of female adult rats (lordosis reflex) was evaluated, 15 min after bilateral microinjection (0,3 μl) of saline - control and 5 doses of Ang II: 10 ,25, 50, 100 and 200 pg. Data (means ± SEM) were analized using a one-way ANOVA test. Pos hoc analyzes was performed using the Newman-Keuls test. Statistic significance was defined as p <0,05. The doses of 100 and 200 pg Ang II caused inhibition of lordosis quotient – LQ (number of lordosis/ number of mouts). However, this peptide no had effects on the frequency and duration of general locomotor behaviour or on ovulation as compared to saline group. These data suggest that Ang II, in MeA, could exert a neuromodulatory effects on sexual behaviour in female rats.

Introdução: o controle parcial das ações da angiotensina II (Ang-II) pode ser realizado pelo uso de bloqueadores do receptor da angiotensina II (BRA). Seus efeitos pró-aterogênico e prótrombótico têm sido alvo de estudos clínicos e experimentais na literatura científica internacional. Objetivos: avaliar os efeitos antiateroscleróticos e antitrombóticos de bloqueador do receptor da angiotensina II, a irbesartana, em modelo experimental de trombose arterial em coelhos submetidos à desendotelização aórtica e dieta rica em colesterol. Material e Métodos: foram analisados cinqüenta e dois coelhos Nova Zelândia, machos, brancos e pesando, em média, 2,96kg. Todos os animais foram submetidos à desendotelização aórtica por cateter Fogarty 3F e, a seguir, divididos em dois grupos. Ao grupo de tratamento ativo foi administrado irbesartana, na dose de 37,5mg⁄dia, via oral, e, ao grupo controle, placebo. Ambos os grupos receberam, durante vinte e oito dias, dieta rica em colesterol 0.33%. Ao final deste período, os animais foram mortos, após receberem tratamento indutor de trombose à base de veneno da víbora Russelis e adrenalina. Resultados: no grupo irbesartana, oito dos vinte e sete animais (29.6%) desenvolveram trombose arterial, comparativamente a quatorze dos vinte e cinco (56%) no grupo controle (p=0.064). A extensão média de trombose arterial, avaliada por vídeoplanimetria, foi de 78,3±111,4 mm2 no grupo controle, e 10,7±24,5 mm2, no grupo irbesartana (p=0.010). Ocorreu uma redução significativa das lesões ateroscleróticas caracterizadas por fibrose da íntima, fibrose da média e no escore global de lesão vascular nos animais que receberam irbesartana. No grupo irbesartana, a média do colesterol total foi 419.9 ± 377 mg/dl e, no grupo controle, 702.6 ± 279 mg/dl (P=0.004), LDL 340,6 ± 338 mg/dl e 561,7 ± 247 mg/dl (P=0.013), triglicérides 57,8± 28 mg/dl e 107,8± 19 mg/dl (P<0,001) e HDL 163,9 ± 115 mg/dl e 117,5 ± 184 mg⁄dl (P=NS) respectivamente. Conclusões: a irbesartana melhorou o perfil lipídico, reduziu a extensão da trombose arterial e o escore de resposta à lesão vascular, neste modelo experimental de lesão endotelial química e mecânica associados à hipercolesterolemia e vasoconstricção.

O estresse pode influenciar o comportamento reprodutivo em fêmeas, sendo a angiotensina II (Ang II) central um peptídeo que participa das respostas ao estresse e da modulação do comportamento sexual. A amígdala medial (MeA), importante estrutura reguladora deste comportamento, está fortemente envolvida na resposta ao estresse. O presente estudo tem por objetivo avaliar o efeito do estresse agudo por contenção na noite do proestro sobre a receptividade sexual, concentração plasmática de corticosterona e a participação da Ang II e MeA sobre estes efeitos. Foram utilizadas ratas Wistar adultas com ciclos estrais regulares. O protocolo de estresse agudo utilizado foi contenção por 15 min na noite do proestro. A participação da Ang II foi avaliada pela microinjeção de Ang II e antagonistas dos receptores de Ang II (losartan e PD12319) na MeA. Foi avaliado o quociente de lordose e a concentração plasmática de corticosterona em diferentes tempos. O estresse ou a microijeção de Ang II na MeA provocaram significativa redução do comportamento sexual. O bloqueio dos receptores AT1 ou AT2 presentes na MeA preveniram tanto o efeito do estresse como da microinjeção de Ang II neste núcleo sobre a receptividade sexual. O estresse provocou aumento da concentração plasmática de corticosterona e este efeito foi prevenido pelo bloqueio dos receptores AT1 na MeA. Concluímos que o estresse agudo por contenção na noite do proestro reduz o comportamento sexual e ativa o eixo HPA, e estes efeitos são mediados pela Ang II agindo na MeA. / Stress might influence the reproductive behavior in females, and central angiotensin II (Ang II) is a peptide that plays a role in the stress response and in the modulation of sexual behavior. The medial amygdala (MeA), an important structure that regulates this behavior, is strongly involved in the stress response. The aim of the present study was to evaluate the effect of acute restraint stress on the night of proestrus on sexual receptivity, plasma corticosterone concentration and the participation of Ang II and MeA in these effects. Adult female Wistar rats with regular estrous cycles were utilized. The acute stress protocol utilized was the restraint stress for 15 minutes on the night of proestrus. The participation of Ang II was evaluated by injecting Ang II and Ang II receptor antagonists (losartan and PD12319) into the MeA. The lordosis quotient and plasma corticosterone concentration were evaluated. Stress or the microinjection of Ang II into the MeA significantly reduced sexual behavior. The blockade of AT1 or AT2 receptors in the MeA prevented the effect of stress and the effect of Ang II microinjection into this nucleus on sexual receptivity. Stress caused an increase in plasma corticosterone and this effect was prevented by blockade of AT1 receptors in the MeA. We concluded that acute restraint stress on the night of proestrus reduces sexual behavior and activates the HPA, and these effects are mediated by Ang II acting in the MeA.

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose. / Platelets are cytoplasmic fragments derived from bone marrow megakaryocytes rupture, whose major role is related to the vascular integrity maintenance. The extracellular nucleotides ATP and ADP as well as adenosine have been implicated in a great number of physiological functions: ADP is the major factor recruiting platelet, whereas ATP has been considered as a competitive inhibitor of ADP-induced platelet aggregation. Adenosine is a molecule able to induce vasodilatation and to inhibit platelet aggregation. Thus, the maintenance of normal purinergic signalling has been showed as an important issue for the treatment of cardiovascular diseases. The nucleoside di and triphosphate can be hydrolyzed by members of several families of membrane-bound or soluble ectonucleotidases, including ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterases (E-NPPs), that together with an ecto-5’-nucleotidase lead to adenosine formation. On the platelets ecto-surface, both E-NTPDase and ecto-5’-nucleotidase are already described. The renin-angiotensin system is the most important regulator of renal and cardiovascular function developing a fundamental role in the arterial blood pressure homeostasis and in the electrolytic balance. Angiotensin II (ANGII) induces physiologically the platelet activation, probably due to its vasoconstrictors properties. The aims of this study were: 1) to kinetically characterize the enzyme E-NPP from rat blood platelet, using the artificial marker substrate p-Nph-5’TMP and 2) to clarify, even though in part, the effects of ANGII upon extracellular nucleotide hydrolysis by rat platelets ectoenzymes. In the first chapter, we describe an enzymatic activity that shares the major characteristics already described for E-NPPs: optimum alkaline pH; KM and Vmax calculated values of approximately 106.22 ± 17.83 μM and 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively; and divalent cation dependence. Besides, AMP inhibited only p-Nph-5’TMP hydrolysis. On the other hand, sodium azide, in high concentrations, ANGII and gadolinium chloride just changed ATP or ADP or both hydrolysis. In the second chapter, we show that ANGII was able to increase ATP, ADP and AMP hydrolysis in platelets from rats in all tested dosis (5, 50, 500 e 5000 picomoles). However, no modification was observed regarding p-Nph-5'TMP hydrolysis. Additionally, we verified an increase on AMP hydrolysis and a reduction on p-Nph-5'TMP hydrolysis in platelets from spontaneously hypertensive rats (SHR) when compared to Wistar normotensive rats. Finally, this work shows the kinetic and biochemistry characterization of an E-NPP enzyme on the intact platelet surface as being part of a complex system for nucleotide hydrolysis that could contribute for the antiplatelet therapies and vascular diseases treatment. In addition, we present some results showing interactions between rat platelet angiotensinergic and adenosinergic systems that could contribute to the understanding and treatment of cardiovascular diseases such as hypertension and atherosclerosis.