Les cancers du sein triple-négatif (TNBC) (RE-, RP-, HER2) représentent 15% des cas de cancer du sein. Les patientes atteintes de TNBC sont traitées uniquement par chimiothérapie. A l’heure actuelle, il n’existe aucune thérapie ciblée efficace. Malgré une chimiosensibilité initiale, les rechutes sont fréquentes. Ainsi de nouveaux traitements sont nécessaires pour soigner ces patientes. Dans le cancer du sein, l’aspartyl protéase cathepsine D (cath-D), un marqueur de mauvais pronostic, est surexprimée par les cellules cancéreuses et est hyper-secrétée dans le microenvironnement tumoral. La cath-D stimule la prolifération des cellules cancéreuses, la croissance invasive des fibroblastes, la croissance tumorale, l’angiogenèse tumorale et la formation des métastases. Différentes études ont mis en exergue le rôle oncogénique de la cath-D extracellulaire dans le cancer du sein, suggérant qu’elle serait une cible thérapeutique d’intérêt. Afin de neutraliser sélectivement la forme sécrétée de la cath-D, le laboratoire a généré des anticorps humains IgG1 dirigés contre la cath-D par un crible de phage display (International patent N° PCT/EP2016/061454).Les principaux objectifs de ma thèse ont été i) de valider la cath-D comme une cible extracellulaire d’intérêt pour les patientes atteintes de TNBC, ii) d’évaluer les effets thérapeutiques et iii) de caractériser les mécanismes d’action des anticorps humains anti-cath-D.Nous avons montré que des niveaux élevés d'ARNm de CTSD sont corrélés à une survie sans récidive plus courte. Par analyse protéomique et étude immunohistochimique anti-cath-D réalisée sur Tissue Micro-Array, nous avons observé que la cath-D extracellulaire est détectée dans le microenvironnement tumoral des TNBC contrairement au tissu mammaire normal. Nos résultats mettent ainsi en exergue que la cath-D serait un biomarqueur tumoral extracellulaire, suggérant que les patientes atteintes de TBNC pourraient bénéficier d’une thérapie par des anticorps anti-cath-D. Par des analyses de SPECT-CT (Single Photon Emission Computed Tomography) et de biodistribution, nous avons validé que les anticorps humains anti-cath-D, F1 et E2, s’accumulent dans les xénogreffes de la lignée TNBC MDA-MB-231 chez la souris athymique. Les anticorps F1 et E2 inhibent la croissance tumorale des xénogreffes MDA-MB-231 et améliorent la survie des souris athymiques. Notre meilleur anticorps anti-cath-D, F1, inhibe également la croissance tumorale de deux lignées de TNBC PDX (patient-tumor derived xenografts). Au niveau mécanistique, l’anticorps F1 module le microenvironnement immunitaire dans les tumeurs issues des xénogreffes MDA-MB-231. L’ensemble de nos résultats suggèrent qu’une immunothérapie avec des anticorps humains anti-cath-D pourrait être une nouvelle approche thérapeutique pour les patientes atteintes de TNBC. / Triple-negative breast cancer (TNBC) accounts for 15-20% of all breast cancer cases, and chemotherapy is the only available treatment. Thus identification of new therapeutic targets is required to improve TNBC outcome. In breast cancer, the aspartic protease cathepsin D (cath-D) is a marker of poor prognosis associated with metastatic risk. This protease is overexpressed by breast cancer cells and is abnormally hypersecreted into the tumor microenvironment. Cath-D affects both cancer and stromal cells in the breast tumor microenvironment by increasing the proliferation of breast cancer cells, fibroblast invasive outgrowth, tumor growth and angiogenesis, and metastasis formation. Many studies indicated that extracellular cath-D displays oncogenic activities, suggesting it could represent a novel therapeutic target in TNBC. In order to block its oncogenic actions, the laboratory generated human IgG1 antibodies against extracellular cath-D by phage display (International patent N° PCT/EP2016/061454). The aims of my PhD project was i) to validate the potential value of cath-D as a tumor-specific extracellular target in TNBC, ii) to evaluate the therapeutic activity, and iii) to characterize the mechanisms of action of these anti-cath-D human antibodies.We showed that elevated CTSD mRNA levels correlated with shorter recurrence-free survival. Using proteomics analysis and anti-cath-D immunohistochemistry performed on Tissue Micro-Array, we observed that extracellular cath-D was detected in the tumor microenvironment of TNBC, but not in matched normal breast stroma samples. Our results thus indicate that cath-D is a tumor cell-associated extracellular biomarker and strongly suggest that it could be a good candidate for antibody-based therapy in TNBC. We found that anti-cath-D human antibodies, F1 and E2, accumulated in TNBC MDA-MB-231 tumor xenografts in athymic mice by SPECT-CT (Single Photon Emission Computed Tomography) and biodistribution analysis. F1 and E2 antibodies inhibited tumor growth of MDA-MB-231 tumor xenografts and improved mice survival without apparent toxicity. F1, the best antibody candidate, inhibited tumor growth of two TNBC patient-derived xenografts (PDX). Mechanistically, F1 treatment modulates immune tumor microenvironment in the MDA-MB-231 tumor cell xenograft model. Together, our results indicate that antibody-based targeting of cath-D may have therapeutic efficacy for TNBC treatment.

Le développement des anticorps monoclonaux thérapeutiques est en plein essor notamment à cause de leur bénéfice important pour le traitement des cancers. Cependant, à l’heure actuelle, aucun anticorps monoclonal sur le marché ou en phase III ne cible de RCPGs, en dépit de l’implication grandissante de ces récepteurs dans la carcinogenèse. Parmi les RCPGs les plus pertinents pour l’oncologie, souvent cités dans la littérature et dont certains inhibiteurs chimiques sont en phase clinique avancée, on trouve les deux sous-types de récepteurs des endothélines ETAR et ETBR. Dans ce contexte, mon projet de thèse a consisté à produire des anticorps monoclonaux capables de lier spécifiquement les récepteurs des endothélines, puis à les caractériser dans le but d’évaluer leur potentiel antitumoral. Grâce à une stratégie d’immunisation génique, un ensemble de 27 anticorps monoclonaux, tous spécifiques de la forme native d’ETBR, a été obtenu. Un de ces anticorps, nommé rendomab-B1, a fait l’objet d’une caractérisation précise et s’est révélé être un puissant inhibiteur allostérique d’ETBR. De plus, cette propriété antagoniste a permis de bloquer l’action autocrine antiapoptotique de l’ET-1 sur des cellules endothéliales vasculaires, suggérant ainsi que le rendomab-B1 pourrait être utilisé comme agent thérapeutique afin d’inhiber les effets tumorigènes liés à la suractivation de l’axe ET1/ETBR au niveau de l’endothélium vasculaire tumoral. Par ailleurs, le rendomab-B1 a également été testé sur des lignées de mélanomes humains ; l’absence de fixation de l’anticorps malgré la présence de récepteurs ETB fonctionnels à la surface de ces cellules suggère l’existence d’une forme moléculaire atypique du récepteur, potentiellement spécifique aux mélanomes. A la lumière de ces résultats, le rendomab-B1 apparaît comme un outil prometteur, à la fois pour l’étude structurale et fonctionnelle d’ETBR, mais aussi pour une éventuelle thérapie anticancéreuse. Enfin, les 26 autres anticorps monoclonaux anti-ETBR, actuellement en cours de caractérisation, constituent également des molécules potentiellement intéressantes pour un usage fondamental ou thérapeutique impliquant ETBR. Pour conclure, ces travaux ont démontré l’intérêt de la méthode d’immunisation génique pour la production d’anticorps monoclonaux anti-RCPGs à visée thérapeutique. / For a decade, monoclonal antibodies have become increasingly important for the biotherapeutic management of cancer. However, none of the monoclonal antibodies currently on the market or in late stage clinical trial do target a G-protein coupled receptor in spite of the emerging role of these receptors in tumor progression. Among the therapeutically relevant GPCRs for oncology, the endothelin receptors (ETAR and ETBR) are particularly attractive considering their overexpression in a wide range of tumors and their involvement in various stages of tumorigenesis. In this context, my PhD project consisted in producing and characterizing monoclonal antibodies directed against endothelin receptors with a view to use them as anti-tumor agents. Using an original DNA immunization strategy, we produced a panel of 27 monoclonal antibodies which selectively recognized ETBR expressed at the surface of transfected cells. One of these antibodies, named rendomab-B1, was extensively characterized and proved to be a potent allosteric antagonist of ETBR. Moreover, rendomab-B1 was able to disrupt the autocrine ET1-mediated survival loop on vascular endothelial cells, suggesting that this antibody could be used to prevent the pro-tumorigenic effect due to ET-1 and ETBR upregulation in the tumor-surrounding endothelium. Furthermore, rendomab-B1 binding onto ETBR was also assessed on melanoma cell lines and revealed that a tumor-specific form of ETBR may exist, as illustrated by the poor fixation of rendomab-B1 on these cells in spite of the presence of functional ETB receptors. Together, these results present rendomab-B1 as promising agent, not only for the structural and functional study of ETBR, but also for its therapeutic modulation in the case of cancer for instance. Finally, the other 26 monoclonal antibodies, whose characterization is still ongoing, also constitute potential tools for fundamental or therapeutic applications involving ETBR. To conclude, this work has highlighted the relevance of the DNA immunization approach to generate monoclonal antibodies against the native form of GPCRs.

Il est admis que l’axe endothéline (endothélines ET-1, -2 et -3 et leurs RCPG ETAR et ETBR), participe à la progression tumorale. Alors qu’ETAR est par exemple surexprimé dans le cancer de l’ovaire, ETBR l’est dans le mélanome. Cette surexpression, ainsi que l’implication d’ETA/BR dans la carcinogenèse, font de ces RCPG une cible tumorale pertinente. En raison de leurs forte spécificité, actions cytotoxiques variées, possibilités de couplage, les anticorps monoclonaux (AcM) sont des outils de choix en diagnostic et thérapie anti-cancéreuse. Cependant, on déplore actuellement l’absence d’AcM ciblant des RCPG sur le marché. Par une technique d’immunisation génique, 4 AcM anti-ETAR et 24 anti-ETBR ont été produits. Les résultats préliminaires obtenus avec les anti-ETAR sont prometteurs puisque ces AcM lient avec une haute affinité ETAR surexprimé dans des cellules CHO, l’un d’eux inhibant fortement la liaison du ligand. Mon travail de thèse s’est cependant concentré sur la caractérisation d’un anti-ETBR. Cet AcM reconnaît de façon spécifique et avec une forte affinité la conformation native d’ETBR surexprimé à la surface de cellules de mélanomes, suggérant l’existence d’une forme tumorale du récepteur. Suite à sa liaison aux cellules UACC-257 (lignée de mélanome), l’AcM se trouve internalisé. Dans ces cellules, malgré son incapacité à inhiber la liaison de l’ET, cet AcM inhibe l’activation de la voie PLC induite par le ligand et est également un fort inhibiteur de la migration due à l’activation de l’axe endothéline. Ces travaux soulignent l’intérêt de cet AcM comme outil diagnostique et thérapeutique dans le cas du mélanome. / It has been admitted that endothelin axis (endothelins ET-1, -2 and -3 and related GPCRs ETAR and ETBR) is involved in tumor progression. For instance, while ETAR is overexpressed in ovarian cancer, ETBR is in melanoma. This overexpression, as well as ETA/BR involvement in carcinogenesis, make these GPCRs a relevant tumor target. Because of their high specificity, various cytotoxic actions, possibilities of coupling, the monoclonal antibodies (mAbs) are useful tools in diagnosis and anti-cancer therapy. However, the absence of mAbs targeting GPCRs on the market is regrettable. Thanks to DNA immunization, 4 anti-ETAR mAbs and 24 anti-ETBR mAbs were produced. Preliminary results obtained with anti-ETAR are promising since these mAbs bind ETAR overexpressed in CHO cells with high affinity, one of them being a potent inhibitor of ligand binding. However, the aim of my PhD research works focused on the characterization of one anti-ETBR. This mAb specifically recognizes with high affinity the native conformation of ETBR overexpressed on the surface of melanoma cells, suggesting the existence of a tumor-specific receptor. Following its binding on UACC-257 cells (melanoma cell line), the mAb is internalized. In these cells, despite its inability to inhibit ET binding, this mAb is able to inhibit the ligand-induced activation of PLC pathway and display a potent inhibition of endothelin axis-induced migration. This work highlights the interest of this mAb as a tool for diagnosis and therapy in melanoma.

La galectine-9 est une lectine animale principalement exprimée dans un contexte inflammatoire et possédant des propriétés à la fois pro-inflammatoires et immunosuppressives. Elle induit la production de cytokines inflammatoires par les cellules du système immunitaire inné tandis qu’elle induit l’apoptose des lymphocytes Th1 CD4+ et favorise l’expansion des lymphocytes Treg. Les propriétés immunomodulatrices de la galectine-9 dépendent en grande partie de son interaction avec le récepteur TIM-3. Cependant, ces deux molécules interagissent chacune avec d’autres protéines et dans plusieurs contextes la responsabilité de l’interaction galectine-9/TIM-3 n’a pas été formellement démontrée. Le développement d’un anticorps neutralisant les effets de la galectine-9 permettrait de préciser son rôle exact dans ces contextes. Par ailleurs, le blocage des voies de signalisations inhibitrices du système immunitaire est aujourd’hui un enjeu majeur en oncologie, comme le démontre le succès récent de la neutralisation du récepteur inhibiteur CTLA-4 pour le traitement des mélanomes. Nous avons produit de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine 9 par immunisation de souris avec la partie C-terminale de la protéine. Parmi ces anticorps, 1G3 permet la détection de la galectine-9 sur coupes de tissus humains d’une manière très sensible et spécifique en immunohistochimie. Son utilisation nous a permis de confirmer l’expression constante et intense de la galectine-9 dans les cellules malignes de carcinome nasopharyngé et la forte expression de la galectine-9 dans les cellules de Kupffer présentes dans les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite C. Pour la première fois, nous avons mis en évidence une expression de la galectine-9 dans les leukocytes infiltrant les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite B. De plus, nous observons une expression de la galectine-9 dans les hépatocytes infectés par ces deux virus, ce qui n’avait pas été démontré jusqu’à présent. Nous avons également caractérisé les capacités fonctionnelles de nos anticorps lors de tests in vitro. L’anticorps 2E12 bloque la fixation de la galectine-9 au récepteur TIM-3 dans un test acellulaire, neutralise l’apoptose induite par la galectine-9 sur cellules de lymphomes T humaines et réduit considérablement l’augmentation de calcium cytosolique induite par la galectine-9 dans les cellules Jurkat. Ces effets de la galectine-9 sont indépendants de TIM-3 dans ce modèle cellulaire. L’anticorps 2E12 constitue un outil puissant pour étudier les fonctions de la galectine-9 à la fois dépendantes et indépendantes de TIM-3. / Galectin-9 is an animal lectin mainly expressed in an inflammatory context which possesses both pro-inflammatory and immunosuppressive properties. It induces inflammatory cytokines production from innate immunity cells whereas it induces apoptosis of Th1 CD4+ lymphocytes and enhance T regulatory lymphocytes expansion. Galectin-9 immunomodulatory properties depends mostly on its interaction with TIM-3 receptor. However, both molecules interact with other proteins, and in several contexts, galectin-9/TIM-3 interaction responsability has not been formally demonstrated. Development of a galectin-9 neutralizing antibody would allow to determine its precise role in those contexts. Moreover, blocking of immune system inhibition pathways is nowaday a major concern in oncology, as the success of CTLA-4 antagonist used for melanoma treatment recently demonstrated. We have produced new monoclonal antibodies against galectin-9 through immunisation of mice with the C-terminus part of the protein. Among those antibodies, 1G3 allows the detection of galectin-9 on human tissue samples in a very sensitive and specific manner in immunohistochemistry. Using 1G3, we could confirm intense and constant expression of galectin-9 in nasopharyngeal carcinoma malignant cells and its strong expression in Kupffer cells infiltrating hepatitis C-infected liver tissue. For the first time, we demonstrated expression of galectin-9 in leukocytes infiltrating hepatitis B-infected liver tissue. Additionally, we could observe galectin-9 expression in infected hepatocytes for both viruses, which had not been demonstrated until now.We also characterized functional properties of our antibodies during in vitro tests. The 2E12 antibody blocks galectin-9 interaction with TIM-3 in an cell-free assay, neutralizes galectin-9-induced apoptosis of human T lymphomas cells and considerably reduces galectin-9-induced increase of intracellular calcium in Jurkat cells. Those effects are independent of TIM-3 in this cell line model. The 2E12 antibody constitutes a powerful too to study both TIM-3-dependent and TIM-3-independent functions of galectin-9.

Les muqueuses représentent la principale voie de contamination par le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) indiquant qu'une protection au niveau des muqueuses serait nécessaire dans la prévention et le développement d'un vaccin efficace. La prise en charge du VIH-1 par l'intermédiaire de la gp120 se fait, grâce à des lectines de type C, au niveau de la muqueuse par les cellules de Langerhans (Langerine) et au niveau de la sous-muqueuse par les cellules dendritiques (DC-SIGN). Notre but était d'analyser la présence d'anticorps capables de bloquer l'interaction entre le virus et les lectines. Nous avons développé des tests spécifiques pour l'étude de la liaison de la gp120 du VIH-1 avec la Langerine et le DC-SIGN. Grâce à ces tests, nous avons pu caractériser des anticorps, dirigés contre la Langerine ou le DC-SIGN, permettant le blocage de la fixation de la gp120 sous forme conformationnelle. Nous avons utilisé ces tests validés pour étudier la fréquence d’anticorps bloquants dans le sérum de 110 individus séropositifs et 30 individus séronégatifs. Seulement peu de sujets infectés ont développé ce genre d'anticorps durant l'infection par le VIH-1. Nous avons pour la première fois décrit des anticorps bloquants chez des sujets séropositifs avec la capacité potentielle d’interférer dans la transmission des particules virales aux cellules dendritiques. Ces résultats permettent d'espérer la conception de nouvelles stratégies pour bloquer la transmission du VIH-1 au niveau des muqueuses et prévenir la dissémination du virus. Ces tests permettront de doser l'inhibition de la liaison de la gp120 soit à la Langerine soit au DC-SIGN et d'étudier différentes cohortes de sujets séropositifs et séronégatifs mais fortement exposés (HEPS) / Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) is primarily transmitted sexually through mucosal surfaces, indicating that protection at mucosal sites may be crucial in prevention and in the development of an effective conventional vaccine against HIV-1. The HIV-1 gp120 is recognized by the C-type lectins of Langerhans cells (LCs), Langerin, in the mucosa and by the C-type lectins of dendritic cells (DCs), DC-SIGN in the sub-mucosa. Our aim was to analyze the presence of antibody able to block HIV / Lectins interactions. We have developed specific assays for the study of the binding of HIV-1 gp120 on human Langerin and DC-SIGN. With these assays, we have been able to characterize specific DC-SlGN and Langerin antibodies able to block fixation of conformational gp120 envelope protein. We have used our validated assays to monitor the prevalence of blocking antibodies in the sera of one hundred and ten HIV-1-infected individuals and thirty HIV-1 non-infected individuals. Only few patients have developed such type of antibodies during their infection. This is the first report which describes blocking antibodies in patients with the potential capacity to interfere during the mucosal transmission of HIV particles to mucosal DCs. The results provide a framework for the design of effective strategies to block local transmission and prevent HIV-1 spread. These tests will allow the measuring of the inhibition of gp120 binding to langerin or to DC-SIGN and the screening of different cohorts of HIV-1 positive subjects and HIV-1 negative but highly exposed subjects (HEPS)

En France, le cancer colorectal (CCR) est la 2ème cause de décès par cancer. Chez les patients, lorsque la tumeur est localisée, elle est réséquée par chirurgie. Toutefois, 50% des patients sont diagnostiqués à un stade métastatique, ces patients sont alors traités par chimiothérapie (FOLFOX/FOLFIRI), souvent en combinaison avec des thérapies ciblées incluant des anticorps tel que le Cetuximab (anti-EGFR) ou le Bevacizumab (anti-VEGF). Cependant, il reste encore environ 40% des patients qui ne répondent pas au traitement et l’une des causes les mieux établies est l'influence des mutations de la voie RAS en aval du récepteur à l'EGF sur la réponse au Cetuximab. C’est pourquoi l’identification de nouvelles cibles moléculaires accessibles aux anticorps permettrait le développement de nouveaux modèles de thérapie ciblée. Depuis peu, les Claudines ont suscité un intérêt pour le ciblage tumoral comme la claudin-4 dans les cancers de l’endomètre ou de la prostate. Très récemment, les résultats d'une étude clinique ont démontré que la combinaison d'un anticorps anti-Claudin-18.2, l'Acm IMAB362, avec la chimiothérapie prolongeait nettement la survie chez des patients atteints de cancer gastrique avancé.C’est dans cette optique que nous nous sommes focalisés sur les claudines dans le CCR. Tout d’abord en étudiant leur expression dans des échantillons de patients atteints de CCR métastatique. En analysant l’expression des claudines dans les nouveaux sous-types moléculaires, nous avons montré que certaines pouvaient avoir une valeur pronostique. Nous avons également identifié des claudines comme cibles thérapeutiques potentielles dans le CCR, parmi elles la CLDN1. En effet, nous avons montré que la forme membranaire de la CLDN1 était surexprimée dans les tumeurs primaires et métastases du CCR. Nous avons développé un anticorps monoclonal (Acm) ciblant les parties extracellulaires de la CLDN1. Nous avons montré que le ciblage thérapeutique de la CLDN1 par Acm provoquait un ralentissement significatif de la croissance, la migration et l'invasion des cellules tumorales aussi bien in vitro que in vivo. Afin d’améliorer l’efficacité du ciblage de la CLDN1 par Acm, nous avons couplé ce dernier avec une toxine, générant ainsi un Antibody Drug conjugated (ADC). Nous avons montré que le ciblage de la CLDN1 par un ADC diminuait la survie cellulaire in vitro en culture cellulaire 2D, mais également celle des sphéroïdes via un effet cytotoxique. Ce travail a permis d'établir la preuve de concept du ciblage de la CLDN1 aussi bien par Acm que par ADC. Afin de finaliser ce travail, ces résultats doivent être confirmés in vivo. A terme, nous espérons que ce ciblage puisse trouver sa place au sein de l’arsenal thérapeutique du CCR métastatique, en particulier chez les patients résistants aux traitements. / Colorectal cancer (CRC) is one of the major causes of cancer-related deaths in the Western world. When localized, CRC is often curable by surgery. However, 50% of patients are diagnosed at a metastatic stage, these patients are then treated with chemotherapy (FOLFOX / FOLFIRI), often in combination with targeted therapies including antibodies such as Cetuximab (anti-EGFR) or Bevacizumab (anti -VEGF). Despite these treatment, almost 40% of patients develop resistance. One of the most known resistance mechanisms of resistance is due to the RAS pathway downstream of the EGF receptor in response to Cetuximab. Therefore, more therapeutic options are required particularly by identifying new molecular targets that can be reached by antibodies. Recently, Claudines have generated interest as targets in cancer, such as claudin-4 in endometrial or prostate cancer. More recently, the results of a clinical study demonstrated that the combination of an anti-Claudin-18.2 antibody, IMAB362 mAb, with chemotherapy significantly prolonged survival in patients with advanced gastric cancer.Therefore, one of our aims was to focus on claudins in CCR. First, by studying their expression in metastatic CRC patient samples. We demonstrated the prognostic value of some claudins, after analyzing their gene expression in the new molecular subtype of CRC. Beside, we identified some claudins as potential therapeutic targets in CCR, among them claudin-1 (CLDN1). Indeed, we showed that the membrane form of CLDN1 is overexpressed in primary tumors and metastases of CRC. Therefore, we developed a monoclonal antibody (mAb) targeting the extracellular parts of CLDN1. We showed that therapeutic targeting of CLDN1 by mAb significantly decreased tumor cell growth, migration and invasion both in vitro and in vivo. In order to improve the efficiency of targeting CLDN1 by mAb, we conjugated it with a toxin, thus generating an Antibody Drug Conjugate (ADC). We showed that CLDN1 targeting by an ADC decreased cell survival in vitro in 2D cell culture, but also spheroids growth via a cytotoxic effect.This work demonstrated the proof of concept of CLDN1 targeting by both mAb and ADC. In order to achieve this work, the next steps remains on testing ADC affect in vivo models. CLDN1 is a good therapeutic target in the CCR. In the long term, we hope that its targeting can find its place within the therapeutic arsenal of metastatic CRC, particularly in treatment of resistant patients.

Les récepteurs de la famille HER jouent un rôle majeur dans le développement du cancer. Alors qu’EGFR, HER2 et HER3 sont très bien étudiés et ciblés par des anticorps thérapeutiques, le dernier récepteur de cette famille, HER4, n’est que peu étudié et son implication dans la cancérogénèse est controversée. Il n’existe à ce jour pas d’anticorps thérapeutique anti-HER4 sur le marché ou en phase clinique. Ce récepteur est présent à la surface en quatre isoformes (JMa/CYT1 ; JMa/CYT2 ; JMb/CYT1 ; JMb/CYT2). Les isoformes JMa sont activées par clivage du récepteur, contrairement aux deux isoformes JMb. Le clivage de ces isoformes conduit à la libération de la partie intracellulaire du récepteur, appelée 4ICD. Ce fragment peut être dirigée au noyau ou dans d’autres compartiments cellulaires, impliquant HER4 dans des signalisations oncogéniques ou suppresseurs de tumeur. La littérature décrivant une activité pro-apoptotique de 4ICD et de la NRG1, le principal ligand de HER4, nous avons étudié la signalisation de ces isoformes afin de déterminer leurs rôles au niveau tumoral. Nos résultats indiquent que la NRG1 induit une signalisation suppresseur de tumeur via JMa/CYT1 et une signalisation oncogénique via JMa/CYT2. Sur la base de ces résultats, nous avons développé un criblage original d’anticorps anti-HER4 par phage display, sur des cellules exprimant l’isoforme JMa/CYT1 et stimulées par la NRG1. Nous avons caractérisés quatre anticorps anti-HER4, dont l’activité et les signalisations de certains sont modulées par la NRG1. Deux de ces anticorps, caractérisés comme étant des agonistes du récepteur HER4, induisent la mort des cellules tumorales par des mécanismes que nous sommes en train d’élucider. De manière similaire a la NRG1, un des anticorps induit la relocalisation de 4ICD-CYT1 a la mitochondrie pour induire la mort cellulaire. Ces résultats prometteurs ouvrent la voie à un ciblage thérapeutique du récepteur HER4 a l’aide d’anticorps agonistes pour le traitement des cancers / HER family is composed by four members which play a major role in cancer development. EGFR, HER2 and HER3 are well described and targeted with therapeutic monoclonal antibodies. HER4, the last one, is poorly described with a contentious role in cancerogenesis. Nowadays, there is no therapeutic antibody targeting HER4 in clinic. Four isoforms of the receptor are addressed to the plasma membrane and are called JMa/CYT1; JMa/CYT2; JMb/CYT1 and JMb/CYT2. JMa isoforms are activated by cleavage, but not JMb isoforms. Following their activation, JMa isoform cleavage releases the intracellular part of the receptor called 4ICD. This part can be directed to the nucleus or others subcellular compartments, involving HER4 in oncogenic or tumor suppressor signalling. Because a pro-apoptotic activity of 4ICD and its main ligand NRG1 have been described, we studied JMa isoforms signaling to determine their roles in cancer. We demonstrated that NRG1 induce a tumor suppressor signalling from JMa/CYT1 and an oncogenic signalling from JMa/CYT2. Based on these results, we developed an innovative screening for anti-HER4 antibodies by whole cell panning with phage display. To this end, we used NRG1- stimulated cells expressing JMa/CYT1 isoforms. We characterized four anti-HER4 antibodies and functions of some of them are affected and modulated by NRG1. Two antibodies were characterized as agonistic anti-HER4 antibodies and induce cell death of cancer cells by different mechanisms. Like NRG1, one of them induce mitochondrial localization of 4ICD-CYT1 to induce cell death. These promising results pave the way to a therapeutic targeting of HER4 receptor with agonistic antibodies to treat cancer

Ce travail de thèse s’est focalisé sur le développement des approches génériques de spectrométrie de masse (MS) pour la quantification des anticorps monoclonaux (mAbs) et de leurs produits dérivés dans des études précliniques. Premièrement, le développement des protocoles de préparation d’échantillons basée sur la digestion directe à partir de sérum ou comportant une étape d’immuno-précipitation spécifique par anticorps a permis la quantification des mAbs couvrant une large gamme d'étalonnage de cinq ordres de grandeur. En outre, l'emploi de peptides provenant de la région constante du mAb a démontré la polyvalence de telles approches génériques de chromatographie liquide en tandem MS (LC-MS/MS). Deuxièmement, les instruments de MS à haute résolution (HRMS) ont étés évalués dans le cadre de cette thèse en tant qu'alternative aux spectromètres de masse de type triple quadripôle traditionnellement utilisés pour l’analyse bottom-up quantitative. L’avantage majeur de l’intégration des analyseurs de HRMS a été associé à la possibilité de l’analyse quantitative simultanée des mAbs et leurs produits associés directement au niveau de la protéine fournissant un niveau d'informations bien au-delà de celui obtenu avec des approches bottom-up. Par conséquent, l’apport essential de la HRMS pour les analyses qualitative et quantitative des protéines thérapeutiques de type mAbs et produits associés a été démontré dans cette thèse. / This PhD thesis focused on the development of generic mass spectrometry (MS)-based workflows for monoclonal antibody (mAb)-related therapeutic protein quantification in pre-clinical species. First, the development of bottom-up sample preparation protocols either based on direct serum digestion or immuno-capture allowed mAb-related therapeutic protein quantification over five orders of magnitude whereas the employment of peptides from the constant region of the mAb demonstrated the versatility of such generic liquid chromatography tandem MS (LC-MS/MS)-based approaches. Second, high-resolution MS (HRMS) instruments were evaluated as an alternative to triple quadrupole mass analyzers, traditionally utilized for bottom-up mAb quantification by LC-MS/MS. The major benefit of HRMS incorporation into the workflow was associated with the possibility to quantify simultaneously mAb-related therapeutic proteins directly at an intact level, providing an information level far beyond the one obtained with bottom-up LC-MS/MS methodologies. Hence, the pivotal role of HRMS for the qualitative and quantitative analyses of mAb-related therapeutic proteins was further outlined throughout this doctoral work.

L'industrie biopharmaceutique voit la plupart des thérapies basées sur les anticorps monoclonaux passer du statut de blockbuster à un marché de niche et personnalisé, dans un monde globalisé. Pour poursuivre le développement de nouveaux médicaments, les installations de production existantes et futures doivent accroître leur flexibilité et leur productivité. La chromatographie multi-colonne est l'un des outils potentiels pour y parvenir, comme elle l’a été au cours des dernières décennies pour la pétrochimie et l'industrie alimentaire. En parallèle, l'étape de capture protéine A reste incontournable pour toutes les lignes industrielles de purification grâce à sa spécificité et sa capacité à atteindre facilement un haut niveau de pureté en une seule étape. Ce travail de recherche est une évaluation des procédés de chromatographie multi-colonnes combinés à l'étape de capture protéine A pour augmenter la productivité et l'applicabilité des plateformes de purification actuelles aux activités de production clinique et commerciale. Dans chaque partie du travail, la technologie des colonnes de chromatographie pré-packées a été évalué en tant que facilitateur de procédé multi-colonnes, libérant les équipes opérationnelles des activités de package et des infrastructures associées. Un premier chapitre décrit la traditionnelle revue de la littérature et l'état actuel des connaissances dans le domaine concerné, ainsi qu'une description théorique de la chromatographie en général, et des processus multi-colonnes en particulier. Dans un deuxième chapitre, plusieurs résines protéine A récentes, disponibles sur le marché, ont été comparées dans le cadre de deux procédés multi-colonnes –la chromatographie séquentielle sur plusieurs colonnes (SMCC) et le procédé par Batch Parallèle– et comparées à un procédé traditionnel mono-colonne. Sur la base d'un logiciel de simulation et d'optimisation, les deux processus proposés ont été comparés en termes de gains et de performances. Des recommandations sur la résine et le type de procédé à choisir ont été proposées. Dans un troisième chapitre, l'impact des procédés multi-colonnes sur la qualité et la pureté résultante a été abordé par plusieurs séries d'expériences. L'impact de l'organisation séquentielle d'un processus SMCC a été évalué. L'impact du temps de séjour sur les étapes de lavage et d'élution a également été évalué, afin d'accélérer potentiellement l'étape de capture. Troisièmement, l'impact de la saturation de la résine sur la conception de l'étape de lavage a été évalué. Finalement, des études de cycling ont été réalisées pour détecter si les différents processus multi-colonnes avaient un impact différent sur la durée de vie et les performances de la résine. Dans un quatrième chapitre, un outil de calcul simplifié a été conçu pour proposer un dimensionnement simple des procédés multi-colonnes, tenant mieux compte des contraintes de production de Merck. Cet outil a été utilisé pour évaluer la performance des procédés Batch Parallèle pour deux études de cas. Enfin, dans un chapitre plus exploratoire, l'outil simplifié développé précédemment a été adapté pour évaluer la faisabilité et les contraintes principales des étapes de capture en continu, caractérisées soit par une étape de chargement continu, soit par une étape d'élution continue / The biopharma industry sees most of the therapeutics based on monoclonal antibodies shifting from the blockbuster status to a niche and personalized market, in a globalized world. To continue the development of new drugs, existing and future production facilities have to increase in flexibility and productivity. Multi-column chromatography is one of the potential tools to make that happen, as the technology did in the last decades for the petro and for the food industries. In parallel, the protein A capture step remains a must for all purification trains of the industrial manufacturing capacities due to its specificity and capability to easily reach a high level of purity in a single step. This research work is an evaluation of the multi-column chromatography processes combined with the protein A capture step to increase the productivity and the applicability of current purification platforms for clinical and commercial manufacturing activities. In every part of the work, prepacked chromatography columns have been evaluated as an enabler of multi-column processes, freeing the operational teams from the packing activities burden and associated infrastructures. A first chapter describes the traditional literature review and current state-of-the-art in the relevant field, together with a theoretical description of chromatography in general, and multi-column processes in particular. In a second chapter, several recent, commercially-available protein A resins have been compared when involved in 2 multi-column processes: the Sequential Multi-Column Chromatography (SMCC) process and the Parallel Batch process, and compared to a traditional mono-column process. Based on a simulation and optimization software, both processes proposed have been compared in terms of gains and performance. Recommendations on the resin and the type of process to be selected have been proposed. In a third chapter, the impact of multi-column processes on the resulting quality and purity has been addressed through several sets of experiments. The impact of the sequential organization of an SMCC process has been evaluated. The impact of the residence time on the washing and the elution steps has also been evaluated, in order to potentially speed-up the capture step. Third, the impact of the resin saturation on the design of the washing step has been assessed. Eventually, cycling studies have been performed to detect if the different multi-column processes were impacting differently the resin’s lifetime and performance. In a fourth chapter, a simplified calculation tool has been designed to propose simple sizing of multi-column processes, accounting more accurately for Merck’s production constraints. This tool has been used to evaluate the performance of Parallel Batch processes for 2 case-studies. Eventually, in a more exploratory chapter, the simplified tool previously developed has been adapted to evaluate the feasibility and the primary constraints of continuous capture steps, characterized by either a continuous loading step or a continuous elution step

La thérapie génique peut être définie comme le transfert du gène thérapeutique dans le tissue d’intérêt à l’aide d’un vecteur. A ce jour, les vecteurs dérivés du virus adéno-associés (AAV) représentent les vecteurs de choix pour le transfert de gène in vivo. Cependant, les réponses immunitaires dirigées contre la capside AAV représentent l’obstacle majeur à l’efficacité du transfert de gène médié par le vecteur AAV. Ce travail de thèse a eu pour objectifs de prévenir et d’inhiber la réponse humorale dirigée contre le vecteur AAV. En administrant des nanoparticules contenant de la rapamycine (ou SVP[Rapa]) avec le vecteur AAV, nous avons démontré une inhibition spécifique des réponses humorale et cellulaire dirigées contre la capside AAV. De plus, cette stratégie nous a permis de re-administrer efficacement le vecteur AAV dans des modèles murins et chez le singe. Nos données ont aussi démontré l’élimination des anticorps préexistants dirigés contre le vecteur AAV en administrant SVP[Rapa] avec le bortezomib. Au cours de travail de thèse, nous avons aussi développée et testée l’efficacité des vecteurs AAV associés aux vésicules extracellulaires (vecteurs exo-AAV) à améliorer l’efficacité des vecteurs AAV. En utilisant les vecteurs exo-AAV, nous avons démontré une expression stable et durable du transgène. De plus, les vecteurs exo-AAV ont montré une résistance aux anticorps neutralisants préexistants. Ainsi, au cours de ce projet de thèse des stratégies efficaces ont été développées afin de prévenir et de contrôler les réponses immunitaires dirigés contre le vecteur AAV, permettant ainsi une re-administration efficace du vecteur AAV. / Gene therapy aims to achieve sustained expression of the therapeutic transgene by the introduction of vector cargo into target tissue. To date, viral vectors based on adeno-associated virus (AAV) represent the leading gene delivery tools in vivo. However, immune responses against AAV vector represent the biggest challenge for the widespread use of AAV-based products. In this PhD project, we aimed at the inhibition and prevention of humoral immune responses to AAV capsid. Using nanoparticles containing rapamycin (SVP[Rapa]) given at the time of vector administration, we demonstrated complete abrogation of anti-capsid humoral and cellular immune responses in antigen-specific manner. Using this strategy, we further demonstrated successful vector re-administration in murine models and in non-human primates. Our data also demonstrated elimination of pre-existing antibodies to AAV vector using a combination of SVP[Rapa] and bortezomib. In this PhD thesis project, we also developed and tested the ability of AAV vectors associated with extracellular vesicles (exo-AAV vectors) to enhance AAV vector potency. Using exo-AAV vectors, we demonstrated higher and sustained transgene expression at low vector doses. Exo-AAV vectors also exhibited resistance to neutralization by pre-existing anti-capsid neutralizing antibodies. Thus in this PhD project, powerful strategies have been developed to prevent and control immune responses against AAV vectors, enabling successful AAV vector re-administration.