La thérapie génique peut être définie comme le transfert du gène thérapeutique dans le tissue d’intérêt à l’aide d’un vecteur. A ce jour, les vecteurs dérivés du virus adéno-associés (AAV) représentent les vecteurs de choix pour le transfert de gène in vivo. Cependant, les réponses immunitaires dirigées contre la capside AAV représentent l’obstacle majeur à l’efficacité du transfert de gène médié par le vecteur AAV. Ce travail de thèse a eu pour objectifs de prévenir et d’inhiber la réponse humorale dirigée contre le vecteur AAV. En administrant des nanoparticules contenant de la rapamycine (ou SVP[Rapa]) avec le vecteur AAV, nous avons démontré une inhibition spécifique des réponses humorale et cellulaire dirigées contre la capside AAV. De plus, cette stratégie nous a permis de re-administrer efficacement le vecteur AAV dans des modèles murins et chez le singe. Nos données ont aussi démontré l’élimination des anticorps préexistants dirigés contre le vecteur AAV en administrant SVP[Rapa] avec le bortezomib. Au cours de travail de thèse, nous avons aussi développée et testée l’efficacité des vecteurs AAV associés aux vésicules extracellulaires (vecteurs exo-AAV) à améliorer l’efficacité des vecteurs AAV. En utilisant les vecteurs exo-AAV, nous avons démontré une expression stable et durable du transgène. De plus, les vecteurs exo-AAV ont montré une résistance aux anticorps neutralisants préexistants. Ainsi, au cours de ce projet de thèse des stratégies efficaces ont été développées afin de prévenir et de contrôler les réponses immunitaires dirigés contre le vecteur AAV, permettant ainsi une re-administration efficace du vecteur AAV. / Gene therapy aims to achieve sustained expression of the therapeutic transgene by the introduction of vector cargo into target tissue. To date, viral vectors based on adeno-associated virus (AAV) represent the leading gene delivery tools in vivo. However, immune responses against AAV vector represent the biggest challenge for the widespread use of AAV-based products. In this PhD project, we aimed at the inhibition and prevention of humoral immune responses to AAV capsid. Using nanoparticles containing rapamycin (SVP[Rapa]) given at the time of vector administration, we demonstrated complete abrogation of anti-capsid humoral and cellular immune responses in antigen-specific manner. Using this strategy, we further demonstrated successful vector re-administration in murine models and in non-human primates. Our data also demonstrated elimination of pre-existing antibodies to AAV vector using a combination of SVP[Rapa] and bortezomib. In this PhD thesis project, we also developed and tested the ability of AAV vectors associated with extracellular vesicles (exo-AAV vectors) to enhance AAV vector potency. Using exo-AAV vectors, we demonstrated higher and sustained transgene expression at low vector doses. Exo-AAV vectors also exhibited resistance to neutralization by pre-existing anti-capsid neutralizing antibodies. Thus in this PhD project, powerful strategies have been developed to prevent and control immune responses against AAV vectors, enabling successful AAV vector re-administration.

Les matériaux inorganiques ont des propriétés uniques à l'échelle nanométrique. Ces propriétés ont généré beaucoup d'intérêt pour fabriquer des nouveaux matériaux utilisant des nano-objets comme unité de construction. Nous avons suivi une approche biomimétique pour la fabrication de dispositifs à base de nanoparticules afin d'améliorer les méthodes actuelles de fabrication top-down et bottom-up. Certaines protéines naturelles se lient en effet spécifiquement à des matériaux inorganiques, et déclenchent notamment la croissance de cristaux inorganiques. Une première étape dans cette approche biomimétique est de comprendre comment des protéines se lient spécifiquement à des nanomatériaux inorganiques. Nous avons exploré ce mécanisme de reconnaissance en sélectionnant des anticorps (les protéines de notre système immunitaire spécialisées dans les interactions avec de nombreuses cibles) contre des matériaux inorganiques par la méthode combinatoire biotechnologique appelée "phage display". Cette technique permet d'obtenir la séquence génétique codante des anticorps sélectionnés se liant à leur cible à partir d'une banque aléatoire d'anticorps. L'analyse statistique des séquences des anticorps sélectionnés fournit de nouvelles informations sur les interactions protéines/matériaux inorganiques. Notre principale conclusion est l'identification de l'acide aminé arginine en tant que contributeur majeur dans les interactions protéine/or. L'ingénierie génétique des anticorps permet de fonctionnaliser ces nouvelles sondes de matériaux inorganiques en vue de leur utilisation pour des applications dans le domaine des nanomatériaux. Les anticorps recombinants sélectionnés et leurs dérivés fonctionnalisés peuvent être exprimés par sécrétion à l'aide d'un hôte eucaryote (Dictyostelium discoideum) mis au point au cours de cette thèse. / Inorganic materials have unique properties at the nanometer scale. These properties have generated a lot of interest among researchers to fabricate novel materials using nano objects as building units. In this PhD thesis, we have attempted to mimick nature in the fabrication of nanoparticle based devices in order to improve upon current top-down and bottom-up nanomaterial fabrication methods. Proteins can specifically bind inorganic materials and trigger crystal growth and thus are considered as the main building units for a biomimetic approach of fabrication. The first step towards mimicking nature is to explore how proteins bind specifically to nanomaterials. We have explored this recognition mechanism by selecting antibodies (the protein binders of our immune system) against inorganic nanomaterials using the combinatorial biotechnology method of phage display. This technique provides us with the genetic sequence of selected antibodies from a random antibody library exposed against a target. Statistical analysis of selected antibody sequences provides new information on proteins/inorganics interactions. Our main finding in this regard is the identification of the amino acid arginine as a major contributor to protein/gold interactions. Additional functionality to these new binders of inorganic materials is obtained by antibody engineering, allowing for their value added use in nanomaterial science applications. Selected recombinant antibodies and their engineered derivatives along with other recombinant protein can be expressed and secreted using a eukaryotic expression platform (Dictyostelium discoideum) developed during this thesis.

Outils miniaturisés, polyvalents et sensibles, les biopuces constituent un type d'instrument très prometteur pour la recherche de vie dans le Système solaire. Elles peuvent en effet détecter une grande variété de molécules organiques, ainsi que des bactéries, avec un haut degré de spécificité et de sensibilité. Les biopuces sont actuellement très usitées dans les domaines médical et environnemental, mais aucun instrument à base de biopuce n'a encore été conçu dans le cadre d'une mission spatiale. Pour adapter un tel instrument à ce nouvel environnement, il est nécessaire d'effectuer une étude approfondie de l'impact des contraintes spatiales sur l'ensemble de ses composants.<br /><br />Cette thèse s'insère dans le projet BiOMAS (Biochip for Organic Matter Analysis in Space), financé par le CNES, qui vise à développer une biopuce dédiée au spatial. Le principal objectif de la thèse est d'évaluer la résistance des composants de cette biopuce face aux diverses contraintes spatiales.<br />Dans un premier temps, nous avons étudié la résistance de la lame de la biopuce, c'est-à-dire le support solide de l'instrument. Plusieurs types de matériaux (verre, thermoplatiques, élastomère) ont été comparés en termes de dégazage, résistance aux solvants organiques et comportement thermique et mécanique, afin d'identifier celui qui répond le mieux au cahier des charges que nous avons établi. Parmi les différents candidats testés, le CycloOléfine Copolymère (COC) s'impose comme le meilleur matériau pour la réalisation d'une biopuce spatiale. <br />Dans un second temps, des études de résistance aux contraintes spatiales ont été menées pour la première fois sur des anticorps (qui servent de sondes de reconnaissance dans les biopuces). L'objectif est de déterminer l'évolution de leur comportement lors de cycles thermiques et sous divers types d'irradiations. Nous avons mis en place un outil de simulation performant, sur la base de l'outil Geant 4 du CERN, qui nous a permis de déterminer le type de particules ainsi que les gammes d'énergies pertinentes pour les expériences d'irradiation. Deux campagnes d'irradiation ont été menées sur la plateforme AIFIRA du CENBG à Bordeaux. Nous avons notamment démontré la bonne résistance des anticorps face à des flux de neutrons de faibles énergies.<br /><br />Ce travail de thèse, fortement pluridisciplinaire, a nécessité la mise en place de nombreuses collaborations complémentaires entre des planétologues, des biochimistes, des physiciens nucléaires et des experts en matériaux. Les résultats que nous avons obtenus sont d'une importance capitale pour la réalisation d'une biopuce spatiale opérationnelle et fiable.

Les maladies à prions sont des maladies neurodégénératives fatales, affectant de nombreuses espèces animales, dont l'homme. Elles se caractérisent par l'accumulation, notamment dans le système nerveux central, d'une isoforme anormale d'une protéine membranaire ubiquiste, la protéine prion cellulaire (PrPc). Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement réellement efficace. Ces dernières années, l'immunothérapie, passive et active, basée sur l'utilisation d'anticorps dirigés contre la conformation native de la PrPc et capables de bloquer sa transconformation en forme pathogène, est apparue comme une méthode prometteuse.<br />En vue d'obtenir des anticorps susceptibles d'être utilisés en immunothérapie passive chez l'homme, nous avons développé différents protocoles d'immunisation génique chez des souris de type sauvage, une technique reconnue pour favoriser la production d'anticorps dirigés contre la conformation native de l'antigène, mais souvent décrite comme peu efficace. L'injection intramusculaire par électrotransfert de l'ADNc codant la PrP humaine nous a permis d'obtenir, en augmentant fortement le niveau d'expression in vivo de la protéine, de fortes quantités d'anticorps polyclonaux contre la PrP humaine native. Ces résultats ouvrent la voie à la production d'anticorps monoclonaux puis recombinants, dans un format d'expression qu'il reste à définir pour tester et optimiser leur potentiel thérapeutique in vivo.<br />Dans le cadre d'une approche par immunothérapie active (vaccination), nous avons essayé de rompre la tolérance immunitaire vis-à-vis de la PrPc endogène chez des souris de type sauvage. La potentialisation de la réponse en anticorps spécifiques, induite par l'électrotransfert in vivo de l'ADNc de la PrP humaine, nous a permis de mettre en évidence une réaction croisée de ces anticorps avec la PrPc murine.<br />D'un point de vue général, nos résultats pourraient contribuer à ouvrir de nouvelles perspectives pour l'immunothérapie, passive et active, de nombreuses pathologies, en particulier d'autres maladies neurodégénératives, comme la maladie d'Alzheimer, ou certains cancers caractérisés par une surexpression de protéines membranaires

Les biopuces sont des systèmes miniaturisés qui permettent des analyses en parallèle et à haut débit. Ainsi, les puces à protéines/peptides sont très utiles dans l'étude des interactions entre diverses molécules biologiques. Nous avons réalisé des puces à protéines et peptides en se basant sur la technologie des polymères conducteurs : la méthode consiste à immobiliser les molécules sondes (protéines ou peptides) sur des supports par électrocopolymérisation à partir d'un mélange de pyrrole et de pyrrole lié à la molécule sonde. Le support consiste en un prisme recouvert d'un film d'or permettant l'analyse des interactions protéine-protéine ou antigène-anticorps par imagerie de la résonance plasmonique de surface. Cette méthode optique, compatible avec des mesures en parallèle, permet une analyse directe, en temps réel et donne accès aux paramètres cinétiques des interactions. Ces puces, de réalisation facile, présentent une très bonne spécificité et une bonne sensibilité. Elles peuvent être régénérées un grand nombre de fois et sont compatibles avec l'analyse d'échantillons biologiques complexes tels que du sérum non dilué. Ces caractéristiques permettent un champ d'application très large, en recherche fondamentale ou clinique mais aussi en diagnostic.

La formation du complexe de fusion qui précède la fusion est essentielle à l'infection de la cellule-cible par le VIH-1. L'inhibition de la formation de ce complexe de fusion peut empêcher l'infection et représenter un moyen de traitement antirétroviral. Plusieurs équipes ont essayé de produire des anticorps neutralisants par immunisation de souris ou de lapins avec des peptides linéaires non conformationnels, mais sans résultat. L'élaboration d'une lignée de cellules eucaryotes exprimant la structure HR1-PID-HR2 TM viral nous a permis de le faire. Cette lignée est un outil susceptible d'engendrer des anticorps monoclonaux (mAb). Trois mAbs contre le complexe de fusion de la région gp41 ont été produits chez la souris. L'activité neutralisante des anticorps produits a été évaluée sur des souches de laboratoires et des isolats primaires de VIH-1 de clades B et C. Ils induisent des réponses neutralisantes à large spectre. Les résultats obtenus montrent aussi que les trois anticorps monoclonaux pouvaient inhiber la formation de syncytia et bloquer l'interaction entre les structures HR1 et HR2

La NADPH oxydase, Nox4, appartient à la famille des Nox qui génèrent les espèces radicalaires de l'oxygène, ROS, en transférant un électron à l'oxygène moléculaire. Malgré sa large distribution dans les tissus, Nox4 est encore mal comprise. Contrairement aux autres Nox, Nox4 est unique par son activité constitutive et sa capacité à former H2O2. Les ROS sont des espèces bactéricides dans les phagocytes et des outils de signalisation dans les cellules non phagocytaires en étant associés à de nombreuses pathologies inflammatoires et du vieillissement. Une étude de la structure en lien avec la fonction de Nox4 permettra de mettre l'accent sur un mécanisme de fonctionnement et sur de nouvelles cibles thérapeutiques. 5 nouveaux anticorps monoclonaux ont été générés contre une construction recombinante tronquée (AA: 206-578) de Nox4. La spécificité de 3 anticorps monoclonaux (8E9, 5F9, 6B11) a été confirmée par western blot dans les cellules HEK293 transfectées et le cortex de rein humain. L'anticorps 8E9 est le seul à permettre un marquage des cellules TRex-Nox4 sans perméabilisation par FACS. L'immunofluorescence confocale a montré que Nox4 est localisée dans la zone périnucléaire et le réticulum endoplasmique. La microscopie TIRF a confirmé sa présence dans la membrane plasmique. Un phénomène intéressant est que 5F9 ne détecte pas Nox4 à la membrane plasmique. L'épitope de 8E9 reconnaît une région sur la dernière boucle E extracellulaire de Nox4 (222H-E241), tandis que les anticorps monoclonaux, 6B11 et 5F9 marquent respectivement les régions 6B11 (389S-P416) et 5F9 (392D-F398). Par ailleurs, seuls 5F9 et 6B11 inhibent l'activité de Nox4, ce qui suggère que les deux régions marquées par ces ACm sont impliquées dans le transfert d'électrons. Une étude ciblée sur la boucle E de Nox4 a permis de montrer que le changement de 2 cystéines modifie la nature des ROS générés par Nox4 avec la production de O2- au lieu de H2O2. O2- est mis en évidence par la formation de peroxynitrite en présence de NO. Par ailleurs l'ACm 8E9 diminue la production de H2O2 dans les cellules COS7 qui expriment Nox4 à la membrane plasmique alors que celle de O2- est augmentée. Des constructions recombinantes de Nox4 (native ou tronquée) ont été générées par induction bactérienne, E.Coli, et par un système de transcription/traduction (RTS). Les protéines correspondantes, solubles, ont été produites à grande échelle et l'activité diaphorase mesurée; cette activité est constitutive. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 et p22phox a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode, TDUFA, particulièrement originale, devrait permettre d'appréhender la topologie de l'hétérodimère Nox4/p22phox, actif.

Le polymorphisme et le polygénisme des complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) limitent les succès de la transplantation. En effet, les disparités, tant d’antigènes mineurs que majeurs, exposent le patient transplanté au risque de rejet et imposent l’administration d’un traitement immunosuppresseur. Ce dernier affecte de façon non spécifique l’ensemble des réponses immunitaires et augmente le risque d’infections mortelles et de cancers. En outre, ce traitement ne semble pas prévenir le rejet chronique. Des découvertes récentes ont confirmé l’existence de lymphocytes appelés régulateurs (Tregs) dont le rôle est de garantir l’homéostasie des réponses immunes afin qu’elles ne deviennent incontrôlées et pathologiques. Les Tregs classiquement décrits expriment de manière constitutive l’antigène CD4+, la chaîne alpha du récepteur de l’interleukine (IL)-2 (CD25) et le facteur de transcription Foxp3. Ils représentent 5 à 10% des lymphocytes CD4+ totaux. Les Tregs sont capables de réguler des lymphocytes alloréactifs et ont été décrits comme responsables du maintien de la tolérance d’allogreffe chez la souris. Mais jusqu'alors, les modèles employés pour démontrer l'importance des Tregs en transplantation utilisaient soit un traitement immunosuppresseur transitoire, soit des transferts de cellules T dans des souris lymphopéniques. Toutefois, ces derniers ne permettent pas de distinguer l'effet des Tregs sur la prolifération homéostatique des lymphocytes effecteurs de leur effet sur la réponse allogénique. Dans notre travail, nous montrons que les Tregs jouent un rôle prépondérant dans l’acceptation spontanée d’allogreffes en l’absence d’immunosuppresseur et en dehors d’un contexte lymphopénique chez la souris. En effet, la déplétion des Tregs du receveur par l’administration d’anticorps anti CD25 amplifie les réponses allogéniques de type Th1 et Th2 et, par conséquent, déclenche le rejet d’allogreffe. Les propriétés régulatrices des Tregs ne sont cependant pas illimitées. En effet, dans un second travail, nous décrivons, d’une part, leur incapacité à contrôler la production d’IL-17 par des lymphocytes CD4+CD25pos mémoires et, d’autre, part leur implication directe dans la différenciation de cellules Th17 au départ de lymphocytes CD4+CD25neg alloréactifs. Nous concluons donc que si les Tregs naturellement présents chez le receveur jouent un rôle primordial dans la protection du greffon contre des réponses de type Th1 ou Th2, ils pourraient néanmoins favoriser une voie alterne du rejet d’allogreffe dépendante de l’IL 17. / Major histocompatibility complex (MHC) polymorphism is a major hindrance to transplantation success. Both minor and major antigen disparities between donor and recipient increase the risk of transplant rejection. This is thwarted by the administration of an immunosuppressive therapy that unspecifically affects all immune responses therefore increasing the risk of infections and cancers. Besides, this treatment does not seem to prevent chronic rejection. Recent studies have confirmed the existence of lymphocytes called regulatory T cells (Tregs), whose role is to maintain the general immune homeostasis and to protect the individual from autoimmune diseases. The classically described Tregs express constitutively the CD4 antigen, the alpha chain of the interleukin (IL)-2 receptor (CD25) and the transcription factor Foxp3. They represent 5 to 10% of total CD4+ T cells. Tregs are able to control alloreactive responses and were described to be responsible for the maintenance of allograft tolerance in mice. So far, the tolerogenic capacities of Tregs have been demonstrated either in mice treated with immunomodulatory antibodies (induced Tregs) or by adoptive co-transfer of Tregs and effector cells into lymphopenic mice. However, the latter has the disadvantage of not being able to distinguish the effect of Treg on lymphopenia-induced homeostatic proliferation from their effect on alloreactive responses. Herein, we show that Tregs play a crucial role in spontaneously accepted allografts in the absence of immunosuppressive therapy and in non-lymphopenic condition. Indeed, the depletion of the recipient’s Tregs through the administration of an anti-CD25 antibody enhances type Th1 and type-Th2 allogeneic responses, consequently triggering allograft rejection. However, the regulatory properties of Tregs are not unlimited. Indeed, we found that Tregs are unable to control allogeneic IL-17 production by memory CD4+ T cells and are even necessary for de novo Th17 differentiation. We conclude, therefore, that Tregs naturally present in the recipient play a critical role in protecting the allograft. Nevertheless, despite this context of regulation, IL-17-producing alloreactive T cells, beyond the control of Tregs, could mediate an alternative pathway of allograft rejection.

Les antigènes exprimés sur les cellules cancéreuses peuvent être ciblées par des anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAbs) capables, d'induire une réduction de la masse tumorale. Dans la plupart des cas, la fixation des mAbs à la surface des cellules tumorales induit, par la portion Fc, le recrutement de cellules phagocytaires et cytotoxiques qui expriment des récepteurs pour la pour la portion Fc des IgG (RFcy). Chez l'homme et chez la souris plusieurs RFcy existent et ont différentes fonctions et expression à la surface des cellules hématopoïétiques. En revanche, lequel parmi les multiples RFcy est responsable pour l'activité thérapeutique des anticorps monoclonaux n'est pas connu, ni quelle population cellulaire qui les exprime est responsable de la destruction des cellules tumorales. Au cours de ma thèse j'ai développé deux modèles d'immunothérapie à base d'anticorps monoclonaux chez la souris : un modèle syngenique (Melanome B16) et un modèle xenogenique (Cancer du sein humain BT474). Dans ces modèles, l'injection de l'anticorps murin TA99 qui reconnaît la protéine gp75 exprimée par les cellules tumorales B16, d'une part, et l'injection de l'anticorps humanisé Trastuzumab qui reconnaît le récepteur HER2 exprimé par les cellules BT474, d'autre part, induit une réduction de la masse tumorale. En utilisant ces deux modèles j'ai identifié des récepteurs murins (RFcyI/RFcyIII) et humains (RFcyI/RFcyIIA) responsables de l'activité anti tumorale de ces anticorps. De plus, j'ai identifié les neutrophiles comme population cellulaire responsable de la destruction des cellules tumorales en présence des anticorps thérapeutiques.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est l'agent responsable de l'hépatite C, maladie qui touche environ 3% de lapopulation mondiale. Une des caractéristiques de cette infection est son évolution dans 60 à 90% des casvers des formes chroniques avec des complications sévères telles que la cirrhose et le carcinomehépatocellulaire. Un des handicaps majeurs de la recherche sur le HCV est l'absence de systèmes decultures in vitro efficaces et de modèles animaux adaptés car le HCV n'infecte que l'homme et le chimpanzé.l'anticorps D32.10. Pour cela, nous avons développé un test de cellbindinget nous avons montré quel'interaction des particules virales sériques (HCVsp) radiomarquées à l'Iode 125 avec les celluleshépatocytaires (Huh‐7 et HepaRG) est spécifique et saturable impliquant des sites de haute et faible affinité.De plus, l'anticorps D32.10 est capable d'inhiber spécifiquement et efficacement les interactions de hauteaffinité entre les HCVsp et les cellules HepaRG avec une IC50 ≤ 0,5 μg/ml. Nous avons mis en évidence quel'inhibition est plus efficace lorsque nous utilisons sélectivement une population de particules HCVenveloppées exprimant fortement E1E2. Récemment, nous avons développé un système d'infection originaldes cellules HepaRG qui sont des cellules progénitrices du foie par les HCVsp et avons montré quel'infection, la réplication et la propagation dépendent de l'état de prolifération/différenciation de cescellules. Nous avons aussi démontré que les particules virales produites dans ce système contiennent del'ARN viral, expriment les protéines d'enveloppe E1E2 et sont infectieuses. Des études préliminairesmontrent que l'anticorps D32.10 inhibe fortement l'infection (95% à 80% aux jours 14 et 21 aprèsinfection) vraisemblablement au niveau des étapes précoces du cycle viral.Dans un second temps, nous avons recherché la prévalence des anticorps de même spécificité que le D32.10(anti‐E1E2A,B) dans différents groupes de patients HCV positifs afin de déterminer leur significationbiologique. Par un test ELISA utilisant les peptides biotinylés E1, E2A et E2B dans la phase de capture, nousavons démontré que la réponse anticorps anti‐E1E2A,B était présente dans 90% des cas chez les patientsqui guérissent spontanément avec des titres élevées (≥ 1/1000). Cette réponse humorale est absente ourare (< 10%) chez les patients porteurs chroniques non traités ou non répondeurs aux traitementsantiviraux. Une étude longitudinale a été réalisée chez des patients non répondeurs ou répondeursdéveloppant une réponse virologique soutenue à une bithérapie standard, interféron pégylé plus ribavirine.L'analyse statistique des résultats a montré que les anticorps anti‐E1E2A,B pouvaient être prédictifs de laréponse au traitement avec une spécificité et une valeur prédictive positive de 100%.La convergence des résultats in vitro et in vivo supporte un rôle neutralisant de l'anticorps monoclonalD32.10, permettant d'envisager son utilisation en immunothérapie.