Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-03. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:31Z : No. of bitstreams: 1 000843898.pdf: 1360987 bytes, checksum: eeb1170ea817515b2c839bf006aca6f0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho visou à produção de fitases por fungos termofílicos em cultivo em estado sólido (CES), utilizando resíduos agroindustriais como substratos, e secá-las, juntamente com xilanases, por spray drying. Após a secagem, os pós foram armazenados e a redução da atividade enzimática com o tempo de armazenamento foi avaliada. Para a produção das fitases foram testados 13 fungos pertencentes do Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada do IBILCE/UNESP, sendo o termotolerante Lichtheimia ramosa escolhido para seguir com os experimentos. A xilanase foi metabolizada pelo fungo Myceliophtora thermophila I-1D3b. O fungo L. ramosa foi cultivado em bagaço de cana de açúcar, bagaço de laranja e farelo de trigo, enquanto que M. thermophila foi cultivado em bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo, ambos a 45 oC. Os ensaios de secagem foram divididos entre discriminação do adjuvante que proporcionasse maior proteção às enzimas, otimização das condições de secagem e armazenamento dos pós secos. Para os ensaios de discriminação de adjuvante, foram escolhidas como variáveis o adjuvante e a temperatura de saída do ar do spray dryer, Os adjuvantes empregados foram farelo de trigo, farelo de milho e farelo de soja, sendo que este último forneceu os melhores resultados. A temperatura não foi um fator significativo na análise de variância. Para os ensaios de otimização das condições de secagem foi empregada a técnica de superfície de resposta, sendo usadas variáveis preditoras a temperatura de saída do ar, a vazão de alimentação de suspensão e a concentração de sólidos. Os resultados indicaram a vazão e concentração de sólidos como variáveis significativas. A suspensão na condição ótima de secagem continha 7,5% e a vazão foi de 3 mL/min, sendo a temperatura escolhida de 83 oC. O ensaio realizado nestas condições proporcionou retenção 83% de atividade de fitase e de 85%... / This work aimed to produce phytases by thermophilic molds in solid state cultivation, using solid agro-industrial by-products as substrates, and dry the enzymes, along with xylanases, by spray-drying. Following the drying, the powders were storage and the reduction of the enzyme activities was evaluated. For the phytase production, 13 fungi were tested, and Lichthemia ramose was chosen. Xylanase was metabolized by Myceliophtora thermophila I-1D3b. All tested microorganisms belonged to the Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada. L. ramose was cultivated in sugar cane bagasse, Orange pulp and peel and wheat bran, while M. thermophila was cultivated in sugar cane bagasse and wheat bran, both at 45 oC. Drying experiments were done to discriminate the adjuvant able to provide the best protection to the enzymes. The tested variables were the adjuvants (brans of wheat, corn and soybean) and the air temperature at the spray dryer outlet. The temperature was not a statistically significant factor and soybean bran provided the best protection. Experiments to optimize the drying conditions for soybean bran were carried out following a response surface approach, having the outlet air temperature, the suspension flow rate and the total solid concentration as the controlled variables. The results showed that the flow rate and the solid concentration were the significant variables. The estimated optimum condition had 7,5% of solids and the flow rate was 3 mL/min. The experiment carried at this condition, at 83 oC showed 83% of retention for phytase and 85%...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:46:55Z : No. of bitstreams: 1 000844224_20160601.pdf: 362616 bytes, checksum: a0311183aabff0045355f750351c75a5 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-06-02T14:22:30Z: 000844224_20160601.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-02T14:23:10Z : No. of bitstreams: 1 000844224.pdf: 4065201 bytes, checksum: e54a6ae6edaf5bf99bd00ffc782a6ac7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente trabalho foi avaliar a cinética de crescimento do fungo termófilo Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo sólido. A aplicação imediata desta cinética é empregá-la a modelos de previsão de transferência de calor e massa em biorreatores; em horizonte mais amplo, a cinética poderá ser relacionada à secreção de metabólitos pelo microrganismo. O meio de cultivo foi composto por bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo (proporção 7:3) e as determinações indiretas das concentrações de biomassa foram realizadas através de metodologias químicas analíticas e de análise de imagens. Os métodos analíticos se basearam nas quantificações de N-acetil-D-glicosamina e atividade de CMCase, α amilases, xilanases, proteases e teor de proteínas solúveis. A análise de imagens foi feita empregando-se o software Lenseye e a partir de fotografias digitalizadas, onde a quantificação do crescimento foi feita através da quantificação da área superficial ocupada pelo micélio fúngico e através de técnicas de Microscopia Ótica (MO) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A técnica de análise do teor de N-acetil-D-glicosamina mostrou ser um bom indicativo de crescimento microbiano, com bom ajuste ao modelo logístico, resultando em um coeficiente R2 igual a 0,98, tendo permitido estimar os parâmetros cinéticos de crescimento, onde o Xmáx foi de 1,889 mg de glicosamina/g de fermentado. Além disso, foi possível observar com clareza as fases de crescimento acelerado, estacionária e de declínio, apesar de apresentar algumas incertezas na fase lag, provavelmente devido à heterogeneidade do meio de cultivo interferir na análise. A análise da cinética de secreção das enzimas estudadas foi um bom indicador das atividades metabólicas do fungo, mas não de seu crescimento. A determinação do teor de proteínas solúveis através da técnica de Lowry... / This work aimed to evaluate the growth kinetics of the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 during solid-state cultivation (SEC). The immediate application of this kinetics is in heat and mass transfer modeling in SEC bioreactors; however, through the kinetics, the metabolic secretion could be understood and forecasted. The cultivation medium was composed by sugar cane bagasse and wheat bran in the proportion 7:3 and the indirect determination of biomass where done using analytical chemical techniques, as well as through image analysis. The analytical methods were based on the quantification of N-acetylglucosamine, extracellular enzyme activities, and soluble proteins. The digital analysis were performed using a specific software, and the growth quantification was correlated to the superficial area occupied by the microorganism and and through Optical Microscopy (LOM) and Scanning Electron Microscopy (SEM).The glucosamine analysis is considered an adequate method to quantify the microbial growth, since it aloud to clearly identify the phases of fast growing, stationary and decreasing, even though the lag phase identification was uncertain due to the interference of the cultivation medium on the analytical method. The analysis of CMCase, amylases, xylanases and proteases were good indicators of the fungal metabolic activities, but not of the fungal growth. The determination of the content of soluble proteins by Lowry technique presented uncertainties and do not represent faithfully all the microorganism development phases. The growth analysis by SEM possible to describe the morphological characteristics of the fungus, as the presence of conidia and hyphae propagation on fibrils branched from sugar cane bagasse. The digital image processing was well correlated to the analytical methods, but was also discarded as an adequate growth indicator. Nevertheless, this technique is promising ...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-06. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:36Z : No. of bitstreams: 1 000844646.pdf: 1641467 bytes, checksum: f99255de843f4bbb0ac75bab37944e11 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As pectinases são um grupo de enzimas capazes de degradar polissacarídeos pécticos (pectinas). Estas enzimas são utilizadas na indústria de produção de sucos de frutas, vinhos, têxtil, papel, chá, óleos e etc. O presente trabalho teve por objetivo produzir, purificar e caracterizar a pectinase exo-poligacturonase (exo-PG - EC 3.2.1.67) do fun-go termofílico Rhizomucor pusillus. A enzima foi produzida por cultivo submerso e puri-ficada por salting-out e cromatografia. Este método se revelou como o mais adequado empregando 95 % de sulfato de amônio, sendo que com esta técnica foi possível obter a enzima quase livre de contaminantes e com um rendimento de aproximadamente 74 %. Um passo subsequente de cromatografia de interação hidrofóbica é capaz de re-mover os contaminantes remanescentes. A enzima pura possui massa molecular ao redor de 43,5-47 kDa, pH ótimo de 4,0, temperatura ótima de 61 °C, é estável a uma faixa de pH que varia de 3,5 a 6,5, possui estabilidade térmica de 30 até 60 °C e é ati-vada na presença de Ca+2. O ponto isoelétrico da exo-PG é 6,2 e estudos termodinâ-micos mostraram se tratar de uma enzima termofílica, destacando seu tempo de meia-vida t1/2 de 2.310 min., a 50 °C. O perfil da hidrólise foi analisado por eletroforese capi-lar e os estudos indicam que a enzima em estudo apresenta um padrão de hidrólise sequencial (exo). A identificação dos aminoácidos por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e a comparação com bancos de dados revelou a maior identidade dos fragmentos sequenciados da exo-PG de R. pusillus com a enzima correspondente de Aspergillus fumigatus. Os testes de aplicação das enzimas do extrato bruto mostraram um aumento da extração de suco e um auxílio no processo de hidrólise, sendo que este não foi observado com a enzima pura / Pectinases are a group of enzymes capable of degrading pectic polysaccharides (pec-tin). These enzymes are used in the industry for production of fruit juices, wines, tex-tiles, paper, tea, oils, etc. This study aimed to produce, purify and characterize an exo-poligacturonase (exo-PG - EC 3.2.1.67) from the thermophilic fungus Rhizomucor pu-sillus. The enzyme was produced by submerged cultivation and purified by chromatog-raphy and salting out. This has proved to be the most appropriate using 95 % ammoni-um sulfate, and with this technique it was possible to obtain the enzyme almost free of contaminants and with a yield of approximately 74 %. A subsequent step of hydropho-bic interaction chromatography is able to remove the remaining contaminants. The pure enzyme has molecular mass around 43.5-47 kDa, optimum pH of 4.0, optimum tem-perature of 61 °C, is stable at a pH range between 3.5 and 6.5, presents thermal stability from 30 to 60 °C and is activated in the presence Ca2+. The isoelectric point of the exo-PG is 6.2 and thermodynamic studies have shown that it is a thermophilic enzyme, highlighting its half-life t1/2 of 2,310 minutes at 50 °C. The profile of hydrolysis was ana-lyzed by capillary electrophoresis and studies indicate that the enzyme in this study has a pattern of sequential hydrolysis (exo). The identification of amino acids by mass spec-trometry MALDI-TOF and a comparison with data banks showed the highest identity of the sequenced fragments of exo-PG from R. pusillus with the corresponding enzyme from Aspergillus fumigatus. The application tests of the enzymes of the crude extract showed increased extra juice extraction and a higher yield in the hydrolysis process, but this was not observed with the pure enzyme

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-24Bitstream added on 2014-08-27T15:57:05Z : No. of bitstreams: 1 000778079.pdf: 2078209 bytes, checksum: f253bd93ea489feb471ed9cad8e18c13 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A conversão enzimática dos polissacarídeos da biomassa é um fator chave no desenvolvimento de bioetanol de segunda geração. A recalcitrância da lignocelulose para a degradação enzimática e o custo elevado de enzimas hidrolíticas necessárias para a despolimerização de polissacarídeos encontrados na parede celular da planta são barreiras significativas para a produção em larga escala e para a comercialização de biocombustíveis e bioprodutos derivados da biomassa vegetal. A fim de aumentar rapidamente a produção de biocombustíveis celulósicos e bioprodutos, existe a necessidade de desenvolver coquetéis enzimáticos mais eficientes e de menor custo para a conversão de biomassa em açúcares fermentáveis. Nesse contexto, o estudo de enzimas degradadoras da parede celular é essencial. No presente trabalho a enzima endo-1,4-?-D-glucanase de Aspergillus terreus (ATEG_09894) foi clonada para expressão em A. nidulans. O teste de expressão mostrou a expressão solúvel da proteína. Sua identidade foi confirmada por espectrometria de massas. O pH ótimo e a temperatura ótima para sua atividade enzimática foram de 5,0 e 55ºC, respectivamente. A desnaturação térmica mostrou que a partir de 60ºC a enzima começa a perder estrutura. Interessantemente a enzima apresenta atividades ?-glucanase e xiloglucanase, tendo preferência por ?-glucano. A caracterização estrutural mostrou que ATEG_09894 foi expressa corretamente e os resultados de SEC e SAXS mostram que a proteína é monomérica em solução e o modelo de sua estrutura tridimensional indica que a superfície eletrostática da molécula contribui para um monômero estável. Os dados apresentados nesse trabalho são importantes pois identificam peculiaridades da enzima ATEG_09894, que atua na degradação da biomassa, sugerem os determinantes de sua seletividade enzimática e apresenta a degradação, não usual, de ?-glucanos... / The enzymatic conversion of polysaccharides from biomass is a key factor in the development of second generation bioethanol. The recalcitrance of lignocellulose to enzymatic degradation and the high cost of hydrolytic enzymes necessary for the depolymerization of polysaccharides found in plant cell wall are significant barriers to large-scale production and commercialization of biofuels and bioproducts derived from plant biomass. In order to rapidly increase the production of biofuel and byproducts cellulosic, a need exists to develop more efficient and lower cost enzymatic cocktails for the conversion of biomass into fermentable sugars. In this context, the study of cell wall degrading enzymes is essential. In this work the enzyme endo-1,4-?-D-glucanase from Aspergillus terreus (ATEG_09894) was cloned for expression in A. nidulans. The expression test showed the expression of a soluble protein. Its identity was confirmed by mass spectrometry. The optimum pH and optimum temperature for the enzyme activity were 5.0 and 55 ºC, respectively. The thermal denaturation showed that above 60 ºC the enzyme starts to lose structure. Interestingly, the enzyme has ?-glucanase and xiloglucanase activities, preferring ?-glucan. Structural characterization showed that ATEG_09894 was expressed correctly folded and the results of SEC and SAXS show that the protein is monomeric in solution and the model of its three dimensional structure indicates that the electrostatic surface molecule contributes to a stable monomer. The data presented in this study are important because they identify peculiarities of ATEG_09894, which acts in the degradation of biomass, suggest the determinants of its selectivity and enzymatic degradation presents, unusual, of ?-glucans and xyloglucans, promising feature for degradation of lignocellulosic material

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-18Bitstream added on 2014-12-02T11:21:32Z : No. of bitstreams: 1 000791510.pdf: 1007722 bytes, checksum: 35de05c30fb9f0918eebd0b6011c60af (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19) é uma enzima capaz de formar ciclodextrinas a partir do amido. As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos, os quais os principais tipos são α-, β- e γ-CD, que apresentam 6, 7 e 8 unidades de glicose interligadas por ligações α-1,4. Duas bactérias alcalofílicas Bacillus sp subgrupo alcalophilus E16 e Paenibacillus campinasensis H69-3 foram estudadas por apresentarem boa produção de CGTase, ambas foram isoladas de amostras de solo. A atividade enzimática foi estudada utilizando os métodos já pré-determinados em estudos anteriores, como dextrinizante, CD-fenolftaleína e determinação de proteína. Para alcançar a purificação foram utilizados os processos de ultrafiltração e purificação por gel filtração em resina Sephadex G-75. A partir desses processos obteve-se resultados significativos, para o extrato purificado produzido por Bacillus sp subgrupo alcalophilus E16, obteve-se um fator de purificação de 35,4 vezes, um rendimento de 34.1 % e atividade específica de 13.10 U/mg, enquanto o extrato purificado de Paenibacillus campinasensis H69-3 resultou em um fator de purificação de 94.5 vezes, um rendimento de 33.2 % e a atividade específica de 23.64 U/mg. Foram feitos ensaios quanto a produção de ciclodextrinas utilizando o extrato bruto concentrado da CGTase por ultrafiltração produzida por Paenibacillus campinasensis H69-3, no perfil de hidrólise de diferentes amidos a 1.0%, a enzima atuou convertendo o amido em β-CD de melhor forma nos amidos de arroz e de mandioca, enquanto que na concentração de 2.5 % a melhor conversão se deu nos amidos de milho e mandioca. Quanto à dextrinização dos amidos, as concentrações de 1.0 % e 2.5 % apresentaram o mesmo perfil de hidrólise, sendo os amidos de mandioca, solúvel e batata apresentaram melhor conversão, quando comparadas aos amidos de arroz e milho. A dextrinização do amido foi mais efetiva na ... / The cyclomaltodextrin glucanotransferase ( EC 2.4.1.19 ) is an enzyme able to form cyclodextrin from starch . Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides , which are the main types α - , β - and γ - CD which have 6, 7 and 8 glucose units connected by α - 1, 4 bonds. Two bacterial alkalophilic Bacillus sp subgroup alcalophilus E16 and Paenibacillus campinasensis H69 -3 was studied due to their good CGTase production, both of which were isolated from soil samples. The enzymatic activity was studied using the methods already pre-determined in previous studies, as dextrinizante, CD-phenolphthalein and protein determination. To achieve the purification and ultrafiltration processes were used for purification gel filtration resin Sephadex G-75. From these processes significant results were obtained for the purified extract produced by Bacillus sp subgroup alcalophilus E16 gave a purification factor of 35.4 times, a yield of 34.1% and a specific activity of 13.10 U / mg , while the purified extract of Paenibacillus campinasensis H69-3 resulted in a purification factor of 94.5 times , a yield of 33.2 % and specific activity of 23.64 U / mg . Tests were made for the production of cyclodextrins using concentrated crude extract by ultrafiltration CGTase produced by Paenibacillus campinasensis H69 3, hydrolysis of starches from different profile than 1.0 % , the enzyme acted converting starch into β- CD best in rice starch and tapioca , whereas a concentration of 2.5 % and better conversion is given cassava and corn starch . As for dextrinizing the starch, the concentrations of 1.0% and 2.5% showed the same profile hydrolysis , and cassava starches , potato and soluble showed better conversion, when compared to starches of rice and corn. Dextrinisation of starch was more effective at 1.0% concentration , because practically all starch was hydrolyzed at a concentration of 2.5% was slower hydrolysis , for 24 hours, the starches in the study were ...

Orientador: João Cláudio Thoméo / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Michel Brienzo / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi avaliar a cinética de crescimento do fungo termófilo Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo sólido. A aplicação imediata desta cinética é empregá-la a modelos de previsão de transferência de calor e massa em biorreatores; em horizonte mais amplo, a cinética poderá ser relacionada à secreção de metabólitos pelo microrganismo. O meio de cultivo foi composto por bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo (proporção 7:3) e as determinações indiretas das concentrações de biomassa foram realizadas através de metodologias químicas analíticas e de análise de imagens. Os métodos analíticos se basearam nas quantificações de N-acetil-D-glicosamina e atividade de CMCase, α amilases, xilanases, proteases e teor de proteínas solúveis. A análise de imagens foi feita empregando-se o software Lenseye e a partir de fotografias digitalizadas, onde a quantificação do crescimento foi feita através da quantificação da área superficial ocupada pelo micélio fúngico e através de técnicas de Microscopia Ótica (MO) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A técnica de análise do teor de N-acetil-D-glicosamina mostrou ser um bom indicativo de crescimento microbiano, com bom ajuste ao modelo logístico, resultando em um coeficiente R2 igual a 0,98, tendo permitido estimar os parâmetros cinéticos de crescimento, onde o Xmáx foi de 1,889 mg de glicosamina/g de fermentado. Além disso, foi possível observar com clareza as fases de crescimento acelerado, estacionária e de declínio, apesar de apresentar algumas incertezas na fase lag, provavelmente devido à heterogeneidade do meio de cultivo interferir na análise. A análise da cinética de secreção das enzimas estudadas foi um bom indicador das atividades metabólicas do fungo, mas não de seu crescimento. A determinação do teor de proteínas solúveis através da técnica de Lowry... / Abstract: This work aimed to evaluate the growth kinetics of the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 during solid-state cultivation (SEC). The immediate application of this kinetics is in heat and mass transfer modeling in SEC bioreactors; however, through the kinetics, the metabolic secretion could be understood and forecasted. The cultivation medium was composed by sugar cane bagasse and wheat bran in the proportion 7:3 and the indirect determination of biomass where done using analytical chemical techniques, as well as through image analysis. The analytical methods were based on the quantification of N-acetylglucosamine, extracellular enzyme activities, and soluble proteins. The digital analysis were performed using a specific software, and the growth quantification was correlated to the superficial area occupied by the microorganism and and through Optical Microscopy (LOM) and Scanning Electron Microscopy (SEM).The glucosamine analysis is considered an adequate method to quantify the microbial growth, since it aloud to clearly identify the phases of fast growing, stationary and decreasing, even though the lag phase identification was uncertain due to the interference of the cultivation medium on the analytical method. The analysis of CMCase, amylases, xylanases and proteases were good indicators of the fungal metabolic activities, but not of the fungal growth. The determination of the content of soluble proteins by Lowry technique presented uncertainties and do not represent faithfully all the microorganism development phases. The growth analysis by SEM possible to describe the morphological characteristics of the fungus, as the presence of conidia and hyphae propagation on fibrils branched from sugar cane bagasse. The digital image processing was well correlated to the analytical methods, but was also discarded as an adequate growth indicator. Nevertheless, this technique is promising ... / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Elení Gomes / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Banca: Márcia Justino Rossini Mutton / Banca: Henrique Vianna de Amorim / Resumo: A produção de etanol no Brasil é baseada, principalmente, em processo de fermentação por batelada alimentada, em tanques de grande volume (250.000 a 3.000.000 de litros), com fermentação rápida (6-12 horas), utilizando altas concentrações de levedura (8-15% p/v). Entretanto, este processo está sujeito a contaminação por cepas Saccharomyces do meio ambiente designadas "selvagens" as quais podem causar sérios problemas ao processo fermentativo como fermentação lenta, floculação do fermento e aumento do açúcar residual no mosto fermentado. O objetivo do trabalho foi selecionar uma linhagem de Saccharomyces cerevisiae mais adaptada ao processo fermentativo da Usina Alta Mogiana e que constituísse um fermento robusto, dominante e persistente na fermentação industrial ao longo da safra. Os experimentos em escala industrial foram conduzidos na Usina Alta Mogiana, localizada na região de São Joaquim da Barra, estado de São Paulo. As principais etapas foram: 1) monitoramento da população de linhagens dominantes e persistentes nas fermentações por cariotipagem; 2) avaliação do desempenho fermentativo das linhagens em escala de laboratório; 3) reintrodução da cepa selecionada no processo fermentativo industrial, 4) avaliação do desempenho da cepa na escala industrial. Os resultados permitiram a seleção de uma linhagem (levedura UAM) que dominou a microbiota da dorna e permaneceu no processo fermentativo durante toda a safra. Esta linhagem permitiu os seguintes ganhos industriais: incremento no teor alcoólico do vinho de 8 para 10%, reduzindo o volume de vinhaça de 11,44 para 10,23 L/L etanol, diminuiu a contaminação por Saccharomyces selvagens, proporcionou uma economia de energia térmica e bagaço (15.000 ton/safra) e contribuiu para aumentar a eficiência industrial de recuperação de açúcar (de 88 para 92% do açúcar processado). Esses resultados demonstraram a viabilidade e vantagens das usinas... / Abstract: Ethanol production in Brazil is based on fed-batch fermentations in large volume tanks (250,000 to 3,000,000 liters), with fast fermentations (6-12hours) and high concentrations of yeast (8-15% w/v). However, this process is subject to contamination by wild Saccharomyces strains that may cause serious problems such as low fermentation yield, flocculation and residual sugars in the wine. The research objective was to select a Saccharomyces strain, more adapted to fermentation process of Alta Mogiana mill that might be a robust yeast, dominant and persistent in the industrial fermentation process during the harvesting season. Experiments in industrial scale were conducted at Alta Mogiana mill, located in São Joaquim da Barra region, state of São Paulo, Brazil. The main steps were: 1) monitoring the population of dominant and persistent strains by karyotyping; 2) evaluation of the fermentation performance of strains in laboratory-scale; 3) re-introducing of the selected strain in the industrial fermentation process; and, 4) evaluation of the strain performance in industrial scale. The results enabled the selection of a strain (yeast UAM) that dominated the microbiota of fermentation tanks and remained in the fermentation process during all harvesting season. This strain enabled industrial gains such as the increase of alcoholic content in wine from 8 to 10%, reduction of vinasse volumes from 11.44 to 10.23 L/L ethanol and lowering the contamination by wild Saccharomyces. Moreover, this strain provided savings of thermal energy and bagasse (15,000 ton/ harvest) and contributed to increase the industrial efficiency of sugar recovery (from 88 to 92 % of processed sugar). These results demonstrate the feasibility and benefits for Brazilian distilleries to have their own yeast strain selected among the indigenous ... / Doutor

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Cristiane Sanchez Farinas / Banca: George Jackson Moraes Rocha / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: João Cláudio Thoméo / Resumo: A adsorção não-produtiva das celulases e β-glicosidases à lignina tem sido consideradaum fator limitante da hidrólise do material lignocelulósico. Esse trabalho avaliou ainteração entre celulases e β-glicosidases dos coquetéis comerciais de Trichodermareesei (Cellic Ctec2) e Aspergillus niger (Novo 188) com preparações de ligninaisoladas por hidrólise enzimática (LDHE) e hidrólise ácida (LDHA) do bagaço de canapré-tratado hidrotermicamente. Também foi selecionada uma β-glicosidase tolerante àinibição pela glicose a partir da coleção de fungos de trabalho do Laboratório deBioquímica e Microbiologia Ibilce/Unesp e o efeito da LDHE e dos compostosfenólicos derivados do pré-tratamento hidrotérmico sobre a mesma foram avaliados. ALDHA apresentou maior capacidade de adsorção das enzimas do que LDHE. A 45°Ctodas as enzimas de T. reesei se ligaram a LDHE e a LDHA. As atividades residuais deendoglucanase, β-glicosidase e exoglucanase no sobrenante após a incubação com aLDHE foi de 28, 45 e 63%. Exoglucanase e β-glicosidase foram completamenteadsorvidas a LDHA enquanto que a endoglucanase manteve 14% da atividade. A β-glicosidase de A.niger foi menos afetada mantendo 94 e 48% da atividade na presençade LDHE e LDHA. A β-glicosidase de A. niger purificada apresentou 89 e apenas 2%de atividade no sobrenadante quando incubada com LDHE e LDHA, contra 100 e 95%de atividade da enzima presente no coquetel. A diminuição da temperatura para 30°Cprovocou a... / Abstract: Non-productive adsorption of cellulase and beta-glucosidase enzymes onto lignin isshown to be a limiting factor to enzymatic hydrolysis of lignocellulosic. This studyevaluated the interaction of cellulases and beta-glucosidase from Trichoderma reesei(Cellic Ctec2) and Aspergillus niger (Novo 188) commercial cocktail with ligninpreparations isolated from liquid hot water sugarcane bagasse by enzymatic (LDHE)and acid hydrolysis (LDHA). Furthermore, a glucose tolerant β-glucosidase wasselected from the collection of working fungi of Laboratório de Bioquímica eMicrobiologia (Ibilce/Unesp), effect of LDHE and liquid hot water pretreatment-derivedphenolic compounds were evaluated. LDHA had higher adsorption capacity on enzymesthan LDHE. At 45°C T. reesei enzymes bound to both LDHE and LDHA.Endoglucanase, beta-glucosidase and exoglucanase remained activities in thesupernatant after incubation with LDHE were 28, 45 e 63%. Exoglucanase and betaglucosidasewere completely adsorbed onto LDHA while endoglucanase activityremained in the supernatant was 14%. A. niger beta-glucosidase was less adsorptionthan enzymes from T. reesei, it maintained 94 and 48% of the activity in the presence ofLDHA and LDHE. Purified beta-glucosidase from A. niger showed 89 and only 2%activity in the supernatant after incubation with LDHE LDHA, while beta-glucosidasefrom enzymatic cocktail showed 100 and 95% of the enzyme activity. The decrease oftemperature to 30°C decreased ... / Doutor

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Adalberto Pessoa Junior / Banca: Mario Tyago Murakami / Banca: Gustavo O. Bonilla Rodriguez / Banca: Aliandra Maura Gibertoni Malaman / Resumo: Os microrganismos termofilicos são de grande interesse biotecnológico, não apenas por tolerar altas temperaturas, mas também por secretarem proteínas de maior estabilidade, com características bioquímicas e estruturais importantes de múltiplas aplicações na indústria. A linhagem do fungo termofílico Myceliophthora heterothallica F.2.1.4, isolada de camas de frango, apresentou alta atividade da enzima β-1,4-endoglucanase (31 U/ml). O gene codificante da β-1,4-endoglucanase de F.2.1.4 foi identificado e expresso em leveduras Pichia pastoris e em bactéria Escherichia coli. A caracterização do gene permitiu identificar esta enzima como membro da família glicosídeo hidrolase 5 (GH5), nomeada neste estudo como Mh_GH5. A enzima apresenta na região N-terminal um módulo de ligação ao substrato (CBM) pertencente a família 1. As enzimas expressas em P. pastoris e em E. coli foram purificadas e submetidas à caracterização bioquímica. A caracterização bioquímica demonstrou que as enzimas recombinantes apresentaram ótimos de temperatura de 55°C (P. pastoris) e 60°C (E. coli) e pH ótimo de 4,0 para ambos os sistemas heterólogos. A análise da estabilidade das enzimas demonstrou que as enzimas expressas por Pichia pastoris apresentaram-se estáveis em temperaturas mais elevadas (70°C), indicando que a glicosilação teria papel essencial na termoestabilidade de enzimas recombinantes. A determinação estrutural em alta resolução foi realizada para o domínio catalítico desta nova β-1,4-endoglucanase GH5 de M. heterothallica expressa em E. coli. A estrutura foi determinada à 1.1 Å e apresenta uma arquitetura frequentemente encontrada dentre os membros da família de GH5, (β/α)8 TIMbarrel. Os dados obtidos neste estudo podem contribuir para a determinação de características envolvidas na termoestabilidade de enzimas provenientes de... / Abstract: Thermophilic microorganisms have gain attention in the last years because of the biotechnological interest. Essentially these organisms secrete thermostable proteins displaying suitable features, such as biochemical and structural, for industrial platforms. The thermophilic fungus Myceliophthora heterothallica F.2.1.4, isolated from poultry litter, showed high activity for β-1,4- endoglucanase (31 U/ml). A new sequence enconding for glycoside hydrolase was identified and expressed in Pichia pastoris and Escherichia coli. Sequence analysis allowed to classify this new β-1,4-endoglucanase as a member of the glycoside hydrolase 5 (GH5). The enzyme, named Mh_GH5, has N-terminal family 1 carbohydrate binding module (CBM1). The recombinant enzymes expressed in Pichia pastoris and Escherichia coli were purified and subjected to biochemical characterization. Recombinant endoglucanases showed optimal temperature of 55°C (P. pastoris) and 60°C (E. coli) and optimal pH of 4,0 for both heterologous systems. The thermostability of these new enzymes were evaluated and demonstrated that post-translational modifications, such as glycosylation, found on Pichia pastoris heterologous enzymes, contributed to higher thermostability. Structural analysis of the catalytic domain of the new GH5 from M. heterothallica expressed in E. coli was solved at 1.1 Å resolution and shows a common (β/α)8 TIM-barrel fold found in members of GH5 family. Based on the biochemical and structural information we have obtained for Mh_GH5 it is possible to suggest potential features involved in the thermostability of proteins from thermophilic microorganisms and might contribute for the development of new efficient biocatalysts required for biomass conversion to bioethanol and/or ... / Doutor

Orientador: Roberto da Silva / Coorientador: Eduardo de Aquino Ximenes / Banca: Eleni Gomes / Banca: Michel Brienzo / Banca: Sarita Candida Rabelo / Banca: Maurício Boscolo / Resumo: A necessidade de mitigação dos efeitos adversos resultantes da industrialização nos últimos três séculos é evidente e representa hoje um dos maiores desafios para a continuidade do desenvolvimento econômico sustentável. A produção de biocombustíveis a partir de resíduos lignocelulósicos opõe-se ao modelo extrativista de recursos fósseis e oferece uma alternativa de energia limpa e renovável para os combustíveis líquidos. Esta tese apresenta uma proposta de produção de etanol de segunda geração a partir de bagaço de cana-de-açúcar utilizando uma combinação dos pré-tratamentos ozonólise e hidrotérmico. O bagaço gerado apresentou propriedades químicas e estruturais favoráveis à hidrólise enzimática e fermentação alcoólica requeridas para a síntese de etanol por rota bioquímica. Os efeitos de deslignificação e solubilização da hemicelulose foram potencializados pela combinação de ozonólise ao pré-tratamento hidrotérmico, gerando uma biomassa com baixa quantidade de hemicelulose residual (4%), porcentagem mediana de lignina (14%) e enriquecida com até 80% de celulose de fácil digestibilidade por enzimas comerciais celulolíticas, acumulando mais de 50 g.L-1 de glicose a partir de 100 g.L-1 de bagaço, ou seja, com rendimento de cerca de 67% de conversão de glucana. O meio de cultivo hidrolisado foi fermentescível por leveduras industriais Saccharomyces cerevisiae com eficiência de fermentação superior a 90%. A combinação dos pré-tratamentos sobre o bagaço gerou um licor rico em... / Abstract: Mitigation of negative effects accumulated from industrialization in the last three centuries is nowadays demanded and it is one of the biggest challenges to support a sustainable economic development. Production of biofuels from lignocellulosic residues opposes to the traditional extractive model from fossil sources and it offers an alternative of clean and renewable liquid fuels. This thesis shows a proposal for production of second-generation ethanol from sugarcane bagasse by combining ozonolysis and hydrothermal pretreatments. The pretreated bagasse showed chemical and structural properties favorable to enzymatic hydrolysis and suitable for alcoholic fermentation required for the synthesis of ethanol by biochemical route. Effects on delignification and hemicellulose solubilization were potentiated by the combination of ozonolysis to hydrothermal process, generating a biomass with a low amount of residual hemicellulose (4%), medium composition of lignin (14%), and enriched to 80% of cellulose of high digestibility by commercial cellulolytic enzymes, reaching more than 50 g.L -1 of glucose from 100 g.L -1 of pretreated bagasse. It achieved around 67% of glucan conversion yield. The hydrolysate medium was fermentable by industrial yeasts Saccharomyces cerevisiae with fermentation efficiency up to 90%. The combination of pretreatments also generated a xylose-rich by-product (liquor), which was compatible with C5-yeasts and filamentous fungi cultivation as a substrate for ... / Doutor