Orientador: Julio Lopes Sequeira / Banca: Noeme Souza Rocha / Banca: Renée Laufer Amorim / Banca: Ana Paula F. Bracarense / Banca: Adriana Wanderley Pinho Pessoa / Resumo: O estudo dos linfomas caninos além de abordar a classificação morfológica e imunofenotípica necessita ser ampliado para que se tenha a avaliação da cinética celular. Esta verificação só pode ser feita com segurança quando são avaliados não só os parâmetros que indicam a taxa de proliferação celular, mas também aqueles relacionados a apoptose, bem como a expressão de proteínas responsáveis por este evento. No homem, muitas vezes a determinação da taxa de proliferação e os marcadores de apoptose têm influência preponderante no prognóstico e no tratamento destas neoplasias e o mesmo deve ocorrer nos linfomas caninos, uma vez que os linfomas nesta duas espécies possuem comportamento biológico muito semelhante. Nesta pesquisa, foram utilizados 40 casos de linfomas caninos. Estes foram classificados de acordo com as classificações de Kiel e Working Formulation (WF), e realizada a imunofenotipagem utilizando marcadores para linfócito T (CD3) e para linfócitos B (CD79a). A proliferação celular foi avaliada pelos métodos de contagem dos AgNORs e células imunopositivas para Ki-67 (MIB-1) e o índice apoptótico foi avaliado pela caspase-3. Foi verificada também a expressão do p-53 mutante. De acordo com as classificações de Kiel e WF os linfomas de alto grau foram os mais freqüentes, a imunofenotipagem mostrou a mesma freqüência de linfomas T e B. Quando avaliada a proliferação celular, houve diferença significativa entre os linfomas de alto e baixo grau tanto pelo método do AgNOR como pela expressão do KI-67 (MIB-1), mas sem significância em relação ao imunofenótipo. Entre as neoplasias de alto grau de malignidade a média de número de NORs por núcleo de célula neoplásica foi de 1,37 0,32, e nos casos de baixo grau de 0,98 0,36. De acordo com o KI-67 a média... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lymphoma studies deals with morphological classification and immunophenotypic features, but they have to be amplified for cellular kinetics evaluation. This evaluation can only be safely made, when not only proliferative index are evaluated, but also when apoptosis and some proteins involved in this processes are studied. In men the proliferative index and apoptosis markers have, most of the time, important influence in neoplasia prognosis and treatment, and the same thing should happen with canine lymphoma, once lymphoma in humans and dogs share similarities in biological behavior. In this work it was used 40 canine lymphomas were classified according to Kiel and Working Formulation (WF) methods and immunophenotype was achieved with T lymphocyte marker (CD3) and B lymphocyte marked (CD79a). Cellular proliferation was evaluated by AgNORs and Ki-67 (MIB-1) and apoptotic index by caspase-3. Mutant p-53 expression was also verified. According to Kiel and WF classification system, high grade lymphomas were more frequent and T and B lymphoma showed the same frequency. When cellular proliferation was evaluated, there was a significant difference between high grade and low grade lymphomas by AgNOR and Ki-67 (MIB-1) methods, but did not differ when comparing immunophenotype. Among high grade malignancy lymphomas the NORs medium number per cell nucleoli was 1.37 0.32 and in low grade was 0.98 0.36. Concerning Ki-67 the positive cellular percentual was 43.19% 19.01 e 14.09% 11.74 in high and low grade, respectively. Apoptotic index and p53 expression did not show differences between high and low grade lymphoma, neither when comparing immunophenotype. / Doutor

Orientador: Tereza Cristina Cardoso Silva / Co-orientador: Fábio Erminio Mingatto / Banca: Vera Cláudia Lorenzetti Magalhaes Curci / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Banca: Mário Jefferson Quirino Louzada / Resumo: O herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um α-herpesvirus responsável por uma doença neurológica em bovinos jovens e também, ocasionalmente incriminado em alterações reprodutivas. Apesar de vários estudos descreverem as vias do processo de apoptose induzidos por infecções virais, pertencendo à família Herpesviridae, poucas informações estão disponíveis sobre as vias intrínsecas da morte celular programada em interações entre BoHV-5 e seus hospedeiros. O BoHV-5 foi capaz, no presente estudo, de replicar e de produzir efeitos citopátcos, caracterizados por um aumento e fusão celular, tanto em células mesenquimais como nas epiteliais. Os antígenos virais foram detectados em células infectadas pela reação de imunofluorescência nos períodos pós-infecção (p.i) compreendido 48 à 96 h. De acordo com a observação dos períodos p.i., entre 48 e 72 h sinais intensos de fluorescência foram observados para a proteína anti-apoptótica BCL-2 e comparação à proteína apoptótica Bax. As células infectadas revelaram um aumento do fenótipo BCL-2 entre 48 e 96 h p.i por citometria de fluxo. Entre 48 a 96 h p.i a expressão de RNA mensageiro relacionado a proteína Bax não foi verificada em nenhuma célula infectada. Ao contrário, a expressão do RNA mensageiro relacionado a proteína BCL-2 foi quantificada em Log 10 1,6 x 10 2 cópias de fita complementar de DNA (cDNA) em todos os p.i. O BoHV-5 quando está em fase de replicação nas células mesenquimais parece modular a expressão e respectiva transcrição gênica da proteína BCL-2, no sentido de aumentar a produção de partículas virais / Abstract: Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) is α-herpesvirus responsible for neurological disease in young cattle and also occasionally incriminated in reproductive disorders.In spite of many studies describing the apoptotic pathways induced by viruses belonging to the family Herpesviridae, scare information about intrinsic programmed cell death pathway in host-BoHV-5 interactions is currently available. BoHV-5 was able to replicate and to produce cytopathology characterized by cellular swelling and cell fusion on both mesenchymal and epithelial cell lines. Viral antigens were detected in infected cells by immunofluorescence assay at 48 to 96 h post-infection (p.i.). According to sequential p.i observation, at 48 to 72 h p.i. higher fluorescent signals were visible for anti-apoptotic BCl-2 antigens in comparison to Bax, considered a proapoptotic protein. Infected cells revealed an increase of BCl-2 phenotype population from 48 to 96 h p.i. by flow cytometric analysis. At 48 to 96 h p.i. Bax mRNA was not expressed among of any infected cell monolayers. In contrast, BCl-2 mRNA was quantified Log10 1,6 x 102 cDNA copies at all p.i. for both cells. BoHV-5 replication seems to modulate BCl-2 expression and respective gene transcription in order to enhance production of progeny virus / Doutor

Orientador: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Banca: Ciro Moraes Barros / Banca: José Antônio Visintin / Resumo: O estresse térmico materno compromete a fertilidade de vacas leiteiras. Os oócitos nas fases de vesícula germinativa (VG) e maturação são susceptíveis aos efeitos deletérios causados pelo estresse térmico, entretanto os mecanismos celulares desencadeados pela temperatura elevada são pouco conhecidos. Os danos celulares induzidos pelo estresse térmico podem ser manipulados por amplo espectro de fatores biológicos, incluindo o fator de crescimento semelhante à insulina- I (IGF-I). Dessa forma, os objetivos gerais desta proposta foram caracterizar as alterações celulares e de desenvolvimento induzidas pela temperatura elevada em oócitos na fase de VG e avaliar o papel termoprotetor do IGF-I neste contexto. Para tanto, os experimentos 1 e 2 visaram estabelecer o modelo de bloqueio meiótico in vitro. No primeiro experimento foram avaliadas concentrações crescentes (50; 75; 100; 150 e 200 μM) do bloqueador meiótico roscovitina. A porcentagem de oócitos em VG (taxa de bloqueio meiótico) foi baixa em todas as doses de roscovitina testadas. No segundo experimento foram avaliadas diferentes concentrações de butirolactona (0; 12,5; 25; 50 e 100 μM) em meio de inibição meiótica contendo 0 ou 3 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) na porcentagem de oócitos em VG e na porcentagem de oócitos em metáfase II (taxa de reversão do bloqueio meiótico após a maturação in vitro). A eficiência do bloqueio meiótico foi alta para todas as doses de butirolactona avaliadas, exceto 12,5 μM de butirolactona com BSA. De maneira similar, a porcentagem de oócitos em MII foi alta para todos os tratamentos, exceto para dose de 100 μM de butirolactona sem BSA, indicando possível efeito tóxico desta concentração. Com base nestes resultados o modelo de inibição meiótica utilizado para todos os demais experimentos fez uso... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Maternal heat stress compromises fertility of lactating dairy cows. Germinal vesicle stage (GV) and mature oocytes are susceptible to deleterious effects of maternal heat stress. However, the cellular mechanisms triggered by elevated temperature are not well known. The cellular damage induced by heat stress can be manipulated by a wide range of biological factors, such as insulin-like growth factor-I (IGF-I). Therefore, overall objectives of this proposal were to characterize cellular and developmental changes induced by elevated temperature on GV oocytes and evaluate the role of IGF-I in this context. Experiments 1 and 2 aimed to establish an in vitro meiotic arrest model. The first study evaluated the effect of increasing concentrations (50, 75, 100, 150 and 200 μM) of the meiotic inhibitor roscovitine. The percentage of GV oocytes (rate of meiotic arrest) was low at all roscovitine doses tested. In the second experiment different butyrolactoneconcentrations (0, 12.5, 25, 50 and 100 uM) were evaluated in meiotic inhibition medium containing 0 or 3 mg/mL bovine serum albumin (BSA) in percentage of GV oocytes and percentage of metaphase II oocytes (rate of meiotic arrest reversibly after in vitro maturation). Meiotic arrest efficiency was high for all butyrolactone doses tested, except 12.5 μM butyrolactone with BSA. Similarly, the percentage of MII oocytes was high for all doses, except for 100 μM butyrolactone without BSA, indicating a possible toxic effect of this concentration. Based on these results the meiotic arrest model used for all subsequent experiments used 12.5 μM butyrolactone in the absence of BSA. The third experiment evaluated the effect of various IGF-I concentrations (0, 12.5, 25, 50 and 100 ng/ml) on heat-induced DNA fragmentation on GV oocyte. In the absence of IGF-I, heat shock of 41°C for 14 hours increased... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Juliana Regina Peiró / Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma antropozoonose considerada uma das mais importantes zoonoses parasitárias emergentes em expansão por todo o mundo. A transmissão de Leishmania (L.) chagasi, se dá pela picada de fêmeas de insetos dípteros, denominados flebotomíneos, conhecidos popularmente como mosquitos "palha" ou "birigui". A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença crônica, fatal, sistêmica e infecciosa. No Brasil é causada pelo protozoário L. chagasi. Cães são os maiores hospedeiros e reservatórios do parasita L. infantum e L. chagasi com um papel central no ciclo da transmissão do parasita para os humanos, com um grande contingente de animais assintomáticos. A infecção em cães é clinicamente semelhante à infecção humana e a apoptose tem sido associada à redução de linfócitos T e células mononucleares de sangue periférico e à falha na imunidade, pois ocorre diminuição na secreção do IFN- . A desregulação da apoptose tem sido associada a várias doenças e as principais moléculas implicadas são o sistema FAS/FASL e o TRAIL, que envolvem reações imunológicas e citotoxicidade mediada pelas células T. O entendimento de tal mecanismo em cães infectados pode permitir futuras intervenções terapêuticas para reduzir a depleção dos linfócitos. Para investigar a apoptose nas células CD4+ e CD8+ e a expressão e função dos principais receptores envolvidos no processo apoptótico, FAS/FASL e TRAIL foram avaliados nas células do sangue periférico e baço de 38 cães sintomáticos com leishmaniose visceral moderada e de 25 cães saudáveis. A apoptose das células CD4+ e CD8 + do sangue e baço foi maior nos cães infectados que nos saudáveis. Nas células CD4+ do sangue e baço dos cães infectados a expressão de FAS e FASL foi menor do que a dos saudáveis, nas células CD8+ do sangue e do baço dos cães...(Resumo completo, clicar acesso aletrônico abaixo) / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a anthropozoonosis considered one of the most important emerging parasitic zoonoses expanding worldwide. The transmission of Leishmania (L.) chagasi, occurs through the bite of female insects flies, called sandflies, mosquitoes popularly known as "straw" or "birigui." Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a chronic, fatal, systemic and infectious. In Brazil it is caused by the protozoan L. chagasi. Dogs are the greatest hosts and reservoirs of the parasite L. infantum and L. chagasi with a central role in the transmission cycle of the parasite to humans, with a large contingent of asymptomatic animals. The infection in dogs is clinically similar to human infection and apoptosis has been associated with reduction of T lymphocytes and peripheral blood mononuclear cells and failure to immunity, because there is a decrease in the secretion of IFN- . Dysregulation of apoptosis has been associated with various diseases and key molecules involved are the FAS/FASL and TRAIL, which involve immune reactions and cell-mediated cytotoxicity T. The understanding of this mechanism in infected dogs may allow future therapeutic interventions to reduce the depletion of lymphocytes. To investigate apoptosis in CD4+ and CD8+ lymphocytes and the expression and function of major receptors involved in apoptotic FAS/FASL and TRAIL were assessed in peripheral blood cells and spleen of 38 dogs symptomatic patients with visceral leishmaniasis moderate and 25 healthy dogs. Apoptosis of CD4+ and CD8+ spleen and blood was... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Glioblastoma (GB) é o tumor cerebral maligno mais frequente. O prognóstico para os pacientes é ruim e a sobrevida média após o diagnóstico varia de 6 meses a 1 ano. Isso ocorre devido à ineficácia das estratégias terapêuticas dos tratamentos atuais, pois esses tipos de tumores são altamente invasivos. Deste modo, novas estratégias terapêuticas são necessárias. Neste contexto surge a doxazosina (2 - {4 - [(2,3-dihidro-1,4-benzodioxano-2-il) carbonil] piperazina-1-il} -6,7-dimetoxiquinazolina-4amina, um composto quinazolínico pertencente à classe farmacológica dos antagonistas dos receptores adrenérgicos α1, amplamente utilizada na clínica para o tratamento de pressão arterial elevada, assim como no tratamento de retenção urinária relacionado com a hiperplasia benigna da próstata (BPH). O presente estudo avaliou os efeitos do tratamento com doxazosina em modelos experimentais de gliomas humano (U-138MG) e de rato (C6). Observamos que a doxazosina foi capaz de inibir a viabilidade na linhagem celular de glioma de rato C6. Além disso, o fármaco permaneceu estável no meio de cultura após 48 horas de incubação e foi captado pelas células de glioma C6, não apresentando efeito tóxico sobre as células não tumorais (cultura organotípica e cultura primária de astrócitos) em concentrações inferiores a 250µM. Os resultados mostraram que doxazosina foi capaz de diminuir a densidade celular e induzir a morte celular em ambas as linhagens (U-138MG e C6). Além disso, o fármaco induziu a diminuição da fosforilação das proteínas Akt e GSK-3β em 24 e 48hs de tratamento. São vários os possíveis mecanismos que possam estar associados com a ação da doxasozina, dentre eles apoptose, necrose, senescência e/ou autofagia. / Glioblastoma (GB) is the most frequent and most malignant human brain tumor. The prognosis for the patients with GB remains dismal, as median survival after diagnosis varies from 6 month to 1 year. This is largely due to the inability of current treatment strategies to address the highly invasive nature of this disease. Thus, new therapeutic strategies are needed. Doxazosin (2-{4-[(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2yl)carbonyl]piperazin-1-yl}-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amine, a quinazoline compound, is an selective α1-adrenoceptor antagonists, widely used for treatment of high blood pressure as well as in the treatment of urinary retention related with prostate benign hyperplasia (BPH). Doxazosin α1-adrenoceptor antagonists is a very promissing quinazoline drug, may represent chemical starting points to develop more potent death inducing agents free of α1-adrenoceptor antagonistic action and suitable for cancer treatment with minimal and well-tolerated side effects. Within this context, the present study was designed to evaluate the effects of doxazosin treatment in experimental models of gliomas. Doxazosin was able to viability inhibition of the C6 glioma cell line. Moreover, the drug seems to be stable in the culture medium after 48 hours of incubation and was taken up by C6 glioma cells and showed no toxic effect on non-tumor cells at concentrations below 250µM. The results showed that doxasozin was able to decrease cell density and induce cell death in both lineages. In addition, doxazosin induced the inactivation of Akt and of GSK-3β proteins after 24 and 48 hours. Taken together, our results show that doxazosin was able to significantly induce cells death of both, human and rat glioma lines (U-138MG and C6 respectively). The mechanisms associated with this effect involve apoptosis induction, necrosis, senescence or autophagy.

Evidências sugerem o envolvimento de mecanismos de resiliência celular, estresse e de alterações epigenéticas na patofisiologia dos transtornos de humor, como o transtorno bipolar (TB) e o transtorno depressivo maior. Os estudos apresentados nesta tese tiveram como objetivo explorar esses mecanismos de forma translacional, partindo da avaliação da morte e sobrevivência celular até a correlação dos achados com a resposta ao tratamento. O primeiro capítulo se propôs a revisar dados da literatura com relação à progressão do TB, os quais apontam para uma série de alterações biológicas envolvendo resiliência celular em pacientes com diferentes estágios do transtorno. O segundo capítulo teve como objetivo avaliar parâmetros de morte celular em pacientes com TB, onde um aumento na frequência de células em apoptose inicial foi detectado em comparação a controles. Em seguida, considerando os efeitos potenciais dos glicocorticóides na indução de apoptose, o terceiro capítulo avaliou a atividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) em pacientes com TB, seus irmãos e em controles saudáveis, além de mecanismos moleculares associados ao eixo. Nossos resultados sugerem uma disfunção do eixo HPA em pacientes associada a uma hiporresponsividade do receptor de glicocorticóide, maiores níveis da proteína ligante de FK506 de 51 kDa (FKBP51) e um aumento da metilação do gene FKBP5. Nós ainda observamos que os pacientes com maior número de episódios apresentaram uma disfunção do eixo mais pronunciada do que aqueles em estágio inicial. No quarto e último capítulo nós realizamos um estudo para verificar os mecanismos moleculares pelos quais o estresse pode induzir alterações epigenéticas envolvendo a metilação do DNA, onde descrevemos o efeito oposto das cochaperonas FKBP51 e FKBP52 sobre a fosforilação da enzima DNA metiltransferase 1 (DNMT1). Além disso, a redução da fosforilação da DNMT1 correlacionou-se com uma melhor resposta clínica ao tratamento em pacientes com transtorno depressivo maior. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a resiliência celular, a resposta ao estresse e a metilação do DNA desempenham importantes papéis na patofisiologia, progressão e resposta ao tratamento de pacientes com transtornos de humor. Novos tratamentos com alvo em mecanismos epigenéticos, na modulação do receptor de glicocorticóide e no aumento da resiliência celular devem ser priorizados em estudos futuros. / Evidence suggests the involvement of cellular resilience mechanisms, stress, and of epigenetic alterations in the patophysiology of mood disorders, such as bipolar disorder (BD) and major depressive disorder. The studies presented in this thesis aimed at exploring these mechanisms in a translational fashion, going from the assessment of cellular death and survival to the correlation of findings with the response to treatment. The first chapter aimed at reviewing data from the literature regarding the progression of BD, which point to a series of biological alterations involving cellular resilience in patients at different stages of the disorder. The second chapter aimed at assessing cell death parameters in patients with BD, in which a higher frequency of cells in early apoptosis was detected when compared to controls. In addition, considering the potential effects of glucocorticoids in the induction of apoptosis, the third chapter assessed the activity of the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis in patients with BD, their siblings, and in healthy controls, in addition to the molecular mechanisms associated with the axis. Our results suggest a dysfunction of the HPA axis in patients associated with a hyporesponsiveness of the glucocorticoid receptor, increased FK506-binding protein of 51 kDa (FKBP51) levels, and increased methylation levels at the FKBP5 gene. We also noted that patients with a greater number of previous episodes presented a more pronounced dysfunction of the axis when compared to early-stage patients. In the fourth and last chapter we performed a study to verify the molecular mechanisms by which stress can induce epigenetic alterations involving DNA methylation, where we describe opposing effects of the cochaperones FKBP51 and FKBP52 on DNA methyltransferase 1 (DNMT1) phosphorylation. In addition, the reduction of DNMT1 phophorylation was correlated with a better clinical response to treatment in patients with major depressive disorder. In summary, the results of this thesis suggest that cellular resilience, response to stress and DNA methylation play key roles in the pathophysiology, progression and response to treatment in patients with mood disorders. Novel treatments targeting epigenetic mechanisms, the modulation of the glucocorticoid receptor, and enhancing cellular resilience should be prioritized in future studies.

As células estreladas hepáticas (HSC) são pericitos específicos do fígado, são células armazenadoras de gordura e produzem componentes de matriz extracelular. As HSCs ao serem ativadas, proliferam, perdem as gotas lipídicas e aumentam a secreção de matriz extracelular. O controle da modulação fenotípica e da proliferação das HSCs é de suma importância para entendermos a fibrose hepática. Esta pesquisa foi realizada com a linhagem celular GRX (representativa das HSCs murinas) obtida a partir de reações fibrogranulomatosas inflamatórias. Estudos anteriores, em nosso laboratório, pesquisaram a ação de diferentes drogas sobre a modulação destas células, tais como: retinol, pentoxifilina, indometacina e insulina. Tem sido relatado que o resveratrol (3,4,5 trihidroxiestilbeno) (RSV) tem ação antioxidante, antiinflamatória, antiproliferativa bem como tem capacidade de ativar ou inibir a transcrição de enzimas envolvidas na regulação de vários eventos celulares, por exemplo metabolismo de lipídeos. Por isso, procuramos utilizar o RSV, um polifenol natural presente na casca das uvas e conseqüentemente em grande quantidade de vinhos tintos, neste modelo celular. As células GRX foram cultivadas (12, 24 e 120 h) em meio DMEM com 5% SFB acrescido ou não de RSV (100 nM, 1µM ou 100 µM) e retinol (RHO) (5µM). Nossos estudos demonstraram que tratamento por 120 h com RSV (100nM e 1µM) inibiu a proliferação das células GRX diminuindo em 35% o número de células. Analisando o efeito de 1µM de RSV sobre o ciclo celular e a apoptose, verificamos que após 120 h de tratamento houve um aumento das células na fase S e Sub-G1. Constatou-se condensação e fragmentação nuclear, sugerindo um possível efeito pró-apoptótico do RSV sobre a célula GRX. Observou-se que o tratamento com RSV (100 nM) por 5 dias não induziu a formação de gotas lipídicas nas células GRX. Porém ao acrescentar RSV+RHO, constatou-se que o RSV não interferiu na síntese e acúmulo de lipídios, provocado pelo RHO (5µM). Propondo que a lipogênese neste modelo de tratamento possa estar associada com a ação da sirtuina (deacetilase NAD-dependente) e do PPARy (receptores ativados por proliferadores de peroxissomos), determinou-se a expressão do mRNA destas duas proteínas. Observou-se que o RSV (100 nM) aumenta a expressão do mRNA da sirtuina 1 (SIRT1) e diminui a expressão de PPARy. Porém, o tratamento com RSV+RHO provocou uma redução na expressão da SIRT1, alterando a relação PPARy/SIRT1, promovendo a síntese de lipídios. Nossos dados mostraram que após 24h de tratamento, o RSV não alterou a incorporação de acetato [C14] em triacilglicerídios (TG), enquanto que, o RHO ou RSV+RHO aumentaram a incorporação do marcador nestes lipídios. O depósito de TG permaneceu constante, porém a síntese diminuiu com o tempo de tratamento. Acredita-se que estes compostos atuam por mecanismos moleculares diferentes modulando o metabolismo de lipídios. Sugerimos, de acordo dados da literatura, que o RHO atua via receptor nuclear LXR formando um heterodímero com PPARy, favorecendo a lipogênese. Por outro lado, o RSV ativa a SIRT1, que reprime o PGC1α (coativador do PPARy). Logo, a inibição do PPARy pelo RSV inibe consequentemente a lipogênese. Concluímos que o resveratrol apresenta um efeito anti-proliferativo, pró-apoptótico sem induzir o fenótipo lipocítico nas células GRX. Desta forma, se mantém em equilíbrio, no espaço de Disse, as células mesenquimais quiescentes e ativadas, contribuindo para restabelecer a homeostase hepática. / The hepatic stellate cells (HSC) are liver-specific pericytes, as well as fat-storing cells and they are also responsible for the extracellular matrix components production. When activated, HSCs lose lipid droplets and increase extracellular matrix secretion. The phenotypical modulation and the HSCs proliferation control have paramount importance to understand the hepatic fibrosis. This research has been carried out with the GRX cell line (HSCs murine representative) which was obtained from inflammatory fibrogranulomatous reactions. Previous studies in our laboratory investigated the action of different drugs on the modulation of these cells, such as: retinol, pentoxifilin, indomethacin and insulin. Resveratrol (RSV) has been referred to as having antioxidant, antiinflammatory and antiproliferative action (3,4,5 trihidroxiestilbeno), as well as the capacity to activate or inhibit the transcription of enzymes involved in the regulation of several cell events, as, for example, lipid metabolism Therefore, we used RSV, which is a natural polyphenol found in the grapes skin and, consequently, in large amounts of red wine, in this cell model. The GRX cells were cultivated (12, 24 and 120 h) in medium DMEM with 5% SFB added RSV or not (100 nM, 1µM or 100 µM) and retinol (RHO) (5µM). Our studies demonstrated that a 120 h treatment with RSV (beginning with 100 nM) inhibited GRX cells proliferation, thus decreasing the cell number in 35%. Assessing the effect of 1µM RSV on the cell cycle and the apoptosis, we found that, after this treatment period, there was an increase of cells in phases S and Sub-G1. Nuclear condensation and fragmentation were observed, which suggested a probable pro-apoptotic RSV effect on the GRX cell. The RSV (100 nM) 120 h treatment did not induce lipid droplets formation in the GRX cells. However, RSV did not interfere in the synthesis or accumulation of lipids caused by RHO (5µM), when RSV+RHO were added. Considering that the lipogenesis in this treatment model might be associated with sirtuin action (deacetilase NAD-dependent) and PPARy (receptors activated by peroxisome proliferators), the mRNA expression of these two proteins was determined. RSV (100 nM) proved to increase sirtuin mRNA expression 1 (SIRT1) and decrease PPARy.expression. However, the treatment with the RSV+RHO caused a reduction in the SIRT1 expression thus alterating the relation PPARy/SIRT1, which promoted the lypid synthesis. Our data showed that after the 24-hour treatment RSV did not change acetate incorporation [C14] in triacylglicerides (TG), whilst RHO or RSV+RHO increased the marker incorporation in these lipids. The TG deposit remained constant, but the synthesis diminished during the treatment period. It appears that these compounds act through different molecular mechanisms when modulating lipids metabolism. According to literature data, we suggest that RHO acts via LXR nuclear receptor, thus forming an heterodímer with PPARy, which favors lypogenesis. On the other hand, RSV activates SIRT1, which inhibits PGC1α (PPARy coactivator). Therefore, the PPARy inhibition by RSV consequently inhibits lypogenesis. We concluded that RSV presents pro-apoptotic, anti-proliferative effect, without inducing lypocytic phenotype in the GRX cells. By this means the mesenquimal activated quiescent cells keep their balance at the Disse space, thus contributing with the hepatic homeostasis restoration.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T14:39:51Z No. of bitstreams: 2 dissertação JEYCE KELLE.pdf: 1297553 bytes, checksum: 4146e619dc069490804cd394359499a2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T14:39:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertação JEYCE KELLE.pdf: 1297553 bytes, checksum: 4146e619dc069490804cd394359499a2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES / Atualmente o câncer é considerado uma doença genética, pois durante seu desenvolvimento as células passam por diversas instabilidades genômicas sendo considerada a segunda causa de morte no mundo. A nitrofurantoína é um derivado nitrofurano hindantoínico amplamente utilizado no tratamento de infecções do trato urinário, cujo mecanismo de ação ainda não está muito bem definido. Neste trabalho foram realizados testes citotóxicos da nitrofurantoína e quatro novos derivados n-alquilados em linhagens de células cancerígenas. O ensaio de citotoxicidade foi feito através do teste do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium) e as ferramentas utilizadas para avaliação do mecanismo de ação incluíram o teste de exclusão do azul de tripan, análise morfologia por coloração May-Grunwald-Giemsa, microscopia de fluorescência através da marcação com anexina V\Iodeto de propídeo, análise da fragmentação do DNA pelo teste do DNA Ladder e análise da expressão de genes anti-apoptótico BCLxL e pró-apoptótico Bax. Os resultados mostraram que a nitrofurantoína e todos os derivados testados apresentaram atividade citotóxica frente a quatro linhagens de células tumorais MCF-7 (Adenocarcinoma de mama), NCI-H292 (carcinoma mucoepidermoide de pulmão), HT-29(Adenocarcinoma de colon) e HL-60 (Leucemia promielocítica). O derivado N-pentil nitrofurantoina (M8A) foi o composto selecionado e a linhagem HL-60 foi escolhida para os estudos de avaliação do mecanismo de ação. No teste do azul de tripan o M8A diminuiu a viabilidade celular nas duas concentrações testadas (6,0 e 12,0 μg\mL). A análise morfológica indicou que o M8A induziu as células à apoptose, pois os núcleos apresentaram condensação da cromatina, fragmentação do DNA e picnose. A análise de fragmentação do DNA mostrou que as células sofreram apoptose no padrão de 180-200 pares de bases. O teste de microscopia de fluorescência confirmou os resultados do DNA ladder, mostrando que o derivado está induzindo as células a sofrem apoptose pela externalização da fosfatidilserina marcadas com anexina V nas duas concentrações testadas. Na análise de RT-PCR pôde-se verificar o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax, confirmando assim o processo de apoptose e indicando o envolvimento da via intrínseca. Os resultados mostram que o derivado M8A é um agente anticâncer promissor e esses dados são inéditos para esta classe de moléculas.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6248_1.pdf: 847551 bytes, checksum: 8ceaa2bed7b099a42d33baab297abaf3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A enzima que degrada a insulina (IDE) é uma proteína intracelular, cuja função mais caracterizada in vitro tem sido sua atividade proteolítica, com alta especificidade para a insulina. Contudo, além da insulina, a IDE também metaboliza outros substratos, como vários fatores de crescimento, e possui outras funções, como a de proteína ligadora e a de proteína regulatória. A IDE se relaciona com várias funções celulares, como a diferenciação e crescimento celulares, e sua expressão é regulada de acordo com o período de desenvolvimento do animal. Também foi referido que a IDE facilita a união dos receptores de esteróides ao DNA nuclear. Por outro lado, sabe-se que o estradiol (E2) estimula o crescimento do epitélio uterino. Para examinar se a IDE é regulada em relação a estímulo de crescimento celular, o presente estudo avaliou na fração citosólica de homogeneizados de útero de ratos, se a IDE é modificada em quantidade e atividade em diferentes status estrogênicos, ou seja, em situação de proliferação celular (proestro e castração +E2) e apoptose (metaestro e castração). Os resultados mostraram que a quantidade e a atividade da IDE aumentam nos animais em fase de proestro ou nos castrados e tratados com E2 e diminuem nos animais em fase de metaestro ou nos castrados. Foi encontrada correlação linear entre a degradação da insulina (atividade da IDE) e o peso relativo do útero, indicando ainda mais o envolvimento da IDE com o crescimento celular. Dessa forma, em condições de proliferação celular (induzida pelo estradiol) observamos aumento na quantidade e atividade da IDE e aumento do peso uterino. Esses dados sugerem que a IDE deve ser considerada um requerimento importante para o crescimento do endométrio induzido pelo estradiol

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5421_1.pdf: 453041 bytes, checksum: 3fdf21fbfc2d1ccf84a25f5295e63dcd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / INTRODUÇÃO: Entre suas diversas ações biológicas, o cálcio extracelular exerce um papel fundamental na manutenção da polaridade da membrana plasmática. Procurou-se avaliar o efeito da despolarização da membrana induzidas por baixa concentração extracelular de cálcio ou ouabaína na apoptose e expressão da Caspase-3 em neutrófilos (PMN). MÉTODOS: PMN foram isolados de sangue de voluntários por gradiente de densidade e cultivados por 18h em meios com concentração normal (1.8mM) ou baixa de cálcio (<10nM), ou com ouabaína (1mM), um inibidor da sódio/potássio ATPase. A apoptose foi quantificada por citometria de fluxo pela captação nuclear do iodeto de propídio. A expressão da proteína Caspase-3 foi avaliada por eletroforese de proteínas. RESULTADOS: Não foram observados efeitos na apoptose basal dos PMN com o uso isolado de estímulos despolarizantes. Entretanto, os efeitos inibitórios do lipopolissacarídeo (LPS - 1ug/ml) foram anulados quando os PMN foram cultivados em meio com baixa [Ca++], e restaurados pela adição de cátions divalentes (cálcio, estrôncio ou manganês); ouabaína, de forma similar, bloqueou o efeito do LPS. Tanto a depleção de cálcio extracelular quanto a utilização de ouabaína reduziram a expressão da forma precursora da Caspase-3. CONCLUSÃO: A cultura de PMN em meio com baixa [Ca++] ou ouabaína, dois estímulos distintos que induzem a despolarização de membrana, bloqueiam a inibição da apoptose mediada por LPS em PMN e alteram a expressão de caspases. Estas observações podem estabelecer um novo mecanismo de regulação da sobrevida dos PMN