Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les infections chroniques de l’Immunodéficience Humaine et de l’Hépatite C (VIH et VHC) sont à l’origine de pandémies. Malgré des traitements avancés, leurs relations avec le système immunitaire ne sont pas résolues et restent nécessaires pour établir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs majeurs antiviraux et sont importants pour l’immunité innée et adaptative. Ils contrôlent leur cytotoxicité et leur fonction immunorégulatrice via de multiples récepteurs activateurs et inhibiteurs qui sont enclenchés par interaction avec leurs ligands respectifs. Parmi tous les récepteurs, je me suis particulièrement intéressé aux Natural Cytotoxicity Receptors NKp30 et NKp44. Il est intéressant de noter que le laboratoire a précédemment identifié un épitope conservé de la gp41 du VIH-1 qui induit l’expression du ligand de NKp44 sur des LT CD4+ les rendant susceptibles à la lyse par des cellules NK-NKp44+. Après plusieurs études, le laboratoire a mis en place une stratégie vaccinale basée sur un peptide de l’épitope conservé de la gp41 qui induit chez la souris des Anticorps Neutralisants (AcNs W614A-3S) contre l’infection VIH-1. Alors que le VIH-2 est considéré comme un modèle unique d’une infection VIH contrôlée, les données sur les cellules NK y sont très limitées. Nous avons observé une dérégulation du récepteur NKp30 et une augmentation de ses ligands qui conduisent à des déficiences de leurs fonctions et représentent un nouveau mécanisme de persistance virale. Ensuite, nous avons observé pendant l’infection chronique par le VHC une forte proportion de cellules NK intra-hépatiques exprimant NKp44 qui corrèle avec la fibrose et la charge virale. De plus, nous avons identifié un épitope conservé de la protéine Core du VHC qui induit le ligand de NKp44 sur des lignées hépatiques. Ces données suggèrent que la déplétion des hépatocytes passe par un mécanisme similaire à celui observé pendant l’infection VIH-1. Enfin, une étude sur des patients VIH-1 contrôleurs nous a permis d’identifier la présence d’AcNs W614A-3S qui sont associées au contrôle viral et au maintien de LT CD4+ fonctionnelles. Ces données ont confirmé le potentiel de ces AcNs et, dont leur production par vaccination, ont été confirmée chez le lapin et le singe. Ainsi, ces études apportent de nouvelles données dans les relations entre les cellules NK et le VIH ou le VHC ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ces études ont notamment confirmé le pouvoir des AcNs W614A-3S dans un vaccin contre le VIH-1. / Human Immunodeficiency and Hepatitis C (HIV and HCV) chronic infections are at the origin of pandemics. Despite advance drug treatments, their relationship with the immune system is not resolved and is still required to establish new therapeutic strategies. Natural Killer (NK) cells are major antiviral effectors of the immune system and are important for innate and adaptive immune processes. They mediate cytotoxicity and immunoregulation via various activator and inhibitor receptors that are triggered upon interaction with their cognate ligands. Among all receptors, I particularly took an interest in Natural Cytotoxicity Receptors NKp30 and NKp44. Interestingly, the lab previously identified a conserved HIV-1 gp41 épitope that induce expression of NKp44 ligand on CD4+ T cells making them susceptible to lyses by NK-NKp44+ cells. After various studies, the lab established a vaccine strategy based on a peptide from the conserved gp41 épitope that induced in mice Neutralizing Antibodies (Nab W614A-3S) against HIV-1 infection. Whereas HIV-2 infection could be considered as a HIV control infection unique model, data on NK cells are very limited. We found a down-modulation of NKp30 receptor and an increased of its ligands that lead to functional impairments of NK cells and could represent a new viral persistence mechanism. Then, during the HCV chronic infection we found a high proportion of intrahepatic NK cells expressing NKp44 that correlates with fibrosis and viral load. Furthermore we identified a conserved épitope of HCV core protein that induced NKp44 ligand on hepatic cell lines. These data suggest that destruction of hepatocyte might occur by a similar mechanism observed during HIV-1 infection. Finally, a study on HIV-1 controllers patients allow us to identify the presence of Nab W614A-3S that correlates with viral control and the preservation of functional CD4+ T cells. These data confirm the potency of this Nab and their induction by vaccination has been also confirmed in rabbit and macaques. Thus, these studies highlight new data regarding relationship between NK cells and HIV or HCV that could represent new therapeutic approaches. These studies especially confirm the potency of Nab W614A-3S to implement a vaccine against HIV-1.

Les maladies infectieuses constituent le principal groupe de maladies humaines communément considérées comme étant d’origine environnementale. Cependant, une question fondamentale dans ce domaine est la variabilité interindividuelle : pourquoi, au sein d’une même population exposée aux mêmes pathogènes, seule une minorité des individus infectés par un pathogène donné va développer une maladie dont l’expression clinique peut varier de l’état asymptomatique à la mort pour les formes les plus sévères. Le microbe est donc nécessaire mais non suffisant pour expliquer ces divergences. Selon la théorie génétique des maladies infectieuses, une proportion d’enfants ayant une ou plusieurs infections sévères mais étant par ailleurs sains, présenterait une immunodéficience primaire Mendélienne à l’origine d’une réponse immunitaire altérée spécifique du pathogène responsable. En considérant la susceptibilité accrue à des infections sévères par des bactéries pyogènes, cette hypothèse a conduit à la découverte, dans les années 2000, de plusieurs immunodéficiences primaires dans la voie de signalisation NF-kB, avec des mutations dans les gènes NEMO/IKBKG, IKBA, IRAK4 et MyD88 chez des enfants présentant des infections sévères par bactéries pyogènes, notamment Streptococcus pneumoniae et Staphylococcus aureus, et conduisant à une altération des voies Toll-interleukine-1 récepteur (TIR)-NF-kB. Mon travail de thèse a principalement porté sur l’étude d’une patiente aujourd’hui âgée de 5 ans. Elle est issue d’une famille consanguine et a souffert d’une pneumonie sévère à l’âge de 3 mois à la suite d’une infection par une souche PVL+ de S. aureus. .J’ai identifié chez elle un défaut autosomique récessif complet en TIRAP. Cependant, sept autres membres de la famille âgés entre 16 et 50 ans sont homozygotes pour la même mutation et n’ont jamais souffert d’infection sévère. TIRAP est un adaptateur des récepteurs TLR2 et TLR4 et la mutation rare R121W affecte un acide aminé très conservé dans son domaine TIR. L’allèle mutant de TIRAP induit une expression normale de l’ARN messager ainsi que de la protéine mais demeure non fonctionnel. Les réponses après stimulation par différents agonistes du TLR2 tels que le PAM2CSK4, le PAM3CSK4, et le FSL-1 ainsi que par le LPS, agoniste du TLR4 sont altérées dans les fibroblastes, les granulocytes et les monocytes des individus homozygotes pour la mutation R121W. Cependant, la réponse des cellules sanguines totales à l’acide lipoteichoïque (LTA) purifié de S. aureus, un autre agoniste du TLR2 est altérée uniquement chez la patiente. J’ai pu montrer que ce défaut est dû à une absence d’anticorps dirigés contre le LTA dans le plasma de la patiente. L’effet combiné de la mutation du gène TIRAP et de l’absence d’anticorps anti-LTA pourrait expliquer la survenue de l’infection sévère par S. aureus chez le cas index. L’ensemble de ce travail décrit pour la première fois un défaut héréditaire en TIRAP chez l’homme et fournit ainsi une meilleure compréhension du rôle de cette protéine dans les réponses en aval des TLRs. Il suggère également que, chez l’homme, la voie dépendante de TIRAP en aval du TLR2 est importante pour le contrôle des infections par S. aureus, au moins chez les enfants présentant un défaut de production d’anticorps anti-LTA ; cependant, TIRAP serait un gène en partie redondant dans l’immunité antibactérienne. / We describe a kindred comprising eight individuals with autosomal recessive complete deficiency of TIRAP (also called MAL), an adaptor downstream of TLR2 and TLR4. The 4-year-old proband suffered at three month of age from a life-threatening pneumonia caused by Staphylococcus aureus. Seven adult relatives, aged between 16 and 50 years, homozygous for the same TIRAP mutation never suffered from any serious infections. The rare missense R121W mutation affects a highly conserved amino acid in the TIR domain of TIRAP. The mutant TIRAP allele is expressed but displays loss of function. Responses to a variety of TLR2 agonists, including PAM2CSK4, PAM3CSK4, and FSL-1, and to the TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS), were impaired in fibroblasts, granulocytes, and monocytes of all TIRAP R121W homozygous individuals tested. Interestingly, the whole blood response to staphylococcal lipoteichoic acid (LTA), another TLR2 agonist, was impaired only in the index case. This defective response was due to a lack of anti-LTA antibodies in the patient’s plasma. The combined effect of the TIRAP R121W mutation and the absence of anti-LTA antibody provide an explanation for severe staphylococcal disease in the index case. These results provide the first description of human inherited TIRAP deficiency and help to delineate the role of human TIRAP in TLR responses. They suggest that human TIRAP-dependent TLR2 immunity is important for the control of S. aureus infection, at least in children lacking anti-LTA antibodies, but that TIRAP is otherwise redundant in host defense.

La transformation des cellules normales de l’organisme en un phénotype malin est souvent accompagnée de changements dans leur antigénicité. L’antigène Tn (GalNac-O-Ser/Thréo) est un antigène (Ag) glycopeptidique spécifique des tumeurs et exprimé à la membrane plasmique des cellules cancéreuses dans la majorité des carcinomes humains ainsi que dans certaines tumeurs hématologiques, tandis qu’il n’est pas détecté dans les cellules normales. Il représente donc une cible potentielle très intéressante pour l’immunothérapie passive par anticorps, car il n’est pas détectable dans les cellules normales, mais est démasqué dans environ 90% des cancers épithéliaux du fait d’une dérégulation des processus de glycosylation. Les anticorps monoclonaux (AcM) spécifiques d’antigènes exprimés à la membrane des cellules tumorales ont une efficacité prouvée dans le traitement de certains cancers. Ces AcM thérapeutiques sont particulièrement intéressants pour le traitement des cancers du fait de leur forte spécificité pour les cellules tumorales et de leur faible toxicité pour les cellules normales, contrairement aux chimiothérapies conventionnelles, mais leur mécanisme d’action est encore mal connu. L’AcM Chi-Tn est un anticorps chimérique homme/souris capable de se fixer de façon spécifique à l’antigène tumoral Tn, alors qu’il ne se fixe pas sur les cellules normales. Cet AcM pourrait donc être envisagé comme agent thérapeutique dans le traitement des cancers épithéliaux par immunothérapie passive.Nous nous sommes intéressés à l’AcM Chi-Tn non couplé en vue d’analyser son mécanisme d’action et d’évaluer son efficacité thérapeutique in vivo. Nous avons montré que l’AcM Chi-Tn seul ne possède pas d’effet toxique direct sur les lignées de cellules tumorales Tn-positives in vitro. Cependant, en présence de macrophages, cet AcM est capable d’induire la lyse de ces cellules par un mécanisme d’ADCC. In vivo, l’AcM Chi-Tn, associé à la cyclophosphamide, induit le rejet d'une tumeur du sein dans plus de 80% des souris. Cette inhibition de la croissance tumorale est abolie chez les souris déficientes pour la chaine associée aux récepteurs RFc activateurs, suggérant in vivo un mécanisme d’ADCC. Par l’étude microscopique du microenvironnement tumoral, nous avons observé que les cellules tumorales forment in vivo des synapses avec des macrophages, des neutrophiles, mais aussi des lymphocytes B. Des expériences de survie in vivo chez des souris déficientes pour différentes populations cellulaires montrent que les lymphocytes T semblent nécessaires à la protection des souris par Chi-Tn contre la tumeur. Ainsi, ces résultats confirment le rôle des effecteurs exprimant des RFc activateurs, mais aussi le rôle indispensable de la réponse immune adaptative pour assurer l'effet thérapeutique des AcM.Nous nous sommes également intéressés à l’utilisation potentielle de l’AcM Chi-Tn comme vecteur d’agents cytotoxiques. In vivo, dans un modèle de tumeurs solides chez la souris, des expériences de biodistribution montrent que l’AcM Chi-Tn est capable de cibler spécifiquement les zones tumorales, ce qui en fait un anticorps potentiellement utilisable comme vecteur de molécules toxiques. L’internalisation du complexe anticorps/antigène cible est un pré-requis nécessaire à l’utilisation de l’anticorps conjugué. Nous avons montré in vitro que l’AcM Chi-Tn est internalisé dans les endosomes précoces et de recyclage pendant un temps relativement long, faisant de cet AcM un bon candidat pour être couplé à des agents cytotoxiques. Durant ma thèse, nous avons couplé l’AcM Chi-Tn à la toxine saporine ou à la molécule cytotoxique auristatine F, et nous avons montré in vitro que ces conjugués sont cytotoxiques sur des lignées cellulaires Tn-positives. / Pas de résumé en anglais

Les anticorps à visée thérapeutique sont en pleine expansion. Le développement de ces protéines issues de la bioingénierie est toutefois entravé par leur tendance naturelle à l'agrégation, particulièrement critique au cours des étapes de repliement. L'association réversible (non covalente) de protéines avec des polymères hydrosolubles pourrait permettre de résoudre ce problème. Nous avons ici étudié les interactions entre des protéines modèles et des dérivés hydrophobes du poly(acrylate de sodium) (PAA) grâce à diverses techniques expérimentales, incluant la spectroscopie de corrélation de fluorescence, le dichroïsme circulaire sous radiation synchrotron, la diffusion de lumière, l'électrophorèse capillaire et la calorimétrie différentielle à balayage. Comme preuve de concept, nous avons démontré que les dérivés du PAA augmentent le rendement de renaturation d'une enzyme modèle, l'anhydrase carbonique bovine, grâce à la protection de conformères partiellement repliés. La stabilisation colloïdale au cours du repliement a été étendue à des fragments d'anticorps de type scFv, d'importants modèles de biothérapeutiques sensibles à l'agrégation. L'efficacité des polymères a aussi été validée pour des immunoglobulines G soumises à un stress thermique. La prédominance de l'association hydrophobe est remise en cause dans cette étude. L'ancrage électrostatique des chaines de PAA s'avère suffisant pour minimiser l'agrégation des protéines, grâce à des associations dynamiques avec les intermédiaires partiellement repliés. Un avantage majeur de ces polymères est la faible quantité nécessaire comparé aux osmolytes conventionnels et l'absence de modification chimique des protéines. / Antibodies constitute the fastest growing class of human biopharmaceuticals. The development of these engineered proteins is yet hampered by their natural propensity towards irreversible aggregation particularly critical during refolding steps. Reversible (non-covalent) association of proteins with water-soluble polymers could circumvent this issue. In the present study, we investigated the interactions between model proteins and hydrophobically-modified poly(sodium acrylate) (PAA) chains with experimental techniques including fluorescence correlation spectroscopy, synchrotron-radiation circular dichroism, light scattering, capillary zone electrophoresis and differential scanning calorimetry. As a proof of concept, we demonstrated that PAA derivatives enhanced the renaturation yield of a single-domain model enzyme, bovine carbonic anhydrase, because of protection of partly-folded conformers against aggregation. Colloidal stabilisation during refolding was extended to two-domain artificial antibody fragments, single chains Fv fragments, as important models of aggregation-prone biotherapeutics. On similar basis, efficient protection was also validated with full-length immunoglobulins G under heat-stress. Prevalence of hydrophobic association between polymers and proteins is questioned in this work. Rather, electrostatic binding with PAA chains turns out to be sufficient to minimize in vitro protein aggregation, most-likely because of dynamic association with partly-folded conformers. A major advantage of these polymers is their use at extremely low amount compared to conventional osmolytes and absence of chemical modification of proteins.

L’analyse de traces dans des matrices complexes (environnementales, alimentaires ou biologiques) requiert très souvent une étape de purification et de préconcentration avant une analyse via des méthodes chromatographiques. Dans cette optique, des supports d’extraction basés sur des mécanismes de reconnaissance moléculaire ont été développés et appliqués à l’extraction de composés cibles rendant ainsi l’analyse plus sensible et plus fiable. Ces supports sélectifs peuvent entre autres résulter de l’immobilisation de biomolécules tels que les anticorps ou les aptamères (i.e. des oligonucléotides présentant une séquence capable de se lier spécifiquement à une molécule). Cette étape de traitement de l’échantillon est particulièrement nécessaire lorsqu’il s’agit de développer des systèmes séparatifs miniaturisés, tels que les microsystèmes séparatifs sur puce, du fait de la diminution de la résolution qui résulte de l’utilisation d’un canal de séparation de faible longueur. Dans ce contexte, ce projet de recherche a consisté à développer des systèmes bioanalytiques miniaturisés pour l’analyse de petites molécules ou protéines dans des échantillons complexes. Pour développer ces systèmes, la synthèse d’un monolithe hybride organique-inorganique in situ dans des capillaires de 100 µm d.i. a, dans un premier temps, été optimisée via une approche sol-gel puis caractérisée en termes de répétabilité. Dans une deuxième partie, deux toxines modèles de faible poids moléculaire ont été choisies : la microcystine-LR (MC-LR) et l’ochratoxine A (OTA). Des anticorps monoclonaux et des aptamères, spécifiques de l’une et l’autre des toxines ont ensuite été greffés sur des monolithes en capillaire. Les immuno- et oligoadsorbants miniaturisés obtenus (respectivement mIS et mOS) ont été couplés en ligne avec la nanoLC. La rétention spécifique des toxines cibles sur les mIS et mOS a été démontrée dans l’eau pure. La répétabilité de la synthèse et du greffage a été évaluée et la capacité de chacun des supports miniaturisés a été déterminée. Enfin, mIS et mOS ont été appliqués avec succès à l’extraction sélective de la MC-LR et de l’OTA à partir d’extraits de cultures de cyanobactéries, d’eaux environnementales ainsi que d’échantillons de bière dopés. Dans un troisième temps, de façon à transposer les outils sélectifs développés à l’analyse de protéines, des microréacteurs enzymatiques (IMER) ont été préparés par greffage de deux enzymes protéolytiques (pepsine et trypsine) sur des monolithes. Ces outils ont ensuite été couplés avec la nanoLC-MS² pour l’analyse d’une protéine modèle, le cytochrome C. Les rendements de digestion sur IMER se sont avérés présenter une bonne répétabilité. Toutefois, l’efficacité de la digestion sur les IMER à base de pepsine reste à ce jour insuffisante et nécessite de réadapter la procédure de greffage et/ou de digestion. / The analysis of ultra-traces from complex matrices (environmental, foodstuff or biological) often requires a step of purification and preconcentration before their analysis by chromatographic separation methods. Therefore, extraction sorbents based on a molecular recognition mechanism can be developed and used for the selective extraction of target molecules thus rendering their quantitative analysis in complex samples more reliable and sensitive. These extraction sorbents may result, among others, from the immobilization of biomolecules such as antibodies and aptamers (i.e. oligonucleotides whose sequence is specific for a target molecule). This selective sample pretreatment step is particularly necessary when developing miniaturized devices such as separative microsystems on chip because of the decrease of the resolution that results from the use of a shorter length separation channel. In this context, the aim of our study was to develop miniaturized bioanalytical devices for the analysis of small molecules or proteins in complex samples. For the development of these devices, in-situ synthesis of a porous hybrid organic-inorganic monolith in capillaries (100 µm i.d.) by sol-gel approach was firstly optimized and characterized in terms of repeatability. Secondly, two model toxins of low molecular weight were chosen: microcystin-LR (MC-LR) and ochratoxin A (OTA). Monoclonal antibodies and aptamers specific to one and the other target molecules were then grafted on the monolithic capillaries. The resulting miniaturized immunosorbent (mIS) and oligosorbent (mOS) were then coupled on-line to nanoLC. Specific retention of MC-LR and OTA on the mIS and the mOS, respectively, was demonstrated in pure water. Synthesis repeatability and capacity of the miniaturized sorbents were evaluated. Finally, these miniaturized tools were applied to the selective extraction of MC-LR or OTA from complex samples, i.e. blue-green algae extracts, environmental waters or beer. In a third part, immobilized enzyme reactors (IMERs) were prepared by grafting two proteolytic enzymes (pepsin and trypsin) on monoliths in order to transpose the developed selective tools to the analysis of proteins. These IMERs were then coupled on-line to nanoLC-MS² for the analysis of a model protein, cytochrome C. Digestion yields on IMERs presented a good repeatability. However, digestion efficiency on the pepsin-based IMERs remains so far insufficient and grafting or digestion procedure needs to be readjusted.

Les neurotoxines botuliques (BoNTs), agents responsables du botulisme, sont les substances les plus toxiques actuellement connues. L'utilisation d'anticorps neutralisants pour l'immunothérapie passive est la seule solution retenue et accréditée par la FDA à l'heure actuelle. L'immunisation génétique par électroporation intramusculaire d'ADN s'est révélée être une alternative crédible à l'immunisation protéique pour produire des anticorps dirigés contre les sérotypes A et E des BoNTs avec un pouvoir neutralisant suffisamment élevé pour satisfaire aux exigences de la Pharmacopée Européenne. Cependant, les résultats se sont avérés décevants dans le cas du sérotype B, troisième type antigénique associé au botulisme humain. Comprendre la raison de la faible immunogénicité de BoNT/B en vaccination ADN et l'optimiser pour produire des anticorps neutralisants dirigés contre cette dernière ont constitué les deux objectifs de mon travail. En combinant différentes approches, nous avons montré que, contrairement à BoNT/A, la sécrétion de l'antigène BoNT/B est inhibée. Nous avons identifié le réticulum endoplasmique (RE) comme étant l'organite de rétention. Nous avons étudié un lien empirique entre la séquence protéique antigénique de BoNT/B et son accumulation intracellulaire et avons conclu que le mauvais repliement de la protéine antigénique était responsable de sa rétention dans le RE. Parmi les stratégies testées afin d'augmenter l'immunogénicité de BoNT/B en vaccination ADN, l'ajout de sites de N-glycosylation a permis de multiplier par 10 le pouvoir neutralisant des anticorps et l'utilisation des dérivés d'acides biliaires comme adjuvants de formulation est prometteuse. / Botulinum neurotoxins (BoNT) have been characterized to be the most potent toxic substances identified so far. Passive immunization with antiBoNT antisera is the only treatment for botulism to have gained FDA approval. We have previously shown that genetic immunization by the non-viral intramuscular DNA electroporation technique is an effective alternative to recombinant proteins immunization to raise high titer neutralizing antibodies against BoNT serotype A and E. The neutralizing titers obtained were high enough to fit the European Pharmacopeia while it did not for type B, commonly linked to human disease as well. Finding out why BoNT/B immunogenicity is low after DNA vaccination and how we could improve it for generation of high-titer neutralizing antiBoNT/B antiserum were the two main goals of my work. Combining different approaches, we have first shown that BoNT/B antigen secretion was inhibited, while it did not for BoNT/A. We identified the endoplasmic reticulum to be the organelle of retention. Then, we studied an empirical link between BoNT/B antigenic protein sequence and intracellular accumulation. We concluded that protein misfolding could be the reason for BoNT/B retention in the endoplasmic reticulum. Among different strategies tested to improve BoNT/B immunogenicity in DNA vaccination, addition of N-glycosylation sites yielded 10 fold higher neutralizing antibodies titers. Finally, bile salts could be promising adjuvants for plasmid DNA vaccines.

La Polyarthrite Rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique qui détruit les articulations. Les auto-anticorps (AAc) les plus spécifiques sont dirigés contre des protéines citrullinées (ACPA). Environ 30% des patients ont des AAc dirigés contre la protéine B-Raf. Les ACPA sont des IgG produits sans réponse lymphocytaire T (LT) détectable contre les protéines citrullinées. Les enzymes PAD, responsables de la citrullination, sont la cible d’AAc dans la PR. Les LT pourrait être dirigés contre les PAD. Les LB produiraient des IgG contre les PAD et les protéines citrullinées, du fait qu’elles soient fixées aux PAD durant leur citrullination. Pour tester ce modèle, nous avons injecté des PAD à des souris et suivi les LT et les Ac anti-PAD ainsi que les ACPA. Nous avons montré que l’immunisation par PAD induit des LT anti-PAD, des Ac anti-PAD ainsi que des Ac anti-peptides de fibrinogène citrulliné.B-Raf est une ser/thr kinase de la voie des MAPK impliquée dans l’inflammation et l’activation des LT. Les LT de patients PR ont une sur-activation de la voie des MAPK, induisant une rupture de tolérance envers les auto-antigènes. Notre hypothèse est que des mutations du gène BRAF pourraient être à l’origine des AAc anti-B-Raf. Nous avons identifié la présence d’une mutation du gène BRAF entrainant la substitution de la valine en alanine en position 600 (V600A) qui est trouvée en plus grande quantité dans les cellules du sang périphérique et les LT des patients PR. V600A n’est pas corrélée à la présence d’AAc anti-B-Raf, mais augmente l’activité kinase de B-Raf qui pourrait activer la voie des MAPK dans les LT et une rupture de tolérance envers les auto-antigènes. / Rheumatoid Arthritis (RA) is a chronic inflammatory autoimmune joint disease. RA most specific autoantibodies (AAb) recognize citrulline proteins (ACPA). 30% of patients with RA have anti-B-Raf AAb. ACPA are IgG that arise in the absence of associated T cell responses. PAD enzymes, responsible for the citrullination, are also targets of AAb in RA. We thus propose a mechanism to explain the emergence of ACPA. We hypothesize that anti-citrullinated protein immunization arises because, at first, PAD is recognized by T cells, which, in turn help the production of AAb to neighbor proteins citrullinated by PAD. To test this model, we primed mice with PAD proteins and looked for immune response to PAD and citrullinated proteins. We found that PAD immunization leads to T cell response, Ab anti-PAD as well as anti-citrullinated fibrinogen peptides Ab production. Anti-PAD immunization could induce anti-citrullinated protein immunization.B-Raf, a ser-thr kinase of the MAPK signalling pathway, is involved in inflammation and in T cell activation. An overexpression of B-Raf is observed in T cells from RA patients increasing T cell activation to autoantigens. Our hypothesis is that BRAF gene mutations could trigger a rupture of tolerance and AAb production in RA. We have identified a BRAF mutation, a valine residue at position 600 is substituted by an alanine (V600A). V600A is found more often and at greater quantities in patients with RA, noteworthy in their T cells. This mutation does not correlate with Anti-B-Raf AAb presence but this is a strong enhancer of B-Raf kinase activity. This could lead to abnormal T cells activation and explain tolerance rupture in RA.

Malgré 30 ans de recherche aucun vaccin VIH n'a permis d'apporter une protection efficace et de manière stable. Au regard des échecs obtenus jusqu'à présent, de nouvelles formes vaccinales ont été développées. Parmi ces dernières les VLP présentent l'avantage notables d'être très immunogènes du fait de leur forme particulaire mimant les virus natifs, et sécuritaire puisque ne véhiculant pas de génome viral. Ce travail de thèse a pour objectif d’établir et d’évaluer une stratégie vaccinale utilisant ces VLP administrées par voies muqueuses dans le but d’initier une réponse humorale et cellulaire au niveau systémique et muqueux. Dans cette étude, nous avons montré que la voie muqueuse est indispensable pour l’induction d’une réponse locale forte. De plus, nos résultats révèlent que la forme particulaire de l’antigène est décisive dans la génération d’une immunité de qualité, générant une réponse TFH forte, une réponse cellulaire locale polyfonctionnelle ainsi qu’une réponse humorale forte et stable dans le temps, caractérisée par des anticorps de qualité.Cherchant à mieux caractériser la stratégie vaccinale établie, nous avons analysé les mécanismes de prise en charge des VLP et d’initiation de la réponse immunitaire après administration IN. Nous avons observé que de nombreuses cellules de l’immunité innée pulmonaire, notamment les macrophages alvéolaires et les neutrophiles, captaient massivement les VLP limitant alors la réponse TFH et potentiellement la réponse humorale qui en découle. Au final, ce travail de thèse aura permis de mettre en avant la voie d’immunisation muqueuse ainsi que la forme particulaire de l’antigène dans la mise en place d’un vaccin VIH. / Currently no HIV vaccine elicit full and stable protection against viral acquisition. In view of the failures until now, new vaccines strategies were developed. Among these, VLP have the advantage to be highly immunogenic because of their particulate structure mimicking native pathogens and safe because of the lack of viral genome.This thesis work aims to develop and evaluate a VLP-based vaccine strategy by mucosal administration in order to initiate systemic and local humoral and cellular responses. In this study, we showed that the mucosal administration is mandatory to generate a strong local immunity. Moreover, our results show that particular form of the antigen is crucial in the generation of the quality of the immune response, generating strong TFH response, polyfunctional T-cell responses in the mucosa and a strong and stable humoral response characterized by high-quality antibodies.We also investigated mechanisms involved in the generation of immune responses following IN VLP injections. We determined which cells take in charge VLP and their role in the followed immune responses. Our preliminary results show many innate immune cells in the lungs, such as alveolar macrophages and neutrophils, have an important role in the particles uptake, limiting TFH response and potentially the followed humoral response.Finally, this thesis work will show the determining role of the mucosal route of immunization and the particulate form antigen for the development of an HIV vaccine.

Le cancer du pancréas est un cancer très agressif et de pronostic très sombre. Il est diagnostiqué tardivement et se montre résistant aux traitements. Dans ce contexte, il est nécessaire de mettre en évidence de nouveaux marqueurs spécifiques de cette pathologie dévastatrice. Le but de notre étude était de rechercher un marqueur « génétique » de ce cancer au sein du gène de la lipase sels biliaires-dépendante (BSDL) localisé en position 9q34.3 et plus particulièrement au niveau de l'exon 11 de ce gène codant pour le domaine C-terminal de la protéine et constitué de séquences répétées (séquences VNTR). L’analyse des électrophérogrammes obtenues après séquençage de Sanger à partir des amplicons de PCR réalisées sur l’ADNg extraits de tissus de patients atteints de cancer du pancréas, a permis d’identifier deux altérations génétiques : (i) la présence d’un SNP (Single Nucleotide Polymorphism) synonyme référencé rs488087, impliquant la transition c.1719C>T ; qui semble être associée au développement d’un cancer du pancréas sporadique et pourrait être un potentiel facteur prédictif de ce cancer permettant de cibler des populations à risque, (ii) la présence d’une insertion d’un nucléotide C induisant l'apparition d'une protéine BSDL tronquée présentant une séquence C-terminale modifiée contre laquelle ont été développé des anticorps polyclonaux. Cette nouvelle séquence pourrait constituer un potentiel marqueur diagnostique et/ou thérapeutique du cancer du pancréas. Ces deux altérations génétiques constituent ainsi de potentiels marqueurs du cancer du pancréas. / Pancreatic cancer is a devastating disease progressing asymptomatically until death within months after diagnosis. In this context, it is necessary to identify new specific markers to develop diagnostic tools and to target an at risk population. The aim of our study was to find a "genetic" marker in the bile salt-dependant lipase gene (BSDL). The human BSDL gene is located on the long arm of chromosome 9 in 9q34.3 with a variable number of tandem repeats (VNTR) in the coding region of exon 11. The electropherograms obtained after Sanger sequencing analysis of gDNA amplified from pancreatic cancer tissue samples allowed us to highlight: (i) the presence of a SNP (Single Nucleotide Polymorphism) involved in c.1719C>T transition which is referenced rs488087. rs488087 seems to be associated with the sporadic pancreatic cancer development and may be a predictive factor of pancreatic cancer for targeting an at risk population, (ii) the presence of a C nucleotide insertion leading to a premature stop codon with truncated protein and to the modification of the C-terminal sequence end. This new C-terminal sequence, alteration could be used as a potential diagnostic and/or therapeutic marker. Finally, these two genetic alterations identified in BSDL gene could constitute potential markers of pancreatic cancer.