Submitted by Raquel Vergara Gondran (raquelvergara38@yahoo.com.br) on 2016-04-22T03:53:34Z No. of bitstreams: 1 silvana menoncin - purificao de lipases produzidas por fungo utilizando sistema.pdf: 1423756 bytes, checksum: ab26bd30dc4f0e48f90bdb7c74c6916b (MD5) / Rejected by Gilmar Barros (gilmargomesdebarros@gmail.com), reason: Faltou colocar o nome do co-orientador. on 2016-04-22T14:51:38Z (GMT) / Submitted by Raquel Vergara Gondran (raquelvergara38@yahoo.com.br) on 2016-04-25T19:34:12Z No. of bitstreams: 1 silvana menoncin - purificao de lipases produzidas por fungo utilizando sistema.pdf: 1423756 bytes, checksum: ab26bd30dc4f0e48f90bdb7c74c6916b (MD5) / Rejected by dayse paz (daysepaz@hotmail.com), reason: Tens que incluir co-orientador ele segue sendo o segundo. Atenciosamente Equipe RI-FURG on 2016-04-26T14:45:06Z (GMT) / Submitted by Raquel Vergara Gondran (raquelvergara38@yahoo.com.br) on 2016-04-26T15:32:29Z No. of bitstreams: 1 silvana menoncin - purificao de lipases produzidas por fungo utilizando sistema.pdf: 1423756 bytes, checksum: ab26bd30dc4f0e48f90bdb7c74c6916b (MD5) / Approved for entry into archive by dayse paz (daysepaz@hotmail.com) on 2016-04-26T15:37:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silvana menoncin - purificao de lipases produzidas por fungo utilizando sistema.pdf: 1423756 bytes, checksum: ab26bd30dc4f0e48f90bdb7c74c6916b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T15:37:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silvana menoncin - purificao de lipases produzidas por fungo utilizando sistema.pdf: 1423756 bytes, checksum: ab26bd30dc4f0e48f90bdb7c74c6916b (MD5) Previous issue date: 2011 / A purificação de proteínas consiste em um dos desafios da área de Bioprocessos. O grau de pureza requerido para enzimas está diretamente relacionado com a aplicação na qual estas serão empregadas. Os sistemas aquosos bifásicos (SAB) e o processo de separação por membranas (UF) vêm sendo amplamente estudados na purificação de diversas proteínas, por apresentarem algumas vantagens sobre os processos cromatográficos, como facilidade de escalonamento e baixo custo. No entanto, a purificação de lipases por SAB ainda é pouco reportada. Neste sentido, o foco deste trabalho foi avaliar a utilização da melhor combinação do SAB formado por polietilenoglicol (PEG) e tampão fosfato de potássio e a combinação com o processo de separação por membrana, na purificação de lipase de Penicillium crustosum produzida por fermentação em estado sólido. O SAB se apresentou como uma técnica potencial para a separação e purificação da lipase obtendo-se fator de purificação 5,8 no sistema composto de 20% PEG 6000, 7,0% fosfato de potássio pH 8. A técnica do planejamento experimental foi utilizada como uma estratégia para a maximização da purificação, no qual foram avaliadas as concentrações de polietilenoglicol (PEG), fosfato de potássio e NaCl em sistemas compostos por PEG 6000 fosfato de potássio pH 8. O sistema 20% PEG 6000, 5,8% fosfato de potássio pH 8 com acréscimo de 4,8% de NaCl apresentou recuperação da atividade de hidrólise de 53,8% e o maior fator de purificação 10,5. O sistema composto de 20% PEG 6000, 5,8% de fosfato de potássio sem o acréscimo de NaCl foi o que apresentou maior atividade de transesterificação e fator de purificação, 8,5 U/mg e 28,3 vezes, respectivamente. Membranas comerciais com massa molecular de corte de 30 e 60 kDa foram testadas. Com acréscimo de 0,09 mol/L de NaCl o fator de purificação aumentou de 0,8 para 1,4 vezes. Quando combinou-se o sistema aquoso bifásico e separação por membrana, o fator de purificação em termos de atividade de hidrólise diminuiu, mas com relação à de atividade de transesterificação aumentou, alcançando valores em torno de 39 vezes para os sistemas compostos de 11,6% PEG 6000, 10% fosfato de potássio e 1,2% NaCl e 38,3 para o sistema formado por 16% PEG 6000, 8% fosfato de potássio e 4,8% NaCl. / The purification of proteins is one of the challenges in the area of Bioprocesses. The purity degree required for enzymes is directly related to the application in which they are employed. Aqueous two-phase systems (ATPS) and membrane separation process have been investigated in the purification of several proteins, which present some advantages over the chromatographic processes, such as easy scale-up and low cost. However, the purification of lipases by ATPS has been little reported. In this sense, the focus of this study was to evaluate the use of the best combination of the ATPS consisting of polyethylene glycol (PEG) and potassium phosphate buffer and the combination with membrane separation process for the lipases purification from Penicillium crustosum produced by solid state fermentation. The ATPS is a potential technique for the separation and purification of such lipases, resulting in a purification factor 5.8 using the system composed of 20% PEG 6000, 7.0% potassium phosphate, pH 8. The technique of experimental design was used as a strategy for maximizing the purification, in which we assessed the concentrations of polyethylene glycol (PEG), potassium phosphate and sodium chloride in systems composed of PEG 6000 at pH 8. The system 20% PEG 6000, 5.8% potassium phosphate at pH 8, and 4.8% NaCl showed a recovery of the activity (hydrolysis) of 53.8% and yielded the highest purification factor 10.5, based on hydrolytic activity. The system made up of 20% PEG 6000, 5.8% potassium phosphate without the addition of NaCl showed highest activity of transesterification and purification factor, 8.5 U/mg and 28,3, respectively. Commercial membranes with molecular weight cutoff of 30 and 60 kDa were tested. That addition of 0.09 mol/L NaCl to the enzymatic extract in the feed increased the purification factor from 0.8 to 1.4. When the processes of ATPS and UF were combined, the purification factor in terms of hydrolytic activity decreased, but increased in terms of transesterification activity, reaching values around 39 for PF in the systems composed of 11.6% PEG 6000 10% potassium phosphate and 38,3 in the systems composed of 1.2% NaCl and 16% PEG 6000, 8% potassium phosphate and 4.8% NaCl.

Orientador: Rahoma Sadeg Mohamed. / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-01T04:27:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PessoaFilho_PedrodeAlcantara_D.pdf: 10293388 bytes, checksum: d2122777bc0a4783f681b4c94289e6de (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A fonnação de sistemas aquosos bifásicos em conseqüência da adição à água de alguns pares de polímeros, ou de certos polímeros e sais, é um fenômeno bem estabelecido e conhecido. Esses sistemas encontram larga aplicação na separação de moléculas biológicas em laboratório e têm conhecido nos últimos tempos incipiente aplicação industrial; sua correta modelagem tennodinâmica é o objetivo deste trabalho. Inicialmente consideraram-se sistemas formados por dois polímeros. Procurou-se incorporar à equação de Flory-Huggins modificações que levassem em conta a formação de ligações de hidrogênio entre moléculas de água e entre moléculas de água e de polímero, no caso, o poli(etileno glicol). Em uma primeira análise utilizou-se como base do desenvolvimento a teoria quimica, que considera a ligação de hidrogênio uma ligação covalente. Os resultados foram bastante adequados e indicavam que a consideração das ligações cruzadas era suficiente para permitir uma boa modelagem. Assim, outros modelos que levavam em conta a solvatação foram desenvolvidos, em uma primeira abordagem considerando o número de moléculas de água na camada de solvatação constante, depois permitindo que esse valor variasse com a composição. Todos esses modelos tiveram bastante sucesso; entretanto, resultados pouco adequados foram obtidos na utilização da SAFT (teoria estatistica do fluido associativo). A polidispersão da dextrana também foi considerada em alguns cálculos, com sucesso; entretanto, dadas as diferenças existentes entre dados experimentais obtidos em grupos de pesquisa diversos, não foi possivel construir um modelo totalmente preditivo. Estudaram-se também sistemas formados por polímeros e sais. Nesse caso, o esforço teórico foi direcionado à compreensão do papel dos componentes nos tennos devidos à interação eletrostática ¿ por exemplo, polímeros presentes alteram a constante dielétrica e a densidade do meio, devendo portanto alterar a equação de Debye-Hückel, o que, por sua vez, faz com que se prevejam comportamentos irrealistas. Análise acurada revelou que a solução completa do problema demanda a conversão de propriedades obtidas no formalismo de McMillan e Mayer ao formalismo de Lewis e Randall para misturas de solventes ¿ esforço teórico cujo vulto ultrapassa o escopo deste trabalho. Desenvolveu-se também um modelo para sistemas fonnados por polieletrólitos e polímeros neutros. Esse modelo é baseado em uma equação empirica do virial, e considera a ocorrência de várias reações, por meio das quais foi possivel obter um novo modelo de energia de Gibbs excedente que levasse em conta a variação do grau de dissociação iônica em soluções aquosas de polieletrólitos. O modelo fisico de solvatação constante, desenvolvido para sistemas formados por dois polímeros, foi utilizado no estudo da partição de moléculas biológicas. O modelo foi capaz de descrever muito bem resultados de experimentos de partição. Nesse caso, a consideração da polidispersão da dextrana, que afeta muito pouco cálculos de equilíbrio líquido-líquido, modificou de maneira adequada a densidade numérica dessas fases, tomando o modelo mais confiável / Abstract: Aqueous two-phase systems are formed when either two polymers or a polymer and a salt are added to water at certain concentrations. These systems have been widely used to separate biological molecules in laboratory, and have recently found incipient industrial application. This work is aimed at the development of reliable thennodynamic models for these systems. First, systems fonned by two polymers were examined. The Flory-Huggins equation was modified to account for hydrogen bonding occurring between water molecules (self-association) and between water and polymer molecules (solvation). The first modification uses the chemical theory, according to which hydrogen bonding is considered to be equivalent to a covalent bonding. The results obtained were very good and indicated that cross-association alone might bring about this improvement. Purely physical models accounting for solvation were subsequently developed, first by considering the number of water molecules bonded to each polymer molecule as a constant value, and later allowing it to vary with concentration. These models were found very successful. A similar attempt to use the SAFT (statistical associating fluid theory), however, did not provide good results. Polydispersion in polymers such as Dextran was also successfully accounted for, even though it was not possible to establish a completely predictive model due to the discrepancies in experimental data obtained by different research groups. Systems fonned by polymers and salts were dealt with next. In this case, the theoretical investigation was aimed at the understanding of the role of the different compounds in the ca1culation of the tenn that accounts for long range interactions. For instance, polymers modify the dielectric constant and the specific gravity ofthe surrounding medium, thus modifying the Debye-Hückel equation; however, accounting for this effect introduces spurious terms in phase equilibrium ca1culations. A more detailed analysis showed that the correct solution to this problem would require the conversion of properties of mixing ca1culated in the McMillan and Mayer forrnalism to that of Lewis and Randal, a serious and challenging theoretical problem whose solution is beyond the scope of this work. A new thennodynamic model tailored for solutions of polyelectrolytes and neutral polymers was also developed. This model is based on an empirical virial equation and considers the occurrence of some ionic dissociation reactions. Through this picture it was possible to develop a new excess Gibbs energy model accounting for the variation of the ionic dissociation degree in aqueous solutions of polyelectrolytes. The model with constant value for the solvation number, developed for systems fonned by two polymers, was also used to model the partitioning of biological molecules in these systems. The model provided a very good description of partitioning experiments. Accounting for Dextran polidispersion, which has almost no effect on phase equilibrium ca1culations, modifies the numeric density of the liquid phases in equilibrium, and increases the reliability of the model / Doutorado / Engenharia de Processos / Doutor em Engenharia Química

A partição das enzimas glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e uroquinase (UK) em sistemas micelares de duas fases aquosas foi investigada, teórica e experimentalmente. Inicialmente, a partição de G6PD em sistema micelar de duas fases aquosas composto pelo tensoativo não-iônico C10E4 (óxido de n-deciltetraetileno) foi estudada. Observou-se uma partição governada primariamente por interações repulsivas estéricas, do tipo \"volume de exclusão\", sendo a G6PD recuperada preferencialmente na fase inferior do sistema, pobre em micelas, resultando em valores de KG6PD inferiores a 1,0. Os tensoativos catiônicos CnTAB (brometos de alquiltrimetilamônio, n = 8, 10 e 12) foram adicionados ao tensoativo C10E4, de modo a formar sistemas micelares mistos (não-iônico/catiônico) de duas fases aquosas e atrair a G6PD de carga efetiva negativa para a fase superior, rica em micelas positivamente carregadas. Os coeficientes de partição obtidos nos sistemas C10E4/CnTAB/tampão foram no mínimo 2,5 vezes maiores que os correspondentes no sistema C10E4/tampão mantendo-se o volume de exclusão constante. De uma forma geral, o sistema micelar misto C10E4/C10TAB/tampão forneceu o melhor KG6PD = 7,7, com um rendimento de G6PD na fase superior de 71%. A adição de ligantes de afinidade (inibidores enzimáticos) ao sistema de duas fases aquosas C10E4/tampão para purificação de UK e G6PD também foi estudada. Não foram observadas diferenças significativas no perfil de partição da UK na presença ou não do ligante p-aminobenzamidina, o qual apresentou partição uniforme entre as duas fases do sistema, sendo obtidos valores de KUK ~ 0,70 em ambos os casos. Para a G6PD, um pequeno incremento no KG6PD foi observado na presença dos ligantes de afinidade cibacron blue e procion red, porém resultando ainda em valoresfnferiores a 1. Portanto, a utilização de inibidores enzimáticos livres em solução como ligantes de afinidade para purificação de UK e G6PD em sistema micelar C10E4/tampão de duas fases aquosas não resultou em diferenças significativas no perfil de partição das enzimas. Por fim, um sistema de purificação em dois estágios, sendo o primeiro constituído de sistema micelar não-iônico (C10E4) de duas fases aquosas e o segundo de sistema micelar misto (C10E4/ C10TAB) de duas fases aquosas foi aplicado para a purificação de G6PD presente em homogeneizado celular de Saccharomyces cerevisiae, sendo obtido um rendimento final de G6PD de 59%, com um fator de purificação de 1,3. / The partitioning of the hydrophilic enzymes glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and urokinase (UK) in two-phase aqueous micellar systems was investigated, both experimentally and theoretically. Initially, the partitioning of G6PD in two-phase aqueous micellar system composed of the nonionic surfactant C10E4 (n-decyl tetra(ethylene oxide) was studied. It was observed a partitioning behavior governed primarily by repulsive, steric, excluded-volume interactions, which drove the enzyme preferentially to the bottom, micelle-poor phase, resulting in KG6PD values smaller than one. The cationic surfactants CnTAB ((alkyltrimethylammonium bromide, n = 8, 10, and 12) were mixed wíth the nonionic surfactant C10E4 to form two-phase aqueous mixed (nonionic/cationic) micellar systems. The measured G6PD partition coefficients in the C10E4/CnTAB/buffer systems were at least 2.5 times larger than those in the corresponding C10E4/buffer system, clearly demonstrating that the net negatively charged G6PD was attracted electrostatically to the top, mixed micelle-rich phase, containing a greater number of positively-charged C10E4/CnTAB mixed micelles. Overall, the two-phase aqueous mixed (C10E4/C10TAB) micellar system yielded the highest KG6PD = 7.7, with a G6PD yield in the top phase of 71%. The addition of affinity ligands (enzyme inhibitors) to the two-phase C10E4 /buffer systems was studied for UK and G6PD purification. No significant differences in the UK partitioning behavior was observed in the presence or not of the ligand p-aminobenzamidine, since the ligand was found to partition evenly between the two phases of the system. Partition coefficient values of about 0.70 were obtained in both cases. For the G6PD, the partition coefficient was found to be slightly higher in the presence of either cibacron blue or procion red as affinity ligand, however still smaller than one. Therefore, the use of competitive inhibitors free in solution as affinity ligands for UK and G6PD purification in two-phase C10E4 /buffer systems did not provide significant differences in the enzymes partitioning behaviors. Finally, a two-step purification process, combining a two-phase aqueous nonionic (C10E4) micelar system, followed by a two-phase aqueous mixed (C10E4/C10TAB) micellar system, was employed for the purification of G6PD present in a Saccharomyces cerevisiae cell homogenate. It was obtained a G6PD final yield of 59%, and a purification factor of 1,3.

<p><strong>Apstrakt je obrađen tehnologijama za optičko prepoznavanje teksta (OCR).</strong></p><p>U radu je ispitana raspodela pektinaza u vodenim dvofaznim sistemima sastavljenim od polietilen glikola 4000 i jednog od dva dekstrana, sirovog i dekstrana 40000. Koncepcija rada je podrazumevala definisanje sistema u kojima su vr&scaron;eni eksperimenti raspodele, ispitivanje parametara raspodele pektinaza komercijalnog enzimskog preparata u model sistemima i, konačno, kultivaciju Polyporus squamosus u dvofaznim sistemima.<br />Ispitivanje uticaja masenih udela polietilen glikola na raspodelu pektinaza u model sistemu, pri konstantnom udelu sirovog dekstrana od 7.5% (w/w), pokazalo je negativan uticaj na parametre raspodele, te su najveće vrednosti koeficijenta raspodele (K) dobijene pri najmanjem ispitivanom udelu polietilen glikola, 5% (w/w), i iznosili su za endo-pektinazu (endo-p) 1.76, odnosno za egzo- pektinazu (egzo-p) 1.22. Istu zavisnost je pokazalo i ispitivanje u model sistemu sa dekstranom 40000, ali je vrednost K_endo bila mnogo niža (0.22). Povećanje udela sirovog dekstrana, pri stalnom udelu, 5% (w/w), polietilen glikola, negativno je uticalo na vrednosti parametara raspodele egzo-p, te su maksimalne vrednosti dobijene pri najmanjem udelu, 3% (w/w), dekstrana (K_egzo 0.79, prinos u gornjoj fazi (Y) 62.04%, stepen preči&scaron;ćenosti u gornjoj fazi (st.preč.) 5.5).<br />Sa povećanjem dužine veznih linija u model sistemu sa sirovim dekstranom opadale su vrednosti parametara raspodele pektinaza. Najbolji rezultati (K_endo 1.66, Y_endo 60.85%, K_egzo 0.95, Y_egzo 47.07%) dobijeni su najkraćoj veznoj liniji, dužine 7.44%. Povećanje odnosa zapremina u istom sistemu smanjilo je koeficijente raspodele endo- i egzo-p, kao i njihove stepene preči&scaron;ćenosti u gornjoj fazi, a u isto vreme povećalo prinose u toj fazi.<br />Dodatak amonijum sulfata i natrijum sulfata u model sistem polietilen glikol/sirovi dekstran u koncentraciji od po 15 mmoI/l povećao je K_endo 1-25, odnosno 1.2 puta, dok je K_egzo u prisustvu 15 mmol/l amonijum sulfata ili 5 mmol/l natrijum sulfata bio za 60% veći. Povećanje rN vrednosti KH₂PO₄-Na₂HPO₄ pufera povećalo je koeficijente raspodele oba tipa pektinaza, te je K_endo, na rN 7.5, bio 0.9, a K_egzo 0.76, na rN 7.0. Najbolja raspodela endo-p u gornju fazu model sistema ostvarena je pri 0.4 mol/l fosfatnog pufera (K 4.21, Y 85.78%, st.preč. 10). Vrednosti iznad 0.1 mol/l fosfatnog pufera nisu imale značajnijeg uticaja na raspodelu egzo-p.<br />Kultivacija Polyporus squamosus je bila moguća u dvofaznom sistemu polietilen glikol/sirovi dekstran, sa pektinom. kao inducerom, pri čemu je ostvareno odvajanje biomase od pektinaza njihovom raspodelom u suprotne faze. U sistemu sastava 5% (w/w) polietilen glikol/4% (w/w) sirovi dekstran, količina produkovane biomase je bila 4.5 puta veća od one u homogenom medijumu, ukupne egzo-p aktivnosti 1.82 puta veća, a endo-p aktivnosti jednaka onoj u homogenom medijumu. Drugog dana kultivacije ostvarene su najveće vrednosti parametara raspodele (K_endo 2.45, Y_endo 80.22%, st.preč._endo 7; K_egzo 0.6, Yegzo 49.83%, st.preč._egzo 5.19). Povećanje koncentracije amonijum sulfata za 15 mmol/l u podlozi za kultivaciju u dvofaznom sistemu sastava 5% (w/w) polietilen glikol/4% (w/w) sirovi dekstran, povećalo je koeficijent raspodele endo-p za 81%, vrednost ove aktivnost u grnjoj fazi za 37%, a da nije uticalo na raspodelu biomase P. squamosus.<br />Prisustvo različitih koncentracija fosfata nije uticalo na raspodelu biomase P. squamosus u dvofaznom sistemu. Pri 0.2 mol/l KH2PO4 postignuto je idealno odvajanje biomase od endo-p, uz K_egzo 112. Najveća vrednost ukupnih produkovanih aktivnosti oba tipa ostvarena je pri 0,1 mol/l fosfata, uz koeficijente raspodele za endo-p i egzo-p 3.9 i 0.95 i visoke stepene njihove preči&scaron;ćenosti u gornjoj fazi (5.89 i 14.36, redom).<br />Kultivacija P. squamosus je ostvarena i u dvofaznom sistemu koji je sadržao suve izlužene repine rezance, sa raspodelom biomase u donju fazu. Koeficijenti raspodele su iznosili 4.70, odnosno 2.78, za endo-p, odnosno egzo-p. Prinosi oba enzima u gornjoj fazi su bili 90.71% za endo-p i 85.24% za egzo-p, uz najveće stepene njihove preči&scaron;ćenosti, 4.26 i 7.98, redom.</p> / <p><br /><strong>Abstract was processed by technology for Optical character recognition (OCR).</strong></p><p>Partition of pectinases in aqueous two-phase systems composed of polyethylene glycol 4,000 and crude dextran or dextran 40,000 was studied in this work. As the first step, phase diagrams were constructed, than partition of commercial pectinases was studied in model systems and finally, cultivation of Polyporus squamosus in aqueous two-phase systems was conducted.<br />Increasing of the concentration of polyethylene glycol in model system at fixed 7.5% (w/w) crude dextran decreased partition parameters. Maximal values for partition coefficient (К) of endo-pectinase (endo-p), 1.76, and exo-pectinase (ехо-р), 1.22, were obtained at 5% (w/w) polyethylene glycol. The same was revealed in investigations in model system with dextran 40,000, but Kendo was lower (0.22). Increasing of concentration of crude dextran at fixed 5% (w/w) polyethylene glycol decreased partition parameters of ехо-р, so their maximal values (Кexo 0.79, top phase yield (Y) 62.04% and purification factor in top phase 5.5) were obtained at 3% (w/w) crude dextran.<br />Increasing of the tie-line length caused decreasing of partition parameters and maximal results were achieved at the shortest tie-line 7.44% (Kendo 1-66, Yendo 60.85%, Кехо 0.95, Yexo 47.07%) in model system with crude dextran. With increasing of the volume ratio, partition coefficients of endo-p and ехо-р were decreased, as well as their purification factor in top phase, while top phase yield for both enzymes had higher values.<br />The addition of 15 mmol ammonium sulphate/l and 15 mmol sodium sulphate/l in model system, composed of polyethylene glycol and crude dextran, increascd Kendo 1.25 and 1.2 times, respectively, while Кехо in the presence of 15 mmol ammonium sulphate/l or 5 mmol sodium sulphate/l was 60% higher. Increasing of рН of KH2PO4- Na2HPO4 buffer favoured partition of both endo-p and ехо- p in top phase, so Kendo was 0.9 at рН 7.5 and Кехо was 0.76 at рН 7.0. The favourable partition of endo-p in top phase was achieved in the presence of 0.4 mol phosphate buffer/l (К 4.21, Y 85.78% and purification factor in top phase 10). Concentrations of phosphate buffer above 0.1 mol/l didn&rsquo;t have significant influence on partition of ехо-р.<br />Cultivation of Роlуроrus squamosus in polyethylene glycol/crude dextran aqueous two-phase system was accomplished with pectin as inducer and biomass was separated from pectinases by their partition into opposite phases. In system composed of 5% (w/w) polyethylene glycol and 4% (w/w) crude dextran, amounts of produced biomass and ехо-р activity were 4.5 and 1.82 times higher, respectively, and endo-p activity equal to those obtained in homogeneous cultivation. At the second day of cultivation the highest values of partition parameters were obtained (Kendo 2.45, Yendo 80.22%, purification factor for endo-p 7; Кeхо 0.6, Yexo 49.83%, purification factor for ехо-р 5.19). Increasing of concentration of ammonium sulphate in two-phase medium for 15 mmol/l increased Kendo for 81% and endo-p activity in top phase for 37%, but didn&rsquo;t influence partition of biomass.<br />Presence of phosphate at various concentrations didn&rsquo;t affect partition of biomass in two-phase system. At 0.2 mol KH2PO4/I tlie onesided partition of endo-p was accomplished while Кeхо was 1.12. The highest amounts of produced activities of endo-p and ехо-р were obtained at 0.1 mol phosphate/l and partition coefficients were 3.9 and 0.95, respectively, followed by high values of purification factors in top phase (5.89 and 14.36, rcspectively).<br />Cultivation of P. squamosus was accomplished in two-phase system containing dry sugar beet extraction waste and fungal growth was restrected to bottom phase. Partition coefficients were 4.70 and 2.78 for endo-p and ехо-р, respectively. Тор phase yields amounted 90.71% for endo-p and 85.24% for ехо-р followed by the highest obtained purification factors in top phase (4.26 and 7.98, respectively).</p>

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近年発酵生産が注目されているコハク酸の抽出分離法についてイオン液体を含む液膜法及び水性２相抽出法を用いて研究した．イオン液体を含む含浸型液膜により，受容相に塩酸水溶液を用いることでコハク酸の上り坂輸送を達成できた．次にイオン液体を含む高分子溶媒膜によるコハク酸の透過を検討した．最適な条件は含浸液膜と異なり，透過にはコハク酸の各化学種が関与していた．最後に水溶性有機溶媒やイオン液体を用いた水性２相抽出法によるコハク酸の抽出を行った．塩および糖を相分離剤とすることで，発酵液で想定されるコハク酸の80％以上の抽出が達成できた． / Succinic acid is widely used in many industrial sectors; pharmacy, textile, food, etc. The bio-production of succinic acid from renewable resource was desired because the petrochemical production of succinic acid became costly. In this study, the extraction and separation techniques of succinic acid by liquid membranes (LMs) and aqueous two-phase system (ATPS) containing ionic liquids (ILs) were exploited. The permeation mechanisms and optical conditions were elucidated. / 博士(工学) / Doctor of Philosophy in Engineering / 同志社大学 / Doshisha University

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Biopharmaceutical manufacturing is a rigorous and expensive process. Due to the medicinal nature of the product, a high purity level is required and several expensive purification steps must be utilized. Cost-effective production and purification is essential for any biopharmaceutical product to be successful and development of the fastest, most economical, and highest-yielding purification scheme is a constant engineering challenge. Commercial-scale purification schemes currently revolve around the use of multiple chromatography steps for the purification of biopharmaceutical products. Chromatography has many shortcomings including high cost, limited throughput, and complex scale up. The goal of this research was to develop an alternative, non-chromatography purification step for the separation of an acidic model protein, recombinant β-glucuronidase (rGUS), from transgenic tobacco with high yield and purity. Aqueous two-phase extraction (ATPE) is a powerful technique for separation and purification of proteins, and has the potential to replace an expensive chromatography step for the initial purification of recombinant proteins. ATPE enables high levels of target protein recovery and concentration while removing large amounts of impurities from the initial extract. Fractional factorial designs and response surface methodology were used to determine an optimized aqueous two-phase system for the purification of rGUS from transgenic tobacco. In a 13.4 % (w/w) PEG/18% (w/w) potassium phosphate system, 74% of the rGUS was recovered in the top PEG-rich phase while 90% of the native tobacco proteins were removed in the interphase and the bottom phase. A purification factor of about 20 was achieved in this process. / Master of Science

Neste trabalho estudou-se a modelagem termodinâmica do equilíbrio de fases de sistemas aquosos bifásicos formados por um polímero neutro, especificamente o poli(etileno glicol), e um sal. O modelo implementado é baseado na equação de Pitzer para soluções de eletrólitos, dele diferindo ao considerar a influência das propriedades do polímero no cálculo da constante dielétrica e da densidade do meio, presentes no cálculo do termo relativo às interações de longo alcance da energia de Gibbs excedente. Além disso, procurou-se também considerar a dependência dos parâmetros relativos ao polímero com respeito ao tamanho de sua cadeia. Dados experimentais obtidos da literatura foram utilizados para a obtenção dos parâmetros ajustáveis do modelo, em cuja implementação foi utilizada a linguagem FORTRAN. A alteração nas propriedades do meio modificou o estado de equilíbrio calculado, fato que pôde ser observado por meio da análise de fatores como o desvio entre a composição calculada pelos modelos e os valores experimentais em cada fase e a inclinação da linha de amarração. Em alguns sistemas o desempenho do modelo modificado foi superior nesses parâmetros, mas em termos gerais a modificação no cálculo da constante dielétrica e da densidade não resultou em melhora no cálculo do equilíbrio de fases, por vezes piorando-o, de modo que investigações específicas sobre o termo de longo alcance foram conduzidas para verificar a razão deste comportamento. A inclusão de parâmetros ternários aumentou a capacidade de correlação de ambos os modelos. No que diz respeito à possibilidade de correlação dos parâmetros de interação como função do tamanho da cadeia polimérica, que poderia levar a um modelo preditivo, observou-se que somente para tamanhos grandes de cadeia foi possível estabelecer uma dependência direta e inequívoca. / The thermodynamic modeling of phase equilibrium in aqueous two phase systems containing the neutral polymer poly(ethylene glycol) and a salt was studied in this work. The implemented model is based on the Pitzer equation for electrolytes solutions, modified in order to account for the influence of polymer properties in both the medium dielectric constant and the medium density, values which are present in long range term of the excess Gibbs energy. The dependence of the adjustable parameters on the polymer molecule size was also investigated. Experimental data from literature were used to obtain the adjustable parameters of the model, in whose implementation the FORTRAN computer language was used. The changes introduced into the long range term resulted in a shift of the calculated equilibrium compositions, which could be observed by analyzing the deviation between calculated and experimental compositions and tie-line slopes. For some systems the performance of the modified model was superior, but in most cases the changes introduced did not result in a significant improvement in phase equilibrium calculations, and even worsened them. Specific investigations on the long range term were carried out to verify the reason for such behavior. The insertion of ternary parameters increased the correlation capacity of both models. Concerning the hypothesis that the interaction parameters can be directly related to the polymer chain size, which might eventually lead to a predictive model, it was noticed that a direct dependency holds only for larger chain sizes.

O ambiente Antártico é caracterizado por condições ambientais restritivas de clima, hábitat e biogeografia. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade de leveduras em amostras marinhas e terrestres do ambiente Antártico, além da prospecção de lipases que atuem em processos que requerem baixas e moderadas temperaturas. De acordo com os resultados obtidos, 97 leveduras foram recuperadas por semeadura em meio de cultura PDA e YMA a partir de diferentes amostras coletadas na OPERANTAR XXVIII (verão 2010), das quais foram identificados 12 gêneros e 21 espécies. Destas, 45 apresentaram atividade de lipase e duas foram selecionadas para o ensaio de otimização da produção enzimática: C. laurentii L59 e L. scotti L117. A extração de lipase de L. scottii L117 foi avaliada por Sistema de Duas fases Aquosas e o sistema micelar utilizando TX-114 foi o mais eficiente para purificação parcial desta enzima. Por fim, a avaliação da diversidade das 405 leveduras isoladas de macroalgas e liquens (coletadas na OPERANTAR XXXII no verão de 2013) revelou a ocorrência de 24 taxons de leveduras a partir das amostras de macroalgas e 18 taxons a partir das amostras de liquens, sendo apenas cinco espécies comuns a estes dois substratos. / The Antarctic continent is characterized by restrictive environmental conditions of climate, habitats and biogeography. In this sense, the objective of this study was to evaluate the diversity of yeasts in marine and terrestrial samples of the Antarctic environments, as well as the propspecting of lipases that can act in proceses that require low and moderate temperatures. According to the results, 97 yeasts were recovered from different samples collected in OPERANTAR XXVIII (summer 2010), representing 21 different species. Among them, 45 showed lipase activity and two were selected for the optimization of enzyme production: C. laurentii L59 and L. scotti L117. Extraction of L. scottii L117 lipase was assessed by Aqueous Two-Phase System and the micellar system TX-114 was the most efficient for partial enzyme purification. Finally, the diversity evaluation of 405 isolates from seaweeds and lichens (collected in XXXII OPERANTAR, summer of 2013) revealed the occurrence of 24 taxa from macroalgae samples and 18 taxa from lichens samples, being only five substrates common to these two substrata.