Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-10-13T04:00:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334829.pdf: 1141175 bytes, checksum: 790483c51ee9852c13a77edb288beefe (MD5) Previous issue date: 2014 / Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) estão entre os principais contaminantes nos ambientes aquáticos. Dentre os HPAs, o fenantreno é um dos mais abundantes nos ambientes marinhos. Além dos danos causados ao ecossistema, a bioacumulação deste xenobiótico pelos animais pode alterar sua homeostase, através da indução de várias respostas para sua eliminação. Entre estas, está a indução de genes que codificam proteínas envolvidas com a biotransformação, defesas antioxidantes e apoptose. Mecanismos de defesas contra xenobióticos são amplamente estudados em animais vertebrados principalmente mamíferos, no entanto em invertebrados ainda existem poucas informações, comparativamente. A compreensão dos mecanismos moleculares de defesas desses animais auxiliará na sua utilização como biomarcadores de contaminação ambiental. Para esses estudos são necessários organismos modelos, como a ostra do mangue Crassostrea brasiliana, que se apresenta como um organismo sentinela adequado para avaliação e monitoramento de ambientes contaminados. Este trabalho analisa a transcrição de genes relacionados a vias de biotransformação e de defesa celular contra xenobióticos no manto desta espécie. O xenobiótico utilizado foi o HPA fenantreno, sendo realizada a exposição dos animais em duas concentrações subletais (100 µg.L-1 e 1000 µg.L-1), e três tempos de exposição (1, 5 e 10 dias). Foi observada uma indução na transcrição de genes da biotransformação de fase I (CYP2AU1, CYP2C8-like, CYP17A1-like e CYP3A-like) e genes envolvidos com a apoptose (Caspases 7, 8 e a p53), principalmente nos animais expostos na concentração de 1000 µg.L-1 de fenantreno. Os resultados observados mostram que a exposição desses animais ao fenantreno, desencadeia uma série de respostas transcricionais, evidenciando estratégias de proteção do organismo frente a uma agressão química, de forma semelhante ao que ocorre em mamíferos. Os resultados demonstram ainda que o manto apresenta respostas destes sistemas de transcrição mais tardias em relação à brânquia e a glândula.<br> / Abstract : Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are among the main contaminants in aquatic environments. Among the PAHs phenanthrene is one of the most abundant in marine environments. In addition to the damage to the ecosystem, bioaccumulation of xenobiotic by animals can change its homeostasis, by inducing several defense systems to its elimination. Among these is the induction of genes that encode proteins involved in biotransformation, antioxidant defenses and apoptosis. Defense mechanisms against xenobiotic exposure are widely studied in mammals mainly vertebrates, however in invertebrates there is little information, comparatively. Understanding the molecular mechanisms of defense of these animals will aid in their use as biomarkers of environmental contamination. Model organisms are required to run these studies, such as the mangrove oyster Crassostrea brasiliana, which is a suitable sentinel organism for evaluation and monitoring of contaminated environments. This work analyzes the transcription of genes related to biotransformation pathways and cellular defense against xenobiotics in the mantle of this species. Phenanthrene, a model PAH, was used in the exposure of the animals. Experiments were carried out using two sublethal concentrations (100 and 1000 ?g.L-1), and three exposure times (1, 5 and 10 days). Induction was observed in the transcription of genes Phase I biotransformation (CYP2AU1, CYP2C8-like CYP17A1-like and CYP3A-like), and genes involved in apoptosis (Caspases 7, 8 and p53), especially in animals exposed to the concentration 1000 ?g.L-1 phenanthrene. Our results show that exposure of these animals to phenanthrene, triggers a cascade of transcriptional responses, indicating protection strategies of the organism to a chemical aggression, similarly to what occurs in mammals. The results further demonstrate that the mantle shows later transcriptional responses than the gill and the gland when exposed to this chemical.

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:14:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 eugenio_hottz_ioc_dout_2014.pdf: 16733087 bytes, checksum: 8997b2db1738619b3afa2e139fcbb5b8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue é a arbovirose humana mais prevalente no mundo. A infecção pelo vírus da dengue (DENV) tem um vasto espectro de sintomas, causando desde febre auto-limitada até casos graves com sangramento e choque podendo evoluir para o óbito. Apesar de plaquetopenia ser frequentemente observada em pacientes com dengue, a participação das plaquetas na patogênese da dengue permanece pouco explorada. Nós inicialmente investigamos a ativação plaquetária em pacientes com dengue ou em plaquetas expostas ao DENV in vitro. Na tentativa de associar a ativação plaquetária com mecanismos imunopatogênicos da dengue, a secreção de citocinas e quimiocinas em plaquetas estimuladas com o DENV e a síntese de IL-1\03B2 em plaquetas de pacientes com dengue foram investigadas. Os mecanismos envolvidos no processamento e secreção da IL-1\03B2, bem como suas contribuições para a permeabilidade endotelial também foram objetos de estudo. A formação de agregados plaqueta-monócito e a expressão de marcadores de ativação de monócitos também foram avaliados em pacientes com dengue. Finalmente, nós investigamos o impacto da apoptose de plaquetas na dengue e sua relação com o desfecho de plaquetopenia. Nossos resultados indicam intensa ativação plaquetária em pacientes com dengue, especialmente em pacientes com dengue grave Nós observamos uma expressão elevada de IL-1\03B2 em plaquetas e micropartículas (MP) derivadas de plaquetas de pacientes com dengue, ou após a exposição de plaquetas ao DENV in vitro. Nós demonstramos que a dengue induz a montagem do inflamassoma NLRP3, ativação de caspase-1 e secreção de IL-1\03B2 de modo dependente da geração de espécies reativas de oxigênio na mitocôndria. A IL-1\03B2 sintetizada por plaquetas foi secretada principalmente em MPs. A ativação do inflamassoma e secreção de MPs contendo IL-1\03B2 correlacionaram com sinais de permeabilidade endotelial aumentada nos pacientes. Além disso, MPs recuperadas de plaquetas expostas ao DENV induziram aumento de permeabilidade endotelial in vitro de modo dependente do receptor de IL-1. Plaquetas de pacientes com dengue também apresentaram características de apoptose como despolarização da mitocôndria, ativação de caspase-3 e de caspase-9 e exposição de fosfatidilserina, que foram associadas à plaquetopenia nos pacientes com dengue. Nós também demonstramos níveis elevados de agregados plaqueta-monócito em pacientes com dengue. A exposição de monócitos isolados de voluntários saudáveis a plaquetas isoladas de pacientes com dengue induziu a secreção das citocinas IL-1\03B2, IL-8, IL-10 e MCP-1 pelos monócitos A secreção de citocinas nos agregados plaqueta-monócito foi dependente tanto da adesão mediada por Pselectina quanto do reconhecimento de plaquetas apoptóticas, que regulou a secreção de IL- 10. Nossos resultados trazem novas evidências de que as plaquetas participam ativamente como efetoras da resposta inflamatória na dengue, e contribuem para os mecanismos patogênicos envolvidos nas alterações hemodinâmicas comuns aos casos de dengue grave / Dengue is the most frequent hemorrhagic viral disease and re-emergent infection in the world. Dengue infection has a large spectrum of clinical manifestations from self-limited febrile illness to severe syndromes accompanied by bleeding and shock. Although thrombocytopenia is characteristically observed in mild and severe forms of dengue, the role of platelet activation in dengue pathogenesis has not been fully elucidated. We hypothesize that platelet activation have major roles in inflammatory amplification and increased vascular permeability during severe forms of dengue. Here we investigate platelet activation in patients with dengue or in platelets exposed to DENV in vitro. The secretion of cytokines and chemokines in DENV-stimulated platelets and the synthesis of IL-1β in platelets from patients with dengue were investigated. The mechanisms involved in processing and secretion of IL-1β, as well as potential contribution of these events to endothelial permeability during infection were also evaluated. Platelet-monocyte aggregates formation and markers of monocyte activation were evaluated in patients with dengue. Finally, we investigated the impact of platelet apoptosis in dengue-associated thrombocytopenia. Our results show increased platelet activation in patients with dengue, especially patients with severe dengue. We showed higher expression of IL-1β in platelets and platelet-derived MPs from patients with dengue or after platelet exposure to DENV in vitro. We demonstrated that DENV infection leads to assembly of NLRP3 inflammasomes, activation of caspase-1, and caspase-1-dependent IL-1β secretion. Our findings also indicate that platelet-derived IL-1β is chiefly released in MPs through mechanisms dependent on mitochondrial reactive oxygen species-triggered NLRP3 inflammasomes. Inflammasome activation and platelet shedding of IL-1β-rich microparticles correlated with signs of increased vascular permeability. Moreover, microparticles from DENV-stimulated platelets induced enhanced endothelial permeability in vitro in an IL-1R-dependent manner. Platelets from dengue-infected patients also showed characteristics of apoptosis, including mitochondrial depolarization, activation of caspase-3 and -9 and phosphatidylserine exposure, which were associated with thrombocytopenia. We also observed increased levels of platelet-monocyte aggregates in blood samples from patients with dengue. The exposure of monocytes from healthy volunteers to platelets from patients with dengue induced the secretion of the cytokines IL-1β, IL-8, IL-10 and MCP-1. In addition to the well-established modulation of monocyte cytokine responses by activated platelets through P-selectin binding, we found that interaction of monocytes with apoptotic platelets mediate IL-10 secretion through phosphatidylserine recognition in platelet-monocyte aggregates. Our findings provide new evidence that platelets actively participate as effector cells in inflammatory response of dengue infection, and contribute to the pathogenesis of dengueassociated vasculopathy.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 desio_oliveira_ioc_dout_2011.pdf: 1175865 bytes, checksum: f838717ed871f60759465b1b71ebee3c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A infecção pelo Trypanosoma cruzi promove alterações em órgãos linfóides. O timo apresenta-se atrofiado com depleção de células CD4+CD8+ (DP) na fase aguda. Em órgãos linfóides periféricos, os linfonodos subcutâneos (LSC) e o baço apresentam-se hipertrofiados com aumento de células T e B, enquanto os linfonodos mesentéricos (LM) apresentam-se atrofiados devido à morte dessas células. Nesse trabalho estudamos os efeitos da infecção pelo T. cruzi sobre células epiteliais tímicas (TEC) e timócitos, bem como o papel do timo no comportamento de órgãos linfóides periféricos. Em experimentos de infecção in vitro, avaliamos TEC, abordando a expressão de ligantes e receptores da matriz extracelular (ECM), e ainda, as possíveis conseqüências desse aumento de ECM sobre a interação de TEC/timócitos ou TEC/parasita. Nossos resultados demonstram que a infecção promove diminuição do número de TEC, alterações morfológicas e aumento de ECM em culturas infectadas. Observamos também que componentes da ECM são requeridos na interação entre TEC/parasita. Curiosamente, o menor crescimento de TEC em culturas infectadas está associada com a inibição do ciclo celular e não com apoptose No que se refere à interação TEC/timócitos, observamos que a adesão foi maior nas culturas infectadas, especialmente sobre TEC parasitadas. Esse aumento de adesão entre TEC/timócitos corrobora a hipótese descrita anteriormente pelo nosso grupo que a infecção favorece a migração de timócitos para periferia. Estendendo nossa análise ao compartimento linfóide do timo, investigamos a apoptose de timócitos na infecção. Observamos que a celularidade do timo diminui viii durante a infecção, juntamente com aumento de apoptose de timócitos CD4-CD8- (DN), DP, CD4 e CD8. Procurando entender a via envolvida na apoptose desses timócitos, demonstramos que a atividade de caspases total, caspase 8, caspase 9 e caspase 3 estão aumentadas na infecção. Observamos que ambas caspases iniciadoras caspase 8 (via extrínseca, Fas, TNF, TRAIL) e caspase 9 (via intrínseca, privação de fatores) parecem estar envolvidas na depleção desses timócitos Esse dado foi confirmado nos experimentos de bloqueio de morte com inibidores de caspases, onde observamos que o tratamento in vivo (injeção intratímica) e in vitro com zVAD (inibidor geral de caspases) em timócitos de animais infectados foi mais eficaz no bloqueio da morte do que os inibidores de caspase-8 (zIETD) ou caspase-9 (zLEHD). Além disso, animais infectados e tratados com zVAD apresentaram a celularidade do timo parcialmente recuperada, mais especificamente em timócitos DN e DP. Finalmente, procurando entender o papel do timo na resposta imune regional de órgãos linfóides periféricos na infecção, camundongos foram timectomizados antes da infecção para avaliação da celularidade dos LSC, LM e baço. Nossos dados demonstram que, mesmo com a ausência do timo, a hipertrofia dos LSC e a atrofia dos LM permaneciam inalterados, entretanto, encontramos significativo acúmulo de linfócitos T e B no baço de animais infectados. Em conjunto, nossos resultados demonstram que as alterações observadas no componente epitelial do microambiente tímico, assim como em timócitos de animais infectados favorecem a migração e morte destes timócitos e a atrofia desse tecido. Além disso, demonstramos que células do timo possuem papel imunoregulatório no baço durante a infecção / Trypanosoma cruzi infection promotes lymphoid organ alterations. The thymus is atroph ied with CD4 + CD8 + (DP) thymocyte depletion in the acute phase of infection. In p eripheral lymphoid organs, subcuta neous lymph nodes (LSC) and spleen present hypertrophy, with increase of T and B cells, whereas mesenteric lymph nodes (LM) are atrophied due to the death of these cells . In this work, we studied the effects of T. cruzi infec tion in thymic epithelial cells (TEC) and thymocytes , as well as the role of thymus in the behavior of peripheral lymphoid organs . In experiments of in vitro infection, we evaluated TEC, concerning the expression of extracellular matrix (ECM) ligands and receptor s , and also the possible conseq uences of ECM increase in TEC /thymocyte or TEC/parasit e intera ctions . Our data demonstrate that T. cruzi infection promotes a decrease of TEC number , morphological alterations and ECM increase in infected cultures . We observed that ECM components ar e required in the interaction between TEC and parasit es . Curiously, the decrease in TE C number in infected cultures is associated to cell cycle inhibition but not to apoptos is . Concerning TEC/thymocyte interactions, we observed that adhesion was greater in infected cultures, especially on parasitized TEC . This increase in TEC/thymocyte adhesion corroborates the hypothesis previously described by our group that the infection favors migration of thymocyte s to the periphery . Extending our analysis to th ymic ly mphoid compartment, we investigated thymocyte apoptosis following infection . We observed that thymus cellulari ty decreases during infection, together with the increase of apopt osis in CD4 - CD8 - (DN), DP, CD4 and CD8 thymocyte s. Searching to understand what death pathway is involved in thymocyte apoptosis, we demonstrated that the activity of total cas pases, caspase - 8, caspase - 9 and caspase-3 (ef f e c tor caspase ) are increased in infection . We observ ed that both initiator ca spase - 8 (extrinsic pathway, Fas, TNF , TRAIL) and caspase - 9 (intrinsic pathway, factor deprivation) seem to be involved in thymocyte deple tion. These data were confirmed in death blocking experiments with caspase inhibitors , in which w e showed that in vivo (intrat hy mic inje ction ) and in vitro treatment s with zVAD ( general caspase in hibitor ) were more effective in blocking thymocyte death than the in hibitors of caspase - 8 (zIETD) or caspase - 9 (zLEHD) separately . Moreover , infected animals treated with zVAD showed a partial recovery of thymus cellularity , more specifica lly in DN and DP thymocytes . Finally, searching to understand the role of the thymus in the regional immune response of peripheral lymphoid organs in infection , mice were t hy mectomiz e d prior to infection to evaluation of LSC, LM and spleen cellularity. Our data demonstrate d that, even in the absence of the thymus, LSC hypertrophy and LM atrophy were not altered ; however , we found a significant accumulation of T and B lymphocytes in the spleen of infected animals. Conjointl y , our results show that the alterations observed in the epithelial component of the thymus microenvironment, as well as in thymocyte s of infected animals favor the migration and death of thymocyte s and the atrophy of this tissue . Besides that , we demonstr at ed that thymic cells have an immunoregulatory role in the spleen during infection .

ARAÚJO, Ana Jérsia. Estudo das propriedades citotóxica da nor-ß-lapachona e seu derivado nitrofenilamino em células HL-60. 2009. 95 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-05T15:41:13Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_ajaraújo.pdf: 1934517 bytes, checksum: 316a2f473392dc4b8e5c026431688ffa (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-07T11:36:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_ajaraújo.pdf: 1934517 bytes, checksum: 316a2f473392dc4b8e5c026431688ffa (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T11:36:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_ajaraújo.pdf: 1934517 bytes, checksum: 316a2f473392dc4b8e5c026431688ffa (MD5) Previous issue date: 2009 / The quinone moiety has been identified as an important pharmacophoric group for cytotoxic activity of several compounds clinically used, constituting just one of the major classes of anticancer agents. β-lapachone is one of the most studied quinones in the last years. Its most important applications are related to its action against several cancer cells. Its derivative, nor-β-lapachone (compound 1), has similar anticancer activity. Thus, the aim of this work was to evaluate the mechanism of action involved in nor--lapachone and its nitrophenylamino derivative (compound 2) cytotoxicity in a leukemia cells model of HL-60 cell line. Initially it was investigated the effect of both the compounds on HL-60 cells viability after 24 hours of incubation, showing IC50 values of 2.92 and 0.48 μM to compounds 1 and 2, respectively. Considering the selectivity, compound 1 showed strong selectivity to cancer cells, while its derivative was only partially selective. Studies performed in HL-60 cells, after 24 hours, indicated that compound 2 induces cell death by apoptosis as showed by morphological changes, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization and phosphatidylserine externalization. Both tested compounds increased generation of reactive oxygen species (ROS). Our results suggest that a nitrophenylamino radical introduction at position 3 of the furane ring enhances the cytotoxicity of nor--lapachone in HL-60 cell line. These findings highlight the potential of these synthetic quinones as prototypes molecules to produce new compounds with anticancer properties. / O esqueleto quinona foi identificado como um importante grupo farmacofórico para atividade citotóxica de vários compostos utilizados na clínica, constituindo ainda uma das maiores classes de agentes anticâncer. A β-lapachona é uma das quinonas mais estudadas nos últimos anos. Suas aplicações mais importantes estão relacionadas às ações contra várias células tumorais. Seu derivado, nor-β-lapachona (composto 1), tem atividade anticâncer similar. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade do composto 1 e de seu derivado nitrofenilamino (composto 2) em células leucêmicas HL-60. Inicialmente foi investigado o efeito desses compostos na viabilidade de células HL-60 após 24 horas de incubação, mostrando CI50 de 2,92 e 0,48 μM para os compostos 1 e 2, respectivamente. Acerca da seletividade celular, o composto 1 mostrou forte seletividade para células tumorais, enquanto que o seu derivado foi apenas parcialmente seletivo. Estudos feitos em células HL-60 indicaram que o composto 2 induz morte celular por apoptose como mostrado pelas mudanças morfológicas, fragmentação do DNA, despolarização da membrana mitocondrial e externalização da fosfatidilserina. Ambos compostos aumentaram a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Nossos resultados sugerem que a introdução do radical nitrofenilamino na posição 3 do anel furano aumenta a citotoxicidade da nor--lapachona em células HL-60. Esses achados apontam para o potencial dessas quinonas sintéticas como modelo para a produção de novos compostos com propriedades anticâncer.

MEIRA, Assuero Silva. Estudo do potencial citotóxico de novos ésteres sintéticos derivados da mistura triterpenoidica a-/ß-amirina em modelos experimentais in vitro. 2011. 124 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-07T11:44:40Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_asmeira.pdf: 5851915 bytes, checksum: aa16a7db83f12d03afb14bdb279c0e74 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-08T11:25:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_asmeira.pdf: 5851915 bytes, checksum: aa16a7db83f12d03afb14bdb279c0e74 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-08T11:25:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_asmeira.pdf: 5851915 bytes, checksum: aa16a7db83f12d03afb14bdb279c0e74 (MD5) Previous issue date: 2011 / Triterpenoids are compounds that in recent years have aroused considerable interest because of their structural diversity and the discovery of a broad spectrum of pharmacological activities. This study evaluated the cytotoxic potential of four derivatives of a mixture of α-, β-amyrin in human tumor cell lines. Among these, only compound 3-O-α-Carboximaleinato of, β-amyrin (3a/3b) was active, especially in the leukemic cell line HL-60, with IC50 values ranging from 1.8 to 3.0 µM. This derivative had its cytotoxic evaluated, also at the other leukemia cell line, K562, with IC50 values ranging between 1.76 and 2.96 µM, suggesting a specificity of this substance for leukemia. And their specificity for tumor cells was confirmed in cytotoxicity assays in a strain of macrophages, J774 (IC50 between 3.10 and 3.60 µM) and mononuclear cells in human peripheral blood mononuclear cells, whose proliferation was not prevented, and there wasn’t damage in the DNA of these cells. None of the compounds showed hemolytic activity against erythrocytes of mice (EC50> 200 mg / mL), suggesting a cytotoxic mechanism more specific. Thus, to determine the mechanism of action involved, sequences of in vitro experiments were performed in HL-60 cell line. Cells were treated at different concentrations of the sample 3a/3b (1.5, 3.0 and 6.0 µM) during 24h. The viability of HL-60 cells (trypan blue test and flow cytometry) was reduced at concentrations of 3.0 and 6.0 µM after treatment. Morphological analysis of cellular changes performed by staining methods (May-Grünwald-Giemsa and acridine orange / ethidium bromide (LA / BE)) and by flow cytometry (membrane integrity) showed typical features of apoptotic cells (intact membrane , reduction of cell volume, picnotic nucleus and chromatolysis), also at concentrations of 3.0 and 6.0 µM. Further testing by flow cytometry revealed that there was externalization of phosphatidylserine, there was no formation of reactive oxygen species (ROS) and that the molecule 3a/3b only induced the extrinsic pathway of apoptosis by activation of initiator caspase 8 and subsequent activation of caspases 3 and 7. These data indicate a cytotoxic mechanism induced by an apoptotic pathway, involving death receptors. Therefore, these results indicate the cytotoxic potential of 3a/3b analogue. / Triterpenóides são compostos que nos últimos anos têm despertados grande interesse em razão de sua diversidade estrutural e da descoberta de um amplo espectro de atividades farmacológicas. O presente estudo avaliou o potencial citotóxico de quatro derivados de uma mistura de α-,β-amirina em linhagens tumorais humanas. Dentre estes, apenas o composto 3-O-Carboximaleinato de α-, β-amirina (3a/3b) foi ativo, especialmente na linhagem leucêmica HL-60, com valores de IC50 variando entre 1,8 e 3,0 µM. Este derivado foi avaliado, também frente à outra linhagem leucêmica, K562, com IC50 variando entre 1,76 e 2,96 µM, sugerindo uma especificidade desta substância para leucemias. E sua especificidade para células tumorais foi confirmada em ensaios de citotoxicidade em células não transformadas, sendo testada em uma linhagem de macrófagos, J774 (IC50 entre 3,10 e 3,60 µM) e em células mononucleares do sangue periférico humano (CMSPH), cuja proliferação não foi impedida e não houve dano ao DNA destas células. Nenhum dos compostos mostrou atividade hemolítica contra eritrócitos de camundongos (EC50 > 200 µg/mL), o que sugere uma citotoxicidade por mecanismos de ação mais específicos. Desta forma, a fim de determinar o mecanismo de ação envolvido, uma sequência de experimentos in vitro foram realizados na linhagem HL-60. As células foram tratadas em diferentes concentrações da amostra 3a/3b (1,5, 3,0 e 6,0 µM) por 24h. A viabilidade das células HL-60 (teste azul de tripan e citometria de fluxo) foi reduzida nas concentrações de 3,0 e 6,0 µM, após o tratamento. A análise morfológica das alterações celulares realizada por métodos de coloração (May-Grünwald-Giemsa e laranja de acridina/brometo de etídio (LA/BE)) e por citometria de fluxo (integridade de membrana) revelaram características típicas de células apoptóticas (membrana íntegra, redução do volume celular, núcleo picnótico e cromatólise), também nas concentrações de 3,0 e 6,0 µM. Outros testes por citometria de fluxo revelaram que houve externalização da fosfatidilserina, que não houve formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e que a molécula 3a/3b induziu apenas a via extrínseca da apoptose, pela ativação da caspase iniciadora 8 e a consequente ativação das caspases efetoras 3 e 7. Estes dados indicam um mecanismo citotóxico por indução de uma via apoptótica, envolvendo receptores de morte. Por conseguinte, estes resultados apontam o potencial citotóxico do análogo 3a/3b.

ROCHA, Danilo Damasceno. Estudo das atividades citóxica e antitumoral de vitafisalinas isoladas de Acnistus arborescens. 2008. 123 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-21T13:30:01Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_ddrocha.pdf: 2475867 bytes, checksum: 2d242c7faf0be539e6e6c0d452db07c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-21T16:27:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_ddrocha.pdf: 2475867 bytes, checksum: 2d242c7faf0be539e6e6c0d452db07c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-21T16:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_ddrocha.pdf: 2475867 bytes, checksum: 2d242c7faf0be539e6e6c0d452db07c5 (MD5) Previous issue date: 2008 / Withaphysalins are C28-steroidal lactones structurally based on the ergostane skeleton commonly found in Solanaceae species. In order to evaluate the anticancer properties of these compounds, five withaphysalins [O, F, M, N and (17S,20R,22R)-5β,6β: 18,20-diepoxy-4β,18-dihydroxy-1-oxowitha-24-enolide] isolated from Acnistus arborescens, a plant from the northeastern Brazilian flora, were analyzed in several biological models. All five withaphysalins showed cytotoxic effects against tumor cell lines, being withaphysalin O the most potent and withaphysalin (17S,20R,22R)-5β,6β: 18,20-diepoxy-4β,18-dihydroxy-1-oxowitha-24-enolide, the less potent. Based on these results, its shown that a double-bond between carbons 2 and 3 is essential for the cytotoxic activity of withaphysalins. Withaphysalins (O, F and N) did not show any specificity to tumor cell lines, showing similar cytotoxic and genotoxic effects against leukemic cells (HL-60) and normal cells (PBMC). Cell viability and growth curves of HL-60 and K-562 treated cells were determined using trypan blue exclusion assay, where all withaphysalins reduced the number of viable cells in a dose-and time-dependent fashion, with IC50 values ranging from 0.7 to 3.5 μM after 72 h of incubation. In HL-60 and K-562 cells, the withaphysalins inhibited DNA synthesis, induced morphological alterations, typical of apoptosis, and only in the HL-60 cell line, and they induced activation of caspase-3. Moreover, it was performed the analyzes of cell membrane integrity, cell cycle distribution, DNA fragmentation and the mitochondrial membrane potential using flow citometry. In these experiments, withaphysalins O and F, only at concentration of 10µM, reduced the number of viable cells to 60 and 40% respectively. In the cell cycle analysis, both withaphysalins led to a cell cycle arrest at G2/M, at the concentration of 5μM. Cells treated with both withaphysalins also showed a significant increase in DNA fragmentation when compared to the negative control. Results of the mitochondrial transmembrane potential showed depolarization changes in accordance to the tested concentration (2.5, 5 and 10μg/mL) with 4.7, 17.5 and 9.1% for withaphysalin O and 7.6, 16.6 and 5.6% for withaphysalin F, respectively. The in vivo antitumor effects of withaphysalin F was performed in animals bearing the sarcoma 180 tumor, and at the highest dose tested (20mg/Kg/day), growth tumor was inhibited in 77%. Histopatological analysis of mice organs showed that withaphysalin F causes moderate toxic effects mostly in liver and kidney, but they may be considered reversible effects. Taking in account all these data, it can be concluded that withaphysalins could be considered as an emerging class of new anticancer compounds. / As vitafisalinas são lactonas esteroidais (C28), estruturalmente baseadas no esqueleto do ergostano, comumente encontradas em plantas da família Solanaceae. A fim de avaliar as propriedades anticâncer desses compostos, cinco vitafisalinas [O, F, M, N e (17S, 20R, 22R) -5 β, 6β :18,20-2-diepóxi β-4, 18 - diidróxi-1 - oxovita-3-24-enolido] isoladas da Acnistus arborescens, planta típica do nordeste brasileiro, foram analisadas utilizando diversos modelos biológicos. Todas as cinco vitafisalinas mostraram efeitos citotóxicos em linhagens de células tumorais, sendo a vitafisalina O a mais potente e a vitafisalina (17S, 20R, 22R) -5 β, 6β :18,20-2-diepóxi β-4, 18 - diidróxi-1-oxovita-3 - 24-enolido) a menos potente. Ao compararmos as estruturas químicas das vitafisalinas e suas atividades, foi observado que a ligação dupla entre os carbonos 2 e 3 é essencial para os efeitos citotóxicos desses compostos. No entanto, as vitafisalinas (O, F e N) não mostraram qualquer especificidade para linhagens tumorais, já que também apresentaram efeitos citotóxicos e genotóxicos, semelhantes, em células leucêmicas (HL-60) e em células normais (PBMC). A viabilidade celular e curvas de crescimento foram determinadas, para as linhagens de HL-60 e K-562, utilizando o ensaio de exclusão de azul de tripan. As vitafisalinas O, F, M e N reduziram o número de células viáveis de modo dose e tempo dependente, apresentando valores de CI50 variando de 0,7 a 3,5 μM após 72 horas de incubação. Nas mesmas linhagens leucêmicas, as vitafisalinas também inibiram a síntese de DNA, causaram alterações morfológicas típicas de apoptose, e apenas na linhagem HL-60 induziram a ativação da caspase-3. Além disso, foi realizado, em células de HL-60, a análise da integridade da membrana celular, distribuição do ciclo celular, fragmentação de DNA e o potencial transmembrânico de mitocôndria, utilizando citometria de fluxo. Nestes experimentos, as vitafisalinas O e F, somente na concentração de 10 μM, reduziram o número de células viáveis para 60 e 40%, respectivamente. Na análise do ciclo celular, ambas vitafisalinas, na concentração de 5 μM, causaram um acúmulo de células na fase G2/M do ciclo celular. Ambas vitafisalinas também causaram um aumento significativo do número de células apresentando fragmentação de DNA. Os resultados da análise do potencial transmembrânico de mitocôndria mostraram um aumento na despolarização de 4,7, 17,5 e 9,1% causado pela vitafisalina O e de 7,6, 16,6 e 5,6% pela vitafisalina F. O efeito antitumoral (in vivo) da vitafisalina F foi analisado em camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180, nas doses de 5, 10 e 20 mg/Kg/dia por via intraperitoneal e na dose de 20 mg/Kg/dia por via oral. O crescimento do tumor foi inibido em mais de 76% na maior doses testada (20mg/Kg/dia), tanto por via intraperitoneal quanto por via oral. A análise histopatológica dos órgãos dos animais mostraram que a vitafisalina F provoca efeitos tóxicos moderados, principalmente no fígado e nos rins, mas esses podem ser considerados como reversíveis. Tendo em vista todos estes dados, pode concluir-se que as vitafisalinas podem ser consideradas como uma classe emergente de novos compostos anticâncer.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:18:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345971.pdf: 2311282 bytes, checksum: 7964f07d2122bb37950c01ec7e200d0a (MD5) Previous issue date: 2017 / O tratamento do câncer ainda se apresenta como um grande desafio, principalmente devido à resistência das células tumorais aos quimioterápicos e à alta toxicidade dos tratamentos convencionais. Estes fatores têm impulsionado a pesquisa de novas estratégias terapêuticas na área da oncologia, focando principalmente em novas classes de medicamentos anticâncer. Alguns compostos que têm despertado interesse na área oncológica são os derivados de ácidos hidroxâmicos, uma vez que estes compostos têm apresentado efeito citotóxico e antitumoral, principalmente por meio de inibição de histona deacetilases. Neste trabalho foi investigado o efeito citotóxico in vitro de onze acetohidroxamatos, além do perfil farmacocinético e atividade antitumoral in vivo dos compostos mais promissores. Todos os compostos apresentaram atividade citotóxica frente às linhagens tumorais de melanoma (A375) e glioblastoma humano (U-87 MG) no ensaio de MTT, sendo que os compostos AKS 7, AKS 26 e AKS 61 destacaram-se pela alta potência e/ou pelas características físico-químicas promissoras, prosseguindo por esta razão para as próximas etapas. Destes, o composto AKS 61 foi o que apresentou capacidade antiproliferativa em concentrações mais baixas nos ensaios de Sulforrodamina B e de Clonogenicidade, além de apresentar menor citotoxicidade frente à linhagem não-tumoral de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (CMCiPS), tendo sido, portanto, selecionado para realizar alguns estudos mecanísticos in vitro. O AKS 61 bloqueou o ciclo celular de células da linhagem A375 de maneira bifásica (inicialmente em G2/M e posteriormente em G1), além de reduzir o potencial de membrana mitocondrial e induzir apoptose das células tratadas. Esse composto foi também eficaz em induzir autofagia após 24 horas de tratamento. A fim de avaliar o potencial antitumoral do AKS 61 in vivo, camundongos nude foram submetidos ao modelo de tumor xenográfico subcutâneo a partir da inoculação de células A375 e, em seguida, foram tratados com o composto AKS 61 pela via intravenosa (i.v.). O tratamento com AKS 61 (2 mg/kg, i.v.) não foi capaz de inibir o crescimento tumoral, provavelmente devido ao seu perfil farmacocinético desfavorável. Este composto apresentou tempo de meia vida plasmática inferior a quarenta minutos, acompanhada de uma alta taxa de eliminação total. Juntamente com a análise farmacocinética do AKS 61, foram também analisados os perfis dos compostos AKS 26 e AKS 7, sendo que este último apresentou o perfil mais favorável, inclusive apresentando biodisponibilidade pela via oral. Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam o potencial desta série de compostos derivados do ácido hidroxâmico e guiarão a otimização dessas moléculas, com o objetivo de obter um composto eficaz in vivo que apresente características farmacocinéticas mais favoráveis para a continuidade do desenvolvimento não-clínico.<br> / Abstract : Cancer treatment is still challenging, mainly due to tumor resistance to chemotherapy and high toxicity of conventional therapy. These factors have driven the search of new therapy strategies and the discovery of better anticancer drugs. Some compounds that have aroused attention in oncology include the hydroxamic acid derivatives, once they have demonstrated cytotoxic and antitumor effect, mostly because of their histone deacetylases inhibition property. In the present study we have investigated the in vitro cytotoxic effect of eleven synthetic acetohydroxamates, as well as the in vivo pharmacokinetic profile and antitumor activity of most promising compounds. All compounds presented cytotoxic activity against A375 (human melanoma) and U-87 MG (human glioblastoma) cell lines in the MTT assay, and the compounds AKS 7, AKS 26 and AKS 61 stood out for their promising potency and/or physicochemical characteristics, therefore proceeding to the next steps. Of these, the compound AKS 61 was the one that presented the most favorable antiproliferative capacity in the Sulforhodamine B and Clonogenic assays, also presenting smaller cytotoxicity against the non-tumoral lineage CMCiPS (cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells), being therefore chosen to perform some mechanistic studies. AKS 61 was able to arrest the cell cycle of A375 cells biphasically (initially in G2/M and later in G1), in addition to inducing a decrease in the mitochondrial membrane potential and increasing apoptosis in treated cells. The compound was also capable of inducing autophagy after 24 hours of treatment. In order to assess the in vivo antitumor effect of AKS 61, nude mice were submitted to the xenographic tumor model (by A375 cells inoculation) and treated with the compound intravenously. AKS 61 treatment (2 mg/kg, i.v.) failed to inhibit tumor growth, probably because of its unfavorable pharmacokinetic profile. This compound presented a half-life time of less than 40 minutes, accompanied by a high clearance rate. Together with the pharmacokinetic analysis of AKS 61, the profiles of the compounds AKS 26 and AKS 7 were also analyzed, the latter having the most favorable profile and presenting oral bioavailability. These data show the potential anticancer effect of these hydroxamic acid derivatives and will guide the optimization of these molecules in order to obtain a more potent and effective in vivo compound associated with favorable pharmacokinetic characteristics to continue the nonclinical development.

Glioblastoma (GB) é o tumor cerebral maligno mais frequente. O prognóstico para os pacientes é ruim e a sobrevida média após o diagnóstico varia de 6 meses a 1 ano. Isso ocorre devido à ineficácia das estratégias terapêuticas dos tratamentos atuais, pois esses tipos de tumores são altamente invasivos. Deste modo, novas estratégias terapêuticas são necessárias. Neste contexto surge a doxazosina (2 - {4 - [(2,3-dihidro-1,4-benzodioxano-2-il) carbonil] piperazina-1-il} -6,7-dimetoxiquinazolina-4amina, um composto quinazolínico pertencente à classe farmacológica dos antagonistas dos receptores adrenérgicos α1, amplamente utilizada na clínica para o tratamento de pressão arterial elevada, assim como no tratamento de retenção urinária relacionado com a hiperplasia benigna da próstata (BPH). O presente estudo avaliou os efeitos do tratamento com doxazosina em modelos experimentais de gliomas humano (U-138MG) e de rato (C6). Observamos que a doxazosina foi capaz de inibir a viabilidade na linhagem celular de glioma de rato C6. Além disso, o fármaco permaneceu estável no meio de cultura após 48 horas de incubação e foi captado pelas células de glioma C6, não apresentando efeito tóxico sobre as células não tumorais (cultura organotípica e cultura primária de astrócitos) em concentrações inferiores a 250µM. Os resultados mostraram que doxazosina foi capaz de diminuir a densidade celular e induzir a morte celular em ambas as linhagens (U-138MG e C6). Além disso, o fármaco induziu a diminuição da fosforilação das proteínas Akt e GSK-3β em 24 e 48hs de tratamento. São vários os possíveis mecanismos que possam estar associados com a ação da doxasozina, dentre eles apoptose, necrose, senescência e/ou autofagia. / Glioblastoma (GB) is the most frequent and most malignant human brain tumor. The prognosis for the patients with GB remains dismal, as median survival after diagnosis varies from 6 month to 1 year. This is largely due to the inability of current treatment strategies to address the highly invasive nature of this disease. Thus, new therapeutic strategies are needed. Doxazosin (2-{4-[(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2yl)carbonyl]piperazin-1-yl}-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amine, a quinazoline compound, is an selective α1-adrenoceptor antagonists, widely used for treatment of high blood pressure as well as in the treatment of urinary retention related with prostate benign hyperplasia (BPH). Doxazosin α1-adrenoceptor antagonists is a very promissing quinazoline drug, may represent chemical starting points to develop more potent death inducing agents free of α1-adrenoceptor antagonistic action and suitable for cancer treatment with minimal and well-tolerated side effects. Within this context, the present study was designed to evaluate the effects of doxazosin treatment in experimental models of gliomas. Doxazosin was able to viability inhibition of the C6 glioma cell line. Moreover, the drug seems to be stable in the culture medium after 48 hours of incubation and was taken up by C6 glioma cells and showed no toxic effect on non-tumor cells at concentrations below 250µM. The results showed that doxasozin was able to decrease cell density and induce cell death in both lineages. In addition, doxazosin induced the inactivation of Akt and of GSK-3β proteins after 24 and 48 hours. Taken together, our results show that doxazosin was able to significantly induce cells death of both, human and rat glioma lines (U-138MG and C6 respectively). The mechanisms associated with this effect involve apoptosis induction, necrosis, senescence or autophagy.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências de Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2013-07-16T00:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221571.pdf: 1747630 bytes, checksum: 95f6bd779e011abb44f7b39b6e8e3c67 (MD5) / A avaliação dos níveis de apoptose por citometria de fluxo é geralmente realizada por métodos que utilizam anexina V-FITC como marcador vital, que se associa aos resíduos de fosfatidilserina, externalizados no início do processo apoptótico. A utilização conjunta do marcador nuclear fluorescente iodeto de propídio (PI), por sua vez, torna possível verificar as alterações nucleares características dos estágios tardios da apoptose, como resultado do aumento da permeabilidade de membrana. Por outro lado, a utilização de calceína AM e homodímero de etídio (EthD-1) permite a verificação da apoptose através da detecção da diminuição de atividade esterásica intracelular e alterações físico-químicas na membrana celular, através do EthD-1, que combina-se à cromatina à medida que esta se torna condensada. O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar a sensibilidade na avaliação precoce da apoptose dos métodos que utilizam calceína AM e homodímero de etídio aqueles que utilizam anexina V FITC e iodeto de propídio, tomado como método de referência, a partir da marcação de células mononucleares periféricas de pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV). As análises por citometria de fluxo foram realizadas após os períodos de incubação de 24 e 48 horas em meio RPMI 1640. Os resultados demonstraram que a metodologia que utiliza calceína AM/ homodímero de etídio apresentou-se mais sensível na quantificação das células apoptóticas em ambos períodos de incubação (Média 46,95% ± 3,56, p<0,0001, para 24 horas e Média 37,67% ± 2,47, p<0,0014 para 48 horas), além de permitir definir com clareza as populações de células viáveis, em apoptose e inviáveis. Tendo em vista que a regulação anormal do processo de morte celular por apoptose está envolvida na patogênese de diversas desordens, incluindo a progressão da infecção pelo HIV, o emprego de metodologias sensíveis de avaliação desse processo, como a calceína AM-EthD-1, pode resultar em importante mecanismo de acompanhamento da progressão de doenças.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:32:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318270.pdf: 3642332 bytes, checksum: bdee1a16252bb2f6286cc9d22aa6a8de (MD5) Previous issue date: 2013 / As leucemias agudas são desordens heterogêneas do sistema hematopoiético caracterizadas pela expansão clonal de uma população de células neoplásicas malignas que sofrem bloqueio maturativo quanto à sua diferenciação. O tratamento mais efetivo para as leucemias, a quimioterapia, está associado a altas taxas de recidiva e a elevados índices de morbidade e mortalidade. Estudos demonstram que as chalconas e seus derivados possuem atividade citotóxica e apresentam potencial para o desenvolvimento de novos fármacos. Assim, o objetivo do presente estudo é a busca por novos compostos a partir de três chalconas sintéticas derivadas do 1- e do 2-naftaldeído que tenham atividade contra células leucêmicas com pouco ou nenhum efeito em células normais. Entre os compostos avaliados, a chalcona A1 apresentou resultados mais promissores e foi selecionada para estudos posteriores. Para os ensaios de citotoxicidade, as células K562, Jurkat, U937, Kasumi, NB4 e CEM foram incubadas com a chalcona A1 em concentrações crescentes por 24, 48 e 72 h. A viabilidade celular foi determinada pelo método do MTT, onde se observou que o composto reduziu a viabilidade celular das seis linhagens de forma dependente da concentração e do tempo de incubação. A fim de verificar a efetividade do composto em um modelo de tumor sólido, foram utilizadas células de adenocarcinoma de cólon humano HT-29. Os resultados demonstram que a chalcona A1 também apresentou citotoxicidade de forma dependente do tempo e da concentração, porém com CI50 mais elevada em comparação às linhagens leucêmicas. Para avaliar a seletividade do composto para células tumorais, a chalcona foi incubada com fibroblastos humanos de medula óssea (JMA) e com células mononucleadas de indivíduos saudáveis. A chalcona A1 não reduziu significativamente a viabilidade celular em ambos os modelos. A apoptose foi confirmada pela observação morfológica após coloração com brometo de etídio e laranja de acridina, pelo ensaio de fragmentação do DNA e por citometria de fluxo pelo método da Anexina V. A investigação do efeito no ciclo celular mostrou que o composto A1 causou bloqueio significativo em diferentes fases nas seis linhagens avaliadas. A fim de investigar os mecanismos pelos quais o composto causou morte celular, investigou-se o efeito da chalcona A1 no potencial mitocondrial e na expressão das proteínas survivina e KI-67 nas células K562, Jurkat e Kasumi, e das proteínas Bcl-2, Bax, FasR, AIF e caspase-3 nas linhagens K562 e Jurkat. Os resultados demonstraram que o composto reduziu o potencial mitocondrial, diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 e aumentou a expressão da proteína pró-apoptótica Bax, sugerindo que o mecanismo de morte celular envolve a via intrínseca. Na linhagem Jurkat, foi observado também aumento de FasR, o que indica o envolvimento da via extrínseca. Além disso, o mecanismo de ação da chalcona A1 envolve o aumento da expressão da caspase-3 e a diminuição da expressão da proteína antiapoptótica survivina e do marcador de proliferação celular KI-67. Em experimentos ex vivo, a chalcona A1 reduziu a viabilidade de células mononucleadas de oito pacientes portadores de diferentes tipos de leucemia aguda, o que confirma os resultados de citotoxicidade encontrados in vitro <br>