Las terapias utilizadas actualmente para el tratamiento de infecciones fúngicas invasoras causadas por levaduras oportunistas están lejos de ser las óptimas. Estas infecciones afectan principalmente a pacientes inmunocomprometidos, dando lugar a tasas de mortalidad muy elevadas. Aunque varias especies de Candida son las responsables del mayor porcentaje de infecciones fúngicas invasoras causadas por levaduras oportunistas, otros géneros, como Cryptococcus, Trichosporon, Blastoschizomyces, Rhodotorula y Sporobolomyces ocasionan también infecciones de incidencia creciente y de difícil tratamiento, existiendo pocos estudios, tanto in vitro como in vivo, acerca de la eficacia de nuevos antifúngicos. El objetivo de la presente tesis es contribuir al desarrollo experimental de nuevos tratamientos o a la mejora de los tratamientos ya existentes. Para ello, se han realizado estudios in vitro para evaluar la eficacia in vitro de los antifúngicos, para posteriormente, comprobar la eficacia de los fármacos en modelos animales adecuados para cada estudio. Las diferentes cepas de Trichosporon asahii estudiadas han mostrado ser resistentes in vitro a los antifúngicos usualmente utilizados en los tratamientos de las infecciones diseminadas por levaduras (la anfotericina B y el fluconazol), siendo por el contrario sensibles a los nuevos triazoles, voriconazol, ravuconazol y albaconazol.. Además el voriconazol ha resultado eficaz en el tratamiento de la tricosporonosis diseminada experimental en el cobaya inmunodeprimido, sugiriendo su potencial utilidad en la terapia de las infecciones humanas producidas por T. asahii. También se ha estudiado la actividad de varias combinaciones de antifúngicos, obteniéndose con la combinación de micafungina y anfotericina B un 100% de interacciones sinérgicas in vitro frente a T. asahii. Esta asociación de antifúngicos ha mostrado una excelente eficacia en el tratamiento experimental de la infección diseminada producida por T. asahii en el ratón. Se ha desarrollado por primera vez un modelo animal de infección diseminada por Blastoschizomyces capitatus en el que se ha estudiado la eficacia del tratamiento con diferentes antifúngicos, clásicos y de reciente introducción. El fluconazol a dosis elevadas ha demostrado ser el tratamiento más efectivo de los ensayados frente a la infección experimental causada por B. capitatus. La combinación de la micafungina con la anfotericina B ha mostrado el mayor porcentaje de interacciones sinérgicas in vitro frente a 40 cepas estudiadas pertenecientes a las cuatro especies de Cryptococcus de mayor relevancia clínica. Se ha estudiado por primera vez el tratamiento con voriconazol en un modelo experimental de criptococosis cerebral en el ratón, demostrándose una eficacia excelente, lo que sugiere la potencial utilidad de este antifúngico en el tratamiento de la infección humana. Se ha evaluado la actividad in vitro de la micafungina combinada con la anfotericina B frente a 115 cepas pertenecientes a las siete especies de Candida de mayor importancia clínica. La disparidad de resultados obtenida en función del criterio de lectura de la CMI, evidencia la necesidad de definir los puntos de corte adecuados para la lectura de las pruebas de sensibilidad in vitro frente a combinaciones de antifúngicos cuando se utiliza la técnica del damero. Se ha estudiado la actividad in vitro de 8 antifúngicos y de las combinaciones de la micafungina con 5 de ellos frente a diferentes cepas de Rhodotorula glutinis y Sporobolomyces salmonicolor. Únicamente la anfotericina B, el ravuconazol y el albaconazol mostraron actividad in vitro frente a R. glutinis. Los triazoles itraconazol, voriconazol, ravuconazol y albaconazol y la terbinafina presentaron buena actividad in vitro frente a S. salmonicolor. Todas las combinaciones de antifúngicos estudiadas con excepción de la combinación de la micafungina con el fluconazol mostraron un alto porcentaje de interacciones sinérgicas frente a R. glutinis. La combinación de la micafungina con el itraconazol dio lugar al mayor porcentaje de interacciones sinérgicas frente a S. salmonicolor. / The conventional antifungal therapies commonly used for the treatment of systemic fungal infections due to opportunistic pathogenic yeasts are far to be the optimal. These infections affect mainly immunocompromised patients, causing high mortality rates. Although Candida spp. are the most common cause of fungal infections, other genera such as Cryptococcus, Trichosporon, Blastoschizomyces, Rhodotorula and Sporobolomyces, have also frequently reported. In general, these latter genera are less susceptible to conventional antifungal treatments and the number of in vitro and in vivo studies about the efficacy of new antifungal treatment against them is very scarce. The main objective of this thesis is to evaluate both in vitro and in animal models the efficacy of new therapeutical strategies. We have evaluated the in vitro activity of micafungin combined with amphotericin B against 115 strains belonging to the seven species of Candida most commonly found in clinical samples (20 of C. albicans, 20 of C. dubliniensis, 15 of C. glabrata, 20 of C. krusei, 10 of C. lusitaniae, 15 of C. parapsilosis and 15 of C. tropicalis).. When we used the MIC-2 endpoint criterion such combination showed synergism against all the species tested. We have evaluated the in vitro activity of micafungin combined with each of the following drugs: amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole and ravuconazole, against 37 strains belonging to the four most clinically relevant species of Cryptococcus i.e. C. neoformans, C. gattii, C. albidus and C. laurentii. The combination micafungin with amphotericin B showed the best synergism, with 70% of synergistic interactions. Voriconazole showed an excellent activity in a murine model of central nervous system infection by Cryptococcus neoformans. We studied the efficacy of voriconazole administered at 10, 40 and 60 mg/kg/day, and amphotericin B administered at 1.5 mg/kg/day. All treatments significantly prolonged survival of mice infected with the three strains of C. neoformans tested with respect to the control group. In addition, all the treatments reduced significantly the fungal loads versus controls. However, the best results were obtained with voriconazole administered at 60 mg/kg/day. Trichosporon asahii is an opportunistic fungus usually resistant in vitro to the conventional antifungals used in systemic infections caused by yeasts. On the other hand, the new triazoles, voriconazole, albaconazole and ravuconazole, have shown an excellent activity. We have evaluated the efficacy of voriconazole in a guinea pig model of trichosporonosis by T. asahii. Voriconazole was effective in resolving such infection. asahii and may represent an important advance in the therapy of this disease. We studied also the efficacy of combined therapy against T. asahii infections. In an in vitro study we tested micafungin combined with five antifungal drugs against ten strains of T. asahii. The combination micafungin with amphotericin B showed 100% of synergistic interactions. With the other combinations tested (micafungin combined with fluconazole, itraconazole, voriconazole or ravuconazole) we obtained between 40 and 20% of synergistic interactions. We selected the combinations that showed the best results i.e, micafungin plus amphotericin B or fluconazole, in the same murine model. Both combinations were effective in prolonging the mean survival time and also significantly reducing the fungal load respect the control group, but only the combination of micafungin with amphotericin B was able to improve the results obtained with monotherapies. We established a reproducible murine model of disseminated blastoschizomycosis to evaluate the effectiveness of the most commonly used antifungal therapies against this infection. We evaluate the efficacy of amphotericin B at 1 and 3 mg/kg/day, fluconazole at 40 and 80 mg/kg/day, flucytosine at 60 mg/kg/day and voriconazole at 40 mg/kg/day, all them against two strains of B. capitatus. This study demonstrated the potential use of this murine model for evaluating therapies against systemic blastoschizomycosis and the highest efficacy of FLC administered at 80 mg/kg/day. Combined therapy has not yet been investigated in blastoschizomycosis and this could be a good alternative for those infections caused by azole-resistant isolates which are increasing among clinical yeasts in general. Since several cases of FLC failure in B, capitatus infections have been documented we decided to evaluate the efficacy of amphotericin B combined with voriconazole, flucytosine or micafungin, using the murine model developed in our previous study. In general, the combinations tested showed better results than the control group and their monotherapies, but they could not improve the efficacy of FLC at high doses. We have also studied the in vitro activity of eight antifungals (amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole, ravuconazole, albaconazole, micafungin and terbinafine) and the interactions of micafungin with five antifungals (amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole or ravuconazole) against 10 strains of Rhodotorula glutinis and 10 of Sporobolomyces salmonicolor. Only amphotericin B, ravuconazole and albaconazole showed low MIC values against R. glutinis. For this reason, we consider interesting the finding that all the antifungal combinations showed a high percentage of synergic interactions (60-80%) with the exception of micafungin plus fluconazole that only showed 20%. Against S. salmonicolor, the amphotericin B MICs were very variable with a 6-fold difference between the lowest and the highest values (0.25-16 mg/L). The best combination was micafungin plus itraconazole with 60% synergic interactions. The other combinations only showed 20-40% synergic interactions. Although these percentages are not so high as for the other species tested, some of these combined therapies could be helpful when amphotericin B fails.

Els estudis inclosos a la present tesi s'han centrat en el desenvolupament de noves teràpies antifúngiques per a infeccions causades per diverses espècies de Candida i per Cladophialophora bantiana. D'aquesta tesi s'han extret les següents conclusions:-La micafungina ha demostrat una eficàcia similar a la d'antifúngics tradicionals per al tractament experimental d'infeccions per C.glabrata. En combinació amb l'amfotericina B, aquest antifúngic ha demostrat, també, una gran eficàcia.-S'ha demostrat l'eficàcia del posaconazole per al tractament experimental d'infeccions disseminades per C.krusei i C.tropicalis.-L'anidulafungina, la caspofungina i la micafungina han estat efectives per al tractament d'infeccions experimentals disseminades per C.dubliniensis.-S'ha comprovat l'eficàcia de dues noves formulacions d'amfotericina B per al tractament d'infeccions experimentals per Candida.-La combinació de la micafungina amb l'itraconazole ha demostrat una bona activitat in vitro envers el gènere Candida.-La combinació del posaconazole, la micafungina i la flucitosina ha demostrat ser efectiva envers C. bantiana. / The studies included in this thesis focused on the development of new antifungal therapies for infections caused by various species of Candida and also Cladophialophora bantiana. The following conclusions were obtained in this thesis:-Micafungin demonstrated to be as effective as some traditional antifungal agents for the treatment of experimental infections by C.glabrata. This drug in combination with amphotericin B has also shown great efficacy.- Posaconazole demonstrated to be effective for the treatment of experimental infections by C.krusei and C.tropicalis. -Anidulafungin, micafungin and caspofungin were effective for the treatment of experimental disseminated infections by C.dubliniensis. -The effectiveness of two new formulations of amphotericin B has been proven for the treatment of experimental disseminated Candida infections. -The combination of micafungin with itraconazole showed good in vitro activity against the genus Candida. -The combination of posaconazole, micafungina and flucytosine has proven to be effective against C. bantiana.

Las plantas están constantemente sometidas a estreses ambientales y los hongos son sus principales patógenos. Actualmente, el control de las enfermedades que causan se realiza utilizando compuestos químicos, generando impacto en el medio ambiente. Una alternativa es la obtención de plantas transgénicas resistentes. En un principio, la mayoría de los transgenes provenían de las propias plantas (genes involucrados en las respuestas de densa). Actualmente, y dada su reducida efectividad, se están identificando genes de defensa de otros organismos, como bacterias, insectos, animales y hongos. En este trabajo se ha evaluado la utilidad de la proteína AFP ("antifungical protein"), producida por el hongo del suelo Aspergillus giganteus, para actuar como agente antifúngico frente a fitopatógenos de geranio y arroz. Es una proteína con una estructura compacta y muy básica, que se secreta al espacio extracelular. Estudios anteriores ya habían demostrado su actividad antifúngica frente al hongo Botrytis cinerea, responsable de la enfermedad "podredumbre gris" en muchas plantas, especialmente las ornamentales. Los resultados revelan una fuerte actividad antifúngica, con inhibición tanto del desarrollo de las hifas como de la germinación de las esporas. Cuando se utiliza en combinación con la proteína cecropina A de lepidóptero, se observa un efecto aditivo entre ambas, lo que puede ser útil para desarrollar estrategias de expresión simultánea de ambos genes en plantas transgénicas. Además, la AFP inhibe el crecimiento de B. cinerea tanto in vitro como in vivo, en plantas de geranio.Por otra parte, el hongo Magnaporthe grises causa la enfermedad piricularosis en arroz. En este trabajo se ha desarrollado una estrategia para expresar el gen afp de manera inducible en plantas transgénicas de arroz con el fin de obtener plantas resistentes y evitar los posibles efectos negativos de una expresión constitutiva, como gasto metabólico y aceptación por los consumidores. Nuestros estudios indicaron que el promotor de un gen PR de maíz, el gen ZmPR4, es funcional e inducible por el hongo M. grisea en plantas de arroz. Este promotor controla la expresión del gen afp en niveles suficientes para conferir resistencia a la infección por este hongo en plantas transgénicas. Además este promotor no es activo en el endospermo de la semilla del arroz (órgano destinado al consumo), con lo que se evita que el producto del transgén se acumule en este tejido. Dado el potencial del gen afp para aplicación biotecnológica, se hacía necesario determinar su mecanismo de acción, así como sus posibles efectos sobre células animales o vegetales. Para eso, se han realizado diferentes estudios utilizando el hongo M. grisea. Mediante microscopía electrónica de transmisión y confocal, s eha observado que esta proteína es capaz de formar poros en la membrana del hongo, penetrando en la célula y acumulándose en el núcleo. Además, tiene la propiedad de interaccionar con ácidos nucleicos (DNA o RNA). Estros resultados sugieren que su mecanismo de acción se basa en una combinación de dos actividades: formación de poros en la membrana, e interacción con ácidos nucleicos. Se realizaron también ensayos con células vegetales (protoplastos de arroz) y humanas (células HeLa), que han permitido determinar que la proteína AFP no ejerce efecto nocivo significativo sobre ellas. Los resultados obtenidos permiten concluir que el gen afp es un buen candidato para ser utilizado como transgén en la protección de plantas de geranio y de arroz frente a los hongos Botrytis cinerea y Magnaporthe grisea, respectivamente. El promotor del gen ZmPR4 representa una buena opción para dirigir la expresión de genes antifúngicos en plantas transgénicas de arroz. / The mold "Aspergillus giganteus" produces the antifungal (AFP) protein. In this work we have analysed the biotechnological applications of this protein against phythopathogenic fungus ("Botrytis cinerea" and "Magnaporthe grisea"). We also studied mechanism of action of AFP against this last fungus. The results are presented in 3 chapters. 1) "Botrytis" blight caused by "Botrytis cinerea" is one of the most widely distributed disease of ornamental plants, especially geranium. Here, the antifungal properties of AFP against various "B. cinerea" isolates were investigated. AFP showed a strong inhibition of mycelial growth and conidial germination by a fungicidal activity. Microscopic observations revealed reduced hyphal elongation and swollen tips. AFP directly protects geranium leaves against "Botrytis". These results are discussed in relation to the potential of the "afp" gene to enhance crop protection against "B. cinerea". 2) Rice blast, caused by "Magnaporthe grisea", is the most important fungal disease of cultivated rice. We have developed a strategy for creating disease resistance to "M. grisea" by pathogen-induced expression of the "afp" gene in transgenic rice plants. Plants expressing the "afp" gene under the control of the maize "ZmPR4" promoter were generated. Transformants showed resistance to "M. grisea". Our results suggest that pathogen-inducible expression of the "afp" gene in rice plants may be a practical way for protection against the blast fungus. 3) The mechanism of action of AFP against "Magnaporthe grisea" was investigated. AFP was able to produce membrane permeabilization on fungal cells but not on rice or HeLa cells. TEM studies revealed cellular degradation and damage of plasma membranesin AFP-treated fungal cells. AFP was found in the nucleus and gel-retardation experiments confirmed that AFP binds nucleic acids. Together, our results suggest that the combination of fungal cell permeabilization, cell-penetrating ability and nucleic acid-binding activity of AFP determines its antifungal activity.

Els avenços que han experimentat tots els camps de la medicina en els darrers 20 anys han influït de forma notable en els tipus de malalts que són atesos als centres hospitalaris, sobre tot en hospitals de tercer nivell. L'aplicació de noves tecnologies o actituds terapèutiques corn el trasplantament de medúl.la òssia o d'òrgan sòlid i la utilització d'agents quimioteràpics han esdevingut cada cop més freqüents. A més a més, factors com la millora en l'atenció dels malalts ingressats en unitats de cures intensives, la nutrició parenteral, l'hemodiàlisi o els antibiòtics d'ampli espectre han contribuït de forma clara i favorable al tractament dels pacients en situacions crítiques. Això però, té una contrapartida negativa que es tradueix en la presència d'un major nombre de malalts hospitalitzats amb un compromís immunitari evident o amb patologies de base molt greus. Considerats corn un conjunt, aquests tipus de pacients constitueixen una població altament susceptible a patir una infeccin nosocomial que pot estar causada per diversos microorganismes entre els que cal incloure els fongs. Les infeccions fúngiques en aquests malalts són sovint severes, ràpidament progressives i generalment, hi ha certes dificultats per arribar al seu diagnòstic o realitzar un tractament adequat. L'increment experimentat en el nombre d'infeccions nosocomials fúngiques ha comportat, de forma paral.lela, un augment en el nombre de comunicacions científiques que descriuen diferents brots epidèmics nosocomia1s causats per fongs (Fridkin and Jarvis, 1996). És obvi que el focus d'origen o el mecanisme de transmissió pot ser molt diferent d'un brot a l'altre segons les característiques de l'agent implicat. A més a més, per determinar la causa d'un brot epidèmic concret i poder adoptar les mesures de control més adients per aturar-lo, és fonamental conèixer la fisiopatologia del fong implicat. Però, tal com ha passat amb les infeccions bacterianes, a mesura que aprofundim en l'epidemiologia d'una determinada infecció fúngica, i per extensió, la dels brots epidèmics, es fa cada cop més evident la necessitat d'utilitzar una determinada metodologia que ens ajudi a avaluar les troballes obtingudes. L'aplicació de mètodes moleculars per compendie millor l'epidemiologia de les infeccions fúngiques i la consegüent tipificació dels fongs implicats ha experimentat un impuls notable en els darrers 10 anys. Tot i els diversos mètodes existents, no hi ha però, un mètode considerat "standard" i l'elecció d'un o altre dependrà de les preguntes plantejades i les possibilitats de cada centre (Soll, 2000). Per tot allò comentat anteriorment, és obvi que la millora en el pronòstic de les infeccions fúngiques, sobre tot en malalts amb immunosupressió, és un objectiu que cal assolir el més aviat possible. Aquest objectiu es pot abordar des de diferents punts de vista. Així, en la pràctica diària hi ha dues opcions que semblen clares: avançar en les tècniques de diagnòstic precoç d'aquestes infeccions i la introducció en el tractament de nous antifúngics que millorin l'activitat, tolerància i seguretat dels antifúngics actuals. Hi ha però altres possibilitats que també cal estudiar per aconseguir l'objectiu que hem comentat. Algunes són necessàries com a pas previ a les opcions anteriors i altres simplement les complementen En aquesta tesi hem centrat el nostre treball en un aspecte més bàsic i inicial com és la valoració de l'activitat in vitro de nous antifúngics sobre fongs patògens prevalents amb la finalitat d'esbrinar les seves possibilitats com a fàrmacs potencialment útils en el tractament de les infeccions fúngiques. A més a més, hi ha un segon aspecte que també ha estat objecte d'anàlisi com és l'aplicació de la sonda semirepetitiva Ca3 a l'estudi de les infeccions nosocomials per “Candida albicans”.