Immunotoxins (ITs), which consist of antibodies conjugated to toxins, have been proposed as a treatment for cancer and chronic infections. To develop and improve the ITs, different toxins such as ricin, have been used, aiming for higher efficacy against target cells. The toxin pulchellin, isolated from the Abrus pulchellus plant, has similar structure and function as ricin. Here we have compared two plant toxins, recombinant A chains from ricin (RAC) and pulchellin (PAC) toxins, for their ability to kill HIV Env-expressing cells. Briefly, RAC and PAC were produced in E. coli, and chromatographically purified, then chemically conjugated to two different anti-HIV monoclonal antibodies (MAbs), anti-gp120 MAb 924 or anti-gp41 MAb 7B2. These conjugates were characterized biochemically by microcapillary electrophoresis and BCA assay and immunologically by a variety of ELISA tests. We performed a side-by-side comparison of their ability to bind, enter and kill HIV infected cells (H9/NL4-3) or Env-transfected 293T cells, as well as their non-specific toxicity on uninfected or non-transfected parental cells. Cell binding and internalization were studied by flow cytometry and confocal microscopy. Results showed that PAC can function within an effective IT. The ITs demonstrated specific binding against native antigens on persistently HIV-infected cells and recombinant antigens on Env-transfected cells. An irrelevant antibody conjugated to either RAC or PAC had no effect. PAC cytotoxicity appears somewhat less than RAC, the standard for comparison. This is the first report that PAC may have utility for the design and construction of therapeutic ITs, highlighting the potential role for specific cell targeting not only for AIDS also for cancer therapy. / As toxinas imunológicas (TIs), que consistem em anticorpos conjugados com toxinas, foram propostas como tratamento para câncer e infecções crônicas. Para desenvolver e melhorar as TI, diferentes toxinas, como a ricina, foram usadas, visando uma maior eficácia contra células alvo. A toxina pulchellina, isolada da planta de Abrus Pulchellus, tem estrutura e função semelhantes à da ricina. Aqui, comparamos duas toxinas de plantas, cadeias A recombinantes de toxinas de ricina (RAC) e pulchellina (PAC), por sua capacidade de matar células que expressam HIV. Resumidamente, RAC e PAC foram produzidos em E. coli e purificados por cromatografia, depois conjugados quimicamente com dois anticorpos monoclonais anti corpo-HIV diferentes (MAcs), MAc 924 anti-gp120 ou MAc 7B2 anti-gp41. Estes conjugados foram caracterizados bioquimicamente por eletroforese microcapilar e teste BCA e imunologicamente por uma variedade de testes ELISA. Realizamos uma comparação lado-a-lado de sua capacidade de ligar, entrar e matar células infectadas pelo HIV (H9 / NL4-3) ou células 293T transfectadas com Env, bem como a sua toxicidade não específica em parentes não infectados ou não transfectados Células. A ligação celular e a internalização foram estudadas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Os resultados mostraram que PAC pode funcionar dentro de uma TI efetiva. As TI demonstraram ligação específica contra antígenos nativos em células persistentemente infectadas pelo HIV e antígenos recombinantes em células transfectadas com Env. Um anticorpo irrelevante conjugado com RAC ou PAC não teve efeito. A citotoxicidade de PAC aparece um pouco menor que o RAC, o padrão de comparação. Este é o primeiro relatório que o PAC pode ter utilidade para o projeto e a construção de TI terapêuticas, destacando o papel potencial para o direcionamento celular específico, não apenas para a AIDS, também para a terapia do câncer.

Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.

Linfomas são cânceres que se iniciam a partir da transformação maligna de um linfócito no sistema linfático. Os linfomas são divididos em duas categorias principais: os linfomas de Hodgkin e todos os outros linfomas, denominados linfomas não-Hodgkin (LNH). Os pacientes com LNH são comumente tratados com radioterapia apenas ou combinada com quimioterapia utilizando-se de anticorpo monoclonal anti-CD20, principalmente o rituximab (MabThera&reg). O uso de anticorpos monoclonais (Acm) conjugados à quelantes bifuncionais radiomarcados com radionuclídeos metálicos ou lantanídeos é uma realidade de tratamento para portadores de LNH pelo princípio de radioimunoterapia (RIT). Este estudo concentrou-se nas condições de conjugação do anticorpo monoclonal rituximab (MabThera&reg) com grupamentos quelantes bifuncionais DOTA e DTPA. Na marcação dos Acm conjugados com lutécio-177, foram estudadas as condições de pré-purificação do Acm, condições de conjugação, determinação de número de quelantes acoplados à molécula do anticorpo, purificação do anticorpo conjugado, radiomarcação do anticorpo conjugado, com lutécio-177, purificação do anticorpo marcado, a ligação específica in vitro dos compostos marcados às células Raji, e distribuição biológica em camundongos BALB/c sadios. As três metodologias empregadas na pré-purificação do anticorpo (diálise, cromatografia de exclusão molecular com coluna Sephadex G-50 e ultrafiltração) demonstram-se eficientes e proporcionaram recuperação da amostra superior a 90%. A metodologia de ultrafiltração foi considerada a mais simples e prática, podendo ser aplicada a procedimentos rotineiros de produção de radiofármacos. Além disso, proporcionou a recuperação final de amostra de 97% em microlitros. Nas conjugações do anticorpo com os quelantes DOTA e DTPA em razões molares diferentes do Acm:quelante, observou-se número de grupamentos quelantes acoplados à molécula do Acm proporcional à razão molar estudada. Quando foi avaliada a influência de condições diferentes de conjugação no número de quelantes acoplados à molécula do Acm, não foram observadas diferenças significativas, com resultados de pureza radioquímica (PR) inferior a 80% em todas as condições estudadas. Na comparação de métodos de purificação do Acm conjugado, a abordagem inédita apresentada neste estudo, na qual a cromatografia de exclusão molecular foi combinada com a ultrafiltração resultou em maior eficiência na purificação e preservação da estrutura do anticorpo. Nos estudos de radiomarcação do anticorpo conjugado com DOTA e DTPA, os imunoconjugados de DTPA apresentaram, de forma geral, maior eficiência de marcação com resultados reprodutíveis quando comparados com os imunoconjugados de DOTA, considerando-se as diferentes razões molares utilizadas. As metodologias cromatográficas empregadas no controle de pureza radioquímica do composto radiomarcado proporcionaram a discriminação das diferentes espécies radioquímicas no meio de marcação. A metodologia de purificação do composto conjugado e radiomarcado utilizada proporcionou a obtenção de compostos com alta pureza radioquímica, 97,4&plusmn;1,3% (DOTA 1:50) e 98,7&plusmn;0,2% (DTPA 1:50). Nos estudos de ligação específica às células tumorais Raji, o anticorpo conjugado com quelante DTPA nas razões molares de 1:50 e 1:20 apresentaram perfil semelhante de ligação, com aumento da porcentagem de ligação específica proporcional à concentração celular, enquanto que o imunoconjugado na razão molar de 1:10 apresentou alta porcentagem de ligação não específica. Os resultados obtidos nos estudos de biodistribuição in vivo do anticorpo conjugado e radiomarcado nem sempre se mostraram compatíveis com a biodistribuição de anticorpos radiomarcados íntegros. No caso do quelante DOTA, o imunoconjugado obtido a partir da razão molar 1:20, apresentou melhores características de biodistribuição. No caso do quelante DTPA, a razão molar utilizada pareceu refletir diretamente no clareamento sanguíneo do anticorpo e todas as razões molares utilizadas apresentaram instabilidade in vivo. / Lymphomas are malignancies or cancers that start from the malign transformation of a lymphocyte in the lymphatic system. Lymphomas are divided in two major categories: Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Patient with NHL are generally treated with radiotherapy alone or combined with immunotherapy using monoclonal antibody rituximab (MabThera&reg). Currently, monoclonal antibodies (Mab) conjugated with bifunctional chelate agents and radiolabeled with metallic or lanthanides radionuclides are a treatment reality for patients with NHL by the principle of radioimmunotherapy (RIT). This study focused on the conditions of conjugation of Acm rituximab (MabThera&reg) with bifunctional chelating agents DOTA and DTPA and labeling with 177-luthetium. Various parameters were studied: method of Acm purification, conditions of Acm conjugation and the determination of the number of chelate coupled to the Acm, the purification of the conjugated Mab, labeling conditions with lutetium-177, purification of the radiolabeled immunoconjugate, radiochemical purity (RP), in vitro specific binding determination to Raji cells (Human Burkitt) and biological distribution performed in normal BALB/c mouse. The three methodologies employed in pre-purification of Acm (dialysis, size exclusion chromatograph and ultrafiltration) demonstrated to be efficient; they provided sample recovery exceeding 90%. However, the methodology of ultrafiltration resulted in greater sample recovery and in microliters. The number of chelate attached to the Mab molecule was proportional to the molar ratio studied. When the influence of different conditions of conjugation in the number of chelate bounded to the Mab was studied, no notable differences were observed. The RP < 80% was observed in all the methods applied. Purification of the conjugated antibody by different methods showed that the innovative combination of Sephadex and ultrafiltration methods resulted in higher efficiency of purification. The optimized conditions for purification of the conjugated antibody preserved the protein integrity. Radiolabelling studies of DOTA and DTPA immunoconjugated showed that DTPA derivatives presented, in general, radiochemical yield superior than DOTA conjugated Mab, considering the different molar ratios studied. The chromatographic methods employed in the RP determination were efficient to separate the different radiochemical species presented in the reaction medium. The methodology used in the purification of the labeled Mab resulted in labeled compounds with high radiochemical purity, 97.4&plusmn;1.3% (DOTA 1:50) and 98.7&plusmn;0.2% (DTPA 1:50). Considering specific cell binding assays (Raji cells), the Mab conjugated to DTPA at 1:50 and 1:20 molar ratios presented similar results, and the percent of cell binding were proportional to the cell concentration, whereas the cell binding for 1:10 molar ratio showed high percent of nonspecific cell binding. The results of in vivo biodistribution studies of labeled Mab not always were compatible with the biodistribution of intact radiolabelled antibody. The DOTA immunoconjugated produced at 1:20 molar ratio, showed better performance in biodistribution studies. In the case of DTPA immunoconjugated, the blood clearance seems to be influenced by the molar ratio applied and the immunoconjugated produced with DTPA chelate at different molar ratio resulted in high in vivo instability compounds.

Sporothrix shenckii é o agente etiológico da esporotricose, micose de carater crônico e de ampla distribuição mundial. No Brasil, vem crescendo o número de casos da doença, bem como a incidência de formas clínicas graves ou atípicas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um anticorpo monoclonal contra o componente antigênico proteíco de 70 kDa, secretado pelas células leveduriformes de S. schenckii, denominado anticorpo monoclonal (AcMo) P6E7. Este AcMo apresentou atividade profilática e terapêutica na esporotricose experimental, no entanto, este anticorpo possui origem murina, o que pode gerar uma resposta imunogênica quando administrado em humanos, impossibilitando sua utilização por tempo prolongado. Visando sua possível utilização no tratamento da esporotricose humana, a nossa proposta foi a humanização do AcMo P6E7 na forma de FvFc (Fv-linker- Fc) através de engenharia genética. Inicialmente construimos duas versões uma humanizada e outra quimérica do AcMo contra a fração de 70 kDa do antigeno de S. schenckii. Os anticorpos foram expressos em vetores de expressão dicistrônicos e produzidos com eficiência e estabilidade estrutural em células de mamíferos da linhagem CHO. Posteriormente, esses anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados quanto a sua capacidade de ligação ao fungo e função efetora. Verificamos que os FvFcs construídos foram capazes de se ligar a porção de 70 kDa do antígeno de S. schenckii. Através de ensaios de fagocitose, constatamos que os fragmentos FvFc do P6E7 humanizado e quimérico foram capazes de opsonizar as leveduras de S. schenckii aumentando, assim, o índice fagocítico em macrófagos humanos. Esses dados em conjunto, sugerem a possível utilização do anticorpo construído no tratamento da esporotricose humana. / Sporothrix shenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a chronical fungal infection that shows a worldwide distribution. In Brazil, there is a growing number of cases of sporotrichosis, as well as the incidence of severe or atypical clinical forms. Our research group developed a monoclonal antibody (mAb) against the fungal antigenic component a protein of 70 kDa, secreted by S. schenckii yeasts called P6E7. This mAb showed prophylactic and therapeutic activity in experimental sporotrichosis, however, this antibody has murine origin, which can generate an immune response when administered to humans, precluding their use for prolonged time. For its possible use in the treatment of human sporotrichosis, our proposal is the humanization of mAb P6E7 through genetic engineering. Initially, we built two versions of the original antibody: an humanized version and a chimeric antibody both against the 70 kDa fraction from S. schenckii antigen. The antibodies were expressed in dicistronic expression vectors and were efficiently produced in mammalian cells CHO strain, showing good structural stability. Subsequently, these antibodies were purified by affinity chromatography and assayed for their binding ability to the fungus and effector function. We found that the built os FvFcs (Fv-linker- Fc) fragments were capable of binding to the 70 kDa portion of S.schenckii antigen. Through phagocytosis assays, we found that the FvFc fragments from the humanized and chimeric P6E7 were able to opsonize S. schenckii yeasts, thus increasing the phagocytic index in human macrophages. Together, These data suggest the potential use of the antibodies constructed in the treatment of human sporotrichosis.

Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.

Anticorpos monoclonais (AcMo) anti-&#946;2GPI foram obtidos de hibridomas produzidos pela fusão de linfócitos de camundongos com células SP2-O, de mieloma murino. A imunização foi realizada com proteína purificada de plasma humano, por cromatografia de afinidade em resina Sepharose-Heparina 6 Fast Flow (GE Healthcare). Os AcMo produzidos pelos hibridomas K257, K2II-3, K233, K22, K237 e K2124 foram estudados quanto à sua capacidade de reconhecer o antígeno adsorvido em suporte sólido (dot-blot, imunoblot, ELISA direto) e em solução (ELISA indireto). Todos os clones foram cultivados e expandidos in vivo (ascite) e in vitro (cultura convencional). Pretende-se a substituição da expansão in vivo pela produção em biorreator. Os AcMo produzidos reconheceram a &#946;2GPI em imunoblot com sensibilidade e especificidade variáveis. O desempenho dos AcMo K22 e K2124 no reconhecimento da proteína adsorvida em placas de ELISA (Maxisorp, NUNC), mostrou-se promissor para o desenvolvimento de um teste ELISA direto (sanduíche), em substituição ao ELISA indireto (competição) atualmente utilizado. O AcMo K22 mostrou reatividade semelhante à do anticorpo comercial 5F7 (ICN) em todos os testes realizados. Tanto o anticorpo produzido pelo clone K22 quanto seus fragmentos Fab, obtidos através de digestão enzimática, foram utilizados para identificação e quantificação da proteína em plasma e tecidos de ratos submetidos a um modelo de sepse e translocação bacteriana. Os resultados obtidos demonstram que a modulação das concentrações plasmáticas de &#946;2GPI e sua distribuição hepática dependem da intensidade e da via de infecção, e sugerem a presença de imunocomplexos da proteína in vivo. / &#946;2-glycoprotein I (&#946;2GPI) detection is important for the accurate diagnostic of autoimmune and chronic inflammatory disease. This project was designed in order to obtain specific monoclonal antibodies (MoAb) that could replace or add to the commercially available 5F7. It is intended to achieve a convenient in vitro production, in the near future. The &#946;2GPI antigen was purified from human plasma through Heparin-Sepharose 6 FF (GE Healthcare) affinity chromatography. Six different hybridomas were generated after the fusion of immunized mouse lymphocytes with SP2-O murine myeloma cells. The anti-&#946;2 GPI MoAb K257, K2II-3, K233, K22, K237, and K2124 were purified after clone expansion from ascites (in vivo) and conventional cellular culture (in vitro). MoAb reactivity was evaluated towards the &#946;2GPI antigen either adsorbed to solid phase support (Dot-Blot, imunoblot, direct ELISA), or in solution (indirect ELISA). All clones were positive in immunoblot. MoAb K237, K257 e K2124 recognized cleaved forms of the protein. The K22, K2124 and K257 MoAb were promising for the development of direct ELISA. Best sensibility was obtained with K22 AcMo in comparison to commercial reference 5F7 (ICN) in all tests. Both AcMo K22 and its digestion product K22Fab, could be applied in assays for &#946;2GPI on plasma and tissues of rats with good performance.

A contaminação da água para consumo humano por toxinas produzidas por cianobactérias é um problema de saúde pública e das autoridades em todo o mundo. Microcistina-LR (MCLR) é uma cianotoxina heptapeptídica cíclica que inibe as proteínas fosfatases PP1 E PP2A nos hepatócitos. Microcistinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias e mais de 70 variações estruturais têm sido caracterizadas em florações naturais. Por serem haptenos, as microcistinas são incapazes de induzir uma resposta imune em animais. Conseqüentemente, foi necessário aplicar métodos de conjugação envolvendo a adição de uma proteína carreadora, mcKLH (cationized Keyhole Limpet Hemocyanin). Portanto, o objetivo inicial desta tese foi o de obter anticorpos monoclonal (em camundongos) e policlonal (em coelho) anti- MCLR. Com relação ao anticorpo monoclonal foram obtidos 9 hibridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232), sendo que apenas 5 se mostraram estáveis (k29, k317, k248, k284, k2232). Estes foram selecionados para serem isotipados, expandidos em líquido ascítico, purificados em coluna cromatográfica de proteína-A e titulados. Dentre estes cinco hibridomas secretores de anticorpos, o clone k317 foi o que melhor reconheceu (mais específico) a toxina MCLR. Os anticorpos do sobrenadante de meio de cultura do hibridoma e o fluido ascítico purificado foram identificados pelo ensaio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) previamente padronizado. Mesmo sensibilizando a placa de ELISA com diferentes antígenos, tais como MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR e MCLA, o clone 17 foi o que apresentou melhor linearidade frente às variantes de microcistina. Portanto, o clone 17 (isótipo IgG1) obtido é muito promissor e será usado para detecção de MCLR na água para consumo humano através do desenvolvimento de um kit de ELISA competição. Com relação ao anticorpo policlonal, o antígeno de imunização foi MCLR-mcKLH, enquanto que o antígeno de sensibilização foi MCLR-cBSA para o ensaio de titulação de anticorpos de classe IgG por ELISA indireto. Na seqüencia, foi padronizado um ensaio ELISA competição utilizando somente a toxina MCLR como antígeno de sensibilização. Este método Caseína foi padronizado, validado e comparado com o kit comercial Abraxis®. O kit ELISA competição que utiliza anticorpo policlonal, nomeado como método Caseína, foi avaliado quanto Limite Inferior de Quantificação, Especificidade, Seletividade, influência do metanol no ensaio, Recuperação, Linearidade, Precisão, Exatidão e Robustez. Este método de triagem apresentou excelente resultado quando comparado ao kit comercial Abraxis®, pois foi capaz de detectar tanto variantes de microcistinas como nodularinas no ambiente aquático. O ensaio ELISA competição utilizando anticorpo policlonal anti-MCLR foi submetido à patente pela Agência USP de Inovação (I.N.P.I. 018090046230). / The contamination of drinking water by cyanobacterial toxins is a public health issue and a concern for water authorities throughout the world. Microcystin-LR (MCLR) is a hazardous cyclic heptapeptide cyanotoxin, which inhibits protein phosphatase PP1 and PP2A in hepatocytes. Microcystins are produced by several genera of cyanobacteria and presents more than 70 structural variations characterized in natural blooms. As haptens, microcystins are unable to invoke an immune response in animals. Consequently, the application of conjugation methods with an additional carrier protein, the KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) was necessary. The main objective of this study was to obtain monoclonal (in mice) and polyclonal (in rabbits) antibodies for reacting against MCLR. In what refers to monoclonal antibodies, 9 hybridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232) were obtained; however only 5 were stables (k29, k317, k248, k284, k2232). These were selected to be isotyped, expanded in ascitic fluid, purified by protein-A column chromatography and then, they were titrated. Out of these five antibody-secretor hybridomas, clone k317 was the best to recognize (more specific) the MCLR toxins. Antibodies in hybridoma cell culture supernatant and purified ascites fluid were identified by ELISA assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) as prior standardized. Even when sensitizing ELISA plate with different antigens, as MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR and MCLA, clone 17 presented the best linearity against microcystin variants. Therefore, the obtained clone 17 (isotype IgG1) is a promising clone and shall be used for detecting MCLR in drinking water through the development of a competitive ELISA immunoassay kit. In what refers to the polyclonal antibody, MCLR-mcKLH was used as immunization antigen, while MCLR-cBSA was used as sensitizing antigen for the IgG titration assay by indirect ELISA. In the sequence, a competition ELISA assay was standardized using the MCLR toxin as sensitizing antigen. This Casein method was standardized, validated and compared to the commercial kit Abraxis®. The competition ELISA kit using polyclonal antibody, known as Casein method, was analyzed concerning its Quantification Inferior Limit, Specificity, Selectivity, methanol influence of the assay, Recuperation, Linearity, Precision, Accuracy and Robustness. This screening method reached excellent results if compared to the commercial kit Abraxis®, for being able to detect both the microcystins variants and the nodularins in aquatic environmental. The competition ELISA assay using anti-MCLR polyclonal antibody was submitted to the grant of a patent by USP Innovation Agency (INPI 018090046230).

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 &#181;g desse anticorpo reconheceu 0,6 &#181;g de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 &#181;g de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina (Int388-667) na forma purificada e a intimina &#945; no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo. / Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections caused by E. coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC and EHEC by immunoblotting. All employed antibodies showed 100% specificity and the sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, respectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 mg recognized 0.6 &#181;g of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10-8 M. The less extent reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFv). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in a strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, which was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction of protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionality of the scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed that 275 ng of scFv reacted with 2 &#181;g of purified intimin resulting in an absorbance of 0.75. By immunofluorescence it was observed a strong reactivity to the typical EPEC isolate E2348/69. This study demonstrated that the recombinant anti-intimin antibody obtained was able to recognize the conserved region of intimin (Int388-667) in its purified form and &#945; intimin in a typical EPEC isolate, and was more efficient than the native monoclonal antibody.

O Vírus Sincicial respiratório (HRSV) é um patógeno de grande importância para crianças. É o maior causador de infecções respiratórias agudas e também um dos principais causadores de internações e mortes de crianças menores de 5 anos. Cepas de HRSV com mutações no sítio de ligação do Palivizumab vêm apresentando resistência ao medicamento. Pouco se sabe sobre a prevalência destas mutações em amostras clínicas, apesar de sua potencial importância na patogênese viral. Além disso, existem poucos dados sobre a evolução molecular da proteína F do HRSV, sobretudo no Brasil. O presente estudo tem como objetivo caracterizar fenotipicamente através de ensaios de microneutralização in vitro, cepas oriundas de crianças não tratadas com Palivizumab circulantes em 2013 apresentando mutações na proteína F, mais especificamente relacionadas a potencial resistência nos epítopos de ligação do Palivizumab. Como resultado deste trabalho todas as amostras testadas foram neutralizadas pelo Palivizumab, concluindo-se que as mutações encontradas não conferem resistência ao monoclonal. / Respiratory Syncytial Virus (HRSV) is a pathogen of great importance for children. It is the major cause of acute respiratory infections and also one of the main causes of hospitalizations and deaths of children under 5 years. Strains of HRSV with mutations in the binding site of Palivizumab have been showing resistance to the drug. Little is known about the prevalence of these mutations in clinical samples, despite their potential importance in viral pathology. In addition, there is little data on the molecular evolution of HRSV F protein, especially in Brazil. The present study aims to characterize phenotypically by in vitro microneutralization assays, strains from children not treated with Palivizumab circulating in 2013 showing mutations in F protein, more specifically related to potential resistance in the binding epitopes of Palivizumab. As result of this study all samples tested were neutralized by Palivizumab, concluding that the mutations found did not confer resistance to the monoclonal.

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 &#181;g desse anticorpo reconheceu 0,6 &#181;g de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 &#181;g de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina (Int388-667) na forma purificada e a intimina &#945; no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo. / Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections caused by E. coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC and EHEC by immunoblotting. All employed antibodies showed 100% specificity and the sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, respectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 mg recognized 0.6 &#181;g of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10-8 M. The less extent reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFv). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in a strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, which was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction of protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionality of the scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed that 275 ng of scFv reacted with 2 &#181;g of purified intimin resulting in an absorbance of 0.75. By immunofluorescence it was observed a strong reactivity to the typical EPEC isolate E2348/69. This study demonstrated that the recombinant anti-intimin antibody obtained was able to recognize the conserved region of intimin (Int388-667) in its purified form and &#945; intimin in a typical EPEC isolate, and was more efficient than the native monoclonal antibody.