Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T23:27:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_GlauciaMonteirode_D.pdf: 5895408 bytes, checksum: d8d1c3aefc773dd3b960ee6aa1bdd0bd (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A esclerose múltipla é doença inflamatória crônica do sistema nervoso central (SNC), na quallinfócitos T auto-reativos voltam-se contra os antígenos da mielina. A doença caracteriza-se por surtos e remissões, que levam a deficiências neurológicas irrecuperáveis. A resposta inflamatória aberrante sugere etiologia autoimune para esclerose múltipla, durante a qual, acredita-se que linfócitos T CD4+ ativados contra antígenos da mielina atravessem a barreira hematoencefálica (BHE), iniciando reação imunológica, seguida de indução e liberação de citocinas, produção de anticorpos e ativação de células da micróglia e astrócitos. Por apresentar inúmeras similaridades com a esclerose múltipla, a encefalomielite experimental autoimune (EAE), tem sido usada como modelo experimental para o estudo desta doença. A EAE pode ser facilmente induzida utilizando-se proteínas da mielina na Indução Ativa, ou infundindo-se linfócitos T reativos contra estas proteínas na Transferência Adotiva. Assim como observado na esclerose múltipla, linfócitos T CD4+ são as células efetoras na EAE, liberando citocinas e recrutando outras células do sistema imunológicopara o ataque ao sistema nervoso central. Neste processo, citocinas têm papel preponderante na modulação da EAE, fornecendo os sinais necessários para ativar linfócitosT específicos para auto-antígenos. Dada sua natureza neurotrófica e imunomodulatória, tem sido proposto o uso de angliosídeos na redução das conseqüências deletérias de várias doenças neurodegenerativas e de origem autoimune. Os gangliosídeos possuem atividades imunomodulatórias múltiplas diminuindo respostas linfoproliferativas e modulando a produção de citocinas. No presente trabalho, utilizando-se ratos da linhagem Lewis no modelo da EAE aguda, foram avaliados os efeitos da administração de gangliosídeos na alteração do perfil de expressão de citocinas Th1 para Th2/Th3 e na indução de apoptose em células esplênicas e medula espinhal respectivamente, durante os sinais clínicos e após a recuperação da doença. Os resultados demonstram que o grupo tratado com gangliosídeos exibe doença moderada, com a expressão gênica de IFN-y diminuída e de TGF-beta elevada, sugerindo que os gangliosídeos estudados possam modular a síntese de citocinas Th1, alterando o perfil para o fenótipoTh2/Th3. Por sua vez, esta alteração do perfil de citocinas pode regular moléculas relacionadas à apoptose, fornecendo evidências que os gangliosídeos diminuam a expressão in vivo de Bcl-2 e Bcl-W, juntamente com o aumento da expressão gênica de Fas e FasL / Abstract: The multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (SNC), which autoreactive T cells drive immune response against myelin antigens. The relapses and remissions of the disease are responsible for the permanent neurological deficits. The observation of an aberrant inflammatory response against myelin epitopes suggests autoimmune etiology for multiple esclerosis. During the inflammatory process, CD4 T cells activated against myelin antigens cross the blood-brain barrier (BBB) beginning an autoimmune reaction, followed by the release of cytokines, antibodies production and activation of the microglia and astrocytes. By present similarities with the multiple sclerosis, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), has been used as experimental model for the study of multiple sclerosis pathology. EAE can be actively induced with myelin proteins, or by infusion of T cells driven against these proteins in the adoptive transfer. As observed in the multiple sclerosis, CD4+T Iymphocytesare the effector cells that release cytokines and recruit other immune cells for the attack to the central nervous system. In this process, cytokines has a crucial role in the EAE modulation, supplying the signs to activate autoreactive T cells. By their neurotrophic and immunomodulatory properties gangliosides have been proposed to reduce deleterious consequences of many neurodegenerative and autoimmune diseases. In the present work, the effects of gangliosides were tested on the switching of Th1 to Th2/Th3 cytokine expression and apoptosis induction, in spleen cells and spinal cord respectively, from Lewis rats on the acute EAE, during clinical signs and after recovery from the disease. The results demonstrate that the group treated with gangliosides show mild disease, with low expression of IFN-gamma mRNA and high TGF-beta mRNA expression, suggestíng that the gangliosides may modulate Th1 cells by the shifting the profile to the Th2/Th3 phenotype. Moreover, the results demonstrate that ganglioside treatment leads to an increase in TGF-beta levels in brain and spleen cells, together with an increase in Fas and FasL mRNA expression.These results provide the evidence that the ganglioside action on the Bcl- 2, Bcl-W, Fas, and FasL expression is associated with cytokine modulation / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Clínica Médica

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:14:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2680_1.pdf: 1987756 bytes, checksum: fdd0f79604394508bc5200c1a773e36e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A radiossensibilidade individual é reconhecida como um importante fator biológico que contribui de maneira significativa na resposta aos danos radioinduzidos em tecidos e células do organismo. Entretanto, os eventos moleculares associados à radiossensibilidade individual ainda são pouco conhecidos. Dessa maneira, o estabelecimento de uma correlação entre as expressões moleculares e a radiossensibilidade individual poderão contribuir para o aprimoramento de pesquisas cujo objetivo seja a definição de diferentes graus de sensibilidade humana à irradiação. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi analisar parâmetros moleculares que caracterizam a apoptose em linfócitos humanos irradiados in vitro, avaliando seu potencial para estimação de radiossensibilidade individual. Para tal, amostras de sangue periférico de 12 voluntários foram coletadas e alíquotas foram irradiadas (fonte 60Co) individualmente com diferentes doses. Células mononucleares foram isoladas, processadas e mantidas com ou sem cultivo celular (com ou sem estímulo mitótico pela fitohemaglutinina-PHA). Com auxílio da citometria de fluxo, quantificou-se nos linfócitos a expressão da fosfatidilserina na membrana plasmática, bem como a expressão das proteínas caspase-3 ativa e p53. Verificou-se que os linfócitos irradiados com diferentes doses e cultivados por diferentes tempos apresentam uma resposta apoptótica do tipo dosedependente, com aumento dos níveis de apoptose nas células estimuladas com PHA. Para os linfócitos não estimulados com PHA, verificou-se que o fenômeno de apoptose em sua fase tardia é predominante. Correlações positivas foram observadas entre a apoptose radioinduzida e os níveis de expressão dos marcadores protéicos investigados. Os maiores níveis de caspase- 3 ativa e p53 foram encontrados nos linfócitos irradiados; dos quais os linfócitos estimulados com PHA apresentaram maiores níveis de expressão protéica. Adicionalmente, contatou-se que dentre as amostras irradiadas, a p53 é expressa tanto em linfócitos quiescentes quanto em linfócitos proliferantes. Os resultados deste estudo indicaram a existência de uma forte correlação entre a quantificação das moléculas que caracterizam a apoptose e a radiossensibilidade de linfócitos

Le CD95 appartient à la famille du TNF-R. Il est capable de déclencher un signal apoptotique et joue un rôle prépondérant dans le maintien de l’homéostasie du système immunitaire et dans l’élimination de cellules infectées ou transformées. Suite à la fixation de son ligand le CD95L ou d’un anticorps agoniste, le CD95 recrute la protéine FADD, qui à son tour agrège les caspases initiatrices (i.e., caspase -8 et -10). Le complexe formé par le CD95, FADD et les caspases -8/10 est appelé DISC, pour Deah Inducing Signaling Complex. Une fois le DISC formé, l’agrégation des caspases initiatrices entraîne leur activation, et la mort de la cellule par apoptose. Ce signal médié par CD95, peut être modulé par la distribution ou l’exclusion du récepteur vis à vis des microdomaines membranaires ou radeaux lipidiques. Ces domaines de la membrane plasmique sont des structures membranaires enrichies en sphingolipides et cholestérol. La relocalisation de CD95 dans ces radeaux lipidiques permet d’amplifier le signal de mort. L’activation de la voie phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt, est connue pour sa capacité à protéger les cellules tumorales du signal apoptotique médié par CD95, et à induire des mouvements latéraux de CD95 à la membrane. Nos travaux montrent que l’inhibition de la voie PI3K/Akt induit i) la relocalisation du CD95 dans les microdomaines et ii) l’induction du signal apoptotique CD95 indépendamment de la présence du ligand CD95L. Ainsi, nous mettons en évidence que la voie PI3K/Akt est capable d’augmenter le seuil d’activation du signal CD95 en agissant en amont de la formation du DISC ou de l’interaction CD95/CD95L, en maintenant le récepteur exclu des microdomaines. / CD95 belongs to the TNF-R superfamily, and it triggers an apoptotic signal. CD95 plays a key role in homeostasis of the immune system and in the elimination of infected and transformed cells. Upon CD95L binding, CD95 recruits FADD, which in turn aggregates initiator caspases (i.e., caspase-8 and -10). The complex CD95, FADD and caspase-8/10 is called DISC for Death Inducing Signaling Complex. At the DISC level, caspase aggregation leads to their activation and death of the cells through apoptosis. The CD95-mediated apoptotic signal is modulated by microdomains, or lipid rafts, which are plasma membrane sub-domains enriched in sphygolipids and cholesterol. Thereby, partition of CD95 into lipid rafts promotes the apoptotic signal. Activation of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway is known to prevent the CD95-mediated apoptotic signal in malignant cells, and to control lateral mobility of CD95 at the plasma membrane. Herein, we showed that inhibition of PI3K signal induced i) the distribution of CD95 into lipid rafts and ii) the subsequent induction of the CD95-mediated apoptotic signal through a CD95L independent manner. In conclusion, we pinpointed that PI3K/Akt signaling pathway inhibits the CD95 signal by acting upstream DISC formation and even upstream the CD95-CD95L interaction through the exclusion of the death receptor from the microdomains.

Evidências sugerem o envolvimento de mecanismos de resiliência celular, estresse e de alterações epigenéticas na patofisiologia dos transtornos de humor, como o transtorno bipolar (TB) e o transtorno depressivo maior. Os estudos apresentados nesta tese tiveram como objetivo explorar esses mecanismos de forma translacional, partindo da avaliação da morte e sobrevivência celular até a correlação dos achados com a resposta ao tratamento. O primeiro capítulo se propôs a revisar dados da literatura com relação à progressão do TB, os quais apontam para uma série de alterações biológicas envolvendo resiliência celular em pacientes com diferentes estágios do transtorno. O segundo capítulo teve como objetivo avaliar parâmetros de morte celular em pacientes com TB, onde um aumento na frequência de células em apoptose inicial foi detectado em comparação a controles. Em seguida, considerando os efeitos potenciais dos glicocorticóides na indução de apoptose, o terceiro capítulo avaliou a atividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) em pacientes com TB, seus irmãos e em controles saudáveis, além de mecanismos moleculares associados ao eixo. Nossos resultados sugerem uma disfunção do eixo HPA em pacientes associada a uma hiporresponsividade do receptor de glicocorticóide, maiores níveis da proteína ligante de FK506 de 51 kDa (FKBP51) e um aumento da metilação do gene FKBP5. Nós ainda observamos que os pacientes com maior número de episódios apresentaram uma disfunção do eixo mais pronunciada do que aqueles em estágio inicial. No quarto e último capítulo nós realizamos um estudo para verificar os mecanismos moleculares pelos quais o estresse pode induzir alterações epigenéticas envolvendo a metilação do DNA, onde descrevemos o efeito oposto das cochaperonas FKBP51 e FKBP52 sobre a fosforilação da enzima DNA metiltransferase 1 (DNMT1). Além disso, a redução da fosforilação da DNMT1 correlacionou-se com uma melhor resposta clínica ao tratamento em pacientes com transtorno depressivo maior. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a resiliência celular, a resposta ao estresse e a metilação do DNA desempenham importantes papéis na patofisiologia, progressão e resposta ao tratamento de pacientes com transtornos de humor. Novos tratamentos com alvo em mecanismos epigenéticos, na modulação do receptor de glicocorticóide e no aumento da resiliência celular devem ser priorizados em estudos futuros. / Evidence suggests the involvement of cellular resilience mechanisms, stress, and of epigenetic alterations in the patophysiology of mood disorders, such as bipolar disorder (BD) and major depressive disorder. The studies presented in this thesis aimed at exploring these mechanisms in a translational fashion, going from the assessment of cellular death and survival to the correlation of findings with the response to treatment. The first chapter aimed at reviewing data from the literature regarding the progression of BD, which point to a series of biological alterations involving cellular resilience in patients at different stages of the disorder. The second chapter aimed at assessing cell death parameters in patients with BD, in which a higher frequency of cells in early apoptosis was detected when compared to controls. In addition, considering the potential effects of glucocorticoids in the induction of apoptosis, the third chapter assessed the activity of the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis in patients with BD, their siblings, and in healthy controls, in addition to the molecular mechanisms associated with the axis. Our results suggest a dysfunction of the HPA axis in patients associated with a hyporesponsiveness of the glucocorticoid receptor, increased FK506-binding protein of 51 kDa (FKBP51) levels, and increased methylation levels at the FKBP5 gene. We also noted that patients with a greater number of previous episodes presented a more pronounced dysfunction of the axis when compared to early-stage patients. In the fourth and last chapter we performed a study to verify the molecular mechanisms by which stress can induce epigenetic alterations involving DNA methylation, where we describe opposing effects of the cochaperones FKBP51 and FKBP52 on DNA methyltransferase 1 (DNMT1) phosphorylation. In addition, the reduction of DNMT1 phophorylation was correlated with a better clinical response to treatment in patients with major depressive disorder. In summary, the results of this thesis suggest that cellular resilience, response to stress and DNA methylation play key roles in the pathophysiology, progression and response to treatment in patients with mood disorders. Novel treatments targeting epigenetic mechanisms, the modulation of the glucocorticoid receptor, and enhancing cellular resilience should be prioritized in future studies.

Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T17:05:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Boechat_LuisHenriqueBarbosa_D.pdf: 2592935 bytes, checksum: cb27a12bf515a7b021e28e8ccb0cc6b1 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Os camundongos NOD (non obese diabetic) representam modelo experimental estabelecido para o estudo de diabetes mellttus tipo 1, onde permitem o acompanhamento detalhado da evolução dos processos imunológicos que antecedem a expressão clínica da doença. Entretanto, estes animais desenvolvem outras manifestações auto-imunes como adenosialite, anemia hemolítica, paratiroidite e tiroidite espontâneas. Resultados publicados a partir da década de 1990 demonstraram que os camundongos NOD, quando submetidos a excesso de iodo após período de baixa oferta dietética deste elemento em associação com drogas antitíroidianas, desenvolvem forma de tiroidite auto-imune similar à tiroidite de Hashimoto em humanos. Este processo, dependente da oferta excessiva de iodo, é acompanhado do aumento dos níveis séricos de auto-anticorpos antitiroidianos e se mantém indefinidamente, ao contrário do que se observa nos modelos clássicos de tiroidite experimental induzida em outras linhagens. Há várias décadas, o iodo tem sido correlacionado com o aumento da expressão de tiroidite de Hashimoto em regiões com programa de suplementação deste mineral. Paralelamente, resultados oriundos de diversos grupos de pesquisa apontam este elemento como um possível indutor de morte celular programada (apoptose), embora o mecanismo envolvido ainda esteja em discussão. Neste trabalho, submetemos camundongos NOD machos à sobrecarga de iodo (20 fxg/animal/dia) após tratamento com metimazole. A expressão dos genes responsáveis pela síntese de Fas, Fas-ligante, BCL-w, TNF-a, INF-y, IL-2, IL-4, IL-10 e IL-12 (cadeias p35 e p40), 24h após a retirada do iodo e na 32a semana de vida foi avaliada por abordagem semi-quantitativa. Adicionalmente, realizamos a observação morfológica e marcação das subpopulações de linfócitos T envolvidas no infiltrado linfo-plasmocitário. Observamos que todos os animais submetidos a este protocolo apresentavam na 32ª semana de vida infiltrado inflamatório englobando folículos tiroidianos em desestruturação. Entretanto, a extensão do infiltrado variava entre os animais deste grupo, sendo mais intenso em 2/5 dos animais estudados. A avaliação semi-quantitativa da expressão de RNA mensageiro de Fas-ligante, BCL-w e TNF-a evidenciou aumento da sinalização destes componentes de apoptose nos animais submetidos à sobrecarga de iodo 24 horas após a administração da última dose. A expressão de IL-12p40 e p35 foi detectada em todos os grupos experimentais e, embora não houvesse diferenças estatísticas, apresentou tendência à elevação nos animais com 32 semanas. IFN-y estava presente de forma isolada em 2/5 dos animais do grupo controle com 32 semanas e em 1/5 do grupo controle com metimazole em 10 semanas. O produto do gene para lL-2 expressou-se em 3/5 dos animais do grupo controle com 32 semanas. Por outro lado, não observamos expressão do RNA mensageiro para iL-4, enquanto a presença de IL-10 foi constatada em baixa intensidade apenas em animais com 32 semanas. Estes dados, tomados em conjunto, sugerem a predominância de resposta com fenótipo Th1 nas tiróides destes animais. A análise das respostas individuais dos camundongos NOD estudados evidencia níveis distintos de resposta para sinalização de Fas-L, BCL-w, TNF-a e IL-12 no grupo de animais submetidos à sobrecarga de iodo e sacrificados após 24 horas (grupo MI44D). O mesmo padrão de resposta foi observado no grupo controle de 32 semanas (grupo C32) tardio em relação à expressão de IL-12. Concluímos que o iodeto de potássio, nas condições experimentais aqui utilizadas, é capaz de promover a intensificação da tiroidite auto-imune nos camundongos NOD, favorecendo o surgimento de processo inflamatório que resulta em destruição folicular. Este padrão, é precedido por aumento na sinalização de Fas-L e BCL-w e tendência de elevação na expressão de TNF-a. nos animais sacrificados imediatamente após a retirada do iodo. A IL-12, citocina característica da resposta Th1, esteve presente em todos os grupos experimentais, com tendência à elevação nos animais mais velhos que apresentam processo inflamatório organizado. Nossos resultados sugerem que os camundongos NOD de nossa colônia têm dois padrões de resposta a este modelo experimental, havendo maior sinalização da expressão de componentes de apoptose (Fas-L, BCL-w e TNF-a) e IL-12 em alguns indivíduos. Desta forma, estes padrões permitirão iniciar processo de detecção de subgrupo de camundongos NOD capaz de responder à sobrecarga de iodo com apoptose e desencadeamento de tiroidite análoga à tiroidite de Hashimoto. / Abstract: NOD (non obese diabetic) mice is an established experimental model for diabetes, allowing detailed observation of immune processes that are developed before the onset of clinical expression of the disease. However, these animals also present other spontaneous autoimmune manifestations such as sialitis, hemolytic anemia, parathyroiditis and thyroiditis. Studies published during the last decade showed that NOD mice, when submitted to iodine excess after a goitrogenic period induced by low iodine diet in association with anti-thyroid drugs, develop autoimmune thyroiditis that resembles human Hashimoto's thyroiditis. This process is dependent on the excessive offer of iodine, is accompanied by the rise of serum levels of anti-thyroid antibodies and is maintained indefinitely, in contrary with what is observed in classic models of experimental thyroiditis induced in other mice strains. Iodine has been correlated for many decades with the rise in prevalence of Hashimoto's thyroiditis in regions where its supplementation has been introduced. By the other side, results presented by many research groups have pointed to this element as a possible inducer of apoptosis. In this study we have evaluated thyroid response in male NOD mice to iodine overload after treatment with methimazole during 6 weeks, focusing the expression of Fas, Fas-ligand, BCL-w, TNF, y-IFN, IL-2, \L-A, IL-10 and p35 and p40 chains of IL- 12 24h after iodine overload and at 32nd week of life. We have also observed the subpopulations of T helper lymphocytes present in inflammatory infiltrate. We have observed that all animals submitted to the protocol above have presented organized inflammatory infiltrate in week 32 with thyroid follicles being destroyed. Nevertheless, the extension of infiltrate varied among animals in this group, being more intense in 2/5 animals. Semi-quantitative analysis of expression of messenger RNA for Fas-ligand, BCL-w and TNF have shown the rise in signalization in NOD mice that received iodine overload (24 hours after), suggesting that this element is involved apoptosis induction. Expression of IL12p40 and IL12p35 was detect in all experimental groups and, although we have not observed statistical differences, this expression presented a tendency of elevation in animals with 32 weeks of life. y-IFN was present in only 2/5 in controls at 32nd week and 1/5 in controls receiving methimazole at 10th week. The product of the gene for IL-2 was expressed in 3/5 animals in control group with 32 weeks. By the other side, messenger RNA for IL-4 was not observed in animals studied herein, while IL-10 have been expressed with low intensity in animals with 32 weeks of life. These data suggest the predominance of Th1 response in these animals. Analysis of individual responses in NOD mice studied have evidenced distinct levels of signalization for Fas-ligand, BCL-w, TNF and IL-12 in those submitted to iodine overload and sacrificed after 24 hours (group M144D). The same pattern of response was detected in control group with 32 weeks of life (group C32) in relation to the expression of IL-12. We suggest that potassium iodide, used in the conditions detailed above, can intensify thyroiditis in NOD mice, favoring the inflammatory process that leads to follicular destruction. This is preceded by the rise in expression of Fas-ligand and BCL-w and probably by TNF. IL-12, a cytokine characteristic of Th1 response, was present in all thyroid specimens studied, with tendency to elevation in older animals, that also present organized inflammatory infiltrate. NOD mice in our colony have two different patterns of response in this experimental model, with higher levels of signalization of apoptosis and IL-12 in some animals. These results will allow the detection of this subgroup of NOD mice that can respond more appropriately to iodine overload and are, probably, more prone to the development of autoimmune thyroiditis. / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Raquel Franco Leal, Luciana Rodrigues de Meirelles / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T15:37:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_CileneBicca_D.pdf: 2833344 bytes, checksum: 59a00c2b42daf6d300e935a2d91f6368 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A doença de Crohn (DC) está associada com as vias patogênicas complexas envolvendo alterações nos mecanismos de apoptose. Recentemente, o tecido adiposo mesenterial (TAM) tem sido associado com a etiopatogenia DC, uma vez que é verificado um aumento da espessura do tecido adiposo mesenterial e envolvimento circunferencial da alça intestinal próximo à área intestinal afetada. Entretanto, não há estudos do mecanismo de apoptose no TAM na DC. Desta forma, o objetivo desse estudo foi avaliar apoptose na mucosa intestinal e no TAM de pacientes com DC, além de correlacionar estes achados com o estudo morfométrico dos adipócitos neste tecido. Casuística e Métodos: Foram estudadas amostras de mucosa intestinal e TAM de 10 pacientes com DC ileocecal e de 8 pacientes sem doenças inflamatórias intestinais (controles). A apoptose foi avaliada pelo ensaio de TUNEL e correlacionada com a análise histológica e morfométrica dos adipócitos. Determinou-se a análise transcripcional e proteica de uma seleção de genes e proteínas relacionadas com o mecanismo de apoptose. Resultados: O ensaio de TUNEL mostrou menor número de células em apoptose na DC, quando comparado com os grupos controles, tanto na mucosa intestinal quanto no TAM. Além disso, o número de adipócitos em apoptose (TUNEL) correlacionou significativamente com a área e perímetro destas células. A análise transcripcional e proteica revelaram níveis de transcritos e de proteína Bax significativamente mais baixos na mucosa intestinal de DC, em comparação com os respectivos controles; sendo que os baixos níveis de Bax foram encontrados na lâmina própria e não no epitélio intestinal; não houve diferença na expressão de Bax no TAM. Além disso, maior nível de Bcl-2 e baixo nível de Caspase 3 foram vistos no TAM de pacientes com DC. Conclusão: A alteração da apoptose no TAM pode explicar as características morfológicas singulares deste tecido na DC, que podem estar implicadas na fisiopatologia da doença / Abstract: Crohn¿s disease (CD) is associated with complex pathogenic pathways involving defects in apoptosis mechanisms. Recently, mesenteric adipose tissue (MAT) has been associated with CD ethiopathology, since adipose thickening is detected close to the affected intestinal area. However, there are no studies concern apoptosis pathways in MAT of CD. Therefore, the aim of this study was to evaluate apoptosis in the intestinal mucosa and MAT of patients with CD, besides to correlate these findings with the morphometricstudy of the adipocytes from MAT.Patients and Methods: Samples of intestinal mucosa and MAT from 10 patients with ileocecal CD and from 8 non-inflammatory bowel diseases patients (controls) were studied. Apoptosis was assessed by TUNEL assay and correlated with the adipocytes histological morphometric analysis. The transcriptional and protein analysis of selected genes and proteins related to apoptosis were determined. Results: TUNEL assay showed fewer apoptotic cells in CD, when compared to the control groups, both in the intestinal mucosa and in MAT. In addition, the number of apoptotic cells (TUNEL) correlated significantly with the area and perimeter of the adipose cells in MAT. Transcriptomic and proteomic analysis reveal a significantly lower transcript and protein levels of Bax in the intestinal mucosa of CD, compared to the controls; low protein levels of Bax were found localized in the lamina propria and not in the epithelium of this tissue. Furthermore, higher level of Bcl-2 and low level of Caspase 3 were seen in the MAT of CD patients. Conclusion: The defective apoptosis in MAT may explain the singular morphological characteristics of this tissue in CD, which may be implicated in the pathophysiology of the disease / Doutorado / Fisiopatologia Cirúrgica / Doutora em Ciências

Die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Apoptose stellt einen zentralen Baustein in der Pathogenese von Tumorerkrankungen dar. cFLIP inhibiert rezeptornah die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose und spielt somit eine bedeutende Rolle als Regulator der Apoptose. Eine verstärkte Expression von cFLIP kann folglich hinweisend auf eine Fehlregulation der Apoptose bei der Entstehung und Progression von Tumoren sein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von cFLIP in kutanen epithelialen und melanozytären Tumoren mit formalinfixierten und paraffinierten Gewebeproben untersucht. Bei der zunächst durchgeführten Charakterisierung der käuflich erhältlichen monoklonalen cFLIP-Antikörper mittels cFLIP-überexprimierenden HaCaT-Keratinozyten wurde überraschenderweise die fehlende Spezifität eines Antikörpers (KlonEPR8438(2)) nachgewiesen, was zur Folge hatte, dass der Hersteller die Produktion nach Mitteilung der Befunde eingestellt hat. Daher wurden die weiteren Untersuchungen unter Verwendung des Antikörper-Klons G11, der sowohl im Western Blot als auch immunhistochemisch die beiden cFLIP-Splicevarianten cFLIPL und cFLIPS spezifisch nachweist, durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass cFLIP in epithelialen Hauttumoren in erheblichem Maß exprimiert wird. In jeweils 40% der untersuchten aktinischen Keratosen und Morbi Bowen konnte cFLIP nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu zeigte sich in den fortgeschrittenen Formen epithelialer Hauttumoren eine deutlich höhere Expressionsrate. Eine Expression wiesen zudem 100% der untersuchten Keratoakanthome und 95% der Plattenepithelkarzinome (mit überwiegend gutem Differenzierungsgrad) auf. Dementsprechend war es nicht verwunderlich, dass alle untersuchten Metastasen von Plattenepithelkarzinomen cFLIP überexprimierten. Die Analyse melanozytärer Läsionen ergab, dass cFLIP in melanozytären Nävi wie auch superfiziell spreitenden Melanomen, Lentigo-maligna-Melanomen und akral lentiginösen Melanomen nur in einer sehr geringen Anzahl der untersuchten Präparate überexprimiert wurde. Erstaunlicherweise konnte jedoch in 65% der nodulären Melanome sowie in 60% der Melanommetastasen cFLIP nachgewiesen werden. Bezüglich der Expression von cFLIP im Primärtumor sowie der Metastase desselben Patienten konnte kein eindeutiger Trend festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die frühe Hemmung des extrinsischen Apoptoseweges durch das antiapoptotische Protein cFLIP an der Entstehung, dem Wachstum und möglicherweise der Metastasierung epithelialer Hauttumore beteiligt sein dürfte. Die auffallend hohe Expressionsrate im nodulären Melanom sowie den untersuchten Melanommetastasen könnte einen zukünftigen therapeutischen Angriffspunkt darstellen. / It is already known, that cFLIP is an effective inhibitor of death receptor-mediated apoptosis. Due to its ability to block one of the most proximal steps of the extrinsic apoptotic cascade, every kind of dysregulation concerning cFLIP may have serious consequences for tissue homeostasis. Therefore, it is possible that cFLIP-mediated prevention of death receptor-mediated apoptosis represents one critical step during the development of malignancy. In the present study, the expression of cFLIP was examined by immunohistochemistry in a panel of 110 epithelial and 140 melanocytic skin lesions. Therefore, we used the purchased monoclonal mouse antibody clone G11 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg). cFLIP expression was undetectable in all analyzed basal cell carcinomas, whereas both actinic keratosis and Bowen’s disease (8/20 (40%)) were positive for cFLIP. Consistent to previous data, all 20 (100 %) keratoacanthomas were positive for cFLIP, too. Furthermore, almost all (19/20 (95%)) squamous cell carcinomas were positive for cFLIP as well as 10/10 (100 %) metastases of squamous cell carcinomas. Melanocytic nevi expressed cFLIP (7/20 (35 %)). In Melanoma, cFLIP expression was different in melanoma subtypes and type of tissue. While only 15% of superficial spreading melanomas and 10 % of lentigo-maligna melanomas were positive, 25% of acral lentiginous melanomas were positive for cFLIP expression. The majority (13/20 (64 %)) of nodular melanomas and of melanoma metastases (12/20 (60 %)) were positive for cFLIP. Additionally, we examined cFLIP expression in ten primary melanomas as well as one of their regional lymph node/skin metastases. Due to the small sample size and the heterogeneity of analyzed primary melanomas/metastases a connection between expression of cFLIP in primary tumors and metastases could neither be proved nor denied and needs to be elucidated in more detail. In conclusion, our study confirms that cFLIP expression is selectively detected in different melanocytic and epithelial skin lesions. In respect to the high proportion of melanoma metastase and metastases of squamous cell carcinomas, our findings demonstrate that cFLIP may be implicated in tumor development and progression and therefore could serve as a biomarker or as a target for future therapies.

Le gène rb est le premier suppresseur de tumeur découvert chez l’homme. Il prévient l’apparition de tumeurs notamment en régulant négativement le cycle cellulaire. Le rôle de pRb dans le contrôle de l’apoptose est plus complexe et les mécanismes moléculaires contrôlés par ce facteur de transcription ne sont pas complétement élucidés. Il existe un homologue de rb chez la drosophile : rbf1. J’ai contribué à caractériser les évènements mitochondriaux induits au cours de l’activation de l’apoptose par Rbf1 dans le disque imaginal d'aile, un tissu en prolifération de la larve de drosophile. Dans cette voie d’apoptose, la protéine Debcl, seule membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2 chez la drosophile, est activée et induit le recrutement et l’oligomérisation de Drp1, protéine effectrice principale de la fission mitochondriale. C’est ainsi qu’est déclenchée la fragmentation mitochondriale et l’accumulation d’espèces activées de l’oxygène (EAOs) mitochondriales. Ces deux évènements participent à la transmission du signal apoptotique. J’ai par ailleurs pu mettre en évidence l’implication de facteurs participant au maintien du contrôle qualité mitochondriale. Celui-ci s’assure de l’intégrité des mitochondries et, le cas échéant, déclenche la digestion des éléments défaillants par mitophagie. Enfin, j’ai contribué à l’étude des liens entre la traduction et l’apoptose induite par Rbf1. Dans cette étude, nous montrons que la poly-A binding protein (PABP) peut supprimer le phénotype d’encoche induit par Rbf1 chez l’adulte alors que la mort cellulaire induite au cours du stade larvaire n’est pas inhibée mais augmentée. Ces résultats nous ont poussé à étudier les mécanismes de compensation induits par l’appareil traductionnel, ce qui nous a permis de montrer qu'une modulation de la traduction pourrait permettre de compenser la perte de tissu consécutive à l'apoptose induite par Rbf1 sans impliquer une inhibition de l'apoptose. / The gene rb is the first tumor suppressor discovered in humans. Its prevents the appearance of tumors by regulating negatively the cell cycle. The role of pRb in apoptosis is more complex and the molecular mechanisms triggered by this transcription factor are not completely elucidated. There is a rb homologue in drosophila: rbf1. I participated in the characterization of mitochondrial events induced during activation of apoptosis by Rbf1 in a proliferating tissue of this model organism, the wing disc. In this apoptosis pathway, the Debcl protein, the only drosophila pro-apoptotic member of the Bcl-2 family, is activated and induces recruitment and oligomerization of Drp1, the main effector of mitochondrial fission. This triggers the mitochondrial fragmentation and the accumulation of mitochondrial reactive oxygen species (ROS). Both events participate to the transmission of the apoptotic signal. I have also been able to highlight the implication of factors involved in maintaining mitochondrial quality control which ensures the integrity of the mitochondria and, if necessary, triggers the degradation of damaged elements by mitophagy. Finally, I have contributed to the study of the links between translation and apoptosis induced by Rbf1. In this study, we show that the Poly-A Binding Protein (PABP) can suppress the Rbf1-induced notch phenotype in adults while cell death induced during larval stage was not inhibited but increased. These results prompted us to study the compensation mechanisms induced by the translational apparatus, which allowed us to show that a mRNA translation-related mechanism could counteract the loss of tissue resulting from Rbf1-induced apoptosis independently of apoptosis inhibition.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.