Le suivi des interactions entre protéines, localisées à la membrane plasmique ou à l'intérieur de cellules, a été réalisé au cours de cette thèse par imagerie de fluorescence et par l'analyse de processus dits de FRET (Forster Resonance Energy Transfer). Pour quantifier le FRET entre nos protéines d'intérêt, nous avons choisi le contraste de durée de vie de fluorescence car cette méthode est indépendante de la concentration et de l'intensité de fluorescence. Afin d'obtenir une résolution suffisante pour des problématiques neurobiologiques, un microscope TIRFLIM (Total Internal Reflection Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) avait préalablement été développé. Celui-ci nous permet de faire de l'imagerie en plein champ avec une résolution axiale sub-longueur d'onde. Ce dispositif a été calibré et optimisé au cours de cette thèse pour répondre au mieux à des problématiques biologiques. Différentes approches ont ainsi été testées dans le but de calibrer la profondeur de pénétration de l'onde évanescente. Des surfaces plasmoniques ont entre autres été utilisées pour augmenter la sélectivité axiale du montage. Notre microscope a été dédié à l'étude de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre la protéine précurseur de l'amyloïde APP, protéine transmembranaire impliquée dans la maladie d'Alzheimer et une de ses enzymes de clivage BACE1. Nous avons ainsi effectué un suivi dynamique de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre APP et BACE1 dans des cellules HEK-293 et dans des cultures primaires de neurones d'hippocampe d'embryons de rat, de la membrane plasmique à l'intérieur des cellules grâce à notre dispositif TIRFLIM. La mesure d'anisotropie de fluorescence résolue en temps a également été implémentée sur notre montage. Ces mesures résolues en temps et en polarisation ont permis de mesurer le temps de corrélation rotationnelle de fluorophores et de mettre en évidence de manière qualitative différents niveaux d'homodimérisation de protéines impliquées dans la maladie d'Alzheimer.

Cette étude a consisté en le développement et l’évaluation de nouvelles molécules pour la radiochimiothérapie concomitante. Ce travail a abouti à la conception de nouveaux agents chimiothérapeutiques duaux basés sur la combinaison covalente de deux radiosensibilisateurs: un inhibiteur de la PARP d’une part, et un alkylant de l’ADN (complexe de platine ou témozolomide) d’autre part. Les évaluations biologiques ont permis de mettre en évidence l’intérêt d’une molécule duale inhibiteur de la PARP/platine. Parallèlement à ce projet, le développement d’outils moléculaires pour l’étude d’inhibiteurs de la PARP a été entrepris. Ainsi, plusieurs sondes d’affinité ont été conçues pour une étude d’inhibiteurs de la PARP par protéomique chimique. Ce travail a permis de valider la spécificité d’une sonde d’affinité pour la PARP1 et la PARP2. Finalement, des molécules fluorescentes inhibitrices de la PARP ont été développées dans l’objectif d’un criblage d’inhibiteurs de PARP3 par anisotropie de fluorescence. / The main topic of this work was the development and biological evaluation of dual molecules for concomitant chemoradiotherapy. To this end, new dual chemotherapeutic agents were designed by linking covalently two radiosensitizers: a PARP inhibitor and an alkylating agent (platinum complex or temozolomide). This study led to an efficient PARP inhibitor/platinum dual molecule. A complementary approach was to develop affinity probes to study PARP inhibitors by a chemical proteomic method. This study permitted to validate the selectivity of an affinity probe for PARP1 and PARP2. Finally, fluorescent PARP inhibitor probes were synthesised and evaluated for a PARP3 screening by fluorescence anisotropy.

Les récepteurs nucléaires sont membres d'une famille de protéines activées par des ligands et qui régulent la transcription de nombreux gènes. Le récepteur nucléaire RevErbα est constitutivement inhibiteur de la transcription de gènes cibles via le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor et Histone DeAcetylase 3). Ce complexe joue un rôle important dans le contrôle de l'horloge circadienne et de la glucogenèse via la régulation de la transcription des gènes codant pour les enzymes G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) et PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase). Ces deux enzymes sont impliquées dans la glucogénèse qui est dérégulée en cas de diabète de type 2. Ce travail est basé sur l'investigation de l'interaction du récepteur nucléaire RevErbα avec deux corépresseurs: son partenaire établit NCor et SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Malgré ce qui est rapporté dans la littérature, c'est à dire que SMRT et RevErbα n'interagissent pas fonctionnellement in vivo, nous avons choisis d'étudier cette interaction à cause de la similarité de séquence entre les deux corépresseurs, mais également parce que les peptides des deux corépresseurs ont été rapportés comme interagissant avec d'autre récepteurs nucléaire. Afin d'étudier ces interactions, nous avons utilisé deux techniques complémentaires basées sur l'émission de fluorescence: Une technique in vitro qui est l'anisotropie de fluorescence et une technique de microscopie de fluorescence in cellulo appelée Number & Brightness. En plus de cette étude de l'interaction entre le récepteur nucléaire et les corépresseurs, nous nous sommes intéressé à déterminer l'effet de plusieurs ligands sur cette interaction. Trois ligands ont été testés: l'hème qui est rapporté comme étant le ligand naturel de RevErbα et deux ligands synthétiques et non naturels de RevErbα (SGN et SD7). Grâce à l'anisotropie de fluorescence (in vitro), nous avons confirmé et quantifié l'interaction entre le domaine de liaison au ligand (LBD) de RevErbα et un peptide NCor contenant le domaine d'interaction majeur (ID1 pour RevErbα et nous avons déterminé l'effet des trois ligands sur cette interaction. Nous avons également quantifié l'interaction entre RevErbα et d'autres peptides provenant de NCor et correspondant aux autres domaines d'interaction (ID2 et ID3) pour sa liaison à RevErbα. Nous avons déterminé que l'hème et le SD7 ont un effet déstabilisateur de la liaison de RevErbα à NCor in vitro, alors que le ligand SGN améliore la stabilité de complexe. Nous avons également confirmé une interaction entre RevErbα et un peptide corépresseur issu de SMRT. Afin d'étudier l'interactions des protéines pleine taille dans un contexte plus fonctionnel, nous avons utilisé le 2 photons-2 couleurs Number & Brightness. C'est une technique de microscopie à fluorescence basée sur la fluctuation de l'intensité de fluorescence pour étudier les interactions spécifiques de RevErbα avec NCor et SMRT pleine taille in cellulo ainsi que l'effet des ligands, précédemment mentionné, sur ces interactions. Dans les conditions choisies pour notre étude, nous avons déterminé que RevErbα interagit fortement avec NCor in cellulo et que cette interaction est améliorée par le ligand SGN. En revanche, l'hème et le SD7 n'ont pas d'effet observable sur ce complexe. Nous avons également montré pour la première fois que RevErbα forme des complexes avec le corépresseur SMRT pleine taille in cellulo. La continuité de ce travail pourrait être ciblée sur l'identification de ligands qui augmenterait le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 sur RevErbα, menant ainsi à la diminution de l'expression des gènes cibles. En définitive, un ligand tel que celui-ci pourrait être d'un grand intérêt dans la recherche de la diminution de glucose dans le sang dans les cas de diabètes de type 2. / Nuclear receptors are members of ligand-inducible factors that regulate the transcription of many genes. Nuclear receptor RevErbα constitutively inhibits the transcription of target genes via the recruitment of the corepressor complex NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor and Histone DeAcetylase 3). This complex plays an important role in controlling the circadian clock and glucogenesis via regulation of the transcription of the G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) and PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase) genes, both coding for proteins involved in glucogenesis, which is central to type 2 diabetes. Here we have investigated the interaction of the nuclear receptor RevErbα with two corepressors: its establish partner, NCor and SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Despite literature reports that SMRT and RevErbα do not interact functionally in vivo, we choose to study this interaction because of sequence similarity between the two corepressors, because peptides of both corepressors were reported to interact with other nuclear receptors. To investigate these interactions, we used two complementary fluorescence techniques: In vitro assays based on fluorescence anisotropy and an in cellulo fluorescence microscopy technique called Number & Brightness. In addition to the interactions between the CoRs and the RN, we were interested in determining the effects of several ligands on these interaction. Three ligands were tested: heme, which is reported to be the natural ligand of RevErbα and two synthetic and non-naturals ligands of RevErbα (SGN and SD7). By fluorescence anisotropy (in vitro) we confirmed and quantitated the interaction between purified RevErbα Ligand Binding Domain (LBD) and an NCoR peptide containing the major interaction domains (ID1) for RevErbα and revealed the effect of the three ligands on this interaction. We quantitated as well, the interaction between RevErbα and other peptides from NCor corresponding to the other interaction domains (ID2 and ID3) for it binding to RevErbα. We found a destabilizing effect of heme and SD7 binding to RevErbα on it interaction with NCor in vitro, whereas the ligand SGN enhanced the complex stability. We also confirmed an interaction between RevErbα and a SMRT peptide corepressor in vitro. In order to examine these interactions in a more functionally relevant context using full length proteins, we used 2 photon 2 colors Cross Number and Brightness (N&B), an fluorescence microscopy technique based on fluorescence intensity fluctuations to study specific interactions of full length RevErbα with NCor and SMRT in cellulo as well as the effect of several ligands above mentioned. Under the conditions of our studies, we find that RevErbα and NCor interact strongly in cellulo, and we observed a slight enhancement of this interaction by the SGN ligand. No effect of heme or SD7 was observed on the complex. We show as well for the first time that RevErbα forms complexes with the full length SMRT corepressor in cellulo. Future extensions of these studies could be aimed at identifying ligands that enhance the recruitment of the corepressor complex NCor/HDAC3 by RevErbα, thus leading to a decrease expression of the target genes. Ultimately such a ligand could be of interest in the quest to decrease blood glucose levels in type 2 diabetes.

Le site d’action des bactériocines de la sous-classe IIa est la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif. Le mécanisme d’action se décompose en trois étapes : (i) adsorption de la bactériocine sur la membrane ; (ii) structuration du peptide et insertion dans la bicouche lipidique ; (iii) formation de pores. La présence de pores provoque des fuites de composés vitaux aboutissant soit à un arrêt de la croissance soit à la mort de la bactérie. Le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane a été mesuré grâce à l’anisotropie de fluorescence de deux sondes, le TMA-DPH et le DPH, respectivement localisées à la surface et en profondeur de la bicouche lipidique. Des résultats différents ont été obtenus avec deux espèces bactériennes appartenant au genre Listeria. Dans un cas, le peptide s’insère partiellement dans la membrane et dans l’autre en profondeur. Ces résultats suggèrent que la mésentérocine 52A peut suivre deux mécanismes distincts aboutissant à une bactériostase. Pour mieux comprendre les interactions entre la bactériocine et la cellule cible, le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane de trois souches de Leuconostoc, la première sensible, la seconde naturellement insensible et la dernière rendue résistante, a été caractérisé. Il semblerait que le phénotype de résistance soit corrélé avec les propriétés physico-chimiques de l’enveloppe cellulaire. Afin de pouvoir généraliser les résultats observés avec la mésentérocine 52A, d’autres bactériocines de la sous-classe IIa, les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2, produites par la souche Carnobacterium maltaromaticum CP5, ont été étudiées. Dans un premier temps, ces bactériocines ont été produites et purifiées à partir d’une souche d’Escherichia coli recombinante. L’étape de production en fermenteur a été optimisée, des quantités de l’ordre de 300 mg de peptides ont été produites. Le mode d’action des carnobactériocines, seules ou en combinaison, a été déterminé vis-à-vis de cellules procaryotes ou eucaryotes. Les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2 ont un mode d’action synergique contre les bactéries sensibles et ne présentent pas de cytotoxicité vis-à-vis des cellules de la lignée Caco-2 / The action site of sub-class IIa bacteriocins is the cytoplasmic membrane of Gram-positive bacteria. The current view of the mechanism of action is divided into three steps: (i) adsorption of bacteriocins on the membrane; (ii) apparition of the structures of peptide and integration into the lipid double layer (iii) formation of pores. The presence of pores leads to efflux of vital cell compounds. They cause growth stop or bacterial death. The degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane was measured by fluorescence anisotropy of two probes, TMA-DPH and the DPH, which target the surface or the depth of the membrane, respectively. Different results were obtained with two bacterial species of the genus Listeria. In the first hand, the peptide is partially inserted into the membrane and in the second hand in depth. These results suggest that mesenterocin 52A can exhibit two different mechanisms leading to the same antibacterial effect. To better understand the interactions between bacteriocins and the target cell, the degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane of three Leuconostoc strains, the first sensitive, the second naturally resistant and last induced resistant, was characterized. It seems that the resistance phenotype is correlated with physical and chemical properties of the cell envelope. To generalize the results observed with mesenterocin 52A, other bacteriocins of sub-class IIa, the carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2, produced by Carnobacterium maltaromaticum CP5 strain, were studied. These bacteriocins were produced in E. coli and subsequently purified. The optimization of the production process in a reactor led to purify up to 300 mg of peptides for 1.5 liter of culture. The mode of action of carnobacteriocins, alone or in combination, was determined with prokaryotic or eukaryotic cells as targets. The carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2 have a synergistic mode of action against sensitive bacteria and are not cytotoxic against Caco-2 cell line

Les recherches présentées dans ce mémoire s'intéressent à la désorption du tensioactif dans les films de latex en cours de séchage. Les travaux concernent d'une part l'élaboration d'un système expérimental modélisant le rapprochement de deux particules de latex recouvertes de tensioactif pour accéder aux paramètres influençant la désorption, et d'autre part l'étude de ce phénomène directement sur un latex. Un protocole pertinent de fabrication d'un film polymère mince déposé sur du mica, de faible rugosité, et résistant à une immersion prolongée dans un milieu aqueux a été obtenu. L'adsorption d'un tensioactif anionique, le dodécyl sulfate de sodium (SDS) sur un film polymère de poly (méthacrylate d'éthyle) (PEMA) est investiguée par microscopie à force atomique et indique la présence d'agrégats de surface dont la densité croit lorsque la concentration en tensioactif dans la solution dépasse la concentration micellaire critique (CMC). Le profil des interactions s'exerçant entre deux surfaces de polymère immergées en solutions aqueuses de tensioactif en fonction de la séparation entre les interfaces est obtenu par la technique de mesure des forces de surface (surface force apparatus, SFA), et permet de répondre à la question de l'occurrence ou non de la désorption du tensioactif (SDS) lorsque le milieu aqueux intermédiaire séparant les interfaces de PEMA est réduit jusqu'au contact physique, comme dans le mécanisme de séchage lorsque les colloïdes de latex se rapprochent au fur et à mesure que l'eau disparaît. L'étude de la désorption du tensioactif dans un système réel, à savoir lors du séchage d'un film de latex, est menée par mesures d'anisotropie de fluorescence et mesures par résonateur de torsion et montre la simultanéité entre la perte de mobilité de la sonde fluorescente hydrophile et l'évaporation de l'eau, augurant d'un comportement analogue pour le tensioactif.

Ce travail présente la synthèse, la caractérisation et l’utilisation (transfert électronique photo-induit) de foldamères de taille nanométriques constitués d’unité quinolines. Grâce a une stratégie de synthèse de doublement de segment une grande variété d’oligomères (jusqu’à 96 unités) ont pu être préparé à partir du synthon 8 aminoquinoline-2-carboxylate.Leurs propriétés dynamiques de ces objets ont été étudiées en solution et en phase gazeuse. La spectrométrie de masse de mobilité ionique a permis de déterminer leur conformation en phase gazeuse. Les expériences de RMN DOSY et d’anisotropie de Fluorescence ont permis de déterminer leurs propriétés de diffusion (transrationnelle et rotationnelle). Ces résultats ont révélés qui ces foldamères sont rigides et que leur architecture hélicoïdale est conservée.Le transport électronique photo-induit à travers ces foldamères de taille nanométrique ont été étudié et le mécanisme de transfert ainsi que son efficacité ont été déterminé pour une série de composés de tailles variables. / Herein, synthesis, characterization and application (photoinduced electron transport) of nanosized quinoline-based foldamers have been explored. With double segment strategy, a variety of helical nanosized foldamers (up to 96 quinoline units) were successfully prepared based on 8-aminoquinoline-2-carboxylic acid monomer.The dynamic properties in gas phase and solution were investigated. Ion mobility mass spectrometry afforded access to the conformation state of foldamers ingas phase; DOSY and fluorescence anisotropy assessed the diffusion (translational and rotational, respectively) of foldamers in solution. All of these techniques revealed that quinoline-based foldamers are rigid and that helical conformation is conserved. Photoinduced electron transport through nanosized foldamer was also studied and the mechanism and the transport ratios were revealed.

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sert de modèle pour l'étude de la multiplication des virus (Mononegavirales) alors que la rage(RV) reste un sérieux problème de santé publique. Le génome de VSV et RV code notamment la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). N s'associe étroitement à l'ARN viral. Ce complexe N-ARN sert de matrice pour la réplication et la transcription virale. P est le cofacteur de la polymérase virale (L) et chaperonne N. En interagissant avec N-ARN (domaine C-terminal) et avec L (domaine N-terminal), P assure le lien physique entre l'ARN viral et L. La stœchiométrie de P, sa structure et son rôle exact pendant la transcription et la réplication restent incertains. Mon travail a consisté à une caractérisation biophysique et structurale de P et des complexes N-ARN-P pour mieux comprendre la dynamique du complexe de réplication de ces virus.<br />L'analyse biophysique montre que P RV & VSV existent sous forme de dimère allongé en solution. L'analyse bioinformatique a révélé une organisation modulaire, confirmé par des études biochimiques et biophysiques de mutants de P RV. La structure du domaine C-terminal de P VSV a été résolue par RMN et montre une homologie celle du C-ter de P RV. La caractérisation de l'interaction entre P et les anneaux N-ARN a révélé l'existence de deux types de complexes N-ARN-P (contenant un et 2 dimères de P par anneau). L'étude par ME des complexes nucléocapsides-P a permis de mettre en évidence un changement de conformation important.<br />Pour devenir accessible à L, l'ARN viral doit se dissocier localement de N. L'interaction N-ARN-P représente potentiellement une nouvelle cible pour le développement d'antiviraux.