L'acide tiénilique (AT) est un diurétique responsable d'hépatites autoimmunes où les autoanticorps appelés anti-LKM2 sont dirigés contre les cytochromes P-450, justement responsables de la métabolisation de l'AT. Cette hépatite constitue un modèle d'étude des maladies autoimmunes spécifiques d'organes où les antigènes sont souvent des enzymes et pour lesquelles des facteurs étiologiques environnementaux ont été suggérés. Afin d'étudier les néoantigènes formés par alkylation des protéines au cours de sa métabolisation, nous avons fixé l'AT à la sérumalbumine de bœuf. La protéine obtenue (BSA-AT) est immunogène chez le lapin et les anticorps obtenus (anticorps anti-AT reconnaissent by Elisa les métabolites de l'AT fixés aux protéines. Ces anticorps sont en cours de développement. Au moyen de la BSA-AT, nous avons recherché la présence d'anticorps anti-médicament dans les sérums de patients atteints d'hépatite. Les résultats préliminaires sont en faveur de la présence de ces anticorps dans les sérums de tous les patients prenant de l'AT.

La pharmacocinétique (PK) des anticorps monoclonaux (mAbs) est sujette à d’importantes variations interindividuelles. Le récepteur néonatal au Fc des IgG (FcRn) et le statut immun à l’encontre de ces mAbs sont des déterminants de cette PK. La bioconjugaison des mAbs à des cytotoxiques entraîne une altération de leur PK. Nous montrons que le taux de couplage modifie l’affinité de ces espèces pour le FcRn à pH6. La proportion d’agrégats au sein des solutions d’anticorps armés augmente avec le taux de couplage et pourrait entraîner une altération de leur PK. Par ailleurs, cette agrégation est impliquée dans l’immunogénicité des mAbs, et nous avons donc cherché à identifier des acides aminés impliqués dans l’agrégation de mAbs indiqués en clinique. Il apparait que la nature biochimique de résidus des paratopes pourrait augmenter cette agrégation. Les anti-TNF- présentent très peu d'agrégats et figurent pourtant parmi les plus immunogènes chez l’Homme. Nous avons donc exploré le rôle des complexes immuns dans leur immunogénicité chez la souris. Il apparait que la présence du FcRn n’est pas à l’origine de l’immunisation contre ces mAbs, contrairement à celle des complexes immuns. Ces résultats donnent des pistes pour la production de mAbs plus efficients et mieux tolérés. / The pharmacokinetic (PK) profile of monoclonal antibodies (mAbs) shows interindividudal variability. The neonatal Fc receptor (FcRn) and the immounogenicity of these mAbs are determinative factors of mAb PK. Generation of antibody-drug-conjugates alters their PK profile. We show that the the affinity for FcRn at pH6 increases with the drug-to-mAb ratio, as does the amount of aggregates inside the mAb-drug-conjugate. The amount of aggregates could be responsible for an avidity effect towards FcRn. These aggregates are known to cause immunogenicity, so we studied biochemical determinants inside the aminoacid sequence of marketed mAbs. We show that the biochemical nature of some aminoacids inside the paratope has an impact on the amount of aggregation. Anti-TNF- mAbs show very little aggregation but are very immunogenic in humans. We studied the role of the formation of immune complexes in the immunization against anti-TNF- mAbs in mice, and showed that immune complexes, but not FcRn are essential in the immunization process against anti- TNF- mAbs. These results give leads towards the generation of more efficient, better tolerated mAbs.

L’objectif de ces travaux de thèse est l’étude des modifications post-traductionnelles de la protéine ATF7. Cette protéine est phosphorylée sur les résidus thréonine (T) 51, T53 et T112 lorsque les cellules subissent un stress (UVs, choc osmotique). Cela permet à la protéine d’être active transcriptionnellement. En absence de stress une fraction de la protéine ATF7 est sumoylée et cela induit une inhibition de son activité transcriptionnelle. Le premier projet consiste à développer des outils qui permettent l’étude de la forme sumoylée de la protéine ATF7. Ces travaux ont permis l’élaboration de scFv-bispécifiques tétramériques qui permettent la reconnaissance simultanée de la protéine ATF7 et de la protéine SUMO1. L’autre projet principal était l’étude du rôle de la phosphorylation de la T112 en absence de stress. Les travaux menés au laboratoire ont permis de montrer que cette thréonine est phosphorylée pendant la phase M du cycle cellulaire et que cet événement est conduit par une autre voie de phosphorylation que la voie du stress et met en jeu la CDK1. / The objective of this thesis work was is the study of post-translationnal modifications (PTM) of the protein ATF7. This protein is phosphorylated on several threonine (T) residues upon stress (UVs, osmotic chock). This allows the protein to be transcriptionally active. In the absence of stress, a fraction of the protein is sumoylated resulting in an inhibition of its transcriptional activity. The first project raise to the development of tools that will enable the study of the sumoylated form of ATF7 protein. This work raise to the development of tetrameric bispecific scFv possessing a simultaneously recognizing ability of the proteins ATF7 and SUMO1. The other main project was the study of ATF7 T112 phosphorylation in the absence of stress. The experiments drove in the lab have shown that thus threonine is phosphorylated during mitosis by a specific pathway, which includes the CDK1.

Les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) appartiennent au groupe des myopathies inflammatoires idiopathiques. Les MNAI sont des maladies musculaires sévères pouvant conduire à un déficit musculaire définitif et handicapant. Pour rétablir une force normale et prévenir le handicap, des traitements prolongés associant corticothérapie et immunosuppresseurs sont nécessaires. Les MNAI sont définies histologiquement par la prédominance de fibres musculaires en nécrose qui contraste avec l’absence ou la faible abondance d'inflammation musculaire. Les mécanismes impliqués dans la nécrose comme ceux impliqués dans les séquelles atrophiques sont en revanche inconnus. Les MNAI peuvent être associées à des auto-anticorps (aAc) soit anti-SRP, soit anti-HMGCR. Ces aAc ciblent des protéines cytoplasmiques ubiquitaires. Leurs titres sont corrélés avec l'activité de la maladie, suggérant ainsi le rôle pathogène de ces aAc. Dans ce travail de thèse, nous avons émis l’hypothèse que les aAc pouvaient être impliqués dans les lésions musculaires observées aux cours des MNAI anti-SRP+ et anti-HMGCR+. Durant cette étude, nous avons eu pour objectifs : (i) de caractériser et de quantifier la nécrose musculaire et l’inflammation associée, ainsi que les mécanismes physiopathologiques impliqués (rôle des aAc) ; (ii) d’analyser la régénération et l’atrophie musculaire et l’effet des aAc sur ces phénomènes. L'analyse histologique des biopsies musculaires des patients MNAI a montré que la proportion des fibres musculaires en nécrose était plus importante chez les patients anti-SRP+. Les taux sériques de créatine phosphokinase étaient corrélés avec la proportion de fibres nécrotiques, montrant ainsi que ce taux est un bon marqueur de l’activité de la maladie. De façon inattendue, une inflammation musculaire était régulièrement observée. En particulier, la densité lymphocytaire T était dans un quart des cas comparable à celle des autres myopathies inflammatoires. Cette densité cellulaire était de plus corrélée au pourcentage de fibres en nécrose. L’infiltrat inflammatoire était néanmoins composé principalement de macrophages. Des macrophages CD68+ iNOS+, impliqués dans des phénomènes de myophagocytoses dans un environnement Th-1 étaient régulièrement observés. Des macrophages avec un phénotype suggérant une activation alternative par l’immunité humorale ont aussi été observés. Dans ce sens, la présence de dépôts de complexe d’attaque membranaire à la surface des fibres musculaires, mais aussi des dépôts de C1q et d’IgG montraient l’activation de la voie classique du complément au cours des MNAI. De plus, la détection des protéines SRP et HMGCR sur certaines fibres musculaires immatures (in vitro et in vivo) suggérait le rôle pathogène des aAc. Concernant les mécanismes de régénération et les phénomènes d’atrophie musculaire, l’analyse des biopsies musculaires a révélé l’importance de l’irrégularité du diamètre des fibres avec une prédominance de petites fibres. Ces petites fibres correspondaient à la fois à des fibres en régénération et à des fibres en nécrose. In vitro, les Ac anti-SRP et anti-HMGCR induisent une atrophie musculaire en augmentant la transcription de MAFbx et Trim63. En outre, l'atrophie des fibres musculaires a été associée à un niveau élevé de cytokines inflammatoires comme TNF, IL-6 et ROS. Concernant l’étude de la régénération musculaire, in vitro, la présence des aAc réduisait la fusion des myoblastes. Ce défaut était associé à une diminution de la production de cytokines anti-inflammatoires IL-4 et IL-13. L’ajout d'IL-4 et/ou d’IL-13 permettait de corriger la fusion des myoblastes. Dans ce travail, les données recueillies convergent pour suggérer le rôle pathogène des aAc anti-SRP et anti-HMGCR dans les lésions musculaires nécrotiques mais aussi dans la régénération musculaire et l’atrophie. Ces données nouvelles soulignent l’importance de traitements ciblés au cours des MNAI. / Immune mediated necrotizing myopathy (IMNM) is recognized as a separate entity among inflammatory myopathies. IMNM is a severe disabling muscle disease requiring prolonged combination of corticosteroid and immunosuppressive drugs. IMNM is morphologically defined by predominant muscle fiber necrosis and no or little inflammation, and is associated with important variation of the size of the fiber. However pathogenic mechanisms involved in muscle necrosis and muscle atrophy are largely unknown. IMNM may be associated with either anti-SRP or anti-HMGCR auto-antibodies (aAbs). The titer of these aAbs, targeting ubiquitous cytoplasmic proteins, is correlated with the disease activity suggesting their pathogenic role. In this thesis, we described the morphology of skeletal muscle alterations occurring in both conditions of anti-SRP+ or anti-HMGCR+ patients, studied the role of the Abs in (i) the necrosis mechanisms and the associated inflammation; (ii) by analyzing the atrophy and the regeneration mechanisms. Muscle histological analysis of anti-SRP+ and anti-HMGCR+ patients showed a random distribution of necrotic fibers that was more pronounced in anti-SRP+ patients. Creatine Phosphokinase levels; myolysis indicator, and muscle regeneration were correlated with the proportion of necrotic fibers. Inflammation was regularly observed in IMNM muscle patients. Macrophages were the most abundant but T cells densities were in a quarter of cases in the same range as myositis controls. CD68+iNOS+ macrophages and a Th-1 immune environment were also observed and involved in ongoing myophagocytosis. Of note, macrophages with alternative activation were also detected. Humoral immunity with activation of the classical pathway of the complement cascade was observed in IMNM. Positive membrane staining for SRP and HMGCR proteins, on some muscle fibers, was detected both in vitro and in muscle biopsies of IMNM patients. An important proportion of small fibers corresponding to both atrophic and regenerating fibers was observed in anti-SRP+ and anti-HMGCR+ patients. In vitro, anti-SRP and anti-HMGCR aAbs induced muscle fibers atrophy and increased the transcription of MAFbx and Trim63. In addition, the muscle fiber atrophy was associated with high level of inflammatory cytokines such TNF, IL-6 and ROS. Muscle regeneration in vitro was also affected by impairing the myoblasts fusion in presence of anti-SRP and anti-HMGCR Abs. This default was associated with a decrease production of anti-inflammatory cytokines: IL-4 and IL-13. Of note, the addition of IL-4 and/or IL-13 totally rescued the fusion. Together those data suggest that these aAbs have a pathogenic effect on muscle. Anti-SRP and anti-HMGCR are involved in muscle atrophy and affect the regeneration. The role of these aAbs in muscle damages occurring in IMNM was highlighted and emphasizes the potential interest of targeted therapies.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’adénosine est un nucléoside ubiquitaire qui exerce un contrôle puissant sur les systèmes nerveux,immunitaire et cardiovasculaire par l’intermédiaire de quatre récepteurs membranaires : A1R, A2AR, A2BR etA3R. L’étude des récepteurs de l’adénosine est nécessaire à la compréhension de physio‐pathologieshumaines non encore élucidées. Pour étudier l’expression des A2AR, nous avons, dans une première étude,produit un anticorps monoclonal, appelé Adonis, d’isotype IgM, . Adonis reconnait un épitope linéaire desept acides aminés sur la partie C‐terminale de la seconde boucle extra‐cellulaire de l’A2AR humain. Adonisrévèle, par Western blotting sur lysats cellulaires, une bande de 45 KDa, correspondant à l’A2AR. Adonis secomporte comme un « agonist‐like » en augmentant la production d’AMPc et en inhibant la proliférationcellulaire via la stimulation des A2AR. Dans une deuxième étude, nous avons utilisé Adonis pour montrerque l’expression des A2AR de cellules mononucléées, qui mime celle des tissus cardiaques, permet dedifférencier certains patients souffrant de syncope neurocardiogénique. Nous avons monté dans unetroisième étude, qu’Adonis induit une « down‐régulation » de l’expression des co‐récepteurs CXCR4 etCCR5 des cellules T via la stimulation des A2AR, et qu’à ce titre il pouvait être un outil thérapeutique dans lesinfections par HIV. Dans une quatrième étude, nous avons évalué les effets anti‐nociceptifs d’Adonis qui,administré par voie intra‐cérébro‐ventriculaire, augmente de manière dose‐dépendante les latencesobtenues avec le test du Hot‐plate et du Tail‐flick chez la souris. Ces effets sont renversés par deuxantagonistes des A2AR mais aussi par un antagoniste des récepteurs aux opioïdes. Ceci suggère que leseffets anti‐nociceptifs d’Adonis sont médiés par la libération d’opioïdes endogènes. En marge de sesétudes, nous avons également testé les propriétés biologiques de nouveaux ligands des A1R dans le cadred’une collaboration entre chimistes et biologistes. Ainsi, nous montrons, dans une cinquième étude, queparmi la trentaine de molécules synthétisées, quatre sont des antagonistes et deux autres des agonistesavec un EC50 de l’ordre du micromolaire pour la production d’AMPc. De tels agonistes des A1R pourraientêtre utiles dans le traitement des douleurs neuropathiques, tandis que les antagonistes le seraient dansl’insuffisance cardiaque ou utilisés comme diurétique. Enfin dans une sixième étude, nous avons testé unemolécule originale, puisque bivalente, possédant un pôle d’activité pour les récepteurs aux opioïdes μ et unautre pour les A1R. Cette molécule est un antagoniste pour les deux récepteurs. Elle pourrait avoir desapplications cliniques dans certaines pathologies comme le choc hypovolémique ou le sevrage aux opiacés. / Adenosine interacts on its cell surface receptors, namely A1R, A2AR, A2BR and A3R, to exertphysiological effects on target tissues. Modulation of these adenosine receptors appears to be a currenttopic of research which may bring more comprehensions on human pathophysiology yet to be elucidated.In order to study A2AR expression, we produced, in study 1, a monoclonal antibody anti‐human A2AR, calledAdonis being of IgM, isotype. Adonis recognized a linear epitope of seven amino acids on the C‐terminalpart of the A2AR second extra‐cellular loop. By Western blotting, Adonis reveals a 45 KDa band of A2AR incell lysates. Adonis behaves as an agonist‐like which increases the cAMP production and inhibits cellproliferation through A2AR stimulation. In study 2, we showed that using Adonis, to measure the A2ARexpression of peripheral blood mononuclear cells which mimic those of the cardiac tissue, was able todifferentiate some patients with suspected neurally mediated syncope. We showed, in study 3, that A2ARstimulation by Adonis leads to a down‐regulation of CXCR4 and CCR5 expression on T‐cells, suggesting thatAdonis would be a potential drug to treat HIV infections. In study 4, we showed that intracereboventricularinjection of Adonis increased the Hot‐plate and Tail‐flick test latencies in mice in a dose‐dependent manner.Such increases were prevented by two A2AR antagonists and by an opiate receptor antagonist, suggestingthat the anti‐nociceptive effects of Adonis were mediated, at least in part, by endogenous opioid liberation.The last section focused on biological evaluation of new A1R ligands in collaborative studies betweenchemists and biologists. Indeed we showed, in study 5, that among thirty synthesized molecules, four act asA1R antagonists and two turn out to be A1R agonists with a micromolar EC50 on cAMP production. ThoseA1R agonists would be used in neuropathic pains, whereas other antagonists could be used in cardiacfailure or as diuretic. Finally, in study 6, we tested an original hybrid molecule which was revealed to be abivalent antagonist to μ opiate receptors and A1R. This hybrid compound may have applications in somepathologies such as hypovolemic shock and opiate addiction.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.